本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種關(guān)節(jié)腔注射用含低分子量黃原膠的藥物制劑及制備方法。
背景技術(shù)：
：骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種在手指，臀部，肩膀和膝蓋等關(guān)節(jié)常見的炎性疾病，以軟骨降解和骨質(zhì)增生為特點，發(fā)病時伴隨著關(guān)節(jié)疼痛，運(yùn)動受限，病情嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)運(yùn)動功能喪失，嚴(yán)重的影響了患者的日常生活。目前我國不同年齡原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎患病率分別是：40至49歲為30.1%，50至59歲48.7%，60至69歲為62.2%，70歲以上為62%。我國已成為世界上OA患病人數(shù)最多的國家之一。OA給中老年人帶來了極大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為導(dǎo)致人類殘疾的第一大疾病，被稱為“不死的癌癥”。因此開發(fā)有效的治療OA的方案具有重要的社會效益和應(yīng)用價值。自上世紀(jì)80年代，黏彈性材料補(bǔ)充療法問世，即通過注射透明質(zhì)酸防治軟骨缺損疾病如骨關(guān)節(jié)炎，并取得了革命性的進(jìn)展。透明質(zhì)酸作為軟骨基質(zhì)的重要組成部分，對軟骨基質(zhì)的平衡具有極其重要的意義。通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)直接給予高黏彈性的透明質(zhì)酸鈉，可保護(hù)并修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨。單獨應(yīng)用透明質(zhì)酸鈉雖可保護(hù)及修復(fù)損傷的軟骨，但作用時間短，修復(fù)速度慢，需多次注射給藥且療程長。醫(yī)用幾丁糖近年來也被用于注射關(guān)節(jié)腔保護(hù)軟骨，醫(yī)用幾丁糖保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)理在于幾丁糖在理化性質(zhì)上與關(guān)節(jié)內(nèi)氨基多糖相似，具有黏彈性，緩吸收性。但是醫(yī)用幾丁糖熱穩(wěn)定性較差，注射液不能高溫滅菌，只能過濾滅菌，產(chǎn)品染菌風(fēng)險的概率較高。黃原膠（Xanthan）又稱漢生膠，是由野油菜黃單胞桿菌（Xanthomonascampestris）分泌的一種胞外酸性多糖，是國外20世紀(jì)50年代開始研究，60年代末開始應(yīng)用的一種功能性水溶膠。黃原膠因其優(yōu)良的理化性質(zhì)：分散液的高黏度、觸變性、穩(wěn)定性、安全性等被關(guān)注和研究，并在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、采油、涂料等諸多方面得到了廣泛的應(yīng)用。黃原膠的水溶液具有特殊的觸變性，因為黃原膠是一種典型的假塑性流體，在低剪切速率下具有高黏度，隨著剪切速率的增加黏度逐漸降低，停止剪切后，黏度會迅速恢復(fù)，黃原膠的該特點使其作用于活動的骨關(guān)節(jié)時，更有利于運(yùn)動滲透，起到很好的物理填充和潤滑作用，更好的保護(hù)軟骨組織；而且黃原膠對溫度不敏感，應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域時，可高溫滅菌，注射更加安全。然而，常規(guī)分子量的黃原膠（相對分子量為200萬~2000萬）十分穩(wěn)定，不易被體內(nèi)酶和自由基降解，難以由機(jī)體代謝排出。。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種含有相對分子質(zhì)量為10萬~199萬的低分子量黃原膠的藥物制劑，其可用于預(yù)防風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎，保護(hù)骨關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨以及修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨，且可通過降解等代謝途徑從體內(nèi)排出；本發(fā)明還提供了一種含低分子量黃原膠的藥物制劑的制備方法，方法快速簡單，雜質(zhì)含量低。