納米乳液的制作方法
本發(fā)明涉及納米乳液和納米乳液組合物的組分、制造方法和用途。納米乳液特別用于口腔藥物遞送。
背景技術(shù)：
藥物遞送是相當活躍和具有挑戰(zhàn)的領(lǐng)域。遞送已知的活性成分的新方法可以帶來相當大的益處，例如最小化治療特定病癥所需的藥物的量、保證藥物達到期望位置、提高便利性、控制釋放分布和改善患者依從性。特別地，口腔遞送經(jīng)常是期望的，但是由于大部分活性成分的疏水性質(zhì)而可能是困難的。
許多研究者已經(jīng)尋找了處理該問題的方式以及特別是處理藥物的不良水溶性的方式。
可以將包封用于分離和遞送活性材料。例如，wo2013/024307公開了使用兩親性支鏈聚合物形成包含活性材料的水包油乳液，隨后交聯(lián)聚合物形成膠囊。
weaveretal.,angew.chem.2009,121,2165-2168公開了將大乳液液滴組裝到更大規(guī)模的工程化結(jié)構(gòu)中。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明是基于已經(jīng)確定了在水性體系內(nèi)攜帶疏水材料的有效方式的研究。
本發(fā)明的第一方面提供了水包油乳液，其包含乳化劑，乳化劑是非凝膠的支鏈聚合物，其中所述聚合物的至少一些鏈的端部以5個或更多個碳原子的烷基鏈封端，并且其中水包油乳液采取具有不大于約1000nm的z均直徑的顆粒的形式。
因為它們的尺寸小，所以在本文中還將本發(fā)明的乳液稱為納米乳液。它們具有其中至少一個尺寸或其中z均直徑(還稱為平均流體力學直徑)不大于約1000nm的平均大小。它們可以具有小于800nm、或小于500nm、或小于300nm、例如約50至500nm或200至300nm的z均直徑。
相反，weaveretal.,angew.chem.2009,121,2165-2168沒有考慮到納米級結(jié)構(gòu)而是涉及較大的結(jié)構(gòu)。從具有9.2微米的平均直徑的水包油液滴開始，其將那些液滴凝聚為mm尺度的更大的球體，然后將那些球體凝聚為cm尺度的管或其他結(jié)構(gòu)。weaver等人沒有涉及藥物遞送應用。weaver等人的較大尺度的結(jié)構(gòu)感興趣的是墨噴式印刷和農(nóng)用化學品領(lǐng)域以及使用時關(guān)系到稀釋的其他領(lǐng)域。
烷基鏈是疏水的并因此與油相關(guān)聯(lián)，且將油相穩(wěn)定在水相中。
我們發(fā)現(xiàn)有效的穩(wěn)定在c5或更大的烷基、例如c6(己基)或更大的烷基發(fā)生，以及在某些情況下更大的穩(wěn)定發(fā)生在c8或更大的烷基、例如c10或更大的烷基、例如c12(十二烷基)或更大的烷基、例如c5至c20。
烷基鏈可以是支鏈或非支鏈的，或是支鏈和非支鏈的混合。
烷基鏈可以是飽和的或不飽和的，或飽和或不飽和的混合。
烷基鏈可以可選地是取代的。
合適的化合物的一個子集包括具有飽和的、未取代的c5-c20烷基鏈的那些；這些制備起來方便且劃算。
支鏈聚合物是非凝膠的和可加工的，即表現(xiàn)出合適的溶解度/相容性以允許溶解和用作乳化劑。其可以與不可溶和/或表現(xiàn)出高粘度的聚合物結(jié)構(gòu)，如大量交聯(lián)的不可溶聚合物網(wǎng)絡、高分子量直鏈聚合物或微凝膠相反。
支鏈聚合物可以是例如加成聚合物。支鏈聚合物可以是例如由不飽和的，例如乙烯基或烯丙基單體，如例如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯單體制成的聚合物。
可以通過已知的方法由單官能的乙烯基單體和二官能的乙烯基單體(支化劑)制備支鏈乙烯基聚合物。它們可以通過以下制備但不限于通過以下制備：活性聚合、受控聚合或常規(guī)的鏈生長聚合技術(shù)，如自由基聚合。幾種類型的活性和受控聚合是本領(lǐng)域已知的并適合用于本發(fā)明。優(yōu)選類型的受控的自由基聚合是原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(atrp)；然而通過有意添加鏈轉(zhuǎn)移劑控制的其他技術(shù)如可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(raft)和氮氧調(diào)控聚合(nitroxidemediatedpolymerization)(nmp)或常規(guī)的自由基聚合也是合適的合成反應。
