本公開涉及一種用于預防或治療慢性骨髓性白血病的藥物組合物以及使用該組合物預防或治療慢性骨髓性白血病的方法。

背景技術(shù)：

慢性骨髓性白血病(cml)是由造血干細胞的克隆物的異常擴增引起的異常骨髓增生性疾病。cml由通過染色體9和染色體22(t(9；22)(q34；q11))之間的易位產(chǎn)生的費城染色體引起。這種染色體易位導致染色體9上的abl基因和染色體22上的bcr基因之間的融合，并且該bcr-abl融合基因產(chǎn)生具有異常酪氨酸激酶活性的bcr-abl融合蛋白。bcr-abl酪氨酸激酶誘導異常細胞分裂。近來，cml患者在tki治療后出現(xiàn)酪氨酸激酶抑制劑(tki)不敏感性cml問題。由于tki僅靶向主動分裂的cml細胞，因此其沒有消除靜息cml干細胞。因此，為了cml的根本治療，需要殺死cml干細胞以及cml細胞。

轉(zhuǎn)化生長因子(tgf)-β是調(diào)節(jié)細胞增殖和分化、傷口愈合、細胞外基質(zhì)產(chǎn)生等的細胞因子。tgf-β家族屬于tgf-β超家族，該tgf-β超家族包括激活素、抑制素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和抗繆勒氏激素。各種癌癥晚期腫瘤內(nèi)的腫瘤細胞和基質(zhì)細胞通常過表達tgf-β。tgf-β會引起刺激血管生成和細胞運動性、抑制免疫系統(tǒng)、并增加腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用。tgf-β受體是絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，分為tgf-β受體1、tgf-β受體2和tgf-β受體3。其中，tgf-β受體1也稱為激活素a受體ii型樣激酶(alk5)。

因此，為了有效預防或治療cml，需要能夠有效抑制酪氨酸激酶和tgf-β信號通路的藥物組合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

問題的解決方案

提供用于預防或治療慢性骨髓性白血病的藥物組合物，該組合物包括具有tgf-β信號通路抑制活性的化合物和酪氨酸激酶抑制劑。

提供用于預防或治療慢性骨髓性白血病的方法，該方法包括向受試者給藥具有tgf-β信號通路抑制活性的化合物和酪氨酸激酶抑制劑。

發(fā)明的有益效果

根據(jù)一方面的用于預防或治療慢性骨髓性白血病的藥物組合物和使用其預防或治療慢性骨髓性白血病的方法可以用于有效地預防或治療慢性骨髓性白血病。

附圖說明

從以下結(jié)合附圖對實施方式的描述中，這些和/或其他方面將變得顯而易見并且更容易理解，其中：

圖1是示出在伊馬替尼、尼羅替尼、達沙替尼、帕納替尼或tew-7197單獨或其組合存在下培養(yǎng)的lt-cml干細胞的集落形成的圖。

圖2a是示出根據(jù)給藥的感染tt-cml的小鼠的存活率(％)的圖，圖2b是示出在多西環(huán)素治療結(jié)束后感染tg-cml的小鼠隨時間的存活率(％)的圖，圖2c是示出根據(jù)藥物給藥的感染tki抗性t315itt-cml的小鼠的存活率(％)的圖；

圖3a至圖3c分別是示出給藥了藥物的感染tt-cml的小鼠的外周血中的白細胞數(shù)的圖、其脾臟照片和示出其脾臟重量的圖。圖3d是示出給藥了tew-7197的感染tt-cml的小鼠的外周血中的總gfp/bcr-abl⁺細胞中的t細胞、b細胞和骨髓細胞的百分比(％)的圖；

圖4a是給藥了藥物的感染tt-cml的小鼠中的gfp/bcr-abl⁺kls⁺細胞(粗線框)和kls^-細胞(虛線框)的流式細胞術(shù)結(jié)果。圖4b是示出gfp⁺-cml細胞中cmlkls^-細胞的百分比(％)的圖，圖4c是示出gfp⁺-cml細胞中cmlkls⁺細胞的百分比(％)的圖；

