本發(fā)明涉及動(dòng)物模型構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種肌肉組織損傷修復(fù)動(dòng)物模型的建立方法。

背景技術(shù)：

成年個(gè)體組織中的干細(xì)胞在正常情況下大多處于休眠狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生一系列損傷如創(chuàng)傷、炎癥、變性病等消耗性疾病時(shí)，在病理狀態(tài)或在外因誘導(dǎo)下，組織能夠保持一定程度的再生能力。肌肉組織具有自己的前體細(xì)胞，即肌衛(wèi)星細(xì)胞，附著于肌細(xì)胞表面的肌衛(wèi)星細(xì)胞具有干細(xì)胞性質(zhì)，當(dāng)肌細(xì)胞受損后，肌衛(wèi)星細(xì)胞可增殖分化，參與肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)，但是其中具體的分子機(jī)制目前尚不清楚。作為肌肉組織工程重要的研究工具，肌肉組織損傷修復(fù)動(dòng)物模型在肌肉組織再生研究中具有重要意義。

目前肌肉組織工程中常用的動(dòng)物模型包括遺傳性肌病模型、失神經(jīng)模型、冷凍模型等，但是它們存在不同程度的缺點(diǎn)，如模型不穩(wěn)定、費(fèi)用較高、損傷不確切(遺傳性肌病)，失神經(jīng)支配影響再生研究、建模周期長(zhǎng)(失神經(jīng)模型)或損傷范圍不易控制(冷凍模型)。所以我們期望能夠建立簡(jiǎn)單易行、費(fèi)用低、造模時(shí)間短、模型穩(wěn)定、損傷確切、范圍精確可控的技術(shù)方法，并且滿足摧毀肌肉細(xì)胞的同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種肌肉組織損傷修復(fù)動(dòng)物模型的建立方法，該建立方法建立簡(jiǎn)單易行、費(fèi)用低、造模時(shí)間短、模型穩(wěn)定、損傷確切、范圍精確可控，并且能夠滿足在摧毀肌肉細(xì)胞的同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的要求。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

一種肌肉組織損傷修復(fù)動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，將模型動(dòng)物麻醉后，以俯臥位固定，并對(duì)麻醉后模型動(dòng)物的后肢進(jìn)行消毒；

步驟2，手術(shù)依次切開消毒后后肢的皮膚、皮下組織，顯露腓腸肌并分離腓腸肌的下段；

步驟3，顯露一側(cè)腓腸肌后，使用電極夾持所述一側(cè)腓腸肌，并對(duì)所述一側(cè)腓腸肌施加脈沖電場(chǎng)，即建立得肌肉組織損傷修復(fù)動(dòng)物模型。

優(yōu)選地，步驟3中，所述脈沖電場(chǎng)的參數(shù)為：電場(chǎng)1500V/cm，頻率3Hz，脈沖長(zhǎng)度70μs。

優(yōu)選地，步驟3中，所述施加脈沖電場(chǎng)的個(gè)數(shù)為200個(gè)。

優(yōu)選地，步驟1中，所述模型動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)鼠。

電穿孔是細(xì)胞膜在外電場(chǎng)作用下形成一種可視為微孔的親水性通道，平時(shí)難以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的大分子(如化療藥物)便可通過該通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在外加電場(chǎng)取消后，若微孔能夠閉合，則稱為可逆電穿孔，若電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到一定程度微孔不能自我修復(fù)，則稱為不可逆電穿孔，直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于電場(chǎng)直接作用于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，僅針對(duì)細(xì)胞水平進(jìn)行滅活，所以對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)能夠很好的保存。本發(fā)明依據(jù)不可逆電穿孔的作用原理，在對(duì)動(dòng)物肌肉組織施加不可逆電穿孔處理后，接受電場(chǎng)處理的肌組織細(xì)胞能夠有效的完全滅活，且細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)完全不受操作的影響，能夠滿足肌肉組織損傷修復(fù)研究的需要。本發(fā)明應(yīng)用不可逆電穿孔建立肌肉組織損傷修復(fù)動(dòng)物模型，能夠提供簡(jiǎn)單易行、費(fèi)用低、造模時(shí)間短、模型穩(wěn)定、損傷確切、范圍精確可控的技術(shù)方法，能夠在滿足摧毀肌肉細(xì)胞的同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的要求。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