一種關(guān)節(jié)腔注射用含低分子量黃原膠的藥物制劑，其特征在于，含有低分子量黃原膠，其相對分子質(zhì)量為10萬~199萬，其在制劑中的含量為0.1%~5%（w/v），制劑的滲透壓為200~400mOsmol/L，制劑的pH值為5.5~9。上述藥物制劑采用以下制備方法獲得：將相對分子量為300萬的原料黃原膠水溶液，原料黃原膠濃度為1%~10%，調(diào)節(jié)pH至5~10，加入高壓反應(yīng)釜，在溫度為50~150℃，壓力為0.2~2.0MPa條件下攪拌，產(chǎn)物使用無水乙醇沉淀，洗滌干燥后得到相對分子量為10萬~199萬的黃原膠，上述黃原膠與其他成分混合均勻制成制劑。作為優(yōu)選，上述藥物制劑中低分子量黃原膠的相對分子量為100萬~150萬，在制劑中的含量為0.5%~5%（w/v），更優(yōu)選為1%~3%（w/v），制劑的pH值為7~8。上述藥物制劑的劑型為可用于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的任何劑型，優(yōu)選液體制劑或凝膠制劑，注射劑量為1~3mL，優(yōu)選2mL。上述藥物制劑用于改善和治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、滑膜炎和軟骨損傷。上述藥物制劑，所述其他成分選自刺槐豆膠、結(jié)冷膠、卡拉膠、瓊脂糖、果膠、阿拉伯樹膠、溶劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、增黏劑和防腐劑中的至少一種。上述成分與相對分子量為10萬~199萬的低分子量黃原膠通過直接混合或其他常規(guī)方式混合均勻成為制劑，或在使用前將各組方現(xiàn)場伍配。一種關(guān)節(jié)腔注射用含低分子量黃原膠的藥物制劑的制備方法，包括以下步驟：（1）將0.1%~1%相對分子量為300萬的原料黃原膠水溶液，調(diào)節(jié)pH至5~10；（2）上述水溶液加入高壓反應(yīng)釜，在溫度為50~150℃，壓力為0.2~2.0MPa條件下攪拌進(jìn)行反應(yīng)，得產(chǎn)物；（3）上述產(chǎn)物使用無水乙醇沉淀，洗滌干燥后得到相對分子量為10萬~199萬的黃原膠；（4）將上述相對分子量為10萬~199萬的黃原膠與其他成分混合均勻制成藥物制劑。上述的制備方法中反應(yīng)時間為5~30min，攪拌速度為50~200轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)釜填充氣體為氮氣。上述制備方法中原料黃原膠水溶液中氯化鈉濃度為1%~5%，EDTA鈉鹽加入量為50~500mg/L，以鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。上述的制備方法中無水乙醇的用量為產(chǎn)物體積的3~7倍。本發(fā)明中10萬~199萬的低分子量黃原膠制劑的制備方法快速簡單，條件控制簡單，不添加強(qiáng)酸強(qiáng)堿及催化劑，產(chǎn)品雜質(zhì)少，通過高溫滅菌即可作注射用的含黃原膠的藥物制劑中原料。含10萬~199萬的低分子量黃原膠的藥物制劑，不但具有緩沖、潤滑、保護(hù)軟骨等物理方面的作用，而且具有生物活性，可通過調(diào)控Capsase-3，Bax和Bcl-2介導(dǎo)線粒體凋亡信號通路以抑制軟骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而治療和緩解關(guān)節(jié)炎，可用于改善和治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、滑膜炎和/或軟骨損傷。含10萬~199萬分子量的黃原膠制劑在關(guān)節(jié)腔作用時間與相對分子質(zhì)量為200萬~2000萬的黃原膠制劑相比差異不顯著，作用時間長；但與200萬~2000萬分子量的黃原膠制劑不同的是，10萬~199萬分子量的黃原膠制劑最終可通過降解等代謝途徑從體內(nèi)排出，因此，其安全性優(yōu)于200萬~2000萬分子量的黃原膠制劑。具體實施方式實施例1低分子量黃原膠的制備方法取10g分子量為300萬的黃原膠溶于1000ml注射用水中，加氯化鈉50g、EDTA鈉50mg，調(diào)節(jié)pH5，以50轉(zhuǎn)/min速度攪拌至充分溶解。