圖5a是給藥了藥物的感染tt-cml的小鼠中t315ibcr-abl-gfp⁺kls⁺細胞(實線框)和kls^-細胞(虛線框)的流式細胞術(shù)結(jié)果。圖5b是示出t315ibcr-abl-gfp⁺細胞中t315ikls^-細胞的百分比(％)的圖，圖5c是示出t315ibcr-abl-gfp⁺細胞中t315ikls⁺細胞的百分比(％)的圖；和

圖6a至圖6c是示出從三名患者得到的人cml起始細胞的集落形成的圖。

具體實施方式

一方面提供用于預防或治療慢性骨髓性白血病(cml)的藥物組合物，所述組合物包括以下化學式i的化合物、其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或立體異構(gòu)體、或它們的組合；和酪氨酸激酶抑制劑：

[化學式i]

化學式i中，r^a可獨立地是h、鹵素、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c3-6環(huán)烷基、oh、-o-c1-6烷基、-o-c1-6鹵代烷基、-o-c3-6環(huán)烷基、nh2、-nh-c1-6烷基、-nh-c1-6鹵代烷基、-nh-c3-6環(huán)烷基、-s-c1-6烷基、-s-c1-6鹵代烷基、-s-c3-6環(huán)烷基、cn或no2；

m可以為0、1、2、3或4；

a¹和a²中任一個可以是n，另一個可以是nr¹，其中r¹是h、oh、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基或c3-6環(huán)烷基；

x可以是-nr^2-、-o-或-s-，其中r²是h或c1-3烷基；

r^b可各自獨立地為h、鹵素、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基、c3-6環(huán)烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、-(ch2)q-or³、-(ch2)q-nr³r⁴、-(ch2)q-sr³、-(ch2)q-no2、-(ch2)q-conhoh、-(ch2)q-cn、-(ch2)q-cor³、-(ch2)q-co2r³、-(ch2)q-conr³r⁴、-(ch2)q-四唑、-(ch2)q-ch＝ch-cn、-(ch2)q-ch＝ch-co2r³、-(ch2)q-ch＝ch-conr³r⁴、-(ch2)q-ch＝ch-四唑、-(ch2)q-nhcor³、-(ch2)q-nhco2r³、-(ch2)q-conhso2r³、-(ch2)q-nhso2r³、-(ch2)q-c＝c-cn、-(ch2)q-c＝c-co2r³、-(ch2)q-c＝c-conr³r⁴、-(ch2)q-c＝c-四唑、-(ch2)q-sor⁵、-(ch2)q-so2r⁵或-(ch2)r-(or³)2，其中r³和r⁴各自獨立地為h、c1-6烷基、c1-6鹵代烷基或c3-6環(huán)烷基，或和與其結(jié)合的氮原子一起形成單環(huán)，例如咪唑、吡咯烷、哌啶、嗎啉、哌嗪和高哌嗪；r⁵是c1-6烷基、c1-6鹵代烷基或c3-6環(huán)烷基；q是0、1、2、3或4；和r為1、2、3或4；

n可以為0、1、2、3、4或5。

烷基可以是直鏈或支鏈的。烷基的實例包括甲基、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。烷基可以被烷氧基、環(huán)烷氧基、氨基、硝基、羧基、氰基、鹵素、羥基、磺基或巰基中的一個或多個取代。

環(huán)烷基是例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。

鹵素是例如氟、氯、溴或碘。

烯基可以是直鏈或支鏈的。烯基是例如乙烯基、烯丙基、異戊二烯基、2-丁烯基和2-己烯基。烯基可以被例如烷氧基、環(huán)烷氧基、氨基、硝基、羧基、氰基、鹵素、羥基、磺基或巰基取代。

炔基可以是直鏈或支鏈的。炔基是例如乙炔基、炔丙基和2-丁炔基。炔基可以被例如烷氧基、環(huán)烷氧基、氨基、硝基、羧基、氰基、鹵素、羥基、磺基或巰基取代。

該化合物可以是以下化學式ii的化合物：

[化學式ii]

化學式ii的化合物是n-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺(稱為“tew-7197”)。

