本申請為國際申請pct/ib2010/001968于2012年1月9日進(jìn)入中國國家階段、申請?zhí)枮?01080030890.0、發(fā)明名稱為“用于細(xì)胞治療的方法和組合物”的分案申請。
本發(fā)明涉及用于提供細(xì)胞治療的方法、及其治療應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高等脊椎動物中的免疫系統(tǒng)代表了抵抗能夠進(jìn)入脊椎動物身體的各種抗原、包括作為各種疾病的病原體的微生物例如細(xì)菌、真菌和病毒在內(nèi)的第一道防線。此外，免疫系統(tǒng)還參與各種其他疾病或障礙，包括自身免疫或免疫病理疾病、免疫缺陷綜合征、動脈粥樣硬化和各種腫瘤疾病。盡管存在可用于治療這些疾病的方法，但許多現(xiàn)有療法不能提供足夠的結(jié)果。在新出現(xiàn)的治療策略中，基于細(xì)胞治療的策略似乎構(gòu)成了用于治療大量疾病的潛在有用的工具。因此，為了實現(xiàn)所述目的，研究人員目前正在進(jìn)行大量努力，
自身免疫疾病
當(dāng)為身體抵御細(xì)菌、病毒和任何其他外來產(chǎn)物的身體的免疫系統(tǒng)機能障礙并產(chǎn)生針對健康組織、細(xì)胞和器官的病理性應(yīng)答時，引起自身免疫疾病?？贵w、t細(xì)胞和巨噬細(xì)胞提供有益保護(hù)作用，但是也能產(chǎn)生有害或致死的免疫應(yīng)答。
自身免疫疾病可以是器官特異性或系統(tǒng)性的，并由不同的致病機制引起。器官特異性自身免疫的特征為主要組織相容性復(fù)合物(mhc)抗原的異常表達(dá)、抗原模擬和mhc基因中的等位基因變異。系統(tǒng)性自身免疫疾病涉及多克隆b細(xì)胞的活化和免疫調(diào)節(jié)t細(xì)胞、t細(xì)胞受體和mhc基因的異常。器官特異性自身免疫疾病的實例是糖尿病、甲狀腺機能亢進(jìn)、自身免疫性腎上腺功能不全、純紅細(xì)胞性貧血、多發(fā)性硬化癥和風(fēng)濕性心臟炎。代表性的系統(tǒng)性自身免疫疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性炎癥、舍格倫綜合征、多肌炎、皮肌炎和硬皮病。
目前的自身免疫疾病治療包括給藥免疫抑制劑例如可的松、阿司匹林衍生物、羥氯喹、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤和環(huán)磷酰胺或其組合。然而，當(dāng)給藥免疫抑制劑時所面對的困境是，自身免疫疾病的治療越有效，患者剩余的對感染攻擊的抵御力越低，并且對發(fā)生腫瘤的易感性也更高。因此，對用于治療自身免疫疾病的新療法存在著極大需求。
炎性障礙
炎癥是身體的白細(xì)胞和分泌的因子保護(hù)我們的身體以對抗外來物質(zhì)例如細(xì)菌和病毒的感染的過程。分泌的被稱為細(xì)胞因子和前列腺素的因子控制這一過程，并以有序和自限的級聯(lián)方式釋放到血液或受影響組織中。
炎性腸病(ibd)
ibd是一類慢性、特發(fā)性、復(fù)發(fā)性和組織破壞性疾病，其特征為黏膜t細(xì)胞機能障礙、細(xì)胞因子生產(chǎn)改變和細(xì)胞炎性，最終引起遠(yuǎn)端小腸和結(jié)腸黏膜的損傷。ibd在臨床上細(xì)分成兩種表型：克隆病(cd)和潰瘍性結(jié)腸炎。cd是發(fā)病率為0.05％、目前不可治愈的自身免疫疾病，其導(dǎo)致慢性炎癥，引起各種胃腸和腸外癥狀，包括腹痛、直腸出血、腹瀉、體重減輕、皮膚和眼的障礙以及兒童生長和性成熟延遲。這些癥狀可以極大影響患者的健康、生活質(zhì)量和功能能力。因為cd是慢性病，并且典型在30歲以前發(fā)作，因此患者一般需要終生治療。盡管它的病因仍然未知，但存在間接證據(jù)將cd與黏膜免疫系統(tǒng)不能減弱針對內(nèi)源抗原的免疫應(yīng)答相聯(lián)系。
目前用于cd的治療藥劑包括氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、抗生素和氨甲蝶呤，不是完全有效的，是非特異性的并具有多種不利副作用。在大多數(shù)病例中，外科切除是最終可選方案。因此，目前的治療策略是發(fā)現(xiàn)特異性調(diào)節(jié)疾病的兩種要素、即炎性和t-細(xì)胞驅(qū)動的應(yīng)答的藥物或藥劑。
最近，藥物英利昔單抗已被批準(zhǔn)用于對標(biāo)準(zhǔn)療法無響應(yīng)的中度到重度克隆病的治療以及開放引流瘺管的治療。英利昔單抗，第一種獲批的特異性用于克隆病的治療，是一種抗腫瘤壞死因子(tnf)抗體。tnf是由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的、可以引起與克隆病相關(guān)的炎癥的蛋白?？箃nf抗體在tnf達(dá)到腸之前將其從血流中移除，從而阻止炎癥。然而，因為它具有系統(tǒng)性效應(yīng)，并且tnf是非常多效的因子，因此嚴(yán)重副作用相對常見，并且其長期安全性仍有待確定。此外，因為在患者中發(fā)生的許多炎性過程不依賴于tnf信號傳導(dǎo)，因此效能也是有限的。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是炎性關(guān)節(jié)炎類型。關(guān)節(jié)炎是描述關(guān)節(jié)中的炎癥的通用術(shù)語。一些、但不是所有關(guān)節(jié)炎類型是炎性誤導(dǎo)的結(jié)果。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎影響世界人口的約1％。并且實質(zhì)上是致殘的。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫障礙，其中身體的免疫系統(tǒng)將關(guān)節(jié)中分泌潤滑液的滑膜不合適地識別為外來物。炎癥發(fā)生，并且關(guān)節(jié)內(nèi)和附近的軟骨和組織受到損傷或破壞。身體用瘢痕組織替換受損組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)的正常空間變窄，骨骼融合在一起。
在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，存在著持久性抗原呈遞、t-細(xì)胞刺激、細(xì)胞因子分泌、滑膜細(xì)胞活化和關(guān)節(jié)破壞的自身免疫循環(huán)。
目前的關(guān)節(jié)炎療法集中于使用抗炎或免疫抑制藥物減輕關(guān)節(jié)的炎癥。任何關(guān)節(jié)炎的第一線治療通常是消炎藥，例如阿司匹林、布洛芬和cox-2抑制劑例如塞來昔布和羅非昔布?？箃nf人源化單克隆抗體例如英利昔單抗也可以使用，但是它具有許多次級效應(yīng)或副作用，并且其效能相當(dāng)?shù)??！暗诙€藥物”包括金、氨甲蝶呤和甾族化合物。盡管這些是沿用已久的關(guān)節(jié)炎療法，但極少有患者在單獨進(jìn)行這些治療后復(fù)原，對于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者來說，仍然存在著治療困難的問題。
總的來說，目前用于慢性炎性障礙的治療方法具有非常有限的效率，并且它們中的許多具有副反應(yīng)的高發(fā)生率或不能完全阻止疾病進(jìn)展。到目前為止，沒有一種療法是理想的，并且這些類型的疾病無法治愈。因此，對用于治療炎性障礙的新療法存在極大需求。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了用于對需要的患者進(jìn)行細(xì)胞治療的改進(jìn)方法。本發(fā)明的其他方面提供了在淋巴內(nèi)遞送的細(xì)胞治療中使用的試劑盒和組合物。
一方面，描述了在具有受損組織和/或具有與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀的對象中，用于治療或修復(fù)受損組織、和/或用于治療、減輕、預(yù)防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，所述方法包含向所述對象的淋巴系統(tǒng)給藥預(yù)防或治療有效量的包含干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在個體中預(yù)防、治療或改善免疫和/或炎性疾病的方法，所述方法包含將細(xì)胞治療直接遞送到淋巴器官。在本發(fā)明的一個實施方案中，細(xì)胞治療與抗原組合遞送。
另一方面，描述了干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞，其使用在下述方法中：
i.治療或修復(fù)受損組織；和/或
ii.治療、減輕、改善和/或預(yù)防與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀；
其中細(xì)胞被給予到淋巴系統(tǒng)。
另一方面，描述了試劑盒，所述試劑盒包含i)包含干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞群體的藥物，以及ii)用于所描述的在需要治療的對象中治療或修復(fù)受損組織和/或用于治療、減輕、預(yù)防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀的方法的使用說明書，所述方法包含向所述對象的淋巴系統(tǒng)給藥預(yù)防或治療有效量的包含干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的組合物。
另一方面，描述了干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞在制造藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療或修復(fù)受損組織和/或用于治療、減輕、預(yù)防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀，所述應(yīng)用包含將干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞給予到淋巴系統(tǒng)中。