技術(shù)人員知道提供支鏈但非凝膠化的乙烯基聚合物的技術(shù)。例如，以下描述了合適的流程：n.o’brien,a.mckee,d.c.sherrington,a.t.slarkanda.titterton,polymer2000,41,6027-6031；t.he,d.j.adams,m.f.butler,c.t.yeoh,a.i.cooperands.p.rannard,angew.chem.int.ed.2007,46,9243-9247；v.bütün,i.bannister,n.c.billingham,d.c.sherringtonands.p.armes,macromolecules2005,38,4977-4982；i.bannister,n.c.billingham,s.p.armes,s.p.rannardandp.findlay,macromolecules2006,39,7483-7492；和r.a.slater,t.omcdonald,d.j.adams,e.r.draper,j.v.m.weaverands.p.rannard,softmatter2012,8,9816-9827。本發(fā)明的非凝膠且可溶的產(chǎn)物不同于l.a.connal,r.vestberg,cj.hawkerandg.g.qiao,macromolecules2007,40,7855-7863中公開的，已知在凝膠化網(wǎng)絡中包含多重交聯(lián)的材料。
每個乙烯基聚合物鏈的聚合起始于引發(fā)劑。單官能乙烯基單體的聚合產(chǎn)生直聚合物鏈。
與二官能乙烯基單體的共聚產(chǎn)生鏈之間的支化。為了控制支化和防止凝膠化，每條鏈應存在少于一個有效的支化劑(二官能乙烯基單體)。在某些條件下，這可以通過使用小于一的支化劑與引發(fā)劑的摩爾比實現(xiàn)：這假設單體(即單官能乙烯基單體)和支化劑(即二官能乙烯基單體)具有相同的反應性，不存在分子內(nèi)反應，支化劑的兩個官能團具有相同或類似的反應性，以及反應性即使在部分反應之后也保持相同。當然，體系和條件可以不同，但是技術(shù)人員理解如何控制反應和在沒有過度實驗的情況下確定如何實現(xiàn)非凝膠結(jié)構(gòu)。例如，在稀釋條件下，一些支化劑形成限制在鏈之間支化的支化劑的數(shù)目的分子內(nèi)環(huán)，即使反應中的支化劑與引發(fā)劑(即聚合物鏈)的摩爾比高于1:1。
用于聚合過程的引發(fā)劑和其他試劑是本領(lǐng)域已知的。例如，在atrp中，方便的和有效的引發(fā)劑包括烷基鹵化物(例如烷基溴化物)，以及在常規(guī)的自由基聚合中，有效的引發(fā)劑包括偶氮化合物。
其他合適類型的支鏈聚合物包括支鏈聚酯。這些可以通過例如單官能的內(nèi)酯單體和二官能的內(nèi)酯單體(支化劑)的開環(huán)聚合制備。開環(huán)聚合方法和材料是本領(lǐng)域例如由nguyenetal.,polymchem2014,5,2997-3008已知的。
合適的支鏈聚合物的一個子集包括含有醚或聚醚部分的那些，例如含有聚乙二醇(peg)或聚氧化乙烯(peo)的那些，例如由包含醚基團的乙烯基單體制成的那些。我們發(fā)現(xiàn)這些便于制備且表現(xiàn)出良好的性能。不希望受到理論限制，看起來雖然烷基鏈充當油顆粒中的錨定物，但是醚部分促進水中的穩(wěn)定性。用于在制備具有peg基團的支鏈聚合物的方法中使用的合適的單體的實例是低聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(oegma)，也稱為peg-甲基丙烯酸酯。
這允許在兩個水平上并入多個醚部分：首先該單體已經(jīng)包含若干(例如5至15)個氧化乙烯部分；以及其次該單體可以經(jīng)由其乙烯基部分聚合，使得在經(jīng)由支鏈連接乙烯基聚合物鏈之前，其可以包含例如30至300個、例如50至200個、例如60至100個、例如約80個oegma單元(并因此高一個數(shù)量級的環(huán)氧乙烷部分)。
其他合適的單官能單體包括但不限于例如n-甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸羥丙基酯、n,n-二乙基氨基甲基丙烯酸乙酯、丙三醇甲基丙烯酸酯和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸膽堿?？梢允褂貌煌瑔误w的混合物來形成共聚物。
合適類型的二官能單體(即支化劑)包括例如包含兩個或更多個可聚合官能團，例如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯單體的那些。
合適的支化劑的一個實例是二甲基丙烯酸乙二醇酯(egdma)。其是方便且有效的。
可以經(jīng)由引發(fā)劑或鏈轉(zhuǎn)移劑，例如經(jīng)由溴化物引發(fā)劑(如溴代異丁酸酯)或硫醇鏈轉(zhuǎn)移劑將疏水的烷基鏈并入到支鏈聚合物中。因此，引發(fā)劑(或鏈轉(zhuǎn)移劑)可以包含5個或更多個碳原子的烷基鏈(如以上所定義的)。這是賦予要求的疏水特征以穩(wěn)定或“錨定”油滴的方便且有效的方式。而且，其是靈活的：其使得可以簡單地通過改變引發(fā)劑來容易地改變生成的聚合物的烷基鏈端部，并從而提供定制組合物的重要方式。