化學式i的化合物，例如化學式ii的化合物可以選擇性地抑制tgf-β受體1(alk5)和/或1b型激活素受體(acvr1b或alk-4)。

藥學上可接受的鹽可以是不會對給藥了化合物的生物體引起顯著刺激并且不會消除化合物的生物活性和特性的鹽。該鹽可以是例如無機酸鹽、有機酸鹽或金屬鹽。無機酸鹽可以是鹽酸、溴酸、磷酸、硫酸或焦硫酸的鹽。有機酸鹽可以是甲磺酸、甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、草酸、酒石酸、蘋果酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸、苯磺酸，樟腦磺酸、乙二磺酸、三氯乙酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甲磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、半乳糖醛酸、撲酸、谷氨酸，乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸或天冬氨酸的鹽。金屬鹽可以是鈣鹽、鈉鹽、鎂鹽、鍶鹽或鉀鹽。

溶劑合物可以是由溶質(zhì)分子和溶劑分子之間的吸引力形成的化合物。溶劑合物可以是例如水合物。

立體異構(gòu)體是指其原子具有相同的分子式和連接性但原子的空間排列不同的分子。立體異構(gòu)體可以是化學式i的化合物的非對映異構(gòu)體或?qū)τ钞悩?gòu)體。

術(shù)語“酪氨酸激酶(tk)”是指能夠?qū)tp的磷酸基團轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基的蛋白質(zhì)。酪氨酸激酶在細胞活性(例如信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)細胞分裂)中起重要作用。酪氨酸激酶可以是bcr-abl酪氨酸激酶。bcr-abl酪氨酸激酶可以是由染色體9上的abl基因和染色體22上的bcr基因之間的bcr-abl融合基因(由人染色體9和染色體22(t(9；22)(q34；q11))之間的易位引起)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。

術(shù)語“酪氨酸激酶抑制劑(tki)”是指抑制酪氨酸激酶的藥物。酪氨酸激酶抑制劑可以是bcr-abl酪氨酸激酶抑制劑。酪氨酸激酶抑制劑可以是例如伊馬替尼、達沙替尼(商品名：sprycel)、尼羅替尼(商品名：tasigna)、伯舒替尼、帕納替尼或其組合。伊馬替尼可以是甲磺酸伊馬替尼(商品名：gleevec或glivec)。

cml可以對酪氨酸激酶抑制劑有抗性。酪氨酸激酶抑制劑抗性包括在cml治療期間獲得的酪氨酸激酶抑制劑抗性以及對酪氨酸激酶抑制劑的初始抗性。酪氨酸激酶抑制劑抗性可能由依賴于bcr-abl的機制和獨立于bcr-abl的機制引起。依賴于bcr-abl的機制可以包括bcr-abl基因的擴增、bcr-abl基因的突變、酪氨酸激酶結(jié)合位點的突變、或其組合。bcr-abl基因的突變可以是磷酸結(jié)合環(huán)(p-loop)突變(例如g250e、q252h、y253f、y253h、e255k和e255v)。酪氨酸激酶結(jié)合位點的突變可以是例如t315i、t315a、f317l和f317v。例如，酪氨酸激酶抑制劑抗性可能由bcr-abl融合蛋白(t315i)引起，其中酪氨酸殘基被來自n末端的315位處的異亮氨酸殘基突變。獨立于bcr-abl的機制可以包括由p-糖蛋白引起的藥物流出、通過有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白1(oct1)的藥物輸入以及替代信號通路的激活，例如src家族激酶。由于tew-7197抑制cml干細胞，因此其可以對具有不同機制的任何酪氨酸激酶抑制劑抗性cml具有預防或治療作用。

如本文所用，術(shù)語“預防”是指通過給藥藥物組合物來限制或延緩慢性骨髓性白血病的發(fā)生的所有作用，術(shù)語“治療”是指通過給藥藥物組合物使慢性骨髓性白血病的癥狀得以好轉(zhuǎn)或得以有利地減輕的所有作用。

藥物組合物可以包括藥學上可接受的載體。載體包括賦形劑、稀釋劑或輔助劑。載體可以選自由乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、金合歡膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、生理鹽水、緩沖液例如pbs、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油組成的組。組合物可以包括填充劑、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、乳化劑、防腐劑等。