另一方面涉及用于給予到淋巴系統(tǒng)的干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。另一方面涉及所述細(xì)胞在治療中的應(yīng)用。
另一方面涉及用于給予到淋巴系統(tǒng)的組合物，其包含干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞以及抗原。
從公開內(nèi)容和權(quán)利要求書，其他方面、特點和優(yōu)點將更充分地顯現(xiàn)。
定義
為了便于理解本說明書，下面將解釋一些術(shù)語和表述在本發(fā)明的情形中的意義。如果需要，其他定義將包含在整個說明書中。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“適用于淋巴內(nèi)注射”或“適用于淋巴結(jié)內(nèi)注射”或“適用于直接注射到腋窩淋巴節(jié)和/或腹股溝淋巴節(jié)中”，是指適用于淋巴內(nèi)或淋巴結(jié)內(nèi)注射的細(xì)胞治療，優(yōu)選包含免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、更優(yōu)選包含干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞以及包含它們的藥物和藥物組合物，具有對于將其作為醫(yī)學(xué)治療注射到個體、特別是人類、更優(yōu)選為人類患者的淋巴組織中，在需要所述治療的對象中用于治療或修復(fù)受損組織(優(yōu)選為間充質(zhì)組織)和/或用于治療、減輕、預(yù)防和/或改善炎性和/或免疫障礙的一種或多種癥狀來說必需或有益的物理、化學(xué)、生物或其他特征。此外，根據(jù)本發(fā)明，“適用于淋巴內(nèi)注射”或“適用于淋巴結(jié)內(nèi)注射”的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞以及包含它們的藥物和藥物組合物，其包含的組合物所有組成成分的濃度允許在適合的體積中將適量的所有組成成分施加到淋巴組織中，所述體積優(yōu)選為最多0.01ml、優(yōu)選最多0.05ml、優(yōu)選最多0.1ml、優(yōu)選最多0.2ml、優(yōu)選最多0.3ml、優(yōu)選最多0.4ml、優(yōu)選最多0.6ml、優(yōu)選最多0.8ml、優(yōu)選最多1.0ml、優(yōu)選最多2ml的體積。此外，“適用于淋巴內(nèi)或淋巴結(jié)內(nèi)注射”的組合物應(yīng)該不含或僅含有限量的如果以過大的量使用將可能損傷淋巴組織的潛在有害物質(zhì)，例如溶劑和佐劑。淋巴組織的損傷是指由于對細(xì)胞的毒性效應(yīng)、由于細(xì)胞的化學(xué)破壞引起的直接損傷，以及例如通過誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、壞死等而引起的對細(xì)胞的間接損傷。
此外，根據(jù)本發(fā)明，理想情況下“適用于淋巴內(nèi)或淋巴結(jié)內(nèi)注射”的組合物具有某些類型的安全機制，以防在注射錯過淋巴組織的情況下意外地、系統(tǒng)性地施用免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞以及包含它們的藥物和藥物組合物，以及在最糟情況下導(dǎo)致將免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞以及包含它們的藥物和藥物組合物直接注射到血液循環(huán)中。這樣的安全機制包括生物活性物質(zhì)的短的細(xì)胞外半衰期。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“注射”以其在本技術(shù)領(lǐng)域中的通常意義使用，是指通過刺穿身體的部分、通常為皮膚而將藥劑遞送至身體。該術(shù)語包括使用中空注射器和高壓噴射注射裝置。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“同種異體的”將取其來自于同一物種的不同個體的意義。當(dāng)在一個或多個基因座處的基因不一致時，兩個或更多個個體被稱為彼此是同種異體的。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“自體的”將取其來自于同一個體的意義。
術(shù)語“免疫疾病”是指對象中以由對象的免疫反應(yīng)所引起的細(xì)胞、組織和/或器官損傷為特征的病癥。術(shù)語“自身免疫疾病”是指對象中和以由對象對自身細(xì)胞、組織和/或器官的免疫反應(yīng)所引起的細(xì)胞、組織和/或器官損傷為特征的病癥?？梢允褂帽景l(fā)明的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞治療的自身免疫疾病的說明性的非限制性實例包括斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森病、腎上腺的自身免疫疾病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、自身免疫性血小板減少癥、貝切特病、大皰性類天皰瘡、心肌病、乳糜瀉-皮炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(cflds)、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、丘-斯綜合征、瘢痕性類天皰瘡、crest綜合征、冷血凝素病、盤狀紅斑狼瘡、原發(fā)性混合型冷球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、腎小球腎炎、突眼性甲狀腺腫、吉-巴綜合征、橋本病、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)、iga神經(jīng)病、幼年型關(guān)節(jié)炎、扁平苔癬、美尼爾氏病、混合型結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化癥、i型或免疫介導(dǎo)的糖尿病、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、多軟骨炎、多內(nèi)分泌腺綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、賴特綜合征、肉樣瘤病、硬皮病、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥、舍格倫綜合征、肺出血-腎炎綜合征、僵人綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、多發(fā)性大動脈炎、顳動脈炎/巨細(xì)胞動脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、眼色素層炎、血管炎例如皰疹樣皮炎、脈管炎、白癜風(fēng)、韋格納肉芽腫、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂綜合征、神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫疾病、家族性地中海熱、朗伯-伊頓肌無力綜合征、交感性眼炎、多內(nèi)分泌腺疾病、銀屑病等。
術(shù)語“免疫介導(dǎo)的炎性疾病”是指以慢性或急性炎癥為特征，由正常免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)異常引起、與其相關(guān)或由其觸發(fā)的任何疾病，例如克羅恩病、1型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、橋本病、移植物抗宿主疾病、舍格倫綜合征、惡性貧血、阿狄森病、硬皮病、肺出血-腎炎綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、自身免疫性溶血性貧血、不育癥、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、突眼性甲狀腺腫、血小板減少性紫癜、吉-巴綜合征、過敏癥、哮喘、特應(yīng)性疾病、動脈硬化、心肌炎、心肌病、腎小球性腎炎、再生不良性貧血和器官移植后的排斥。
“乳糜瀉”也稱為腹腔疾病、口炎性腹瀉、非熱帶脂肪瀉,地方性口炎性腹瀉、谷蛋白腸病或谷蛋白敏感性腸病和谷蛋白不耐受。
出于本文描述的發(fā)明的目的，“免疫障礙”包括自身免疫疾病和免疫介導(dǎo)的疾病。
術(shù)語“炎性疾病”是指對象中的以炎癥例如慢性炎癥為特征的病癥。炎性障礙的說明性的非限制性實例包括但不限于乳糜瀉、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、炎性腸病(ibd)、哮喘、腦炎、慢性阻塞性肺病(copd)、炎性骨質(zhì)溶解、過敏性障礙、膿毒性休克、肺纖維變性(例如特發(fā)性肺纖維變性)、炎性血管炎(例如結(jié)節(jié)性多動脈炎、韋格納肉芽腫、多發(fā)性大動脈炎、顳動脈炎和淋巴瘤樣肉芽腫)、創(chuàng)傷后血管成形術(shù)(例如血管成形術(shù)后再狹窄)、未分化脊柱關(guān)節(jié)病、未分化關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)炎、炎性骨質(zhì)溶解、慢性肝炎以及由慢性病毒或細(xì)菌感染引起的慢性炎癥。
術(shù)語“分離的”在用于細(xì)胞群體時是指從人類或動物身體分離的細(xì)胞群體，其基本上不含在體內(nèi)或體外與所述細(xì)胞群體相伴的一種或多種細(xì)胞群體。術(shù)語“mhc”(主要組織相容性復(fù)合物)是指編碼細(xì)胞表面抗原呈遞蛋白的基因亞類。在人類中，這些基因被稱為人類白細(xì)胞抗原(hla)基因。在本文中，縮寫mhc或hla可互換使用。術(shù)語“對象”是指動物，優(yōu)選為哺乳動物包括非靈長動物(例如奶牛、豬、馬、貓、狗、大鼠或小鼠)和靈長動物(例如猴或人)。在優(yōu)選實施方案中，對象是人。
