本申請是申請?zhí)枮?01380026898.3的中國專利申請的分案申請，原申請是2013年5月21日提交的pct國際申請pct/ep2013/001503于2014年11月21日進入中國國家階段的申請。

本申請涉及針對密蛋白18.2之抗體的聯(lián)合治療。

背景技術(shù)：

胃和食管(胃食管；ge)的癌癥屬于具有尚未被滿足之最高醫(yī)療需求的惡性腫瘤。在世界范圍內(nèi)，胃癌是癌癥死亡的第二主要原因。近幾十年來，食管癌的發(fā)病率(incidence)有所上升，同時其組織學類型及原發(fā)腫瘤部位發(fā)生變化。在美國和西歐，現(xiàn)在食管的腺癌比鱗狀細胞癌更普遍，其中大多數(shù)腫瘤位于食管遠端。胃食管癌的五年總存活率為20％至25％，不論與大量副作用相關(guān)的已建立之標準治療的積極性(aggressiveness)。

大部分患者出現(xiàn)局部晚期或轉(zhuǎn)移疾病，并不得不經(jīng)受一線化學治療。治療方案基于通常與第三化合物(例如，紫杉烷(taxane)或蒽環(huán)類藥物(anthracyclines))組合的鉑和氟嘧啶衍生物骨架(backbone)。然而，可預(yù)期之最好的中值無進展存活為5至7個月，而最好的中值總存活為9至11個月。

來自多種更新一代用于這些癌癥的組合化學治療方案的主要益處的缺乏刺激了對靶向藥劑使用的研究。最近，曲妥珠單抗(trastuzumab)已經(jīng)被批準用于her2/neu陽性胃食管癌。然而，由于僅～20％的患者表達該靶標并且適于進行該治療，因此醫(yī)療需求仍然較高。

緊密連接分子密蛋白18剪接變體2(密蛋白18.2(cldn18.2))是緊密連接蛋白質(zhì)之密蛋白家族中的一員。cldn18.2為27.8kda的跨膜蛋白質(zhì)，其包含四個具有兩個小的胞外環(huán)的跨膜結(jié)構(gòu)域。

在正常組織中(除胃外)，通過rt-pcr檢測不到cldn18.2的表達。cldn18.2特異性抗體的免疫組織化學顯示胃為唯一的陽性組織。

cldn18.2為只在短暫分化的胃上皮細胞上表達的高度選擇性胃譜系抗原。cldn18.2保持在惡性轉(zhuǎn)化的過程中，因此頻繁在人胃癌細胞的表面上展示。此外，在食管、胰腺和肺腺癌中，以顯著水平異位活化該泛腫瘤抗原(pan-tumoralantigen)。cldn18.2蛋白還位于胃癌腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤以及特別是卵巢中的遠處轉(zhuǎn)移瘤(distantmetastase)(所謂的克魯肯伯格氏腫瘤(krukenbergtumor))中。

ganymedpharmaceuticalsag已開發(fā)出針對cldn18.2的igg1嵌合抗體imab362。imab362以高親和力和特異性識別cldn18.2的第一胞外結(jié)構(gòu)域(ecd1)。imab362不與任何其他密蛋白家族成員結(jié)合，包括緊密相關(guān)的密蛋白18剪接變體1(cldn18.1)。imab362表現(xiàn)出精確的腫瘤細胞特異性，并且組合了四種獨立的高度有效的作用機制。靶標結(jié)合后，imab362通過adcc、cdc、誘導通過腫瘤細胞表面上的靶標交聯(lián)誘導的凋亡以及直接抑制增殖來介導細胞殺傷。因此，imab362有效裂解cldn18.2陽性細胞，包括體外和體內(nèi)的人胃癌細胞系。具有cldn18.2陽性癌細胞系的小鼠具有生存益處，并且當用imab362處理時，多至40％的小鼠表現(xiàn)出其腫瘤的退化。

已經(jīng)在小鼠和食蟹猴(cynomolgusmonkey)中對imab362的毒性和pk/tk特性進行了徹底研究，包括確定劑量范圍的研究、在食蟹猴中進行28天重復劑量毒性研究以及在小鼠中進行3個月重復劑量毒性研究。在小鼠(最長處理持續(xù)時間3個月，每周施用，最高劑量水平400mg/kg)和食蟹猴(每周多至5次施加多至100mg/kg)兩者中，經(jīng)靜脈注射的重復劑量的imab362被良好耐受。未誘發(fā)全身或局部毒性的跡象。具體而言，在任何毒性研究中均未觀察到胃毒性。imab362不誘導免疫激活和細胞因子釋放。未記錄到對雄性或雌性生殖器官的不良作用。imab362不與缺乏靶標的組織結(jié)合。小鼠中的生物分布研究表明缺乏胃毒性的原因最可能是在健康胃上皮中的管腔部位(luminalsite)的緊密連接區(qū)室化，這樣似乎嚴重削弱了imab362表位的易接近性。一旦惡性轉(zhuǎn)化，則該區(qū)室化消失，致使可通過imab362使表位有可藥性(drugable)。

