本發(fā)明涉及一種顯著提高穩(wěn)定性、吸收利用率及生物活性，用于改善記憶及認(rèn)知功能障礙的組合物，尤其涉及一種元寶楓籽油、磷蝦油、脂溶性迷迭香提取物的配伍組合物。
技術(shù)背景
記憶功能是人類獲取知識(shí)、經(jīng)驗(yàn)和從事不同作業(yè)活動(dòng)的生理基礎(chǔ)，是衡量智能發(fā)育的重要指標(biāo)。記憶能力下降的誘因可分為兩類:一類是由于衰老導(dǎo)致腦部生理功能減退造成的記憶能力下降，常見的有老年性癡呆、更年期等；另一類是由于應(yīng)激損傷造成的記憶能力下降，常見的有心理應(yīng)激、作業(yè)疲勞、腦外傷等。
記憶能力的下降甚至退化與人體健康狀況、大腦生理老化、大腦創(chuàng)傷以及病理性變化等有著密切的關(guān)系。除此之外，經(jīng)濟(jì)、社會(huì)飛速發(fā)展所帶來的壓力也會(huì)導(dǎo)致不同年齡階層的人出現(xiàn)記憶紊亂，從而影響正常生活。目前針對因生理性老化或疾病而導(dǎo)致記憶退化改善的理論研究已有許多，同時(shí)針對改善記憶功能的藥物研究非?；钴S，但由于這些藥物靶點(diǎn)單一、缺乏足夠的有效性且毒副作用較大、不易透過血腦屏障、吸收利用率低等，目前大多僅用于緩解癥狀，使得臨床及普通人群的使用受到一定限制。
元寶楓籽油為國家衛(wèi)計(jì)委(原衛(wèi)生部)批準(zhǔn)的新資源食品(公告2011年第9號)，公告規(guī)定的生產(chǎn)工藝以元寶楓種仁為原料，經(jīng)壓榨、脫色、脫臭等制成，神經(jīng)酸含量≥3％。磷蝦油為國家衛(wèi)計(jì)委(原衛(wèi)生部)批準(zhǔn)的新資源食品(公告2013年第16號)，公告規(guī)定的生產(chǎn)工藝以南極大磷蝦為原料，經(jīng)水洗、破碎、提取、濃縮、過濾等步驟制得，DHA含量≥3％。迷迭香提取物收載入食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2014)中，可添加到植物油脂、動(dòng)物油脂中作為食品添加劑使用，其中植物油脂中最大使用限量為0.7g/kg、動(dòng)物油脂中最大使用限量為0.3g/kg。
一種提高免疫力、治療三高的磷蝦油復(fù)方制劑(專利申請公布號：CN105146543A)公開了一種提高免疫力、治療三高的磷蝦油復(fù)方制劑。該制劑由磷蝦油78-85份、芥藍(lán)籽油12-18份、元寶楓籽油3-6份、美藤果油2-5份、長柄扁桃油4-9份、維生素E1-0.7份、蜂蠟2-7份組成。說明書記載的組成物質(zhì)除磷蝦油中要求總磷脂含量大于30％、EPA含量大于8％、DHA大于6％外，并無其他組成物質(zhì)的工藝及質(zhì)量要求。
本發(fā)明所述組合物由重量份數(shù)49～90份的元寶楓籽油、10～51份的磷蝦油、0.01～0.03份的脂溶性迷迭香提取物組成。其中，元寶楓籽油系采用元寶楓種仁為原料，經(jīng)85～90℃蒸炒40min、物理壓榨、真空過濾得到，神經(jīng)酸含量≥5％；磷蝦油系采用南極大磷蝦為原料，經(jīng)破碎、CO2超臨界抽提(添加濃度為95％、比例為蝦粉質(zhì)量10％的乙醇作夾帶劑、35℃、30MPa連續(xù)萃取1h)得到，DHA含量在4％～6％之間；脂溶性迷迭香提取物系采用迷迭香莖、葉為原料，經(jīng)粉碎、CO2超臨界抽提(采用95％乙醇與迷迭香葉質(zhì)量比2：5為夾帶劑、50℃、20MPa連續(xù)萃取4h)得到，鼠尾草酸含量在10％～20％之間。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一目的在于提供一種顯著提高穩(wěn)定性、吸收利用率及生物活性的組合物。第二目的在于提供該組合物的制備方法及應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
一方面，本發(fā)明提供一種顯著提高穩(wěn)定性、吸收利用率及生物活性的組合物，所述組合物由重量份數(shù)49～90份的元寶楓籽油，重量份數(shù)10～51份的磷蝦油，重量份數(shù)0.01～0.03份的脂溶性迷迭香提取物組成。