圖1為對(duì)6周齡雌性大鼠的腓腸肌組織在電脈沖處理1天后的組織病理學(xué)分析結(jié)果圖；

圖2為對(duì)6周齡雌性大鼠的腓腸肌組織在電脈沖處理3天后的組織病理學(xué)分析結(jié)果圖；

圖3為對(duì)6周齡雌性大鼠的腓腸肌組織在電脈沖處理1周后的組織病理學(xué)分析結(jié)果圖；

圖4為對(duì)6周齡雌性大鼠的腓腸肌組織在電脈沖處理3周后的組織病理學(xué)分析結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明提供了一種肌肉組織損傷修復(fù)動(dòng)物模型的建立方法，包括以下步驟：

步驟1，將模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)鼠麻醉后，以俯臥位固定，并對(duì)麻醉后實(shí)驗(yàn)鼠的后肢進(jìn)行消毒；

步驟2，手術(shù)依次切開消毒后后肢的皮膚、皮下組織，顯露腓腸肌并分離腓腸肌下段；

步驟3，顯露一側(cè)腓腸肌后，使用電極夾持所述一側(cè)腓腸肌，并對(duì)所述一側(cè)腓腸肌施加脈沖電場(chǎng)，即建立得肌肉組織損傷修復(fù)動(dòng)物模型。

具體地，本實(shí)施例通過本發(fā)明提供的肌肉組織損傷修復(fù)動(dòng)物模型的建立方法建立幼年SD大鼠及老齡SD大鼠肌肉損傷修復(fù)過程中的蛋白基因表達(dá)差異，具體按照以下步驟進(jìn)行：

步驟1，分別選取6周齡及24月齡雌性大鼠，異氟烷吸入麻醉之后，以俯臥位固定于恒溫實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，常規(guī)消毒麻醉后的實(shí)驗(yàn)鼠的后肢。

步驟2，手術(shù)依次切開消毒后后肢的皮膚、皮下組織，切口約1cm，顯露腓腸肌并分離腓腸肌下段。

步驟3，顯露一側(cè)腓腸肌后，連接平板式電極與脈沖電源，使用平板式電極夾持需要處理的一側(cè)腓腸肌組織，并對(duì)需要處理的一側(cè)腓腸肌組織施加脈沖電場(chǎng)。其中，通過測(cè)量平板式電極間的垂直距離來(lái)計(jì)算并設(shè)置電壓，如：電極板間的距離為0.8cm時(shí)電壓設(shè)置為0.8cm×1500V/cm＝1200V，頻率設(shè)置為3Hz，脈沖長(zhǎng)度為70μs，一共施加200個(gè)脈沖。

分別于術(shù)后1天、3天、1周、3周取經(jīng)手術(shù)處理的腓腸肌組織行病理學(xué)檢查，確認(rèn)動(dòng)物模型是否成功建立。

通過病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，電脈沖處理后1天，肌細(xì)胞壞死凋亡明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分血管管腔暫時(shí)性栓塞，接受電脈沖處理滅活的肌肉組織與正常組織邊緣清晰；電脈沖處理后3天時(shí)可見大量巨噬細(xì)胞聚集，肌纖維結(jié)構(gòu)不清楚，肌細(xì)胞染色淺淡；電脈沖處理后1周時(shí)可見炎性細(xì)胞減少，壞死肌細(xì)胞逐漸被清理，新生肌纖維細(xì)胞出現(xiàn)。電脈沖處理后3周時(shí)發(fā)現(xiàn)肌肉組織內(nèi)肌纖維排列整齊，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，此觀察結(jié)果提示其與正常肌肉組織相較無(wú)明顯差異。通過對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的腓腸肌施加特定參數(shù)的電脈沖能夠有效的滅活原組織內(nèi)的肌細(xì)胞，并完整保留細(xì)胞外基質(zhì)及血管，肌組織再生過程中未見明顯的瘢痕組織形成。以上檢查結(jié)果表明通過本發(fā)明的肌肉組織損傷修復(fù)動(dòng)物模型的建立方法所建立的動(dòng)物模型是成功的。

在確認(rèn)動(dòng)物模型的建立是否成功時(shí)，分別對(duì)術(shù)后1天、3天、1周、3周取經(jīng)手術(shù)處理的腓腸肌組織留取標(biāo)本行免疫組織化學(xué)、蛋白電泳以及基因檢測(cè)明確幼年大鼠及老年大鼠在肌肉損傷修復(fù)過程中的蛋白基因表達(dá)差異。

雖然，本說(shuō)明書中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。