術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)”是指抑制或降低免疫系統(tǒng)的一種或多種生物活性，其包括但不限于免疫應(yīng)答和炎性狀態(tài)的下調(diào)一級細(xì)胞因子分布情況、細(xì)胞毒性活性和抗體生產(chǎn)的變化。術(shù)語“抗原特異性免疫調(diào)節(jié)”是指抑制或降低免疫系統(tǒng)的與特定抗原、包括同種異體抗原和自體抗原兩者相關(guān)的一種或多種生物活性。術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)”將包含“抗原特異性免疫調(diào)節(jié)”。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“陰性”或“－”當(dāng)用于細(xì)胞表面標(biāo)記物時，是指在細(xì)胞群體中，少于20％、10％、優(yōu)選少于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的細(xì)胞或沒有細(xì)胞表達(dá)所述標(biāo)志物。細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)可以例如使用常規(guī)方法和裝置(例如beckmancoulterepicsxlfacs系統(tǒng)，并使用可商購抗體和本技術(shù)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)流程)，通過用于特定細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)來確定。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“淋巴系統(tǒng)”具有其在本技術(shù)領(lǐng)域中通常的意義，是指通過淋巴管和淋巴毛細(xì)管的輸導(dǎo)系統(tǒng)相連的淋巴組織。術(shù)語“淋巴器官”是指淋巴節(jié)，更優(yōu)選為腋窩淋巴節(jié)或腹股溝淋巴節(jié)，或者對于缺少淋巴結(jié)或淋巴結(jié)具有缺陷的個體來說，是指淋巴組織或免疫細(xì)胞。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“間充質(zhì)干細(xì)胞”(在本文中也稱為“msc”)是指最初源于間充質(zhì)的能夠產(chǎn)生多種不同細(xì)胞類型的細(xì)胞。該術(shù)語是指能夠分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或肌細(xì)胞中的至少一種的細(xì)胞。msc可以從任何類型的組織分離。一般來說，msc將從骨髓、脂肪組織、臍帶或外周血分離。在某些實施方案中，在本發(fā)明中使用的msc可以從骨髓(bm-msc)或脂肪組織(asc)分離。在本發(fā)明的優(yōu)選情況下，msc從脂肪吸取物分離，所述脂肪吸取物本身從脂肪組織獲得。
當(dāng)在本文中使用時，表述“顯著表達(dá)”或其等價術(shù)語“陽性”和“+”當(dāng)用于細(xì)胞表面標(biāo)志物時，是指在細(xì)胞群體中，超過20％、優(yōu)選超過30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或甚至所有的細(xì)胞表達(dá)所述標(biāo)志物。
細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)可以例如使用常規(guī)方法和裝置(例如beckmancoulterepicsxlfacs系統(tǒng)，并使用可商購抗體和本技術(shù)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)流程)，通過用于特定細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)來確定，例如使用常規(guī)方法和裝置(例如beckmancoulterepicsxlfacs系統(tǒng)，并使用可商購抗體和本技術(shù)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)流程)，在流式細(xì)胞術(shù)中檢測對于特定細(xì)胞表面受體來說顯示出高于背景信號的信號。背景信號被定義為在常規(guī)facs分析中將同一同種型的非特異性抗體作為用來檢測每種表面標(biāo)志物的特異性抗體時給出的信號強度。對于被認(rèn)為是陽性的標(biāo)志物來說，在使用常規(guī)方法和裝置(例如beckmancoulterepicsxlfacs系統(tǒng)，并使用可商購抗體和本技術(shù)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)流程)時觀察到的特異性信號比背景信號強度強20％以上、優(yōu)選強30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、500％、1000％、5000％、10000％或更高。
此外，可以使用可商購的和已知的針對所述細(xì)胞表面受體(例如細(xì)胞受體和跨膜蛋白)的單克隆抗體來鑒定相關(guān)細(xì)胞。
術(shù)語“結(jié)締組織”是指源于間充質(zhì)的組織，并包括幾種組織，其特征在于它們的細(xì)胞包含在細(xì)胞外基質(zhì)中。結(jié)締組織的實例包括但不限于脂肪和軟骨組織。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“成纖維細(xì)胞”將包括成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞。
術(shù)語“t-細(xì)胞”是指作為免疫系統(tǒng)的表達(dá)t細(xì)胞受體(tcr)的淋巴細(xì)胞亞類的細(xì)胞。術(shù)語“調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞”(在本文中也稱為t-reg細(xì)胞)是指積極抑制免疫系統(tǒng)的活化并阻止病理性自體反應(yīng)性即自身免疫疾病的t細(xì)胞亞類。術(shù)語“調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞”或“t-reg細(xì)胞”將包括天然存在的t-細(xì)胞(foxp3+t-reg細(xì)胞)和不表達(dá)foxp3分子的適應(yīng)性t-細(xì)胞(也稱為tr1細(xì)胞或th3細(xì)胞)兩者。
術(shù)語“谷蛋白”是指在組分中包含麥醇溶蛋白和谷蛋白的蛋白質(zhì)。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“治療”當(dāng)直接用于指稱患者或?qū)ο髸r，是指與障礙相關(guān)的一種或多種癥狀的改善，所述障礙包括但不限于炎性障礙、自身免疫疾病或免疫介導(dǎo)的疾病包括被移植器官和組織的排斥，其中所述改善由向需要所述治療的對象給藥本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或包含它們的藥物組合物來獲得。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“修復(fù)”當(dāng)直接用于指稱受損組織時，是指通過直接機制例如受損組織的再生以及通過間接機制例如降低炎癥從而使組織形成這兩種機制改善所述損傷。
術(shù)語“組合治療”是指以本發(fā)明的方式將本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或包含它們的藥物組合物與其他活性藥劑或治療方式一起使用，用于改善與障礙相關(guān)的一種或多種癥狀，所述障礙包括但不限于炎性障礙、自身免疫疾病或免疫介導(dǎo)的疾病包括被移植器官和組織的排斥。這些其他藥劑或治療可以包括用于治療所述障礙的已知藥物和療法，例如但不限于皮質(zhì)類固醇和非甾體抗炎化合物。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或包含它們的藥物組合物，也可以與可用于治療炎癥的其他治療方案例如皮質(zhì)類固醇、非甾體抗炎化合物或其他藥劑相組合。本發(fā)明的藥劑與這些其他療法或治療方案的組合使用可以是同時的，或相繼提供，也就是說，這兩種治療可以分開，使得所述免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或包含它們的藥物組合物可以在其他療法或治療方案之前或之后給藥。主治醫(yī)師可以決定與其他藥劑、療法或治療方案相組合的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或包含它們的藥物組合物給藥的適合順序。
附圖說明
圖1說明了在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中給藥擴增的脂肪源干細(xì)胞降低了關(guān)節(jié)炎得分，并且淋巴內(nèi)給藥在治療上比靜脈內(nèi)途徑更有效。a組：未治療的對照；c組：在連續(xù)5日中iv給藥一百萬個asc；d組：在第1日給藥三百萬個asc并在第3和5日給藥一百萬個asc；e組：在第1和7日淋巴內(nèi)給藥320,000個asc；f組：在第1和7日淋巴內(nèi)給藥介質(zhì)。
發(fā)明詳述