藥物組合物可以通過一般方法制備成任何制劑。組合物可以制備成例如口服制劑(例如粉劑、片劑、膠囊劑、糖漿、丸劑、顆粒劑)或腸胃外制劑(例如可注射制劑)。此外，組合物可以制備成局部制劑或全身制劑。

藥物組合物可以制備成單一組合物或分立組合物。

藥物組合物可以包括化學式i的化合物、其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或立體異構(gòu)體、或它們的組合；和有效量的酪氨酸激酶抑制劑。術(shù)語“有效量”是指當向需要預防或治療的受試者給藥時足以顯示預防或治療效果的量。本領域技術(shù)人員可以根據(jù)要選擇的細胞或受試者適當選擇有效量。有效量可以根據(jù)以下而定：疾病的嚴重程度、患者的年齡、體重、健康狀況、性別和藥物敏感性、給藥時間、給藥途徑、排泄率、治療期、與組合物混合或共同給藥的藥物以及醫(yī)療領域中眾所周知的其它因素?；瘜W式i的化合物、其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或立體異構(gòu)體、或它們的組合的有效量，基于藥物組合物，可以為約0.5μg至約2g、約1μg至約1g、約10μg至約500mg、約100μg至約100mg、約1mg至約90mg、約5mg至約80mg、約10mg至約70mg、約15mg至約60mg、或約20mg至約50mg。酪氨酸激酶抑制劑的有效量，基于藥物組合物，可以為約0.5μg至約2g、約1μg至約1g、約10μg至約500mg、約100μg至約100mg、約1mg至約50mg、約5mg至約40mg、或約10mg至約30mg。

藥物組合物的給藥劑量可以是例如每個成人約0.001mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg或約0.1mg/kg至約1mg/kg的范圍內(nèi)?？梢悦刻煲淮?、每天幾次、每周兩次或三次、每月一次至四次、或每年一次或十二次進行給藥。

另一方面提供預防或治療受試者的慢性骨髓性白血病的方法，所述方法包括向受試者給藥根據(jù)一方面的化學式i的化合物、其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或立體異構(gòu)體、或它們的組合；和酪氨酸激酶抑制劑。

化學式i的化合物、其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或立體異構(gòu)體、酪氨酸激酶、酪氨酸激酶抑制劑、慢性骨髓性白血病、預防和治療與上述相同。

受試者可以是哺乳動物，例如人、牛、馬、豬、狗、綿羊、山羊或貓。受試者可以是患有慢性骨髓性白血病或罹患慢性骨髓性白血病風險的受試者。

化合物、其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或立體異構(gòu)體、或它們的組合以及酪氨酸激酶抑制劑可以通過任何方式(例如口服給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、口腔給藥、透皮給藥、粘膜給藥、鼻內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥或皮下給藥)直接給藥于受試者?；衔铩⑵渌帉W上可接受的鹽、溶劑合物或立體異構(gòu)體、或它們的組合以及酪氨酸激酶抑制劑可以單獨或與其它藥學活性化合物一起被全身地或局部地給藥。

化合物、其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或立體異構(gòu)體、或它們的組合以及酪氨酸激酶抑制劑可以同時、單獨或順序地給藥。例如，在將達沙替尼給藥于受試者之后，可將化學式i的化合物、其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或立體異構(gòu)體、或它們的組合給藥于受試者。

化合物、其藥學上可接受的鹽、溶劑合物或立體異構(gòu)體、或它們的組合以及酪氨酸激酶抑制劑的優(yōu)選給藥劑量可以根據(jù)患者的狀況和體重、疾病的嚴重程度、藥物制劑、給藥途徑和給藥期而不同，但是可被本領域技術(shù)人員適當?shù)剡x擇。給藥劑量可以是每個成人例如在約0.001mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg或約0.1mg/kg至約1mg/kg的范圍內(nèi)?？梢悦刻煲淮巍⒚刻鞄状?、每周兩次或三次、每月一次至四次、或每年一次或十二次進行給藥。