imab362用于早期臨床測試中。i期臨床研究已在人中進行。3名患者的5個劑量組(33mg/m²、100mg/m²、300mg/m²、600mg/m²、1000mg/m²)各自接受單次靜脈內(nèi)施用imab362，并觀察28天。imab362被良好地耐受，在患者中未觀察到相關(guān)的安全性后果。在一名患者中，在治療后四周內(nèi)，所測量的全部腫瘤標志物均顯著下降。在正在進行的iia期臨床研究中，重復給予imab362。

本文所示數(shù)據(jù)表明，雙膦酸/鹽/酯(bisphosphonate)(例如唑來膦酸(za))，特別是當與重組白細胞介素-2(il-2)聯(lián)合施用時，增強了抗cldn18.2抗體(例如imab362)的活性。潛在的機制為活化并擴增高細胞毒性的免疫細胞群(γ9δ2t細胞)。

此外，我們示出這樣的數(shù)據(jù)，其證明化學治療劑可通過抗cldn18.2抗體(例如，imab362)來穩(wěn)定或增加cldn18.2在癌細胞表面上的表達，從而導致cldn18.2增強的可藥性。觀察到抗cldn18.2抗體(例如，imab362)與特定的化學治療方案，特別是用于治療胃癌或治療人實體癌的化學治療方案的協(xié)同效應(yīng)。用化學治療預(yù)處理的人癌細胞對抗體誘導的靶特異性殺傷作用更敏感。在小鼠腫瘤模型中，用抗cldn18.2抗體加化學治療控制腫瘤優(yōu)于用抗cldn18.2抗體作為單一藥劑控制腫瘤。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明普遍地提供了一種聯(lián)合治療，其用于有效治療和/或預(yù)防與表達cldn18.2之細胞相關(guān)的疾病，所述疾病包括癌癥疾病，例如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌(nsclc))、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌及其轉(zhuǎn)移，特別是胃癌轉(zhuǎn)移(例如，克魯肯伯格氏腫瘤、腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)。特別優(yōu)選的癌癥疾病為胃、食管、胰管、膽管、肺和卵巢的腺癌。

在一個方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防癌癥疾病的方法，所述方法包括向患者施用能夠結(jié)合cldn18.2的抗體與刺激γδt細胞之藥劑的組合。刺激γδt細胞的藥劑可在施用能夠結(jié)合cldn18.2的抗體之前、同時或之后施用，或其組合。

在一個實施方案中，γδt細胞為vγ9vδ2t細胞。在一個實施方案中，刺激γδt細胞的藥劑為雙膦酸/鹽/酯，例如，含氮雙膦酸/鹽/酯(氨基雙膦酸/鹽/酯)。在一個實施方案中，刺激γδt細胞的藥劑選自唑來膦酸、氯膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、利塞膦酸、米諾膦酸、奧帕膦酸、阿侖膦酸、英卡膦酸及其鹽。在一個實施方案中，刺激γδt細胞的藥劑與白細胞介素-2組合施用。

在一個實施方案中，本發(fā)明方法還包括施用穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑。cldn18.2優(yōu)選地在癌細胞的細胞表面表達。

穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑可為細胞毒劑和/或細胞抑制劑。在一個實施方案中，穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑包含這樣的藥劑，其誘導細胞周期停滯或細胞累積在細胞周期中的一個或更多個時相中，優(yōu)選在細胞周期除g1期之外的一個或更多個時相中。穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑可包括選自以下的藥劑：蒽環(huán)類藥物、鉑化合物、核苷類似物、紫杉烷類和喜樹堿類似物或其前藥及其組合。穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑可包括選自表柔比星(epirubicin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶或其前藥(例如，卡培他濱)、多西他賽(docetaxel)、伊立替康(irinotecan)及其組合的藥劑。穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑可包括奧沙利鉑與5-氟尿嘧啶或其前藥的組合、順鉑與5-氟尿嘧啶或其前藥的組合、至少一種蒽環(huán)類藥物與奧沙利鉑的組合、至少一種蒽環(huán)類藥物與順鉑的組合、至少一種蒽環(huán)類藥物與5-氟尿嘧啶或其前藥的組合、至少一種紫杉烷與奧沙利鉑的組合、至少一種紫杉烷與順鉑的組合、至少一種紫杉烷與5-氟尿嘧啶或其前藥的組合或者至少一種喜樹堿類似物與5-氟尿嘧啶或其前藥的組合。穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑可為誘導免疫原性細胞死亡的藥劑。誘導免疫原性細胞死亡的藥劑可包括選自蒽環(huán)類藥物、奧沙利鉑及其組合的藥劑。穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑可包括表柔比星與奧沙利鉑的組合。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用至少一種蒽環(huán)類藥物、至少一種鉑化合物以及至少一種5-氟尿嘧啶和其前藥。蒽環(huán)類藥物可選自表柔比星、阿霉素、柔紅霉素、伊達比星和戊柔比星。優(yōu)選地，蒽環(huán)類藥物為表柔比星。鉑化合物可選自奧沙利鉑和順鉑。核苷類似物可選自5-氟尿嘧啶和其前藥。紫杉烷可選自多西他賽和紫杉醇。喜樹堿類似物可選自伊立替康和拓撲替康。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括施用(i)表柔比星、奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶，(ii)表柔比星、奧沙利鉑和卡培他濱，(iii)表柔比星、順鉑和5-氟尿嘧啶，(iv)表柔比星、順鉑和卡培他濱，或(v)亞葉酸、奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶。