將溶液置于高壓反應(yīng)釜中，反應(yīng)壓力0.4MPa，反應(yīng)溫度75℃，反應(yīng)時間為15min，以3000ml無水乙醇沉淀樣品，洗滌干燥得到黃原膠樣品，經(jīng)多角度激光散射器檢測其Mw為150萬。實施例2低分子量黃原膠的制備方法取30g分子量為300萬的黃原膠溶于1000ml注射用水中，加氯化鈉30g、EDTA鈉100mg，調(diào)節(jié)pH7，以100轉(zhuǎn)/min速度攪拌至充分溶解。將溶液置于高壓反應(yīng)釜中，反應(yīng)壓力1MPa，反應(yīng)溫度100℃，反應(yīng)時間為10min，以5000ml無水乙醇沉淀樣品，洗滌干燥得到黃原膠樣品，經(jīng)多角度激光散射器檢測其Mw為100萬。實施例3低分子量黃原膠的制備方法取100g分子量為300萬的黃原膠溶于1000ml注射用水中，加氯化鈉10g、EDTA鈉200mg，調(diào)節(jié)pH10，以200轉(zhuǎn)/min速度攪拌至充分溶解。將溶液置于高壓反應(yīng)釜中，反應(yīng)壓力1.6MPa，反應(yīng)溫度135℃，反應(yīng)時間為25min，以7000ml無水乙醇沉淀樣品，洗滌干燥得到黃原膠樣品，經(jīng)多角度激光散射器檢測其Mw為20萬。實施例4含1%低分子量黃原膠的關(guān)節(jié)腔注射用凝膠制劑用注射用水將上述藥劑溶解直接混合得到凝膠制劑，注射用量為2ml。實施例5含0.5%低分子量黃原膠的關(guān)節(jié)腔注射用凝膠制劑用注射用水將上述藥劑溶解直接混合得到凝膠制劑，注射用量為3ml。實施例6含3%低分子量黃原膠的關(guān)節(jié)腔注射用凝膠制劑用注射用水將上述藥劑溶解直接混合得到凝膠制劑，注射用量為1ml。實施例7含2%低分子量黃原膠的關(guān)節(jié)腔注射用凝膠制劑用注射用水將上述藥劑溶解直接混合得到凝膠制劑，注射用量為1ml。實驗數(shù)據(jù)實驗一實施例4、實施例5對膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的療效研究取新西蘭大耳白兔496只隨機(jī)分為62組，每組8只：正常對照組1和正常對照組2、模型組1-生理鹽水組和模型組2-生理鹽水組、實驗組-黃原膠治療組（1~56）、陽性對照組1-醋酸潑尼松龍組和陽性對照組2-醋酸潑尼松龍組。通過前交叉韌帶切斷術(shù)切斷左膝韌帶建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型，造模成功后，黃原膠治療組關(guān)節(jié)腔分別注射1.0%黃原膠制劑1周1次（分子量依次為：1000萬~1500萬；350萬~500萬；190萬~199萬；180萬~190萬；170萬~180萬；160萬~170萬；150萬~160萬；140萬~150萬；130萬~140萬；120萬~130萬；110萬~120萬；100萬~110萬；50萬~100萬；10萬~50萬）并編號為1~14；0.5%黃原膠制劑1周1次（分子量如上所述），并編號為15~28；1.0%黃原膠制劑2周1次（分子量如上所述），并編號為29~42；0.5%黃原膠制劑2周1次（分子量如上所述）并編號為43~56；以上各實驗組均連續(xù)處理8周。正常對照組、模型組關(guān)節(jié)腔分別注射生理鹽水（1周1次，連續(xù)8周）并記為正常對照1和模型組1，分別注射生理鹽水（2周1次，連續(xù)8周）并記為正常對照2和模型組2；陽性對照組關(guān)節(jié)腔注射市售2.5％醋酸潑尼松龍（1周1次，連續(xù)8周）并記為陽性對照組1，注射市售2.5％醋酸潑尼松龍（2周1次，連續(xù)8周）并記為陽性對照組2；治療結(jié)束后處死動物，進(jìn)行病理學(xué)觀察，根據(jù)Mankin骨關(guān)節(jié)組織學(xué)分類方法，對軟骨評分，記錄病理積分，結(jié)果見表1兔膝骨關(guān)節(jié)炎病理積分表。同時獲取膝關(guān)節(jié)軟骨置于-80℃保存，用于蛋白檢測。表1膝骨關(guān)節(jié)炎病理積分表由上表可知，實驗組（1~28）和陽性對照組均可顯著改善兔膝骨關(guān)節(jié)炎。在1周1次和2周1次給藥頻率中，1.0%黃原膠治療組（實驗組1~28）的治療效果優(yōu)于0.5%黃原膠治療組（實驗組29~56）。在1.0%黃原膠治療組和0.5%黃原膠治療組中，隨著黃原膠分子量的降低，其治療效果無顯著差異。