可以將本發(fā)明的支鏈聚合物理解為用鏈之間的支鏈保持在一起的許多直鏈聚合物鏈(優(yōu)選地每條鏈一條支鏈或更少)，使得一些鏈以疏水的烷基部分封端。這些疏水的“錨定物”不需要存在于每個聚合物鏈上。我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)當90％或更少、或75％或更少、或50％或更少、或甚至25％或更少的聚合物鏈端部攜帶要求的烷基鏈時，可以實現(xiàn)有效的乳化和有效的穩(wěn)定性。這意味著經(jīng)由引發(fā)劑并入疏水部分時，僅一些引發(fā)劑可以攜帶這些部分，且其他引發(fā)劑可以具有不同的結(jié)構(gòu)，例如可以具有更簡單的結(jié)構(gòu)，或可用于并入其他化學性質(zhì)或功能，例如靶向能力或其他用于治療、診斷或其他生物用途的能力。
我們還發(fā)現(xiàn)用于本發(fā)明的支鏈聚合物出乎意料地比包含類似的基團的對應的直鏈聚合物，例如由除支化劑外的對應的組分制成的那些更有效。
有利地，本發(fā)明的水包油乳液可以進一步包含由油相攜帶或溶解在油相中的材料。這可以是有機化合物、疏水材料或可溶于油或有機溶劑的材料。這種材料可以例如是生物學上有用的材料，例如治療或診斷上有用的材料，例如藥物或前藥。
本發(fā)明的產(chǎn)物因此可以優(yōu)選地是藥物組合物。
因此，本發(fā)明的進一步方面提供了如上所述的水包油乳液，用作藥劑。
本發(fā)明還提供了對應的醫(yī)療方法，包括將有效量的以上定義的水包油乳液給予至需要其的受試者。
該組合物在口腔藥物遞送中是特別有效的。我們發(fā)現(xiàn)該乳液不僅在保持優(yōu)異的穩(wěn)定性上而且在穿過模型內(nèi)臟系統(tǒng)上出乎意料地有效。
本發(fā)明的進一步方面提供了制備水包油乳液的方法，包括在乳化劑的存在下混合油相與水相，其中所述乳化劑是非凝膠的支鏈聚合物，其中所述聚合物的至少一些鏈的端部以5個或更多個碳原子的烷基鏈封端，并且其中水包油乳液采取具有不大于約1000nm的z均直徑的顆粒的形式。
乳液的乳化劑和其他組分的特征可以如以上所描述的。
在制備納米乳液的初始步驟中，可以將藥物和/或其他藥物組分溶解在油中。對于藥物用途和治療給予，油當然必須選自適用于并安全用于那些應用的油。技術(shù)人員熟知滿足這種標準的油。有利地，油將是用于攜帶的材料的良好的溶劑。
一些合適的油包括篦麻油、椰子油、十二烷酸、角鯊烯、花生油、芝麻油和大豆油。篦麻油對于某些藥物是特別優(yōu)選的。
用藥物來飽和油將給出藥物在最終的乳液中的最大可能的濃度。如果需要，可以容易地稀釋納米乳液。相反，一旦形成則可能難以濃縮乳液：一種濃縮方法包括凍干，但是這可以降低穩(wěn)定性和改變直徑。
我們制備了具有各種不同的藥物的許多乳液。理論上，本發(fā)明適用于具有不良的水溶性的任何親脂性的/疏水性的藥物。
一些合適的藥物的非限制性實例包括例如抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物洛匹那韋(lpv)和依法韋侖(efv)及抗生素利福平和紅霉素。實際上，可以將約50mg/ml的依法韋侖或25mg/ml的洛匹那韋溶解在篦麻油中。
我們還制備了其中攜帶各種其他疏水材料例如姜黃素、熒光素和尼羅紅的制劑。
可選地，在制備流程中，除了油之外，可以使用另外的溶劑。其與油是可互溶的且還溶解藥物。另外的溶劑存在于最終的乳液中并因此是可以通過蒸發(fā)或其他方法除去的溶劑。
合適的揮發(fā)溶劑包括例如乙酸乙酯、己烷、丙酮或thf。乙酸乙酯是優(yōu)選的溶劑：其與水不互溶，溶解油，容易和迅速地蒸發(fā)，并具有低毒性。
將油(其中溶解藥物等)與揮發(fā)溶劑混合?？梢赃x擇油與溶劑的比率來定制納米乳液液滴的大小。典型地，溶劑與油比率越高，最終的乳液中的液滴越小。
按體積計溶劑相對于油的量可以是例如50:50或更大、例如60:40或更大、例如70:30或更大、例如80:20或更大、例如90:10或更大、例如95:5或更大、例如99:1或更大、例如95:5至99.9:0.1、例如約99:1。
通過混合油相(可選地包含揮發(fā)溶劑)與支鏈聚合物的水溶液方便地形成乳液。
可以選擇水相相對于油相的量和水相內(nèi)的支鏈聚合物的濃度來定制乳液的性質(zhì)和性能。應該使用足夠的聚合物來穩(wěn)定納米乳液液滴。聚合物的濃度可以影響液滴的大小。不希望受到理論限制，相信較低量的聚合物導致較大的液滴，因為沒有足夠的聚合物來完全包封液滴并因此導致聚集。相反，通常存在需要的聚合物的上限，使得在該量以上，將觀察不到進一步的穩(wěn)定益處并產(chǎn)生溶液中游離的聚合物。
在一些情況下，水相中的聚合物的優(yōu)選的濃度(w/v)選自約0.1-99.9％、0.5-99％、1-90％、1-50％、1-20％、2-10％、3-7％或約5％。