本發(fā)明的方法還可包括施用至少一種另外的化學治療劑，所述治療劑可為細胞毒劑。

能夠結(jié)合cldn18.2的抗體可與活細胞表面上存在的cldn18.2的天然表位結(jié)合。在一個實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體與cldn18.2的第一胞外環(huán)結(jié)合。在一個實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體通過以下的一種或更多種來介導細胞殺傷：補體依賴性細胞毒性(cdc)介導的裂解、抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)介導的裂解、誘導凋亡和抑制增殖。在一個實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體為單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體，或抗體的片段。在一個實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體為選自以下的抗體：(i)由以如下登記號保藏的克隆產(chǎn)生的和/或能夠從其獲得的抗體：dsmacc2737、dsmacc2738、dsmacc2739、dsmacc2740、dsmacc2741、dsmacc2742、dsmacc2743、dsmacc2745、dsmacc2746、dsmacc2747、dsmacc2748、dsmacc2808、dsmacc2809或dsmacc2810，(ii)(i)中抗體的嵌合形式或人源化形式的抗體，(iii)具有(i)中抗體的特異性的抗體，以及(iv)包含(i)中抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合位點特別是可變區(qū)并且優(yōu)選地為具有(i)中抗體的特異性的抗體。在一個實施方案中，抗體與治療劑(例如毒素、放射性同位素、藥物或細胞毒劑)相偶聯(lián)。

在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括以多至1000mg/m²的劑量施用能夠結(jié)合cldn18.2的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括以300至600mg/m²的劑量重復施用能夠結(jié)合cldn18.2的抗體。

在一個實施方案中，癌癥呈cldn18.2陽性。在一個實施方案中，癌癥疾病選自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌及其轉(zhuǎn)移。癌癥疾病可為克魯肯伯格氏腫瘤、腹膜轉(zhuǎn)移和/或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，癌癥為腺癌，特別是晚期腺癌。在一個實施方案中，癌癥選自胃癌、食管(特別是下段食管)的癌癥、食管-胃連接部(eso-gastricjunction)癌和胃食管癌?；颊呖蔀閔er2/neu陰性患者或具有her2/neu陽性狀態(tài)但不適于進行曲妥珠單抗治療的患者。

根據(jù)本發(fā)明，cldn18.2優(yōu)選地具有根據(jù)seqidno：1的氨基酸序列。

在另一個方面，本發(fā)明提供了醫(yī)藥制備物，其包含能夠結(jié)合cldn18.2的抗體和刺激γδt細胞的藥劑。本發(fā)明的醫(yī)藥制備物還可包含穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑。能夠結(jié)合cldn18.2的抗體和刺激γδt細胞的藥劑以及任選地穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑可以以混合物或彼此分離的形式存在于醫(yī)藥制備物中。醫(yī)藥制備物可為藥盒，所述藥盒包含含有所述能夠結(jié)合cldn18.2之抗體的第一容器和含有所述刺激γδt細胞之藥劑的容器，以及任選地含有所述穩(wěn)定或增加cldn18.2表達之藥劑的容器。所述醫(yī)藥制備物還可包含將制備物用于治療癌癥(特別是用于本發(fā)明方法的制備物)印刷說明書。醫(yī)藥制備物不同的實施方案，特別是刺激γδt細胞的藥劑和穩(wěn)定或增加cldn18.2表達之藥劑的不同的實施方案如上文中對本發(fā)明的方法所描述的。