優(yōu)選地，所述組合物由重量份數(shù)54～76份的元寶楓籽油，重量份數(shù)24～46份的磷蝦油，重量份數(shù)0.013～0.027份的脂溶性迷迭香提取物組成。
進(jìn)一步優(yōu)選，所述組合物由重量份數(shù)60～67份的元寶楓籽油，重量份數(shù)33～40份的磷蝦油，重量份數(shù)0.016～0.024份的脂溶性迷迭香提取物組成。
最優(yōu)選，所述組合物由重量份數(shù)62～65份的元寶楓籽油，重量份數(shù)35～38份的磷蝦油，重量份數(shù)0.018～0.022份的脂溶性迷迭香提取物組成。
另一方面，本發(fā)明提供該組合物的制備方法，所述方法包括以下步驟：
步驟1：采用元寶楓種仁為原料，經(jīng)加熱至85～90℃蒸炒40min，選用95型螺旋榨油機(jī)(配真空擠壓式過濾機(jī))物理壓榨，得元寶楓籽油。檢測神經(jīng)酸的含量≥5％。
步驟2：以南極大磷蝦為原料，破碎后置HL-ⅡA型超臨界(CO2)流體萃取裝置中，選用濃度為95％、比例為蝦粉質(zhì)量10％的乙醇作為夾帶劑，在萃取溫度35℃、萃取壓力30MPa下連續(xù)萃取1h，得磷蝦油。檢測DHA含量在4％～6％之間。
步驟3：以迷迭香莖、葉為原料，粉碎后置HL-ⅡA型超臨界(CO2)流體萃取裝置中，選用濃度為95％、與迷迭香莖葉質(zhì)量比為2：5的乙醇作為夾帶劑，在萃取溫度50℃、萃取壓力20MPa下連續(xù)萃取4h，得脂溶性迷迭香提取物。其中，鼠尾草酸的含量在10％～20％之間。
步驟4：按本發(fā)明重量份數(shù)及優(yōu)選重量份數(shù)稱取步驟1～3制備的元寶楓籽油、磷蝦油、脂溶性迷迭香提取物，置潔凈不銹鋼容器中，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?，即得所述組合物。
此外，本發(fā)明還提供了上述組合物在制備用于改善記憶及認(rèn)知功能障礙的藥品、保健食品、功能性普通食品、特殊醫(yī)學(xué)食品、特殊膳食食品等方面的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比：本發(fā)明步驟1～3制備的元寶楓籽油、磷蝦油、脂溶性迷迭香提取物來源于新資源食品/食品添加劑但高于新資源食品/食品添加劑質(zhì)量要求，通過本發(fā)明組合物組成比例、優(yōu)選組成比例及具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證，達(dá)到顯著提高穩(wěn)定性、吸收利用率、改善記憶及認(rèn)知功能障礙的技術(shù)效果，具有顯著進(jìn)步和實(shí)質(zhì)性意義。
具體實(shí)施方式：
下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不以任何方式對本發(fā)明限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變化或替換，均屬本發(fā)明保護(hù)范圍。
實(shí)施例1：組合物料的制備
元寶楓籽油：取元寶楓種仁2000g，置蒸汽加熱炒鍋中加熱蒸炒40min，溫控85～90℃。取出置于95型螺旋榨油機(jī)(配備真空擠壓式過濾機(jī)裝置)物理壓榨，得元寶楓籽油720g，得率為36％，檢測神經(jīng)酸含量為6.0％。
磷蝦油：取南極大磷蝦1500g，置HL-ⅡA型超臨界(CO2)流體萃取裝置萃取釜中，連好管路，添加95％乙醇150g作為夾帶劑，開啟設(shè)備，設(shè)置萃取溫度為35℃，萃取壓力30MPa，待工藝參數(shù)穩(wěn)定后，連續(xù)萃取1h，收集萃取磷蝦油765g，得率為51％，檢測DHA含量為5.0％。
脂溶性迷迭香提取物：取2000g迷迭香莖葉粗粉，置HL-ⅡA型超臨界(CO2)流體萃取裝置的萃取釜中，連好管路，添加95％乙醇800g作為夾帶劑，設(shè)置萃取溫度50℃，萃取壓力20MPa，開啟設(shè)備待工藝參數(shù)穩(wěn)定后，連續(xù)萃取4h，收集萃取物得脂溶性迷迭香提取物224g，得率為11.2％，檢測鼠尾草酸的含量為15.0％。
實(shí)施例2：組合物制備
取實(shí)施例1制備的元寶楓籽油49g、磷蝦油51g、脂溶性迷迭香提取物0.01g，置潔凈不銹鋼容器中，充分?jǐn)嚢枋够旌暇鶆?，即得?/p>