以上結(jié)果說明本發(fā)明實施例中的10~199萬黃原膠對骨關(guān)節(jié)炎的治療效果與350~500萬和1000~1500萬的黃原膠相比，在1.0%、0.5%以及1周1次、2周1次給藥的條件下，其治療效果無統(tǒng)計學(xué)差異。實驗二實施例4、實施例5對關(guān)節(jié)軟骨中casapase-3，bax和bcl-2蛋白的影響取實驗一中1周1次治療周期下凍存的關(guān)節(jié)軟骨，常溫放置解凍并加入含1%PMSF的RIPA裂解液1ml。將組織用超聲波儀破碎30s（冰上操作），冰上放置30min，4℃12000r/min離心20min，提取上清液。然后用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，進(jìn)行灌膠上樣SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)所需適時終止電泳。采用半干法轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，按照對應(yīng)分子量切割后分別置于1:400稀釋的caspase-3，bax和bcl-2等一抗溶液中，4℃雜交過夜，第2d用洗膜液漂洗后加入1:1000稀釋的二抗，搖床上雜交1h，取出用洗膜液沖洗，加ECL顯色劑顯色，檢測，所得蛋白相對表達(dá)水平結(jié)果見表2。表2caspase-3相對蛋白表達(dá)水平Cascpase-3，bax和bcl-2在線粒體信號通路中起著重要的作用。caspase-3和bax是一種加速軟骨降解的蛋白，而bcl-2是抑制軟骨降解的蛋白。由上表可知正常對照組中caspase-3和bax表達(dá)較低而bcl-2表達(dá)較高，模型組中caspase-3和bax表達(dá)較高而bcl-2表達(dá)較低。1.0%黃原膠治療組（實驗組1~14）可降低caspase-3、bax的表達(dá)并提高bcl-2的表達(dá)，且優(yōu)于0.5%黃原膠治療組（實驗組15~28）。且隨著分子量的降低，caspase-3和bax的表達(dá)降低越明顯，bcl-2表達(dá)增高越明顯。以上實驗數(shù)據(jù)說明本發(fā)明所含10萬~199萬的黃原膠除具有保護(hù)關(guān)節(jié)炎中軟骨的作用外，在調(diào)控casapase-3、bax和bcl-2蛋白的活性效果優(yōu)于350萬~500萬和1000萬~1500萬黃原膠。實驗三實施例4對牛關(guān)節(jié)軟骨潤滑效果的影響制備含有不同分子量1%黃原膠關(guān)節(jié)腔注射劑（分子量依次為：1000萬~1500萬；350萬~500萬；190萬~199萬；180萬~190萬；170萬~180萬；160萬~170萬；150萬~160萬；140萬~150萬；130萬~140萬；120萬~130萬；110萬~120萬；100萬~110萬；50萬~100萬；10萬~50萬）并編號為實驗組1~14。實驗分成5組：干摩擦組-無潤滑劑、陰性對照組-生理鹽水組、陽性對照組-玻璃酸鈉組和實驗組-黃原膠（1~14）。采用特殊牛骨鋼刀剝離牛關(guān)節(jié)軟骨，制成厚度均勻（1.89mm）的軟骨塊，于往復(fù)摩擦試驗機(jī)檢測在各組黃原膠潤滑下的摩擦學(xué)指標(biāo)。試驗機(jī)設(shè)置參數(shù)：試驗力為3N、往復(fù)頻率為1Hz。表3黃原膠對牛關(guān)節(jié)軟骨摩擦系數(shù)的影響組號摩擦系數(shù)（μ）實驗組10.105±0.05實驗組20.102±0.08實驗組30.076±0.09實驗組40.073±0.008實驗組50.071±0.009實驗組60.068±0.008實驗組70.065±0.005實驗組80.063±0.005實驗組90.061±0.008實驗組100.059±0.009實驗組110.058±0.006實驗組120.056±0.001實驗組130.055±0.009實驗組140.051±0.008干摩擦組0.389±0.03陰性對照組0.141±0.07陽性對照組0.109±0.05實驗數(shù)據(jù)表明，在往復(fù)摩擦試驗機(jī)上，牛膝關(guān)節(jié)軟骨在沒有潤滑劑作用下的摩擦系數(shù)高達(dá)0.389（干摩擦組）。在生理鹽水的潤滑下，摩擦系數(shù)顯著降低（陰性對照組）。隨著黃原膠分子量的降低，摩擦系數(shù)逐漸下降，且優(yōu)于玻璃酸鈉（陽性對照組）。以上結(jié)果表明，本發(fā)明制劑所含100萬~199萬黃原膠的潤滑效果優(yōu)于350萬-500萬和1000萬-1500萬黃原膠。