本發(fā)明還提供了本文所述的藥劑，例如，用于本文所述方法中的能夠結(jié)合cldn18.2的抗體，例如，用于與刺激γδt細胞的藥劑，以及任選地穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑組合施用。

本發(fā)明的另一些特征和優(yōu)點將通過下文的詳細描述和權(quán)利要求而明顯。

附圖說明

圖1.化學治療對胃癌細胞的作用。將katoiii細胞培養(yǎng)96個小時導致細胞周期停滯在g0/g1期且cldn18.2下調(diào)。導致細胞周期停滯在細胞周期的不同時相的細胞抑制化合物(s期(5-fu)或g2期(表柔比星))穩(wěn)定cldn18.2表達。

圖2.化學治療對胃癌細胞的作用。a/b：化學治療對胃癌細胞中cldn18.2的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的作用，c：流式細胞術(shù)分析結(jié)合在經(jīng)化學治療劑處理的胃癌細胞上的胞外imab362。

圖3.化學治療對胃癌細胞的作用。導致細胞周期停滯在細胞周期的不同時相的細胞抑制化合物(s/g2期(伊立替康)或g2期(多西他賽))。

圖4.經(jīng)化學治療劑預(yù)處理之后，imab362誘導的adcc介導的胃癌細胞殺傷。

圖5.化學治療對胃癌細胞的作用。a：與用培養(yǎng)基培養(yǎng)的靶細胞相比，經(jīng)伊立替康、多西他賽或順鉑處理的細胞顯示出較低水平的活細胞。b：與用培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞相比，經(jīng)伊立替康、多西他賽或順鉑處理的細胞中cldn18.2的表達增加。c/d：用伊立替康、多西他賽或順鉑處理細胞增強了imab362誘導adcc的效力。

圖6.化學治療對imab362誘導的cdc的作用。

圖7.化學治療對效應(yīng)細胞的作用。

圖8.補充有za/il-2的培養(yǎng)物中pbmc的擴增。

圖9.補充有za/il-2的pbmc培養(yǎng)物中vγ9vδ2t細胞的富集。

圖10.補充有za和增加劑量的il-2的培養(yǎng)基中vγ9vδ2t細胞的富集。

圖11.當與za脈沖的單核細胞和人癌細胞共孵育時vγ9vδ2t細胞的擴增和細胞毒性活性。

圖12.在pbmc培養(yǎng)物中不同細胞類型的za-依賴性發(fā)育(development)。

圖13.經(jīng)za/il-2處理后，表面標志物在vγ9vδ2t細胞上的展示。

圖14.具有imab362的vγ9vδ2t細胞對cldn18.2陽性nugc-4胃癌細胞的adcc活性。

圖15.使用vγ9vδ2t細胞作為效應(yīng)細胞的imab362的adcc。

圖16.za對cldn18.2在靶細胞上表面定位的作用。

圖17.化學治療和za/il-2處理對效應(yīng)細胞的作用。

圖18.小鼠中綴合抗體的生物分布研究。

圖19.hek293-cldn18.2腫瘤異種移植物的早期治療。

圖20.晚期hek293-cldn18.2腫瘤異種移植物的治療。

圖21.imab362對胃癌異種移植物的皮下腫瘤生長的作用。

圖22.使用imab362的免疫治療對nci-n87～cldn18.2胃癌異種移植物的作用。

圖23.使用imab362和eof方案的聯(lián)合治療對nci-n87～cldn18.2異種移植物的作用。

圖24.使用imab362和eof方案的聯(lián)合治療對nugc-4～cldn18.2異種移植物的作用。

圖25.za/il-2誘導的vγ9vδ2t細胞對通過imab362控制nsg小鼠中肉眼可見腫瘤(macroscopictumor)的作用。

圖26.使用imab362和eof方案的聯(lián)合治療對cls-103～cldn18.2同種異體移植腫瘤的作用。

具體實施方式

盡管下文將對本發(fā)明作詳細描述，但應(yīng)當理解的是本發(fā)明并不局限于本文中所描述的具體方法學、方案和試劑，因此這些可以變化。還應(yīng)當理解的是本文中所使用的術(shù)語僅僅是為了描述一些具體的實施方案，并非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求限定。除非另有限定，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語的含義與本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。

在下文中，將對本發(fā)明的要素進行描述。這些要素隨具體的實施方案列出，然而，應(yīng)當理解的是這些要素可以任意方式和任意數(shù)量組合以產(chǎn)生另外的實施方案。各種描述的實施例和優(yōu)選實施方案不應(yīng)解釋為將本發(fā)明限制于僅明確描述的實施方案。本說明書應(yīng)當被理解為支持且涵蓋將明確描述的實施方案與任意數(shù)量的公開和/或優(yōu)選要素組合的實施方案。此外，除非在上下文中另有指出，否則在本申請中所有描述的要素的任意排列和組合應(yīng)被認為是由本申請的說明書所公開的。