現(xiàn)在將詳細參考實施方式(其實施例在附圖中示出)，其中相同的附圖標記始終表示相同的元件。在這方面，當前實施方式可以具有不同的形式，并且不應被解釋為限于本文中所闡述的說明。因此，下面僅通過參考附圖描述示例性實施方式來解釋本說明書的方面。如本文所用，術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)所列項的任何和所有組合。

在下文中，參考實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明。然而，這些實施例僅用于說明的目的，本發(fā)明不受這些實施例的限制。

實施例1.酪氨酸激酶抑制劑和tew-7197組合對cml治療效果的試驗

1.小鼠模型和cml干細胞的制備

通過使scl/tal1-ttatg小鼠(mice,stockno.006209,jacksonlaboratory)和tre-bcr-abl1轉(zhuǎn)基因小鼠(mice,stockno.006202,jacksonlaboratory)進行交配來制備scl/tal1-ttaxtre-bcr-abl1雙轉(zhuǎn)基因(tg)小鼠。維持這些小鼠，同時供應含有20mg/l多西環(huán)素(sigma-aldrich)的水。出生后5周，用不含多西環(huán)素的水代替含多西環(huán)素的水(多西環(huán)素結(jié)束)，以誘導bcr-abl1致癌基因的表達。多西環(huán)素結(jié)束后約2周至5周，轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)cml樣疾病。這些小鼠是scl-tta/bcr-abl-teto雙陽性小鼠，并被稱為四環(huán)素(tet)誘導型“感染tg-cml的小鼠”。

從tet誘導型感染tg-cml的小鼠中分離原始的長期(lt)-cml干細胞(cd150⁺cd135^-cd48^-c-kit⁺lineage^-sca-1⁺細胞)。

同時，將引入了人bcr-abl1-gfp基因的小鼠的造血干細胞移植到c57bl/6(sankyo-labservice,日本)小鼠中以制備感染轉(zhuǎn)導/移植(tt)-cml的小鼠模型(naka等,nature2010；463:676-680)。從感染tt-cml的小鼠中分離含有g(shù)fp/bcr-abl1-陽性和gfp/bcr-abl1t315i-陽性c-kit⁺lineage^-sca-1⁺(kls⁺)細胞的cml-mpp(多能祖細胞)(naka等,nature2010；463:676-680)。此外，通過上述方法將引入了人bcr-abl1t315i突變型gfp基因的小鼠造血干細胞移植到小鼠中以制備感染tki抗性t315itt-cml的小鼠(naka等,nature2010；463:676-680)。

2.藥物的制備

作為載體，將7ml37％(v/v)胃酸、2.0gnacl、3.2g胃蛋白酶(sigma-aldrich)和蒸餾水混合以制備1000ml人造胃液。

作為給藥藥物，將n-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺(以下稱為“tew-7197”)(syngene，india)溶解在載體中以制備2mg/ml的tew-7197溶液。作為tew-7197的比較對照，將ly2157299(selleckchemicals)溶解在載體中以制備ly2157299溶液。

此外，作為酪氨酸激酶抑制劑(tki)，分別將甲磺酸伊馬替尼(novartis)、尼羅替尼(novartis)、達沙替尼(bristo-myerssquibb)和帕納替尼(selleckchemicals,ap24534)溶于載體中以制備藥物。

3.酪氨酸激酶抑制劑和tew-7197組合對cml治療效果的體外試驗

將約100,000個小鼠間充質(zhì)干細胞、op-9細胞(crl-2749)作為單層在24孔板中培養(yǎng)約1天。將100,000個在1中制備的lt-cml干細胞加入到所培養(yǎng)的op-9細胞中以制備細胞培養(yǎng)液。

向細胞培養(yǎng)液中加入5μmtew-7197，將細胞在3％氧氣和37℃條件下培養(yǎng)約1天。第二天，分別向培養(yǎng)的細胞中加入1μm甲磺酸伊馬替尼、1μm尼羅替尼、1μm達沙替尼或1μm帕納替尼，并將細胞在3％氧氣和37℃的條件下培養(yǎng)約2天。lt-cml干細胞和op-9細胞的共培養(yǎng)期共3天。作為對照組，使用二甲基亞砜(dmso)代替藥物。此后，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞培養(yǎng)液，收集細胞。將收集的細胞在3％氧氣和37℃的條件下在甲基纖維素(干細胞技術(shù)，gfm3434)中培養(yǎng)約1周，并在培養(yǎng)的細胞中測量cml干細胞的集落形成。