實(shí)施例3：組合物制備
取實(shí)施例1制備的元寶楓籽油54g、磷蝦油46g、脂溶性迷迭香提取物0.013g，置潔凈不銹鋼容器中，充分?jǐn)嚢枋够旌暇鶆?，即得?/p>
實(shí)施例4：組合物制備
取實(shí)施例1制備的元寶楓籽油60g、磷蝦油40g、脂溶性迷迭香提取物0.016g，置潔凈不銹鋼容器中，充分?jǐn)嚢枋够旌暇鶆?，即得?/p>
實(shí)施例5：組合物制備
取實(shí)施例1制備的元寶楓籽油62g、磷蝦油38g、脂溶性迷迭香提取物0.022g，置不銹鋼容器中，充分?jǐn)嚢枋够旌暇鶆?，即得?/p>
實(shí)施例6：組合物制備
取實(shí)施例1制備的元寶楓籽油76g、磷蝦油24g、脂溶性迷迭香提取物0.027g，置不銹鋼容器中，充分?jǐn)嚢枋够旌暇鶆?，即得?/p>
實(shí)施例7：組合物制備
取實(shí)施例1制備的元寶楓籽油90g、磷蝦油10g、脂溶性迷迭香提取物0.03g，置不銹鋼容器中，充分?jǐn)嚢枋够旌暇鶆?，即得?/p>
實(shí)施例8：不添加輔料的軟膠囊制備
取實(shí)施例5制備的組合物以明膠、甘油和水作為囊材制備成改善記憶力的軟膠囊。
實(shí)施例9：添加輔料的軟膠囊制備
取實(shí)施例5制備的組合物，添加大豆油、玉米油、紅花油、橄欖油等植物油脂中的一種或幾種，并以明膠、甘油和水作為囊材制備成提高記憶和改善認(rèn)知功能障礙的軟膠囊。
實(shí)施例10：滴丸的制備
取實(shí)施例5制備的組合物，添加硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、蜂蠟、氫化植物油中的一種或幾種作為基質(zhì)，并以水或不同濃度乙醇作為冷凝介質(zhì)制備成改善認(rèn)知功能障礙的滴丸。
實(shí)施例11：膠囊劑、顆粒劑、片劑等固體口服制劑的制備
取實(shí)施例5制備的組合物，添加a-環(huán)糊精、β-糊精、羧甲基纖維素鈉、明膠、聚維酮、PEG-4000、PEG-6000等中的一種或幾種，通過包合、微囊化、固體分散技術(shù)中的一種或幾種，可制成提高記憶和改善認(rèn)知功能障礙的膠囊劑、顆粒劑、片劑等固體口服制劑。
為了更進(jìn)一步對本發(fā)明組合物技術(shù)效果進(jìn)行說明，本發(fā)明選取實(shí)施例5所制備的組合物作為試驗(yàn)樣品，編號為⑤。選取實(shí)施例1制備的元寶楓籽油、磷蝦油、脂溶性迷迭香提取物以及三者非本發(fā)明組合物比例制備的組合物(由實(shí)施例1制備的元寶楓籽油50g、磷蝦油100g、脂溶性迷迭香提取物0.05g混合制成)作為對照樣品，編號為依次為①、②、③、④。開展加速穩(wěn)定性、吸收利用率、水迷宮、跳臺(tái)、短暫性腦缺血所致記憶障礙的改善等比較試驗(yàn)，結(jié)果如下：
1.加速穩(wěn)定性試驗(yàn)
考察指標(biāo)確定：一方面，本發(fā)明組合物及其組成物質(zhì)均為植物/動(dòng)物油脂，根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，推薦選用過氧化值、碘值作為植物/動(dòng)物油脂酸敗程度及不飽和程度的穩(wěn)定性考察指標(biāo)【備注：鑒于脂溶性迷迭香提取物(樣品③)主要含萜類、酚類化合物，不適宜用過氧化值和碘值作為考察指標(biāo)，故本試驗(yàn)未開展所述指標(biāo)穩(wěn)定性考察】。另一方面，本發(fā)明組合物組成物質(zhì)均限制了功能成分含量限度，為充分驗(yàn)證加速試驗(yàn)條件下功能成分含量的穩(wěn)定性，本試驗(yàn)還選取組合物及各組成物質(zhì)所對應(yīng)的功能成分含量作為穩(wěn)定性考察指標(biāo)。
試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：分別取編號為①、②、③、④、⑤的試驗(yàn)樣品各100g，置于潔凈透明玻璃瓶中，按原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則(《中國藥典》2015版四部9001)，置溫度為40℃士2℃、相對濕度75％士5％的條件下放置6個(gè)月，分別于0個(gè)月、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月取樣測定過氧化值、碘值、組合物及組成物質(zhì)對應(yīng)的功能成分含量，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1、表2。