優(yōu)選地，如“amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms：(iupacrecommendations)″，h.g.w.leuenberger，b.nagel，和h.eds.，helveticachimicaacta，ch-4010basel，switzerland，(1995)中所述定義本文中使用的術(shù)語。

除非另有指出，否則本發(fā)明的實踐將采用化學、生物化學、細胞生物學、免疫學和重組dna技術(shù)中的常規(guī)方法，這些方法在本領(lǐng)域的文獻中進行了解釋(參見，例如，molecularcloning：alaboratorymanual，第2版，j.sambrook等編輯，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor1989)。

除非上下文另有要求，否則在整個本說明書和所附權(quán)利要求中，詞語“包括/包含”及其變化形式將被理解為意指包括/包含所述成員、整數(shù)(integer)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其它的成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組，盡管在一些實施方案中可能不包括這樣其它的成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組，即，主題在于包括所述成員、整數(shù)或步驟或者成員、整數(shù)或步驟的組。除非在本文中另有指出或明顯地與上下文矛盾，否則在描述本發(fā)明的上下文中(特別是在權(quán)利要求的上下文中)使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞應(yīng)被解釋為涵蓋單數(shù)和復數(shù)兩者。本文中引用的數(shù)值范圍僅僅旨在用作分別指落入該范圍的每個單獨值的簡寫方法。除非在本文中另有指出，否則每個單獨的值都被并入說明書，就像其在本文中被單獨引用一樣。除非在本文中另有指出或明顯地與上下文矛盾，否則本文中描述的所有方法均可以以任何合適的順序進行。除非另有要求，否則本文中提供的任何和所有實例，或示例性語言(例如，“例如”)的使用僅旨在更好地說明本發(fā)明，并非對本發(fā)明的范圍設(shè)定限制。說明書中的語言不應(yīng)被解釋為表示對實施本發(fā)明必不可少的任何未要求保護的要素。

貫穿本說明書的正文，引用了幾篇文獻。本文中引用的每一篇文獻(包括所有專利、專利申請、科學出版物、制造商說明書、說明等)，無論上文中還是下文中，均通過引用以其整體并入本文。本文中沒有任何內(nèi)容應(yīng)被解釋為承認本發(fā)明由于先前的發(fā)明而無權(quán)早于該公開內(nèi)容。

術(shù)語“cldn18”指密蛋白18，并且包括任意變體，包括密蛋白18剪接變體1(密蛋白18.1(cldn18.1))和密蛋白18剪接變體2(密蛋白18.2(cldn18.2))。

術(shù)語“cldn18.2”優(yōu)選指人cldn18.2，并且特別指包含優(yōu)選由根據(jù)序列表的seqidno：1的氨基酸序列或所述氨基酸序列的變體組成的蛋白質(zhì)。

術(shù)語“cldn18.1”優(yōu)選指人cldn18.1，并且特別指包含優(yōu)選由根據(jù)序列表的seqidno：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的變體組成的蛋白質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“變體”特別指突變體、剪接變體、構(gòu)象、同種型、等位基因變體、種變體(speciesvariant)和種同源物(specieshomolog)，特別是天然存在的那些。等位基因變體指基因的正常序列中發(fā)生了改變，其顯著性通常不明顯。對于給定的基因，全基因測序通常鑒定出多種等位基因變體。種同源物是與給定的核酸或氨基酸序列具有不同物種來源的核酸或氨基酸序列。術(shù)語“變體”應(yīng)涵蓋任何經(jīng)翻譯后修飾的變體和構(gòu)象變體。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“cldn18.2陽性癌癥”意指涉及表達cldn18.2之癌細胞的癌癥，優(yōu)選在所述癌細胞的表面上表達cldn18.2。

“細胞表面”根據(jù)其在本領(lǐng)域中的通常含義使用，并因此包括易于被蛋白質(zhì)和其他分子結(jié)合的細胞外部。

如果cldn18.2位于細胞的表面并且易于被添加到所述細胞的cldn18.2特異性抗體結(jié)合，則cldn18.2在所述細胞表面上表達。

根據(jù)本發(fā)明，如果與胃細胞或胃組織中的表達相比，表達水平較低，則cldn18.2在所述細胞中基本不表達。優(yōu)選地，表達水平為胃細胞或胃組織中的表達的低于10％，優(yōu)選地低于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％，或甚至更低。優(yōu)選地，如果表達水平超過非癌組織(除胃外)中表達水平不超過2倍，優(yōu)選1.5倍，并且優(yōu)選地不超過所述非癌組織中的表達水平，則cldn18.2在所述細胞中基本不表達。優(yōu)選地，如果表達水平低于檢測界限和/或如果表達水平太低以致于不能被添加至細胞的cldn18.2特異性抗體結(jié)合，則cldn18.2在所述細胞中基本上不表達。