在tew-7197、伊馬替尼、尼羅替尼、達沙替尼或帕納替尼單獨或以其組合存在下培養(yǎng)的lt-cml干細胞的集落形成如圖1中所示。如圖1中所示。與tew-7197、伊馬替尼、尼羅替尼或達沙替尼的單獨治療相比，在tew-7197與伊馬替尼、尼羅替尼、達沙替尼或帕納替尼的共處理中觀察到集落形成的顯著減少。特別地，tew-7197與達沙替尼的組合以及tew-7197與帕納替尼的組合顯著抑制了集落形成。因此，確認tew-7197與酪氨酸激酶抑制劑的組合對cml干細胞具有抑制作用。

4.酪氨酸激酶抑制劑和tew-7197的組合對小鼠存活率的體內(nèi)試驗

(1)伊馬替尼與tew-7197的組合對感染tt-cml的小鼠的效果

如在1中所述，將細胞移植到制備的感染tt-cml的小鼠中，在移植后第8天，口服給藥載體或伊馬替尼(200mg/kg/天)。從移植后的第15天到第90天，給藥：載體；載體和tew-7197(2.5mg/kg，每三天)；載體和伊馬替尼(200mg/kg/天)；伊馬替尼(200mg/kg/天)和ly2157299(150mg/kg，每三天)、或伊馬替尼(200mg/kg/天)和tew-7197(2.5mg/kg，每三天)。

給藥藥物后，監(jiān)測小鼠存活直到移植后第125天。根據(jù)該結(jié)果，計算感染tt-cml的小鼠隨時間的存活率(％)，結(jié)果如圖2a中所示(----：載體(n＝23)，─--─：載體和tew-7197(n＝24)，粗線：載體和伊馬替尼(n＝24)，─-─：伊馬替尼和ly2157299(n＝24)，實線：伊馬替尼和tew-7197(n＝24))。

如圖2a中所示。與單獨給藥伊馬替尼或tew-7197以及同時給藥伊馬替尼和ly2157299相比，同時給藥伊馬替尼和tew-7197提高了感染tt-cml的小鼠的存活率。因此，tew-7197和伊馬替尼的組合在體內(nèi)對cml顯示出預防或治療效果。

(2)達沙替尼和tew-7197的組合對感染tg-cml的小鼠的效果

為了檢驗tew-7197和達沙替尼的組合對感染tg-cml的小鼠的體內(nèi)治療效果，如1中所述制備感染tg-cml的小鼠。

將供給感染tg-cml的小鼠的水用不含多西環(huán)素的水替代。在多西環(huán)素治療結(jié)束后第1天至第36天，將感染tg-cml的小鼠以5mg/kg/天的劑量每天一次口服給藥達沙替尼。此外，在多西環(huán)素治療結(jié)束后第8天至第36天，每兩天口服給藥單獨的達沙替尼、或達沙替尼和tew-7197(2.5mg/kg/天)。作為對照組，使用不含藥物的載體。

在多西環(huán)素治療結(jié)束后，計算感染tg-cml的小鼠隨時間的存活率(％)，結(jié)果如圖2b中所示。(虛線：載體(n＝20)，粗線：單獨的達沙替尼(n＝12)，實線：達沙替尼和tew-7197(n＝11))。

如圖2b中所示，與對照組和單獨給藥達沙替尼相比，達沙替尼和tew-7197的同時給藥提高了感染tg-cml的小鼠的存活率。因此，確認tew-7197和達沙替尼的組合在體內(nèi)對cml顯示出預防或治療效果。