一方面，本發(fā)明提供了用于在需要治療的對象中治療或修復(fù)受損組織(優(yōu)選為間充質(zhì)組織)和/或治療、減輕、預(yù)防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，所述方法包含向所述對象的淋巴系統(tǒng)給藥預(yù)防或治療有效量的包含細(xì)胞治療的組合物。因此，另一方面，本發(fā)明提供了優(yōu)選包含免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、最優(yōu)選包含干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的細(xì)胞治療，其用于治療或修復(fù)受損組織(優(yōu)選為間充質(zhì)組織)和/或用于治療、減輕、預(yù)防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀，其中細(xì)胞治療被給予到淋巴系統(tǒng)。淋巴內(nèi)給藥優(yōu)選通過淋巴內(nèi)注射來執(zhí)行。細(xì)胞治療適用于淋巴內(nèi)給藥、優(yōu)選為淋巴內(nèi)注射。
將干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞直接給予到淋巴系統(tǒng)中，與現(xiàn)有技術(shù)、即所述干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的常規(guī)皮下注射相比具有幾個優(yōu)點，例如較少量的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞就已足夠，所述治療對于患者來說不比常規(guī)皮下注射更痛苦，以及存在較少的不利副作用。此外，通過直接施用到淋巴組織，例如通過淋巴結(jié)內(nèi)注射，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞被遞送至與受損組織的治療或修復(fù)位點更近的地方。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞以及包含它們的藥物和藥物組合物可以在淋巴內(nèi)給藥的同時，通過常規(guī)途徑例如皮下給藥或舌下給藥、經(jīng)口、透皮(表面疫苗接種)、真皮內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、鼻內(nèi)、結(jié)膜、支氣管內(nèi)、透過真皮、直腸內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、肺內(nèi)、陰道、直腸或眼內(nèi)給藥。
優(yōu)選情況下，本發(fā)明的細(xì)胞治療包含干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞。特別優(yōu)選情況下，所述干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞(在后文中也稱為msc)，最優(yōu)選為脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(在后文中也稱為asc)，其是源于脂肪組織、一般為人類脂肪組織的msc(hasc)。
在本發(fā)明中使用的成纖維細(xì)胞是間充質(zhì)來源的結(jié)締組織，其與細(xì)胞外基質(zhì)的合成和維持相關(guān)，并將包括成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞。成纖維細(xì)胞可以從任何適合的動物、最優(yōu)選為人類獲得。
在本發(fā)明中使用的調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞(有時被稱為抑制性t-細(xì)胞)可以源于任何適合來源，例如血液或脾臟。調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞可以是天然存在的cd4+foxp3+細(xì)胞，或者它們可以是離體分離和/或擴增的調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞。用于調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞的離體擴增的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，包括從全血分離(例如作為pbmc級份的一部分)然后使用例如間充質(zhì)干細(xì)胞或雷帕霉素進(jìn)行擴增。
在本發(fā)明的方法中使用的msc優(yōu)選源于結(jié)締組織。在優(yōu)選實施方案中，所述msc源于脂肪組織，在另一個優(yōu)選實施方案中，源于脂肪組織的基質(zhì)部分。在可選實施方案中，所述msc從透明軟骨的軟骨細(xì)胞獲得。在另一個實施方案中，所述msc從皮膚獲得。在另一個實施方案中，所述msc從骨髓獲得。
msc可以從來自任何適合動物、最優(yōu)選為人類的任何適合的結(jié)締組織來源獲得。優(yōu)選情況下，所述細(xì)胞從無病原體哺乳動物來源、優(yōu)選為出生后(例如嚙齒動物或靈長動物)來源獲得。在優(yōu)選實施方案中，msc從結(jié)締組織來源獲得，例如但不限于脂肪組織的基質(zhì)部分、透明軟骨、骨髓或皮膚。最優(yōu)選情況下，本發(fā)明方法的msc從無病原體出生后人類基質(zhì)脂肪組織獲得。
相對于按照本發(fā)明的方法給藥的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的目標(biāo)受體來說，在如上描述的所述方法中使用的msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞可以是同種異體(供體)或自體(對象)來源的。在方法的一個實施方案中，所述msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞是同種異體來源的。在方法的一個實施方案中，所述msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞是自體來源的。
優(yōu)選情況下，在本發(fā)明的方法中使用的msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的特征為(i)它們不表達(dá)特異性針對抗原呈遞細(xì)胞的標(biāo)志物，(ii)它們不組成性表達(dá)ido(吲哚胺2,3-雙加氧酶)，(iii)它們在用ifn-γ刺激后表達(dá)ido，并且在msc的情況下，(iv)它們表現(xiàn)出分化成至少兩種細(xì)胞譜系的能力。
本發(fā)明的干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞優(yōu)選在適合于注射的生理可接受載體中遞送。一般來說，已知可用的任何生理可接受載體都可用于本發(fā)明的實踐。這些載體的選擇包括但不限于林格(ringer)溶液、水、標(biāo)準(zhǔn)鹽水溶液、葡萄糖溶液和白蛋白水，并且無疑是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。
任選地，在注射操作過程中可以使淋巴系統(tǒng)或其一部分例如淋巴管或淋巴器官的局部區(qū)域、優(yōu)選為淋巴節(jié)可視化?？梢允褂贸暡ā⒎派鋵W(xué)或其他可視化手段例如計算機軸向斷層攝影術(shù)(cat掃描)來可視化淋巴節(jié)并監(jiān)測針頭的位置和淋巴結(jié)中的變化，例如膨脹。由于易于進(jìn)行超聲波指導(dǎo)的定位和注射，注射到腋窩淋巴節(jié)和腹股溝淋巴節(jié)中是優(yōu)選的。
用于注射的技術(shù)在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。一種方法是使用含有細(xì)胞液體制劑的單室注射器。
另一方面，本發(fā)明提供了在需要治療的對象中治療或修復(fù)受損組織(優(yōu)選為間充質(zhì)組織)和/或治療、減輕、預(yù)防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，所述方法包含向所述對象的淋巴系統(tǒng)給藥預(yù)防或治療有效量的包含細(xì)胞治療(最優(yōu)選包含msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞)的組合物，并且還包含將抗原直接給予到所述對象的淋巴系統(tǒng)。所述抗原可以在給藥細(xì)胞治療之前、同時或之后給藥?？乖梢栽诮o藥細(xì)胞治療之前或之后至少1、2、3、5或10個小時給藥。
所述方法中使用的抗原可以是所選抗原、抗原組或表達(dá)和/或呈遞所述抗原的細(xì)胞類型。在一個實施方案中，抗原選自：源于經(jīng)受自身免疫的患者的自體抗原混合物、肽抗原、核酸、改變的肽配體、重組蛋白或其片段。在一個實施方案中，所述抗原與關(guān)節(jié)炎相關(guān)(例如但不限于膠原蛋白抗原)。在可選實施方案中，所述抗原與乳糜瀉相關(guān)。與乳糜瀉相關(guān)的抗原是谷蛋白家族的成員，包括某些形式的醇溶谷蛋白(例如但不限于麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白和/或裸麥醇溶蛋白的抗原)。在另一個實施方案中，所述抗原與多發(fā)性硬化癥相關(guān)(例如但不限于髓磷脂抗原)。用于分離、純化和制備這些抗原的方法，對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是已知的。
在特別優(yōu)選情況下，本發(fā)明的所有方面的細(xì)胞治療直接給予到淋巴器官，最優(yōu)選為外周淋巴器官，包括但不限于淋巴節(jié)，最優(yōu)選為腋窩淋巴節(jié)或腹股溝淋巴節(jié)。在缺少淋巴結(jié)或淋巴結(jié)具有缺陷的個體中，細(xì)胞治療可以遞送至淋巴組織或免疫細(xì)胞。