表1：過氧化值、碘值穩(wěn)定性考察結(jié)果
表2：對應(yīng)功能成分含量穩(wěn)定性考察結(jié)果
由表1、表2看出：經(jīng)6個(gè)月加速試驗(yàn)后，樣品①過氧化值增大約4.5倍，碘值降低約50％，功能成分神經(jīng)酸衰竭率為53％；樣品②過氧化值增大約3.3倍，碘值降低約50％，功能成分DHA衰竭率為56％；樣品③功能成分鼠尾草酸衰竭率為58％；樣品④過氧化值增大約2.5倍，碘值降低約1/3，組合物功能成分神經(jīng)酸衰竭率為36％、DHA衰竭率為38％、鼠尾草酸衰竭率60％；樣品⑤過氧化值、碘值未出現(xiàn)明顯變化，功能成分神經(jīng)酸衰竭率為2.2％、DHA衰竭率為7.3％、鼠尾草酸衰竭率6.1％。
試驗(yàn)結(jié)論：經(jīng)6個(gè)月加速穩(wěn)定性考察，樣品①～④均出現(xiàn)明顯酸敗/不飽和程度降低、功能成分含量明顯衰竭；樣品⑤(本發(fā)明所述組合物)酸敗/不飽和程度、功能成分含量變化不明顯，質(zhì)量穩(wěn)定。
2.吸收利用率試驗(yàn)
監(jiān)測指標(biāo)確定：以各組成物質(zhì)及其組合物對應(yīng)的功能成分為監(jiān)測指標(biāo)，考察灌胃給予試驗(yàn)樣品后被吸收進(jìn)入血液的功能成分濃度，從而計(jì)算吸收利用率。
試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：采用體重約3kg的健康家兔5只，隨機(jī)分為5組，預(yù)先禁食12h后，分別灌胃給予①～⑤號樣品各0.2g。給予樣品后3h從耳靜脈采血，檢測血液中各樣品對應(yīng)功能成分含量，按下述公式計(jì)算吸收利用率，結(jié)果見表3。
表3：試驗(yàn)樣品功能成分吸收利用率檢測結(jié)果
由表3看出：樣品①～③所對應(yīng)的功能成分吸收利用率均未超過30％；樣品④雖有所提高，但未超過55％，接近一半功能成分未被吸收利用；樣品⑤功能成分吸收利用率達(dá)到80％。
試驗(yàn)結(jié)論：樣品⑤中功能成分神經(jīng)酸吸收利用率為樣品①的2.9倍、為樣品④的1.6倍；DHA的吸收利用率為樣品②的2.9倍、樣品④的1.6倍；鼠尾草酸的吸收利用率為樣品③的3.4倍、樣品④的1.6倍。說明通過本發(fā)明制備的組合物，其功能成分吸收利用率較組合前各組成物質(zhì)顯著提高。
3.水迷宮試驗(yàn)
試驗(yàn)動(dòng)物及劑量：采用昆明種小鼠共50只，體重18～22g，雌雄各半。隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各5只。根據(jù)60kg成年人神經(jīng)酸日推薦劑量為0.125g這一公知常識(shí)，計(jì)算樣品①～⑤給樣劑量如下：小鼠神經(jīng)酸折算劑量為125mg/60kg×9.01＝18.7mg/kg，每只小鼠(平均體重20g)神經(jīng)酸折算劑量為0.374mg/只。據(jù)此：折算成樣品①的給樣劑量為6.23mg/只、折算成④的給樣劑量為18.71mg/只、折算成樣品⑤的給樣劑量為10.052mg/只。根據(jù)樣品⑤的給樣劑量折算樣品②的給樣劑量為3.82mg/只、樣品③的給樣劑量為0.002mg/只。
試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：各樣品組動(dòng)物連續(xù)給樣四周，末次給樣后次日開始訓(xùn)練，訓(xùn)練期間繼續(xù)給樣，水迷宮由直徑為250cm，高60cm的圓形水池構(gòu)成，水深15cm，水溫保持在25℃，距迷宮周邊50cm處有黃色簾布圍住迷宮，簾布上懸掛4個(gè)黑色標(biāo)示物分別對應(yīng)一個(gè)象限，在任一象限的水面下置一高11cm，面積為13cm×13cm的有機(jī)玻璃平臺(tái)供動(dòng)物逃避溺水，每次在水槽同一點(diǎn)釋放小鼠，記錄小鼠到達(dá)平