(3)帕納替尼和tew-7197的組合對感染tki抗性t315itt-cml的小鼠的效果

如1中所述，將細胞移植到制備的感染tki抗性t315itt-cml的小鼠中，并且在移植后第8天，口服給藥載體或帕納替尼(15mg/kg/天)。從移植后第15天到第60天，給藥：載體；載體和tew-7197(2.5mg/kg，每三天)；載體和帕納替尼(15mg/kg/天)；或帕納替尼(15mg/kg/天)和tew-7197(2.5mg/kg，每三天)。

給藥藥物后，監(jiān)測小鼠存活直到移植后第100天。由該結(jié)果計算感染tki抗性t315itt-cml的小鼠隨時間的存活率(％)，結(jié)果示于圖2c中(----：載體(n＝23)，實線：載體和tew-7197(n＝3)，粗線：載體和帕納替尼(n＝32)，―-─：帕納替尼和tew-7197(n＝32))。

如圖2c中所示，與單獨給藥帕納替尼或tew-7197相比，帕納替尼和tew-7197的同時給藥提高了感染tki抗性t315itt-cml的小鼠的存活率。因此，確認了tew-7197和帕納替尼的組合在體內(nèi)對酪氨酸激酶抗性cml具有預防或治療效果。

5.酪氨酸激酶抑制劑與tew-7197的組合的體內(nèi)效果

(1)達沙替尼和tew-7197的組合對感染tt-cml的小鼠的cml治療效果

對如1中所述制備的感染tt-cml的小鼠口服給藥如下藥物約30天：達沙替尼(5mg/kg/天)、tew-7197(2.5mg/kg/天，每三天)、或達沙替尼(5mg/kg/天)和tew-7197(2.5mg/kg/天，每三天)。

在圖3a中示出了給藥了藥物的感染tt-cml的小鼠的外周血中的白細胞數(shù)(n＝5，ns：不顯著)，在圖3b中示出了其脾臟的照片(比例尺：10mm)，在圖3c中示出了其脾臟的重量(n＝3)。此外，在圖3d中示出了在給藥了tew-7197的感染tt-cml的小鼠的外周血中的總bcr-abl1-gfp⁺細胞中t細胞(使用抗-cd4抗體和抗-cd8抗體檢測)、b細胞(使用抗-b220抗體檢測)和骨髓細胞(使用抗mac1抗體和抗gr-1抗體檢測)的百分比(％)(n＝3,ns：不顯著)。

如圖3a至3c中所示，與給藥該載體的對照組相比，在給藥了tew-7197的感染tt-cml的小鼠中外周血中白細胞數(shù)量增加并且脾腫大加劇。然而，在給藥了達沙替尼和tew-7197的感染tt-cml的小鼠中，外周血中白細胞數(shù)量的增加和脾腫大得以抑制。如圖3d中所示，給藥tew-7197不影響bcr-abl1-gfp⁺細胞中的骨髓細胞的分化。因此，確認了達沙替尼在體內(nèi)抑制由tew-7197誘導分化的cml細胞的增殖。

細胞移植后，向感染tt-cml的小鼠口服給藥以下藥物30天：達沙替尼(5mg/kg/天)、tew-7197(2.5mg/kg/天，每三天)、或達沙替尼(5mg/kg/天)和tew-7197(2.5mg/kg/天，每三天)。通過流式細胞術(shù)對外周血中的gfp/bcr-abl⁺c-kit⁺lineage^-sca-1⁺(kls⁺)細胞(粗線框)和c-kit⁺lineage^-sca-1^-(kls^-)細胞(虛線框)進行分析，結(jié)果示于圖4a中。將細胞在gfp⁺和lineage^-上門控，將感染tt-cml的小鼠的總gfp/bcr-abl⁺細胞中的gfp/bcr-abl⁺kls^-細胞和kls⁺細胞的百分比(％)分別示于圖4b和圖4c中(n＝3，ns：不顯著)。

如圖4a至圖4c中所示，在給藥了tew-7197的感染tt-cml的小鼠中，bcr-abl1-gfp⁺cml細胞中的kls^-細胞和kls⁺細胞的百分比(％)顯著降低。單獨給藥達沙替尼降低了cmlkls^-細胞的百分比，但是同時給藥達沙替尼和tew-7197進一步降低了cmlkls^-細胞的百分比，表明tew-7197抑制原始cml-mpp的自我更新能力，但是不抑制分化了的cml細胞的增殖。因此，同時給藥達沙替尼和tew-7197消除了對tki不敏感的cml-mpp，從而為cml患者提供治療效果。