在一些情況下，油(+溶劑)相的量相對于水相的量(v/v)是約90:10至10:90、或75:25至25:75、或60:40至40:60、或約50:50。
可以使用任何合適的方法或裝置混合和均勻化油相和水相來產(chǎn)生水包油乳液。通常，乳液將包含納米尺寸的液滴并將通過乳白色和黏稠度識別。
可以通過任何合適的方法，例如通過使得其蒸發(fā)、和/或通過稀釋和攪拌和/或通過使氣體(例如惰性氣體，例如氮氣)流過材料，除去揮發(fā)性溶劑。我們發(fā)現(xiàn)的一個簡單和有效的方法是簡單地將材料置于未密封的容器中并事情蒸發(fā)(例如在通風櫥中)12-48小時、通常約24小時的時間。
蒸發(fā)或除去溶劑導致形成處于其最終形式的乳液。其具有存在于油相中的藥物和/或其他疏水的組分，由于納米液滴上的聚合物的“涂覆”，油相穩(wěn)定在水中。通過動態(tài)光散射(dls)確定的z均直徑通常是100-500nm、例如200-300nm。
可以在25℃下通過dls測量z均直徑。
納米乳液在存儲和稀釋時是穩(wěn)定的。
如以下所描述的，我們還觀察到納米乳液制劑的抗凝血劑效果，并因此本發(fā)明的進一步方面提供了所述乳液，用作抗凝血劑。
水包油乳液可以具有與上述的那些不同尺寸的顆粒或液滴，即不一定具有不大于約1000nm的z均直徑。換句話說，在進一步的方面，本發(fā)明提供了包含乳化劑的水包油乳液，乳化劑是非凝膠的支鏈聚合物，其中所述聚合物的至少一些鏈的端部以5個或更多個碳原子的烷基鏈封端。這種乳液和對應的組合物的其他特征、用途和方法可以如上所述。
附圖說明
現(xiàn)在將參考以下實施例和附圖描述本發(fā)明的進一步的非限制性的細節(jié)，其中：
圖1示出了通過在制備過程中改變?nèi)軇┡c油的比率所導致的本發(fā)明的納米乳液的直徑的變化；
圖2示出了存儲時納米乳液樣品的z均直徑；
圖3示出了聚合物的量對納米乳液直徑的影響；
圖4示出了連續(xù)稀釋之后納米乳液的z均直徑；
圖5至7示出了與對照相比關(guān)于本發(fā)明的納米乳液的免疫結(jié)果；
圖8示出了納米乳液對血漿凝結(jié)的影響-用依法韋侖、空白納米乳液和包含依法韋侖的納米乳液處理健康志愿者的血漿，之后分析凝血酶原時間(a)、凝血酶時間(b)和活化部分凝血活酶時間(c)；
圖9示出了本發(fā)明的納米乳液-藥物制劑與對照藥物制劑相比的療效；
圖10和11示出了與對應的直鏈聚合物乳化劑(比較例)相比，由根據(jù)本發(fā)明的支鏈聚合物乳化劑提供的穩(wěn)定性；
圖12示出了與其他引發(fā)劑相比，用根據(jù)本發(fā)明的混合引發(fā)劑制備的某些乳液的平均液滴尺寸是如何作為疏水引發(fā)劑的量的函數(shù)變化的；
圖13示出了與lpv的水溶液的跨細胞滲透相比，負載lpv的納米乳液的跨細胞滲透；以及
圖14示出了與efv的水溶液的跨細胞滲透相比，負載efv的納米乳液的跨細胞滲透。
具體實施方式
實施例
第1部分：支鏈聚合物(包含十二烷基部分、使用egdma鏈接的polyoegmadp80鏈)的制備、及其制備并入藥物的納米乳液的用途以及這些納米乳液的安全性和療效研究
聚合物的制備
可以使用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(atrp)制造用于穩(wěn)定納米乳液的聚合物，原子轉(zhuǎn)移自由基聚合是受控的聚合方法，允許限定具體的聚合度(dp)。根據(jù)本發(fā)明的可溶于水的聚合物的一個實例基于polyoegmadp80。
使用dp80，是指每聚合物鏈存在約80個單體單元(oegma)。通過將egdma用作支化劑一起支化這些直鏈。
首先，在圓底燒瓶中稱取單體的量(oegma，mw300)。去除天平皮重，然后添加恰當量的egdma支鏈使得與單體相比摩爾比是0.95。然后添加十二烷基引發(fā)劑(2-溴代異丁酸十二烷基酯)，隨后添加少量的苯甲醚，其用作之后的nmr分析的內(nèi)標。最后，添加反應溶劑(ipa：h2o；92.5:7.5)。將燒瓶用橡膠塞蓋住，并固定在通風櫥中的夾具上。將氮氣通過塞泵入燒瓶中以通過塞中在氮氣入口針頭旁邊插入的小規(guī)格針頭除去燒瓶中的任何氧氣(氧氣通過淬滅自由基物質(zhì)滅活反應)。
除氣10分鐘之后，迅速稱重氯化銅和bpy并在秤盤中組合，然后通過稍微移開塞子小心添加到反應混合物中來滴入cucl/bpy混合物。其添加啟動反應，并再密封燒瓶并使其進一步除氣10分鐘，該點之后移除出口針頭和氮氣入口。消耗約8小時來完成反應，并通過每小時的nmr樣品測定聚合％確認反應完成。通過分析凝膠滲透色譜確定聚合物的分子量。
該流程的精確反應量如下：
oegma9.44g
十二烷基引發(fā)劑0.118g
egdma62.5ul
苯甲醚400ul
cucl0.034g
bpy0.137g