臺(tái)的潛伏時(shí)間(s)，時(shí)間限定為120s，在120s內(nèi)未到達(dá)終點(diǎn)的動(dòng)物均計(jì)為120s，以此作為訓(xùn)練成績，每日訓(xùn)練四次，共訓(xùn)練11天，前7天為不可見平臺(tái)訓(xùn)練，即平臺(tái)被淹沒在水中，后4天為可見平臺(tái)訓(xùn)練，在平臺(tái)上樹立一標(biāo)志物，以便小鼠能夠確定平臺(tái)位置，試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，結(jié)果見表4。
表4：小鼠水迷宮試驗(yàn)結(jié)果
樣品⑤相較于樣品①～④，潛伏時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較P值均小于0.01，具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
試驗(yàn)結(jié)論：表4看出，樣品①、②、④潛伏時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示一定記憶改善作用，但改善的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯；樣品③潛伏時(shí)間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果接近120s，未顯示記憶改善作用；樣品⑤相較于樣品①、②、③、④潛伏時(shí)間顯著下降，顯示出良好的記憶改善作用。說明本發(fā)明所述的組合物對小鼠的學(xué)習(xí)記憶和空間記憶有顯著的改善作用。
4.跳臺(tái)試驗(yàn)
試驗(yàn)動(dòng)物及劑量：采用昆明種小鼠共50只，體重18～22g，雌雄各半。隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各5只。根據(jù)60kg成年人神經(jīng)酸日推薦劑量為0.125g這一公知常識(shí)，計(jì)算樣品①～⑤給樣劑量如下：小鼠神經(jīng)酸折算劑量為125mg/60kg×9.01＝18.7mg/kg，每只小鼠(平均體重20g)神經(jīng)酸折算劑量為0.374mg/只。據(jù)此：折算成樣品①的給樣劑量為6.23mg/只、折算成④的給樣劑量為18.71mg/只、折算成樣品⑤的給樣劑量為10.052mg/只。根據(jù)樣品⑤的給樣劑量折算樣品②的給樣劑量為3.82mg/只、樣品③的給樣劑量為0.002mg/只。
實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：各樣品組動(dòng)物連續(xù)給樣四周，末次給樣后次日開始訓(xùn)練，訓(xùn)練期間繼續(xù)給樣。實(shí)驗(yàn)裝置為一長方形反射箱，大小為10cm×10cm×60cm，用黑色塑料板分割成5間。地面鋪以銅柵，間距為0.5cm，可以通電，每間左后角置一高和直徑為4.5cm的平臺(tái)。將動(dòng)物放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3min，然后立即通以36V交流電。動(dòng)物受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)躲避傷害性刺激。多數(shù)動(dòng)物可能再次跳回至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺(tái)，如此訓(xùn)練5min，并記錄每只鼠受到電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，以此作為學(xué)習(xí)成績。24h后重新作測驗(yàn)，即記憶保持測驗(yàn)。記錄受電擊的動(dòng)物數(shù)、第一次跳下平臺(tái)的潛伏期和5min內(nèi)的錯(cuò)誤總數(shù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，結(jié)果見表5。
表5：小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果