淋巴內(nèi)給藥的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，并通常利用注射裝置(例如注射器)來執(zhí)行?？梢岳贸上裱b置例如但不限于放射學(xué)、超聲波和計算機軸向斷層攝影術(shù)(cat掃描)來輔助和觀察給藥。這允許細(xì)胞治療的精確給藥并監(jiān)測淋巴器官的不利事件。在方法的一個方面，對象用多劑淋巴內(nèi)給藥的細(xì)胞治療進(jìn)行治療。優(yōu)選情況下以一定時間間隔給藥至少2、3、4、5、10或15劑。在方法的另一方面，每劑所述藥劑包含10,000至5,000,000個細(xì)胞。在優(yōu)選實施方案中，每劑所述藥劑包含10,000至100,000個細(xì)胞、100,000至500,000個細(xì)胞、500,000至1,000,000個細(xì)胞或1,000,000至5,000,000個細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了用于給藥至淋巴系統(tǒng)的干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞作為藥物的應(yīng)用，通過將干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞給予到淋巴系統(tǒng)中，用于治療或修復(fù)受損組織(優(yōu)選為間充質(zhì)組織)和/或治療、減輕、預(yù)防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀。
本發(fā)明的可選方面提供了干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞在藥物制造中的應(yīng)用，所述藥物通過將干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞給予到淋巴系統(tǒng)中，用于治療或修復(fù)受損組織(優(yōu)選為間充質(zhì)組織)和/或治療、減輕、預(yù)防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀。
另一方面，本發(fā)明提供了用于給藥至淋巴系統(tǒng)的藥物組合物，其包含干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞。所述藥物組合物用于治療、修復(fù)、預(yù)防和/或改善受損組織或與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀，例如但不限于自身免疫疾病、炎性障礙和免疫介導(dǎo)的疾病，包括被抑制器官和組織的排斥。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物還可以包含抗原、抗原組或表達(dá)和/或呈遞所述抗原的細(xì)胞類型。在一個實施方案中，抗原選自：源于經(jīng)受自身免疫的患者的自體抗原混合物、肽抗原、核酸、改變的肽配體、重組蛋白或其片段。在一個實施方案中，所述抗原與關(guān)節(jié)炎相關(guān)，例如但不限于膠原蛋白抗原。在可選實施方案中，所述抗原與乳糜瀉相關(guān)。與乳糜瀉相關(guān)的抗原是谷蛋白家族的成員，包括某些形式的醇溶谷蛋白(例如但不限于麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白和/或裸麥醇溶蛋白的抗原)。谷蛋白及其組分麥谷蛋白和麥醇溶蛋白，是與乳糜瀉相關(guān)的優(yōu)選抗原。在另一個實施方案中，所述抗原與多發(fā)性硬化癥相關(guān)，例如但不限于髓磷脂抗原和髓磷脂組分抗原例如髓磷脂堿性蛋白(mbp)、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(mog)、蛋白脂質(zhì)蛋白(plp)和髓磷脂糖脂例如半乳糖腦苷脂。用于分離、純化和制備這些抗原的方法，對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是已知的。
本發(fā)明的藥物組合物包含預(yù)防或治療有效量的干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞、任選的抗原和藥用載體。每種這些細(xì)胞類型的劑量和劑量方式的實例在上文中給出。適合的藥用載體在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，并且優(yōu)選是由美國聯(lián)邦或州政府的管理機構(gòu)批準(zhǔn)或列于美國藥典(uspharmacopeia)或歐洲藥典(europeanpharmacopeia)或其他公認(rèn)藥典中可用于動物、更具體為人類中的藥用載體。術(shù)語“載體”是指與治療藥劑一起給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑或介質(zhì)。如果需要，組合物也可以包含少量ph緩沖劑。適合的藥用載體的實例描述在ewmartin的《remington藥物學(xué)》(remington'spharmaceuticalsciences)中。這樣的組合物將含有預(yù)防或治療有效量的優(yōu)選采取純化形式的預(yù)防或治療藥劑以及適量的載體，以提供用于適當(dāng)給予到對象的形式。制劑應(yīng)該適合于給藥方式。在優(yōu)選實施方案中，藥物組合物是無菌的，并采取適合給藥于對象、優(yōu)選為動物對象、更優(yōu)選為哺乳動物對象、最優(yōu)選為人類對象的形式。
本發(fā)明的藥物組合物可以采取各種形式。它們包括例如半固體和液體劑型，例如冷凍干燥制備物、液體溶液或懸液、可注射和可輸注溶液等。正如上面指出的，藥物組合物優(yōu)選為可注射的。
優(yōu)選情況下，本發(fā)明的方法、藥物、組合物和細(xì)胞用于治療或修復(fù)受損組織(優(yōu)選為間充質(zhì)組織)和/或治療、減輕、預(yù)防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關(guān)的一種或多種癥狀。因此，本發(fā)明的方法和細(xì)胞可用于治療以任一或所有所述癥狀為特征的任何障礙。這樣的障礙的代表性而非窮舉的名單提供在定義部分中。特別優(yōu)選的是將本發(fā)明的方法、藥物、組合物和細(xì)胞應(yīng)用于免疫介導(dǎo)的炎性疾病的治療。此外，優(yōu)選將本發(fā)明的方法、藥物、組合物和細(xì)胞應(yīng)用于糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、炎性腸病(ibd，包括克羅恩病和/或潰瘍性結(jié)腸炎)和多發(fā)性硬化癥(ms)的治療。更特別優(yōu)選情況下，將本發(fā)明的方法、藥物、組合物和細(xì)胞應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。
在本發(fā)明的方法或組合物包含一種或多種抗原的情形中，優(yōu)選將方法或組合物用于與所述抗原相關(guān)或由其誘導(dǎo)的障礙的治療中，例如在抗原是膠原蛋白的情形中，方法或組合物可用于治療關(guān)節(jié)炎，在抗原是谷蛋白組分的情形中，方法或組合物可用于治療乳糜瀉，在抗原是髓磷脂組分的情形中，方法或組合物可用于治療多發(fā)性硬化癥。因此，優(yōu)選的組合物包含：msc、優(yōu)選為asc，以及膠原蛋白，用于治療關(guān)節(jié)炎；msc、優(yōu)選為asc，以及谷蛋白和/或谷蛋白組分，用于治療乳糜瀉；msc、優(yōu)選為asc，以及髓磷脂和/或髓磷脂組分，用于治療多發(fā)性硬化癥。
另一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含i)包含干細(xì)胞,調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞群體的藥物，以及ii)根據(jù)本發(fā)明的方法使用它們的說明書。
在另一個實施方案中，所述試劑盒還可以包含iii)一種或多種抗原。
msc表型標(biāo)志物
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中使用的msc優(yōu)選對與apc(抗原呈遞細(xì)胞)表型相關(guān)的標(biāo)志物為陰性。因此，優(yōu)選情況下，所述msc對至少一種、兩種、三種或四種或優(yōu)選所有下述標(biāo)志物陰性：cd11b；cd11c；cd14；cd45；hlail。此外，msc優(yōu)選對至少一種、兩種或優(yōu)選所有下述細(xì)胞表面標(biāo)志物陰性：cd31；cd34；cd133。
在具體實施方案中，優(yōu)選情況下，本發(fā)明方法中使用的msc的特征為它們表達(dá)至少一種、兩種、三種、四種或優(yōu)選所有下述細(xì)胞表面標(biāo)志物(即對它們陽性)：cd9、cd44、cd54、cd90和cd105。優(yōu)選情況下，msc的特征為它們具有至少一種、兩種、三種、四種和優(yōu)選所有所述細(xì)胞表面標(biāo)志物cd9、cd44、cd54、cd90和cd105的顯著表達(dá)水平。
任選地，msc也可以對細(xì)胞表面標(biāo)志物cd106(vcam-1)陰性。適用于本發(fā)明方法的msc的實例在本技術(shù)領(lǐng)域中已有描述，例如在wo2007039150中，在此以其全文引為參考。
分化
適用于本發(fā)明方法的msc優(yōu)選為多能干細(xì)胞，并可以表現(xiàn)出增殖和分化成至少兩種、更優(yōu)選三、四、五、六、七或更多種細(xì)胞譜系的能力。所述msc可以分化成的細(xì)胞譜系的說明性而非限制性實例包括骨細(xì)胞、脂肪組織細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血支持性基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞。msc通過常規(guī)方法能夠增殖并分化成其他譜系的細(xì)胞。鑒定以及隨后將分化的細(xì)胞與其未分化對應(yīng)物分離開的方法，也可以通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法來執(zhí)行。