根據(jù)本發(fā)明，如果表達水平超過非癌組織(除胃外)中表達水平優(yōu)選2倍以上，優(yōu)選10倍、100倍、1000倍或10000倍以上，則cldn18.2在細胞中表達。優(yōu)選地，如果表達水平高于檢測界限和/或如果表達水平足夠高使得能夠被添加至細胞的cldn18.2特異性抗體結(jié)合，則cldn18.2在所述細胞中表達。優(yōu)選地，在細胞中表達的cldn18.2在所述細胞表面上表達或暴露。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“疾病”指任何病理狀態(tài)，包括癌癥，特別是本文中所描述的那些形式的癌癥。任何本文中提及的癌癥或癌癥的特別形式還包括其癌癥轉(zhuǎn)移。在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本申請，待治療的疾病涉及表達cldn18.2的細胞。

根據(jù)本發(fā)明，“與表達cldn18.2之細胞相關(guān)的疾病”或類似表達意指cldn18.2在病態(tài)組織或器官的細胞中表達。在一個實施方案中，與健康組織或器官中的狀況相比，病態(tài)的組織或器官中的cldn18.2表達增加。增加指增加至少10％，特別是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％，或甚至更多。在一個實施方案中，表達僅見于病態(tài)的組織，而健康組織中的表達被抑制。根據(jù)本發(fā)明，與表達cldn18.2之細胞相關(guān)的疾病包括癌癥疾病。此外，根據(jù)本發(fā)明，癌癥疾病優(yōu)選地為其中癌細胞表達cldn18.2的那些。

如本文所用，“癌癥疾病”或“癌癥”包括具有如下特征的疾?。寒惓Ｕ{(diào)節(jié)性細胞生長、增殖、分化、粘附和/或遷移?！鞍┘毎币庵钙渫ㄟ^迅速、不受控制的細胞增殖生長并且能在起始新生長的刺激停止后繼續(xù)生長的異常細胞。優(yōu)選地，“癌癥疾病”以表達cldn18.2的細胞為特征并且癌細胞表達cldn18.2。表達cldn18.2的細胞優(yōu)選地為癌細胞，優(yōu)選地為本文所述癌癥的癌細胞。

“腺癌”為源自腺組織的癌癥。該組織也是稱為上皮組織的一大類組織的一部分。上皮組織包括皮膚、腺體以及內(nèi)襯于身體的腔和器官的多種其他組織。在胚胎學上，上皮來自外胚層、內(nèi)胚層和中胚層。被歸類為腺癌的細胞并不一定必須是腺體的一部分，只要它們具有分泌特性即可。該形式的癌癥可發(fā)生在一些包括人在內(nèi)的高等哺乳動物中。高度分化的腺癌趨向于與其所來源的腺組織類似，而低分化的腺癌則可能不是這樣。通過染色來自活檢的細胞，病理學家將確定腫瘤是腺癌還是一些其他類型的癌癥。由于腺體在體內(nèi)普遍存在的性質(zhì)，腺癌可在身體的許多組織中發(fā)生。盡管每種腺體可以不分泌相同的物質(zhì)，但只要細胞具有外分泌功能，它就可被認為是腺性的，并且它的惡性形式因而被命名為腺癌。只要有充足的時間，惡性腺癌就侵襲其它組織并且常常轉(zhuǎn)移。卵巢腺癌是最常見的卵巢癌類型。其包括漿液和粘液腺癌、透明細胞腺癌和子宮內(nèi)膜樣腺癌。

“轉(zhuǎn)移”是指癌細胞從其初始部位擴散至身體的其它部位。轉(zhuǎn)移的形成是非常復雜的過程，并依賴于惡性細胞從原發(fā)腫瘤脫離，侵襲胞外基質(zhì)，穿透內(nèi)皮基底膜進入體腔和血管，并隨后在被血液運輸后，浸潤靶器官。最后，新腫瘤在靶部位的生長依賴于血管發(fā)生。由于腫瘤細胞或組分可殘留并發(fā)展出轉(zhuǎn)移潛力，因此即使在去除原發(fā)腫瘤后仍經(jīng)常發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“轉(zhuǎn)移”指“遠處轉(zhuǎn)移”，其指遠離原發(fā)腫瘤和局部淋巴結(jié)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“轉(zhuǎn)移”指淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。使用本發(fā)明的治療可治療的轉(zhuǎn)移中的一個特定形式為源自胃癌(作為原發(fā)部位)的轉(zhuǎn)移。在一些優(yōu)選實施方案中，這樣的胃癌轉(zhuǎn)移為克魯肯伯格氏腫瘤、腹膜轉(zhuǎn)移和/或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