(2)帕納替尼和tew-7197的組合對感染tki抗性t315itt-cml的小鼠的tml抗性cml治療效果

向根據(jù)1中所述制備的感染tki抗性t315itt-cml的小鼠口服給藥以下藥物30天：帕納替尼(5mg/kg/天)、tew-7197(2.5mg/kg/天，每3天)、或者帕納替尼(15mg/kg/天)和tew-7197(2.5mg/kg/天，每3天)。通過流式細胞術(shù)對外周血中的t315ibcr-abl-gfp⁺kls⁺細胞(粗線框)和kls^-細胞(虛線框)進行分析，將結(jié)果示于圖5a中。將細胞在gfp⁺和lineage^-上門控，將感染tki抗性t315itt-cml的小鼠的總t315ibcr-abl-gfp⁺細胞中的t315ibcr-abl-gfp⁺kls^-細胞和kls⁺細胞的百分比(％)分別示于圖5b和圖5c中(n＝3，ns：不顯著)

如圖5a至圖5c中所示，在給藥了tew-7197的感染tki抗性t315itt-cml的小鼠中，t315ibcr-abl-gfp⁺kls⁺細胞的百分比顯著下降。同時給藥帕納替尼和tew-7197進一步降低了t315ibcr-abl-gfp⁺kls⁺細胞的百分比。因此，同時給藥帕納替尼和tew-7197以及單獨給藥tew-7197有效限制了t315i-cmlkls⁺細胞的自我更新能力，從而為cml患者提供了治療效果。

6.達沙替尼和tew-7197的組合在體外對人cml起始細胞的集落形成的抑制效果

制備了三個慢性cml患者的骨髓單核細胞(allcells,cat.no.06-255,06-620,和147742,ca)。

用抗-cd34(8g12)抗體(bdbiosciences)、抗-cd38(hit2)抗體(bdbiosciences)、抗-cd3(sk7)抗體(bdbiosciences)、抗cd16(3g8)抗體(bdbiosciences)、抗-cd19(sj25c1)抗體(bdbiosciences)、抗-cd20(l27)抗體(bdbiosciences)、抗-cd14(mfp9)抗體(bdbiosciences)和抗-cd56(ncam16.2)抗體(bdbiosciences)對骨髓單核細胞進行染色。將識別cd3、cd16、cd19、cd20、cd14和cd56的小鼠抗體混合物用于鑒定lineage^-(lin-)細胞，并分離cd34⁺cd38^-lin^-細胞。在3％氧氣和37℃的條件下，在存在單獨的tew-7197、單獨的達沙替尼、或tew-7197和達沙替尼下，將cd34⁺cd38^-lin^--細胞與op-9基質(zhì)細胞(crl-2749)共培養(yǎng)。以相同的方式制備對照組，不同之處在于使用dmso。收集細胞并用pbs洗滌，然后在甲基纖維素(干細胞技術(shù)，gfm3434)中培養(yǎng)以測定人cml起始細胞的集落形成。如此測定的三個患者的人cml起始細胞的集落形成如圖6a至圖6c中所示。

如圖6a至圖6c中所示，tew-7197在體外顯著抑制人cml起始細胞的集落形成。此外，與單獨的達沙替尼治療相比，tew-7197和達沙替尼的共同治療顯著抑制人cml起始細胞的集落形成。因此，確認了tki和tew-7197的組合消除了人cml患者中的原始cml起始細胞。

應當理解，本文描述的示例性實施方式應僅在說明性意義上被考慮，而并非為了限制目的。對每個示例性實施方式中的特征或方面的描述通常被認為可用于其它示例性實施方式中的其它類似特征或方面。

雖然已經(jīng)參考附圖描述了一個或多個示例性實施方式，但是本領域普通技術(shù)人員應當理解，在不脫離由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍的情況下，可以對其形式和細節(jié)進行各種改變。