msc分離
用于分離msc的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的，并且可以使用任何適合的方法。在一個實施方案中，asc的分離可以包含下列步驟：
(i)從脂肪樣品制備細(xì)胞懸液；
(ii)從所述細(xì)胞懸液回收細(xì)胞；
(iii)將所述細(xì)胞在固體表面上，在適合的細(xì)胞培養(yǎng)基中，在允許細(xì)胞附著于固體表面并增殖的條件下進(jìn)行溫育；
(iv)在溫育后清洗所述固體表面以除去非黏附細(xì)胞；
(v)選擇在這樣的培養(yǎng)基中傳代至少兩次后附著于所述固體表面的細(xì)胞；以及
(vi)證實所選細(xì)胞群體表現(xiàn)出目標(biāo)表型。
當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“固體表面”是指asc能夠附著在其上的任何材料。在具體實施方案中，所述材料是經(jīng)過處理以促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞與其表面的黏附的塑料材料，例如任選包被有聚d-賴氨酸或其他試劑的可商購聚苯乙烯板。
步驟(i)-(vi)可以通過本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的常規(guī)技術(shù)來執(zhí)行。簡單來說，asc可以通過常規(guī)手段，從如上所討論的任何適合動物的任何適合的結(jié)締組織來源獲得。典型情況下，人類脂肪細(xì)胞使用公認(rèn)的流程例如手術(shù)或脂肪抽吸術(shù)從活供體獲得。事實上，由于脂肪抽吸法如此常見，因此脂肪抽吸流出物是可以從其產(chǎn)生asc的特別優(yōu)選的來源。因此，在具體實施方案中，asc來自于通過脂肪抽吸術(shù)獲得的人類脂肪組織的基質(zhì)部分。
優(yōu)選情況下，在將組織進(jìn)行處理以將asc與其余材料分離之前，對組織進(jìn)行清洗。在一種常用方案中，將組織樣品用生理相容的鹽水溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水(pbs))進(jìn)行清洗，然后劇烈攪拌并靜置沉降，該步驟從組織中移除松散物質(zhì)(例如受損組織、血液、紅細(xì)胞等)。因此，清洗和沉降步驟一般重復(fù)至上清液相對不含碎片。剩余的細(xì)胞一般以各種大小的團塊存在，并使用檢定過的降解總體結(jié)構(gòu)同時最小化對細(xì)胞自身的損傷的步驟繼續(xù)流程。實現(xiàn)這一目標(biāo)的一種方法是用減弱或破壞細(xì)胞之間的連接的酶(例如膠原蛋白酶、分散酶、胰蛋白酶等)處理洗過的細(xì)胞團塊。這種酶處理的量和持續(xù)時間隨著所使用的條件而變，但是這類酶的使用在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的?？蛇x地，或與這樣的酶處理相結(jié)合，可以使用其他處理例如機械攪拌、聲能、熱能等來降解細(xì)胞團塊。如果通過酶方法實現(xiàn)降解，理想情況下在適當(dāng)時間段后中和酶，以最小化對細(xì)胞的有害效應(yīng)。
降解步驟典型地產(chǎn)生聚集細(xì)胞的漿液或懸液和通常不含基質(zhì)細(xì)胞(例如紅細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和干細(xì)胞)的流體級份。分離過程中的下一個階段是從asc分離聚集的細(xì)胞。這可以通過離心來實現(xiàn)，所述離心迫使細(xì)胞成為被上清液覆蓋的沉淀。然后可以將上清液丟棄，將沉淀懸浮在生理相容流體中。此外，懸浮的細(xì)胞典型地包括紅細(xì)胞，并且在大多數(shù)方案中希望裂解它們。用于選擇性裂解紅細(xì)胞的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，并且可以使用任何適合的方案(例如在高滲或低滲介質(zhì)中溫育，使用氯化銨裂解等)。當(dāng)然，如果紅細(xì)胞被裂解，然后將通過例如過濾、沉降或密度分級將細(xì)胞與裂解液分離開。
不論是否裂解紅細(xì)胞，可以將懸浮的細(xì)胞連續(xù)清洗、重新離心并重懸浮一次或多次，以獲得更高的純度。可選地，可以在細(xì)胞表面標(biāo)志物情況的基礎(chǔ)上或在細(xì)胞尺寸和粒度的基礎(chǔ)上分離細(xì)胞。
在最后的分離和重新懸浮之后，可以將細(xì)胞培養(yǎng)，并且如果需要測定數(shù)量和生活力以評估收率。優(yōu)選情況下，使用適合的固體細(xì)胞培養(yǎng)基，在適合的細(xì)胞密度和培養(yǎng)條件下，將細(xì)胞不分化地培養(yǎng)在固體表面上。因此，在具體實施方案中，將細(xì)胞在適合的細(xì)胞培養(yǎng)基[例如dmem，典型地增補有5-15％(例如10％)的適當(dāng)血清例如胎牛血清或人血清]存在下，在通常由塑料材料制成的固體表面例如皮氏培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶上不分化地進(jìn)行培養(yǎng)，并在允許細(xì)胞附著于固體表面并增殖的條件下進(jìn)行溫育。在溫育后，對細(xì)胞進(jìn)行清洗以便移除非黏附細(xì)胞和細(xì)胞片段。將細(xì)胞維持在相同培養(yǎng)基中和相同條件下，直到它們達(dá)到足夠合生，其中在需要時更換細(xì)胞培養(yǎng)基。在達(dá)到所需的細(xì)胞合生后，可以使用拆解劑例如胰蛋白酶并以適合的細(xì)胞密度(通常為2,000-10,000個細(xì)胞/cm2)接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)表面上，利用連續(xù)傳代來擴增細(xì)胞。因此，然后將細(xì)胞在這樣的培養(yǎng)基中不分化地、同時仍保留其發(fā)育表型地傳代至少兩次，更優(yōu)選情況下，細(xì)胞可以傳代至少10次(例如至少15次或甚至至少20次)而不失去發(fā)育表型。典型情況下，將細(xì)胞以所需密度例如約100個細(xì)胞/cm2至約100,000細(xì)胞/cm2之間(例如約500個細(xì)胞/cm2至約50,000個細(xì)胞/cm2之間，或更特別情況下約1,000個細(xì)胞/cm2至約20,000個細(xì)胞/cm2之間)鋪板。如果以更低密度(例如約300細(xì)胞個/cm2)鋪板，細(xì)胞可以更容易地克隆分離。例如，在幾天后，以這樣的密度鋪板的細(xì)胞將增殖成均勻群體。在具體實施方案中，細(xì)胞密度在2,000-10,000個細(xì)胞/cm2之間。
正如下面所提到的，選擇在這種包含至少兩次傳代的處理后保持附著于固體表面的細(xì)胞，并通過常規(guī)方法分析目標(biāo)表型，以便證實asc的身份。在第一次傳代后保持附著于固體表面的細(xì)胞來自于非均質(zhì)來源；因此，必須對所述細(xì)胞進(jìn)行至少另一次傳代。作為上述方法的結(jié)果，獲得了具有目標(biāo)表型的均質(zhì)細(xì)胞群體。在至少兩次傳代后細(xì)胞附著于固體表面，構(gòu)成了本發(fā)明用于選擇人asc的優(yōu)選實施方案。目標(biāo)表型的證實可以使用常規(guī)手段來進(jìn)行。
優(yōu)選情況下，通過將所述群體至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次、至少15次或至少20次復(fù)制兩倍或三倍，來進(jìn)行所述擴增。在另一個實施方案中，所述擴增繼續(xù)進(jìn)行至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次、至少15次或至少20次傳代。
細(xì)胞表面標(biāo)志物可以通過任何適合的通?；陉栃?陰性篩選的常規(guī)技術(shù)來鑒定；例如，可以使用針對需要證實其在細(xì)胞中的存在/不存在的細(xì)胞表面標(biāo)志物的單克隆抗體，盡管也可以使用其他技術(shù)。因此，在特定實施方案中，使用針對cd11b、cd11c、cd14、cd45、hlaii、cd31、cd34和cd133中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或優(yōu)選所有標(biāo)志物的單克隆抗體，以便證實在所選細(xì)胞中不存在所述標(biāo)志物；并使用針對cd9、cd44、cd54、cd90和cd105中的一個、兩個、三個、四個或優(yōu)選所有標(biāo)志物的單克隆抗體，以便證實至少一個和優(yōu)選所有所述標(biāo)志物的存在或其可檢測的表達(dá)水平。所述單克隆抗體是已知的、可商購的或可以由本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員通過常規(guī)方法獲得。
所選細(xì)胞中ifn-γ可誘導(dǎo)的ido活性可以通過任何適合的常規(guī)測定法來測定。例如，所選細(xì)胞可以用ifn-γ刺激并測定ido的表達(dá)；然后可以執(zhí)行常規(guī)的western印跡來分析ido蛋白的表達(dá)，并可以通過色氨酸向犬尿氨酸的轉(zhuǎn)化，例如通過用上清液中犬尿氨酸濃度的高效液相色譜(hplc)分析和光度測定作為讀出值，來測量所選細(xì)胞在ifn-γ刺激后的ido酶活性。因為asc在某些條件下表達(dá)ido，因此允許檢測ifn-γ刺激后的ido酶活性的任何適合的技術(shù)都可用于選擇asc。產(chǎn)生的ido的量取決于每平方厘米的細(xì)胞數(shù)量，其優(yōu)選處于5000個細(xì)胞/cm2或以上的水平，但不限于該濃度，還取決于ifn-γ的濃度，其理想情況下為3ng/ml或以上，但不限于該濃度。在所描述的條件下產(chǎn)生的ido活性，將在24小時或更長時間后引起μm范圍內(nèi)的可檢測的犬尿氨酸生產(chǎn)。