克魯肯伯格氏腫瘤為一種不常見的卵巢轉(zhuǎn)移性腫瘤，占全部卵巢腫瘤的1％至2％?？唆斂喜袷夏[瘤的預(yù)后仍然很差，并且未建立起用于克魯肯伯格氏腫瘤的治療?？唆斂喜袷夏[瘤為卵巢轉(zhuǎn)移性指環(huán)狀細胞(signetringcell)腺癌。在大多數(shù)克魯肯伯格氏腫瘤病例(70％)中，胃為原發(fā)部位。結(jié)腸、闌尾和乳房(主要為侵入性小葉癌)的癌是第二最常見的原發(fā)部位。已報道極少數(shù)的克魯肯伯格氏腫瘤病例源自膽囊、膽管、胰腺、小腸、法特壺腹(ampullaofvater)、子宮頸和膀胱/臍尿管的癌。在診斷原發(fā)性癌和隨后發(fā)現(xiàn)卵巢參與之間的間隔通常為6個月或更短，但已報道過更長的時期。在很多病例中，原發(fā)腫瘤非常小并且可避開檢測。在僅20％至30％的病例中可得到胃或其它器官先前的癌病史。

克魯肯伯格氏腫瘤為胃-卵巢軸中最普遍的癌癥選擇性擴散的一個實例。該腫瘤擴散軸在歷史上引起了許多病理學家的注意，特別是當發(fā)現(xiàn)胃瘤可在不涉及其它組織的情況下選擇性地轉(zhuǎn)移至卵巢。長期以來，胃癌轉(zhuǎn)移至卵巢的途徑一直是個謎，但現(xiàn)在明顯的是逆行淋巴擴散是最可能的轉(zhuǎn)移途徑。

對患有轉(zhuǎn)移癌的患者來說，患有克魯肯伯格氏腫瘤的女性不通常趨于為年輕人，因為她們一般處于她們生命的第五個十年，平均年齡為45歲。該年輕年齡分布可能部分與年輕女性中胃指環(huán)狀細胞癌頻率升高有關(guān)。出現(xiàn)的常見癥狀通常涉及卵巢參與，其中最常見的癥狀為腹部疼痛和膨脹(主要是由于通常兩側(cè)的和常常大的卵巢質(zhì)量)。其余患者具有非特異性胃腸癥狀或無癥狀。此外，據(jù)報道，克魯肯伯格氏腫瘤與由卵巢基質(zhì)產(chǎn)生激素導致的男性化有關(guān)。腹水存在于50％的病例中并且通常顯示惡性細胞。

在超過80％的已報道病例中，克魯肯伯格氏腫瘤是兩側(cè)的。卵巢通常不對稱地擴大，并具有有圓凸的輪廓。切面為黃色或白色；它們通常為實心的，但偶為囊狀的。重要的是，具有克魯肯伯格氏腫瘤的卵巢的囊狀表面通常為光滑的并且無粘附或腹膜沉積物。注意到，其它至卵巢的轉(zhuǎn)移腫瘤傾向與表面移植有關(guān)。這可能解釋了為什么克魯肯伯格氏腫瘤的總體形態(tài)可欺騙性地看起來好像原發(fā)卵巢腫瘤。然而，克魯肯伯格氏腫瘤的兩側(cè)對稱與其轉(zhuǎn)移性質(zhì)一致。

患有克魯肯伯格氏腫瘤的患者具有顯著高的總死亡率。大多數(shù)的患者在2年內(nèi)死亡(中值存活為14個月)。幾項研究表明當原發(fā)腫瘤在發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移至卵巢之后被鑒定時，預(yù)后差，且如果原發(fā)腫瘤保持隱藏，預(yù)后變得更差。

文獻中尚未明確建立針對克魯肯伯格氏腫瘤的最佳治療策略。還未充分解決是否應(yīng)進行手術(shù)切除?；瘜W治療或放射治療對患有克魯肯伯格氏腫瘤的患者的預(yù)后無顯著作用。

“治療”意指向?qū)ο笫┯没衔锘蚪M合物或者化合物或組合物的組合以預(yù)防或消除疾病，包括減小對象中的腫瘤大小或腫瘤數(shù)目、停滯或減緩對象中的疾病、抑制或減緩對象中新疾病的發(fā)展、降低目前患有或以前曾患有疾病的對象中癥狀和/或復發(fā)的頻率或嚴重程度，和/或延長，即增加對象的壽命。