溶劑12mls
納米乳液的制備
生產(chǎn)溶解在篦麻油中的藥物的儲備溶液(50mg/ml依法韋侖在篦麻油中或25mg/ml的洛匹那韋在相同的油中)。
將負載藥物的油轉(zhuǎn)移到玻璃小瓶中，并添加溶劑以達到99:1的溶劑與油比率。對于該比率，將30ul的油添加到小瓶中，然后與2970ul的揮發(fā)溶劑(乙酸乙酯)混合。
改變?nèi)軇┡c油的比率對改變最終的納米乳液的直徑有影響(圖1)。圖1示出了基于使用本文所描述的支鏈聚合物與篦麻油、乙酸乙酯和依法韋侖，通過dls確定的最終的納米乳液的z平均值。
以5％(w/v)的濃度下向3ml的油/溶劑中添加3ml可溶于水的支鏈聚合物。均勻化之前最終的溶液組成6ml。
使用5％(w/v)的濃度，因為其完全穩(wěn)定納米乳液液滴，給予它們最小的直徑，并允許在均勻化之后在該直徑下穩(wěn)定大于2年(圖2)。在圖2中，“e652011年7月”是在2011年7月制造的樣品，存儲然后在2013年7月改變尺寸。隨著時間觀察到優(yōu)異的穩(wěn)定性。dmem和rmpi是其中分散了e65的細胞培養(yǎng)物介質(zhì)，然后存儲在冰箱中并在三個月后改變尺寸(e65是基于使用本文所描述的支鏈聚合物與篦麻油、乙酸乙酯和依法韋侖的樣品)。
即使當溶劑與油的比率保持不變時，改變聚合物的濃度也增加液滴的直徑。這表明在較低的濃度下不存在足夠的聚合物來完全包封油滴，導致它們聚集(圖3)。圖3示出了作為水相中的支鏈聚合物的濃度的函數(shù)的對于最終的乳液的z均直徑。在5％(w/v)以上的濃度下，沒有觀察到直徑的進一步降低，因此使用該值以上的濃度僅導致納米乳液中殘留的游離聚合物。
使用安裝有s25n-10g分散元件并設置為25,000rpm的最大速度的ultrathuraxxt-25數(shù)字勻漿器使兩相溶液均勻化2分鐘。在2分鐘期間，順時針方向旋轉(zhuǎn)小瓶30秒，逆時針旋轉(zhuǎn)30秒，然后上下旋轉(zhuǎn)1分鐘。
可以使用任何合適的勻漿器，條件是其能夠具有充分混合物溶液并將油“切碎”為納米尺寸的液滴所必需的力?？梢愿淖冃D(zhuǎn)小瓶的過程，但是在本實驗中，將其保持相同以實現(xiàn)納米乳液的批次之間的連續(xù)性。
均勻化之后，可以通過它們現(xiàn)在的乳白色和黏稠度看出樣品被乳化。
在不封蓋的情況下將小瓶置于通風櫥中24小時，這使得揮發(fā)溶劑在環(huán)境溫度下蒸發(fā)并使油滴瓦解，導致形成高度穩(wěn)定的水包油乳液。用于除去揮發(fā)溶劑的其他方法包括稀釋到水中和攪拌，并且稀釋到水中并使氮氣流過樣品。這些方法中生產(chǎn)的液滴的直徑與簡單地將小瓶放置整夜相同。
藥物存在于油相中，通過聚合物的覆蓋而穩(wěn)定，并具有通過dls確定的約200-300nm的z均直徑(圖2)。在該方法中制備的樣品的最終體積是3ml。
當稀釋以得到對于各種細胞分析適當?shù)臐舛葧r，最終的納米乳液也保持穩(wěn)定。通過稀釋納米乳液直到不再能通過dls看到而確認(圖4)。
納米乳液安全性
使用三個單獨的試驗流程進行免疫學評估。對于所有實驗，使用了利用ficoll離心梯度法從全血中提取的外周血單核細胞。
最初，使用通過磁分離使用macs系統(tǒng)(miltenyibiotech)從pbmc分離的cd4+和cd8+細胞兩者確定細胞表面活化標記物(cd25、cd44、cd69和cd95)的表達。數(shù)據(jù)示出不存在由于暴露于納米乳液制劑導致的活化標記物的表達的增加，指示至少在體外非免疫原性的化合物。實際上，在對細胞表面標記物的表達的影響方面，納米乳液與標準水溶液是相當?shù)?圖5)。
圖5示出了暴露于洛匹那韋(lpv)和依法韋侖(efv)的水溶液或納米乳液(n)制劑24小時之后細胞表面激活標記物的表達水平。如上所述，使用99:1乙酸乙酯：篦麻油，以及如上所述的支鏈聚合物(具有c12烷基部分并使用egdma支化的polyoegma)制備納米乳液，且納米乳液包含lpv或efv(“nlpv”或“nefv”-“n”表示納米乳液)或完全不包含藥物(“空白”)。從上到下的圖例在每種情況下對應于從左到右的條。
分離表達試驗的細胞外介質(zhì)并使用bioplex200系統(tǒng)和試驗試劑盒(bio-rad)分析細胞因子il-2、il-10和ifnγ的分泌水平。用t細胞活化試劑盒(miltenyibiotech)預刺激的細胞的數(shù)據(jù)示出了由暴露于納米乳液的那些細胞分泌的細胞因子的水平與在暴露于相同藥物的水溶液之后觀察到的那些類似。在ifnγ的情況下，lpv納米乳液在其分泌分布方面相比lpv的水溶液與對照更加相當(圖6)。圖6示出了用含水或納米乳液arv制劑溫育24小時之后細胞因子il-2(1)、il-10(2)和ifng(3)的分泌水平。在未刺激的細胞上進行相同的實驗，結(jié)果示出在所有條件下不可檢測的細胞因子水平(數(shù)據(jù)未示出)。