所選細(xì)胞分化成至少兩種細(xì)胞譜系的能力，可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法來測定。
如果需要，可以使用用于克隆細(xì)胞群體的適合方法對asc進(jìn)行克隆擴增。例如，可以將增殖的細(xì)胞群體物理挑出并接種到分開的表面(或多孔板的孔)中?？蛇x地，可以將細(xì)胞在多孔板上以統(tǒng)計比率進(jìn)行亞克隆，所述統(tǒng)計比率便于將單個細(xì)胞置于每個孔中(例如約0.1至約1個細(xì)胞/孔或甚至約0.25至約0.5個細(xì)胞/孔，例如0.5個細(xì)胞/孔)。當(dāng)然，可以通過將細(xì)胞以低密度鋪板(例如在皮氏培養(yǎng)皿或其他適合基質(zhì)上)并使用裝置例如克隆環(huán)將它們與其他細(xì)胞分離開，來克隆細(xì)胞?？寺∪后w的生產(chǎn)可以在任何適合的培養(yǎng)基中擴增。在任何情況下，可以將分離的細(xì)胞培養(yǎng)至適合的時間點，此時可以評估它們的發(fā)育表型。
已經(jīng)顯示，通過例如使用適合血清(例如胎牛血清或人血清)的特殊篩選的批次，可以在長時期內(nèi)實現(xiàn)不誘導(dǎo)分化的asc離體擴增。用于測量生活力和產(chǎn)率的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(例如臺盼藍(lán)拒染試驗)。
如果需要，用于分離本發(fā)明細(xì)胞群體的細(xì)胞的任何步驟和程序，都可以手動進(jìn)行?？蛇x地，分離這樣的細(xì)胞的方法可以通過一種或多種適合的裝置來促進(jìn)和/或自動化，所述裝置的實例在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。
msc細(xì)胞培養(yǎng)
所述msc也能夠離體擴增。也就是說，在分離后，所述msc可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中維持并允許其離體增殖。這樣的培養(yǎng)基包含例如dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)，含抗生素(例如100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)或不含抗生素，含有2mm谷氨酰胺并增補有2-20％胎牛血清(fbs)。根據(jù)所使用的細(xì)胞的需要修改或調(diào)整培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)基增補劑的濃度，在本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。血清通常含有細(xì)胞和非細(xì)胞因子，以及生活力和擴增所必需的組分。血清的實例包括胎牛血清(fbs)、牛血清(bs)、小牛血清(cs)、胎小牛血清(fcs)、出生后小牛血清(ncs)、山羊血清(gs)、馬血清(hs)、豬血清、綿羊血清、兔血清、大鼠血清(rs)等。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括下述情況，即如果所述msc是人類來源的，細(xì)胞培養(yǎng)基增補有人血清、優(yōu)選為自體來源的。應(yīng)該理解，如果認(rèn)為需要失活補體級聯(lián)的組分，可以將血清在55-65℃熱失活。血清濃度的調(diào)節(jié)和/或從培養(yǎng)基中撤出血清，也可用于促進(jìn)一種或多種所需細(xì)胞類型的存活。優(yōu)選情況下，所述msc將得益于約2％至約25％的fbs濃度。在另一個實施方案中，msc可以在確定組成的細(xì)胞培養(yǎng)基中擴增，在所述培養(yǎng)基中血清被血清白蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒以及重組蛋白的組合代替，所述重組蛋白包括但不限于胰島素、血小板衍生生長因子(pdgf)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)，正如本技術(shù)領(lǐng)域中已知的。
許多細(xì)胞培養(yǎng)基已經(jīng)包含氨基酸，然而某些培養(yǎng)基在培養(yǎng)細(xì)胞之前需要增補。這樣的氨基酸包括但不限于l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬氨酸、l-天冬酰胺、l-半胱氨酸、l-胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺\l-甘氨酸等。
典型情況下，抗微生物劑也可用于細(xì)胞培養(yǎng)中，以減輕細(xì)菌、支原體和真菌感染。典型情況下，使用的抗生素或抗真菌化合物是青霉素/鏈霉素的混合物，但是也可以包括但不限于兩性霉素
有利情況下，激素也可用于細(xì)胞培養(yǎng)中，并且包括但不限于d-醛甾酮、二乙基己烯雌酚(des)、地塞米松、β-雌二醇、氫化可的松、胰島素、催乳素、孕酮、生長激素釋放抑制因子/人生長激素(hgh)等。
擴增的細(xì)胞
在一個實施方案中，msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞在用于本發(fā)明的方法之前可能已被擴增。用于細(xì)胞擴增的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。
遺傳工程改造的細(xì)胞
在另一個實施方案中，msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞可以是遺傳工程改造的細(xì)胞(例如用外源核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染過)，或源于遺傳工程改造的細(xì)胞。
例如，所述細(xì)胞可以被遺傳工程改造以組成性表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶(ido)，這可以通過例如用編碼所述酶和任選的適合的啟動子序列的適合的核酸構(gòu)建物進(jìn)行轉(zhuǎn)染來進(jìn)行。細(xì)胞的遺傳工程在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，并可以由本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來執(zhí)行。
輻照過的細(xì)胞
在另一個實施方案中，msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞在用于本發(fā)明的方法之前可能已被輻照。細(xì)胞的輻照降低了它們的增殖能力和存活時間。
輻照可以使用適合的受控電離輻射源例如γ-輻射體裝置來進(jìn)行。輻照條件必須由本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員通過實驗進(jìn)行調(diào)整，以確定提供引起msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的長期生長停止的輻射劑量所需的暴露時間。在一個實施方案中，所述輻射劑量在選自1-100gy、5-85gy、10-70gy、12-60gy的范圍內(nèi)，然而，特別優(yōu)選情況下，所述輻射劑量在15-45gy的范圍內(nèi)。
cd26拮抗劑處理的細(xì)胞
在另一個實施方案中，msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞在用于本發(fā)明的方法之前，可以用cd26拮抗劑或抑制劑進(jìn)行處理。cd26拮抗劑和抑制劑在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，并包括但不限于氨基甲基吡啶、p32/98、nvpdpp728、psn9301、異亮氨酸噻唑烷、地那列汀、西他列汀、維達(dá)列汀、沙格列汀、阿格列汀、抑二肽素a，并且這樣的處理可以由本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來執(zhí)行。
ifn-γ刺激的細(xì)胞
在另一個實施方案中，msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞在用于本發(fā)明的方法之前，可以用γ-干擾素進(jìn)行處理。msc的ifn-γ處理以對其進(jìn)行刺激在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，并可以由本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來執(zhí)行。
抗原刺激的細(xì)胞
在另一個實施方案中，msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞在用于本發(fā)明的方法之前，可以用抗原進(jìn)行刺激。msc的抗原處理以對其進(jìn)行刺激在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，并可以由本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來執(zhí)行。
絲裂霉素c處理的msc
在另一個實施方案中，msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞在用于本發(fā)明的方法之前，可以用絲裂霉素c進(jìn)行處理。msc的絲裂霉素c處理在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，并可以由本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來執(zhí)行。
此外，如果需要，msc、調(diào)節(jié)性t-細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞在用于本發(fā)明的方法之前，可以進(jìn)行選自輻照、ifn-γ刺激和絲裂霉素c處理的兩種或三種處理的組合。