樣品⑤相較于樣品①～④各組，其學(xué)習(xí)潛伏時(shí)間、學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)、記憶潛伏時(shí)間、記憶潛伏期、記憶錯(cuò)誤次數(shù)P值均小于0.01，具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
試驗(yàn)結(jié)論：表5看出，樣品⑤相較于樣品①～④，其小鼠應(yīng)激學(xué)習(xí)記憶改善作用具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明本發(fā)明所述的組合物對小鼠的應(yīng)激學(xué)習(xí)記憶有顯著的改善作用。
5.短暫性腦缺血所致的記憶障礙改善試驗(yàn)
試驗(yàn)動(dòng)物及劑量：昆明種6周齡雄性小鼠共50只，體重18～22g，隨機(jī)分為5組，每組10只。根據(jù)60kg成年人神經(jīng)酸日推薦劑量為0.125g這一公知常識(shí)，計(jì)算樣品①～⑤試驗(yàn)劑量如下：小鼠神經(jīng)酸折算劑量為125mg/60kg×9.01＝18.7mg/kg，每只小鼠(平均體重20g)神經(jīng)酸折算劑量為0.374mg/只。據(jù)此：折算成樣品①的給樣劑量為6.23mg/只、折算成④的給樣劑量為18.71mg/只、折算成樣品⑤的給樣劑量為10.052mg/只。根據(jù)樣品⑤的給樣劑量折算樣品②的給樣劑量為3.82mg/只、樣品③的給樣劑量為0.002mg/只。手術(shù)前3天按推薦的給樣劑量開始分別灌胃樣品至試驗(yàn)結(jié)束。以5％的水合氯醛作為麻醉劑，用量300mg/kg。
試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：以5％的水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉，待小鼠無翻正反射后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，保持呼吸通暢，常規(guī)消毒，經(jīng)頸部做0.8～1cm正中切口，切開皮膚和皮下組織，鈍性分離二腹肌和胸鎖乳突肌，暴露頸動(dòng)脈鞘，然后小心分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)約0.5～1cm，并于頸總動(dòng)脈下穿零號絲線，備用。提拉絲線，以無創(chuàng)傷性微動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)阻斷血流15min，然后去除，恢復(fù)灌注15min，如此反復(fù)3次，最后縫合皮膚，消毒，以青霉素肌注抗炎。
術(shù)后第5天灌胃1h后進(jìn)行避暗試驗(yàn)：將小鼠尾部朝向暗室放入避暗箱明室，小鼠進(jìn)入暗室會(huì)受到1～2次電擊，如小鼠不進(jìn)入，則驅(qū)入暗室，使之產(chǎn)生記憶，共5min。第2天進(jìn)行測試，記錄小鼠四肢全部進(jìn)入暗室的次數(shù)，進(jìn)入暗室的時(shí)間為潛伏期，如果300s小鼠未進(jìn)入暗室，錯(cuò)誤次數(shù)計(jì)為0次，潛伏期計(jì)為300s。試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，結(jié)果見表6。
表6：短暫性腦缺血所致的記憶障礙改善試驗(yàn)結(jié)果
樣品⑤相較于樣品①～④，其潛伏時(shí)間、錯(cuò)誤次數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果P值均小于0.01，具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
試驗(yàn)結(jié)論：表6看出，樣品⑤相較于樣品①～④，其小鼠因短暫性缺血所致記憶障礙改善均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明本發(fā)明所述的組合物對小鼠因短暫性缺血所致的記憶障礙有顯著的改善作用。