還使用3h-胸苷并入試驗研究了納米乳液對pbmc的細胞增殖的影響。簡要地，在水溶液或納米乳液等價物存在下，使pbmc生長72小時，其中在溫育的最后16小時期間添加3h-胸苷。使用放射分析確定這些溫育對增殖的任何影響。在添加或不添加用于刺激細胞增殖的植物血球凝集素(pha)的情況下進行實驗。數(shù)據(jù)示出在所有制劑和添加下，在處理和未處理的細胞之間沒有觀察到差異(圖7)。
抗凝血劑療效
還評估了納米乳液制劑對血漿凝結(jié)的影響。通過靜脈穿刺術(shù)將來自三個供體的人血液收集到用檸檬酸鈉抗凝結(jié)的管中；在收集的一個小時內(nèi)使用血液。通過在2500xg下、在21℃下離心血液10分鐘來制備測試血漿，并且收集并聚集得到的血漿。將聚集的血漿穩(wěn)定在室溫下8小時。以需要的最終濃度的10x制備納米乳液樣品以在添加到測試血漿中時提供稀釋。濃度和隨后的稀釋是基于包含在樣品內(nèi)的依法韋侖的濃度，并且以相同的方式稀釋空白納米乳液。測試的最終濃度是40μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml和0.16μg/ml。將納米乳液樣品與測試血漿混合并在37℃下溫育30分鐘。制備三份每種納米乳液制劑。將代表正常和不正常血漿(凝結(jié)延遲的血漿)的凍干的對照用蒸餾水(2ml)重組并在使用之前置于室溫下平衡30分鐘。
試驗設計為捕獲納米乳液與三種主要凝結(jié)途徑的組分的相互相用；內(nèi)源性途徑(也稱為接觸活化途徑，因為其由損傷的表面激活)、外源性途徑(也稱為組織因子途徑)和最終共同途徑(finalcommonpathway)。將活化部分凝血活酶時間(aptt)試驗用于評估內(nèi)源性途徑，而凝血酶原時間(pt)試驗是外源性途徑的量度。凝血酶時間(tt)是最終共同途徑的作用的指示。
將試管放置到抗凝計上的a、b、c和d測試行，并將一個金屬球添加到每個試管(在使用之前溫熱至少3分鐘)中。當測試pt或凝血酶時間時，將100μl的對照或測試血漿的任一種添加到試管中，并且當測試aptt時，添加50μl，其中對于每個血漿樣品用三個重復的試管。另外，對于aptt測定，還添加50μl的ptt-a。對于每個測試行開始計時器，并且在響鈴提示之前10秒將試管轉(zhuǎn)移到pip行中。一旦溫育時間完成，將凝結(jié)試劑添加到每個試管中并記錄凝結(jié)時間。根據(jù)下式計算每個對照和測試樣品的百分比變化系數(shù)：％cv＝sd/平均值x100％。如果對于研究樣品％cv大于5％，則重新分析該樣品。將數(shù)據(jù)表達為對于不存在納米材料的血漿(僅血漿的對照)記錄的凝結(jié)時間的百分比。
觀察到依法韋侖溶液、空白納米乳液或包含依法韋侖的納米乳液對pt(圖8a)或tt(圖8b)沒有影響。對于40μg/ml(大159％的凝結(jié)時間)和4μg/ml(大52％的凝結(jié)時間)的空白納米乳液觀察到aptt試驗中(圖8c)凝結(jié)時間顯著延長。40μg/ml(大147％的凝結(jié)時間)和4μg/ml(大88％的延長時間)的包含依法韋侖的納米乳液對延長時間具有類似的影響。然而，依法韋侖溶液對凝結(jié)時間完全沒有影響，表明aptt的延長受納米乳液或組成材料本身的影響。
此處，我們證明了新型納米乳液的抗血凝性質(zhì)。另外，已證明這種納米乳液經(jīng)由一種特殊的凝結(jié)途徑延長凝結(jié)時間，從而潛在地減輕不希望的副作用。
抗病毒藥物的療效
針對適應實驗室的菌株hiv-1iiib評估納米乳液制劑的抗病毒活性，在暴露于病毒(有和沒有水溶液或納米乳液)之后使用mtt試驗確定人淋巴細胞cd4+細胞系(mt4)的存活率。將細胞溫育5天的時間。數(shù)據(jù)示出納米乳液制劑的抗病毒活性與水溶液的那些類似，分別是對于lpv和efv的0.46μm和0.18μm的ic50值。
圖9示出基于用lpv(頂部)和efv(底部)的含水或納米乳液制劑溫育的mt4細胞的存活率的hiv-1iiib的病毒殺傷曲線。
納米乳液efv的劑量響應曲線與含水efv的那些相同，而納米乳液lpv與水溶液相比在較低的濃度下具有更大的病毒殺傷。
因此，本發(fā)明提供了不僅表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性而且還沒有顯示細胞毒性或免疫應答問題且此外有效的組合物。
第2部分：改變疏水基團的類型和量，包括使用混合引發(fā)劑的影響以及與類似的直鏈聚合物相比支鏈聚合物的性能的進一步研究
引發(fā)劑
通過用伯醇酯化α-溴代異丁酰溴制備具有不同的疏水性的若干atrp引發(fā)劑。這些引發(fā)劑以疏水性降序包括以下：
-溴代異丁酸十二烷基酯(dbib)，c12引發(fā)劑
-溴代異丁酸己基酯(hbib)，c6引發(fā)劑
-異丁酸乙酯(ebib)，c2引發(fā)劑