實驗四實施例4在大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)的殘留實驗將健康Wistar大鼠162只隨機(jī)分成3組，每組54只：實驗組1-黃原膠1000萬~1500萬組、實驗組2-黃原膠350萬-500萬組、實驗組3-黃原膠100萬~150萬組。實驗動物用乙醚麻醉后，分別于右側(cè)關(guān)節(jié)腔注射1000萬~1500萬、350萬~500萬、100萬~150萬分子量的14C-黃原膠注射液（各50μL）。給藥前后正常飲水飲食。各實驗動物組，分別于給藥后0h、8h、16h、24h、48h、96h、168h、15d、30d，各時間點隨機(jī)處死6只動物。將大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)整體取下，剖開關(guān)節(jié)腔，用15mL生理鹽水沖洗，收集洗液，補(bǔ)水至20mL。取此沖洗液50μL置入閃爍瓶中，加2mL液閃試劑，用旋渦混合器充分混勻，置于液體閃爍計數(shù)儀上測定，記錄放射性強(qiáng)度。根據(jù)放射性強(qiáng)度及14C-黃原膠樣品的比活度，計算給藥后關(guān)節(jié)腔內(nèi)14C-黃原膠的殘留量。記錄見表4關(guān)節(jié)腔內(nèi)14C-黃原膠殘留量及殘留比例。表4關(guān)節(jié)腔內(nèi)14C-黃原膠殘留量及殘留比例由上表可知，大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射14C-黃原膠后，0~96h藥物消除較快，至96h，關(guān)節(jié)腔內(nèi)高、中、低分子量黃原膠殘余藥量分別為43.05%±2.14%、36.82%±6.49%、34.34%±3.37%。之后，藥物消除緩慢，至給藥后30d，高、中、低分子量黃原膠殘余藥量分別為25.07%±2.09%、27.57%±2.62%、27.99%±3.86%。試驗結(jié)果表明在30d內(nèi)，本發(fā)明制劑所含100~150萬黃原膠在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的殘留量與1000萬~1500萬、350萬~500萬無統(tǒng)計學(xué)差異。實驗五實施例4在大鼠體內(nèi)的吸收實驗制備含有不同分子量14C標(biāo)記的1.0%黃原膠注射劑（分子量依次為：1000萬~1500萬；350萬~500萬；190萬~199萬；180萬~190萬；170萬~180萬；160萬~170萬；150萬~160萬；140萬~150萬；130萬~140萬；120萬~130萬；110萬~120萬；100萬~110萬；50萬~100萬；10萬~50萬）并編號為1~14。將健康Wistar大鼠112只，隨機(jī)分為14組，每組8只，關(guān)節(jié)腔分別注射已配置好的黃原膠注射劑（各50μL）并編號為實驗組1~28。于注射后720h后經(jīng)頸靜脈取血100μL，置肝素化試管中，3000r/min離心10min，分離血漿待測。取待測血漿50μL，置閃爍管中，加入2mL液閃試劑，用旋渦混合器充分混勻。置于液體閃爍計數(shù)儀上測定，記錄放射性強(qiáng)度，根據(jù)14C-黃原膠的比活度計算血漿中的藥物濃度。記錄見表5關(guān)節(jié)腔注射黃原膠后血漿藥物濃度。表5關(guān)節(jié)腔注射黃原膠后血漿藥物濃度組號血漿中藥物濃度(μg/mL)實驗組10.40±0.06實驗組21.05±0.09實驗組36.87±0.04實驗組46.57±0.16實驗組57.00±0.12實驗組67.42±0.09實驗組77.52±0.13實驗組87.65±0.08實驗組97.85±0.05實驗組109.73±0.08實驗組119.75±0.04實驗組129.81±0.09實驗組1310.44±0.07實驗組1411.25±0.12大鼠關(guān)節(jié)腔注射或腹腔注射14C-黃原膠后，在720h時，1000萬~1500和350萬~500萬黃原膠（實驗組1、2）都檢出較低，表明該分子量黃原膠代謝緩慢，720h時仍大量存在于體內(nèi)，安全性較低。而分子量為10萬~199萬的黃原膠（實驗組3~14）在血液中的檢出值隨分子量的降低而增加，表明本發(fā)明制劑中10萬~199萬分子量的黃原膠可通過降解等途徑代謝并排出體外，相對于分子量1000萬-1500萬和350萬-500萬的黃原膠安全性更高。當(dāng)前第1頁1 2 3