所述msc的維持條件也可以含有允許細(xì)胞保持在未分化形式中的細(xì)胞因子。對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，顯然在分化之前，必須從培養(yǎng)基中除去抑制細(xì)胞分化的增補劑。此外，顯然不是所有細(xì)胞都需要這些因子。事實上，取決于細(xì)胞類型，這些因子可能引發(fā)不想要的效應(yīng)。
具體實施方式
通過下面的非限制性實施例，本發(fā)明的特點和優(yōu)點將得到更充分的說明，其中除非另有指明，否則所有份數(shù)和百分比以重量計。
實施例1：使用asc治療膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(cia)
材料和方法
膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(cia)小鼠模型
在dba1/(h-2q)雄性小鼠(6-8周齡)中誘導(dǎo)實驗性關(guān)節(jié)炎。在開始研究的當(dāng)天，使用第一劑雞ii型膠原蛋白(cii)(終濃度為1mg/ml)在弗氏完全佐劑(結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)終濃度為1mg/ml)(cfa)中的乳液，以0.1ml/動物的乳液體積對每只小鼠在尾部(距身體2-3cm)進(jìn)行皮下注射。在第一次注射膠原蛋白后21天，向每只動物給藥第二次cii注射(加強針)(0.1ml/動物)，仍然是在尾部皮下給藥，但是在與第一次注射不同的位置處。這次，使用弗氏不完全佐劑(ifa)制備膠原蛋白懸液。
當(dāng)關(guān)節(jié)炎得分值在2-4左右時，將動物用擴增的脂肪源干細(xì)胞或作為對照的介質(zhì)(林格溶液)進(jìn)行治療。通過按照預(yù)先建立的得分系統(tǒng)測量上下肢關(guān)節(jié)的炎癥-發(fā)紅-關(guān)節(jié)強硬，每日(從星期一至星期五)跟蹤cia的演變。
在給藥測試物或介質(zhì)后，每日測量每只動物的兩只后爪的體積，并計算兩只爪的平均值。此外，將在第1日測量的每只動物的后爪體積(在第一次膠原蛋白注射之前，并取為基線體積)從其后每日測量的爪體積中減去，以獲得每只動物的爪體積的凈增加(或浮腫)。此外，按照下面的關(guān)節(jié)炎指數(shù)得分系統(tǒng)，以相同的頻率和時間對前爪和后爪中關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性進(jìn)行記分：
0：無關(guān)節(jié)炎跡象
1：爪或1個指頭腫脹和/或發(fā)紅
2：兩組關(guān)節(jié)發(fā)炎(腫脹和/或發(fā)紅)
3：多于兩組關(guān)節(jié)發(fā)炎(腫脹和/或發(fā)紅)
4：整個爪的炎癥。嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎
最后的得分值是四只爪的得分值的總和。最高得分值為16。
實驗設(shè)計
對照
a組＝無治療
靜脈內(nèi)給藥
c組＝靜脈內(nèi)注射，每劑1百萬個細(xì)胞，每日1劑連續(xù)給藥，總共5劑。
d組＝靜脈內(nèi)注射，第一劑3百萬個細(xì)胞，第二和第三劑1百萬個細(xì)胞，每隔一日給藥1劑，總共3劑。
淋巴內(nèi)給藥
e組＝淋巴內(nèi)注射，每劑320,000個細(xì)胞(右側(cè)腹股溝淋巴結(jié)160,000個，左側(cè)160,000個)，總共2劑，第二劑在第一劑后7天給藥。
介質(zhì)對照
f組＝淋巴內(nèi)注射林格溶液，總共2劑，第二劑在第一劑后7天給藥。
n＝12只小鼠/組。
靜脈內(nèi)給藥
使用無菌蝴蝶針(25g)，通過尾靜脈對測試物進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。動物連續(xù)5日或3個隔日接受藥劑(每日1劑)。動物接受0.2ml測試物，以0.05ml/min的速率通過尾靜脈進(jìn)行靜脈內(nèi)輸注。
淋巴內(nèi)給予到腹股溝淋巴節(jié)中
通過經(jīng)鼻罩吸入2.0％至2.5％異氟烷將dba1小鼠麻醉，并躺置在37℃的加溫板上。在脫毛(veet敏感型脫毛膏)并用70％乙醇對腹股溝區(qū)域消毒后，在腹股溝區(qū)域中制造6mm至8mm切口。定位腹股溝脂肪中的淋巴節(jié)，并使用帶有30號針頭的hamilton注射器向淋巴結(jié)內(nèi)注射8μl介質(zhì)或帶有asc的介質(zhì)(密度為2千萬個細(xì)胞/ml)。通過一個或兩個結(jié)縫合切口，并在另一側(cè)腹股溝淋巴結(jié)中重復(fù)該程序。使小鼠從麻醉中恢復(fù)。7日后，重復(fù)該程序。
擴增的脂肪源干細(xì)胞的制備
在局部麻醉和普通鎮(zhèn)靜下通過吸脂術(shù)獲得人類脂肪組織。通過小切口(直徑小于0.5cm)將中空鈍頭套管導(dǎo)入到皮下空間中。在輕柔抽吸下，將套管移動通過脂肪組織腹壁區(qū)室，用于脂肪組織的機械破裂。將鹽水溶液和血管收縮劑腎上腺素注射到脂肪組織區(qū)室中以將失血減至最少。通過這種方式，從每個待治療患者獲取80ml至100ml原始脂肪吸取物。
將原始脂肪吸取物用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(pbs；gibcobrl,paisley,scotland,uk)大量清洗，以除去血細(xì)胞、鹽水和局部麻醉劑。將細(xì)胞外基質(zhì)用平衡鹽溶液(5mg/ml；sigma,st.louis,usa)中的ii型膠原蛋白酶(0.075％；gibcobrl)在37℃下消化30分鐘，以釋放出細(xì)胞級份，然后通過加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清(fbs；gibcobrl)的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem；gibcobrl))將膠原蛋白酶失活。將細(xì)胞懸液以250xg離心10分鐘。將細(xì)胞重懸浮在0.16mnh4cl中，并允許其在室溫(rt)下靜置5分鐘以裂解紅細(xì)胞。將混合物以250xg離心，并將細(xì)胞重懸浮在添加10％fbs和1％青霉素/鏈霉素混合物(gibcobrl)的dmem中，然后將它們通過40μm篩網(wǎng)過濾，并以10-30x103個細(xì)胞/cm2的密度鋪于組織培養(yǎng)瓶中。
將細(xì)胞在37℃下，在含有5％co2的空氣氣氛下培養(yǎng)24小時。然后將培養(yǎng)瓶用pbs清洗以除去非黏附細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將細(xì)胞維持在相同培養(yǎng)基和相同條件下的培養(yǎng)中，直至它們達(dá)到約80％合生，其間每3至4日更換培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞以1:3的稀釋率用胰蛋白酶-edta(gibcobrl)進(jìn)行傳代，所述稀釋率對應(yīng)于約5-6x103個細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度。
對于實驗來說，將復(fù)制加倍12-16次的細(xì)胞用胰蛋白酶處理，并以所需細(xì)胞密度懸浮在介質(zhì)(林格溶液)中。然后轉(zhuǎn)移至注射器并注射到小鼠中。
統(tǒng)計分析
結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)顯著性使用統(tǒng)計學(xué)程序graphpadinstat3來評估。結(jié)果被表示成平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，其中(n)是動物數(shù)量。
圖1的注解說明了a組與e組的比較的p-值。顯著差異被表示成：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。組之間的差異通過用于不成對數(shù)據(jù)的kruskal-wallis檢驗和dunn形式多重比較的事后檢驗來評估。p值<0.05被當(dāng)作是顯著的。
結(jié)果
通過注射雞膠原蛋白ii在dba1小鼠中誘導(dǎo)了關(guān)節(jié)炎。當(dāng)小鼠顯示出2-4的關(guān)節(jié)炎得分值時，使用擴增的asc通過靜脈內(nèi)或淋巴內(nèi)途徑對它們進(jìn)行治療。作為淋巴內(nèi)給藥的對照，將小鼠用介質(zhì)進(jìn)行處理。每日監(jiān)測關(guān)節(jié)炎得分值(參見表1)。盡管未治療小鼠或用介質(zhì)處理的小鼠顯示出以時間依賴性方式增加的爪的高度炎癥，但用淋巴結(jié)內(nèi)遞送的擴增的asc治療的小鼠顯示出明顯減輕的炎癥。此外，淋巴內(nèi)給藥的療效高于靜脈內(nèi)給藥(參見圖1)。
結(jié)論
本研究顯示，人類asc向dba1小鼠的淋巴內(nèi)給藥引起關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性的統(tǒng)計學(xué)顯著的降低(正如通過關(guān)節(jié)炎指數(shù)得分值所表明的)。
此外，淋巴內(nèi)給藥總共640,000個asc(在兩劑藥劑中)的療效顯著高于靜脈內(nèi)給藥總共5百萬個細(xì)胞。這些結(jié)果表明淋巴內(nèi)給藥途徑更加有效，因為使用較低數(shù)量的細(xì)胞達(dá)到了較高療效。
因此，盡管在本文中已經(jīng)參考本發(fā)明的具體方面、特點和說明性實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)該認(rèn)識到，本發(fā)明的用途不限于此，而是擴展到并涵蓋大量其他方面、特點和實施方案。因此，權(quán)利要求書打算相應(yīng)廣義地解釋為包括其精神和范圍之內(nèi)的所有這樣的方面、特點和實施方案。