-peg750溴代異丁酸酯(pbib)，聚氧化乙烯大分子引發(fā)劑
根據(jù)在以下反應方案中概括的反應制備這些引發(fā)劑(ebib也購自sigmaaldrich)。從sigmaaldrich購買試劑。由具有750gmol-1平均分子量的單乙氧基peg合成peg引發(fā)劑。
聚合物的制備
將引發(fā)劑用于聚合oegma來得到直鏈聚合物以及用于制備oegma和egdma以得到統(tǒng)計學的支鏈聚合物。使用0.80:1的支化劑(egdma)與引發(fā)劑的比率以避免凝膠化。
使用單種引發(fā)劑進行聚合以產(chǎn)生相同官能化的端基，以及使用混合的引發(fā)劑來產(chǎn)生具有混合的端基官能團的統(tǒng)計學聚合物。
以每條直鏈80單元的單體oegma的目標聚合度(dp)進行聚合；將得到的直鏈聚合物表示為poegma80。這用每種引發(fā)劑進行；在每種情況下，聚合達到85-90％的轉(zhuǎn)化率來產(chǎn)生具有類似的重量性質(zhì)(根據(jù)gpc)的直鏈聚合物，如下表所示。
在egdma存在下通過聚合制備支鏈類似物。優(yōu)化聚合以得到超過
99％的單體轉(zhuǎn)化率，并且在引發(fā)劑范圍內(nèi)再次觀察到類似的分子量性質(zhì)，
如下表所示。
因此，通過改變引發(fā)劑可以定制疏水性而不顯著改變聚合物的其他性質(zhì)。
使用混合的引發(fā)劑制備另外的支鏈類似物。測試了各種體系。通過舉例的方式，一種代表性體系使用不同比率的dbib和ebib。再次，反應進行為超過99％的單體轉(zhuǎn)化率并產(chǎn)生類似的分子量特征的聚合物，如下表所示。因此，本發(fā)明允許細調(diào)疏水性，以及允許靈活性，因為可以出于其他原因改變引發(fā)劑。
聚合物作為乳化劑的用途
在模型體系中，使用按體積計1:1的十二烷油和聚合物水溶液制備乳液。使用高剪切混合器均勻化乳液兩分鐘。在不存在聚合物乳化劑的情況下，相分離在5分鐘內(nèi)產(chǎn)生。
由直鏈聚合物和支鏈聚合物制備的乳液的比較
將dbib、hbib和ebib各自單獨用于直鏈poegma80的聚合和支鏈poegma80-egdma0.8的聚合。然后將這些用于制備乳液。在29天時間周期內(nèi)研究乳液的平均液滴尺寸和分布。
直鏈聚合物產(chǎn)生具有開始的類似液滴尺寸的乳液，但是之后平均液滴尺寸取決于使用的引發(fā)劑增加不同的程度(ebib產(chǎn)生最不穩(wěn)定的乳液，隨后是hbib，隨后是pbib)。相反，所有支鏈聚合物在整個時間周期內(nèi)保持穩(wěn)定；沒有觀察到凝聚且沒有看到平均液滴尺寸隨時間的顯著變化，這對于所有支鏈聚合物是類似的。與圖10(示出使用對應的直鏈聚合物制備的乳液作為時間的函數(shù)的平均液滴尺寸)相比，在圖11(示出使用支鏈聚合物制備的乳液作為時間的函數(shù)的平均液滴尺寸)中看到差異。
不希望受到理論限制，支鏈構(gòu)造似乎由于多端基效應，多個錨定物組裝在同一結(jié)構(gòu)中而提供了增加的錨定能力。
由具有混合引發(fā)劑的支鏈聚合物制備的乳液
使用混合的引發(fā)劑體系制備若干支鏈poegma80-egdma0.8聚合物，并將其用于制備乳液。一個非限制性的實例組使用不同比率的dbib和ebib，如下表所示。
與疏水的dbib相比，ebib是相對親水的。即使當存在一些ebib時，dbib也提供良好的錨定效果。事實上，可以看出即使少至25mol％的dbib也足以在平均液滴尺寸的任何顯著變化之前產(chǎn)生穩(wěn)定的乳液，如圖12所示。
跨細胞滲透實驗
圖13示出了與lpv的水溶液的跨細胞滲透(左手側(cè)的柱)相比負載lpv的納米乳液(右手側(cè)的柱)在頂端至基底外側(cè)方向(血液至內(nèi)臟)(a)和基底外側(cè)至頂端方向(內(nèi)臟至血液)(b)中的跨細胞滲透。星形表示數(shù)據(jù)組之間的統(tǒng)計顯著性。
圖14示出了與efv的水溶液的跨細胞滲透(左手側(cè)的柱)相比負載lpv的納米乳液(右手側(cè)的柱)在頂端至基底外側(cè)方向(血液至內(nèi)臟)(a)和基底外側(cè)至頂端方向(內(nèi)臟至血液)(b)中的跨細胞滲透。星形表示數(shù)據(jù)組之間的統(tǒng)計顯著性。
跨細胞滲透試驗
以35,000細胞每孔的密度將caco-2細胞接種在24孔
在試驗期間，將培養(yǎng)介質(zhì)從孔中除去并用具有10μm最終濃度的lpv或efv的水溶液或納米乳液等同物的補充有15％fbs的dmem的替換。在不同的孔中，頂端或底外側(cè)腔室(供體腔室)負載有包含藥物或納米乳液的介質(zhì)，并且那些孔的相對的腔室(受體腔室)填充有新鮮的不含藥物的介質(zhì)。以1、2和24小時的時間周期從所有孔中從頂端和基底外側(cè)腔室兩者中取出樣品。然后立即將樣品冷凍在-40℃下用于隨后經(jīng)由高效液相色譜的批次分析，來確定樣品中的藥物的濃度。
使用以下等式計算表觀滲透性(papp)：papp＝((a/t)*(v))/(s*0.3)。
其中a是樣品的濃度，t是收集樣品時的以秒計的時間，v是包含在采樣的腔室中的樣品的總體積，s是藥物初始的起始濃度，以及0.3是以cm2計算的caco-2在其上生長的遷移室嵌入物的表面積。
負載lpv的納米乳液的跨細胞滲透
在1小時和2小時時間點對于lpv的納米乳液制劑看到統(tǒng)計上顯著的(通過使用spss軟件的獨立樣品t檢驗確定的)更大的滲透，其中在1小時的papp值是1x10-4對比8.4x10-6(p＝<0.05)以及在2小時的papp值是6.4x10-5對比2.7x10-6(p＝<0.05)。24小時之后，水溶液和納米乳液體系之間看不到差異。
水溶液和納米乳液lpv的papp數(shù)據(jù)最初示出在1小時時間點處頂端至底外側(cè)的滲透對于納米乳液改善(papp值是1x10-4對比8.4x10-6(p＝<0.05))。然而，還觀察到在相反方向上的滲透，即基底外側(cè)至頂端也比水溶液值高得多(papp值9.3x10-6相比6.1x10-5)。lpv是已知的p-gp(在某些細胞表面發(fā)現(xiàn)的藥物轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)底物，其使得可能在b-a方向上經(jīng)歷從caco-2細胞的流出(模擬從需要藥物的體循環(huán)返回至腸道系統(tǒng)的移動)。然而，遷移室試驗體系的條件沒有理想地匹配在動物模型或?qū)嶋H上人體中發(fā)現(xiàn)的那些，因為藥物不會在基底外側(cè)隔室中聚集和累積，反而是被體循環(huán)運走(caco-2遷移室是靜態(tài)試驗)。另外，與轉(zhuǎn)運(移動到細胞中，然后在另一側(cè)移出)相反，caco-2細胞沒有形成與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的那些一樣的致密的單層，其被認為是低估經(jīng)由細胞外路途徑(即細胞之間，而不是穿過它們)滲透的化合物的原因。因此，非常有希望的是在1小時時在a-b方向滲透的大幅增加將可能導致體內(nèi)體系中更多的藥物越過腸屏障。
2小時時間點的數(shù)據(jù)再次示出與lpv的水溶液相比，對于納米乳液存在從頂端至基底外側(cè)的滲透的增加(6.4x10-5對比2.7x10-6(p＝<0.05))。然而，在這種情況下，沒有觀察到基底外側(cè)至頂端方向的相同增加(6.0x10-6對比1.3x10-5(p＝0.11))，表明lpv納米乳液的滲透優(yōu)于lpv水溶液。
水溶液和納米乳液制劑之間的滲透的差異可以表明藥物通過不同的機制越過單層的轉(zhuǎn)運。由于納米乳液將不會經(jīng)由轉(zhuǎn)運蛋白越過單層轉(zhuǎn)運，所以其意味著納米乳液液滴經(jīng)由細胞外轉(zhuǎn)運越過單層滲透，這在之前的納米顆粒滲透的研究中已經(jīng)看出。這還可以解釋為什么納米乳液超過水溶液的在b-a滲透中的大幅增加，因為該制劑允許藥物在其陷入乳液液滴內(nèi)時在單層的小間隙之間移動。對于納米乳液2小時時與1小時時相比b-a滲透的降低的可能解釋是納米乳液開始聚集且不再能經(jīng)由細胞外方式穿過單層。
負載efv的納米乳液的跨細胞滲透
1小時之后，在乳液制劑和含水efv溶液之間沒有觀察到表觀滲透性的增加。然而，在2和24小時之后，efv納米乳液具有顯著升高的滲透性(2小時時與efv納米乳液的1.1x10-5相比，水溶液為8.2x10-6(p＝<0.05)和24小時時與efv納米乳液的6.4x10-6相比，水溶液為7.0x10-7(p＝<0.05))。
在1和2小時時，與efv納米乳液相比，efv水溶液的b-a滲透性增加，但是再次應注意在靜態(tài)體系如遷移室試驗中，b-a滲透性相對a-b是較不有用的量度。仍然有希望的是看到b-a滲透性降低。caco-2遷移室體系的另一個問題是caco-2細胞不表達細胞色素p4502b6，并且因為這是efv的新陳代謝的主要途徑，所以如果受新陳代謝保護，將低估在乳液液滴內(nèi)包含藥物可以具有的保護作用。還應注意efv已經(jīng)示出了良好的腸道滲透性，因為其具有fda的2類狀況(不良的溶解度、高腸道滲透性)，所以看到進一步的改善表明納米乳液制劑具有固有的良好的滲透性特征。
另外，可以將納米乳液制劑直接稀釋到含水培養(yǎng)介質(zhì)中并用于測定而不需要提前溶解到溶劑中(其是制造lpv和efv的水溶液所必需的)。這對于制造容易調(diào)節(jié)劑量的更耐受的和安全的口服制劑是高度有吸引力的，尤其作為其中考慮使用溶劑如乙醇的兒科設置。
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