特別地，術(shù)語“疾病的治療”包括疾病或其癥狀的治愈、縮短持續(xù)時間、減輕、預(yù)防、減緩或抑制發(fā)展或惡化，或者預(yù)防或延遲發(fā)生。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“患者”意指治療對象，特別是患病的對象，包括人類、非人靈長類或其它動物，特別是哺乳動物，例如，牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒目動物(例如，小鼠和大鼠)。在一個特別優(yōu)選實施方案中，患者為人類。

γδt細胞(伽馬德耳塔t細胞)表示t細胞中在其表面上具有不同t細胞受體(tcr)的小亞類。大多數(shù)t細胞具有由兩個糖蛋白鏈(稱為α-tcr和β-tcr鏈)構(gòu)成的tcr。相比之下，在γδt細胞中，tcr由一個γ鏈和一個δ鏈構(gòu)成。該組t細胞通常比αβt細胞不常見得多。人γδt細胞在應(yīng)激-監(jiān)督應(yīng)答(stress-surveillanceresponse)(例如，感染性疾病和自身免疫)中起著重要作用。腫瘤中轉(zhuǎn)化誘導的改變還表明造成了由γδt細胞介導的應(yīng)激-監(jiān)督應(yīng)答并且增強抗腫瘤免疫。重要的是，在抗原接合后，病變部位中被活化的γδt細胞提供介導其它效應(yīng)細胞募集的細胞因子(例如，infγ、tnfα)和/或趨化因子，并且表現(xiàn)出立即的效應(yīng)功能例如細胞毒性(通過死亡受體和溶細胞顆粒途徑)和adcc。

在外周血中，大多數(shù)γδt細胞表達vγ9vδ2t細胞受體(tcrγδ)。vγ9vδ2t細胞是人類和靈長類動物特有的，并且由于vγ9vδ2t細胞在很多急性感染中顯著擴增并且可在幾日內(nèi)超過諸如以下病中的所有其他淋巴細胞，例如，結(jié)核病、沙門菌病、埃里希菌病、布氏菌病、土拉菌病、利斯特菌病、弓形體病和瘧疾，因此被認為在通過侵入病原體感知“危險”中起著早期和必要作用。

γδt細胞對小的非肽磷酸化抗原(磷酸抗原)產(chǎn)生應(yīng)答，例如，細菌中合成的焦磷酸鹽和哺乳動物細胞中通過甲羥戊酸途徑產(chǎn)生的異戊烯基焦磷酸(ipp)。盡管正常細胞中的ipp產(chǎn)生不足以活化γδt細胞，腫瘤細胞中甲羥戊酸途徑的調(diào)節(jié)異常導致ipp的累積和γδt細胞活化。ipp還可通過氨基雙膦酸/鹽/酯在治療上增加，這抑制甲羥戊酸途徑酶法呢焦磷酸合酶(fpps)。其中，唑來膦酸(zoledronicacid)(za，唑來膦酸鹽/酯，zometa^tm，novartis)是這種氨基雙磷酸鹽的代表，其已向患者臨床施用來治療骨質(zhì)疏松癥和轉(zhuǎn)移性骨疾病。當體外治療pbmc時，za特別由單核細胞攝取。ipp在單核細胞中累積并且它們分化成刺激γδt細胞發(fā)育的抗原呈遞細胞。在這種情況下，優(yōu)選添加白細胞介素-2(il-2)作為活化的γδt細胞的生長和存活因子。最后，已經(jīng)描述了一些體外活化vγ9vδ2t細胞的烷基化胺，不過僅以毫摩爾的濃度。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“刺激γδt細胞的藥劑”指在體外和/或體內(nèi)，特別是通過誘導γδt細胞的活化和擴增來刺激γδt細胞，特別是vγ9vδ2t細胞發(fā)育的化合物。優(yōu)選地，該術(shù)語指在體外和/或體內(nèi)，優(yōu)選通過抑制甲羥戊酸途徑酶法呢焦磷酸合酶(fpps)來增加哺乳動物細胞中產(chǎn)生的異戊烯基焦磷酸(ipp)的化合物。

刺激γδt細胞的一組特定的化合物為雙膦酸/鹽/酯，特別是含氮雙膦酸/鹽/酯(n-雙膦酸/鹽/酯；氨基雙膦酸/鹽/酯)。

例如，適用于本發(fā)明中的雙膦酸/鹽/酯可包括下列化合物中的一種或更多種，所述化合物包括類似物和衍生物、藥用鹽、水合物、酯、綴合物及其前藥：

[1-羥基-2-(1h-咪唑-1-基)乙烷-1，1-二基]雙(膦酸)，唑來膦酸，例如，唑來膦酸鹽/酯；

(二氯-膦酰基-甲基)膦酸，例如，氯膦酸鹽/酯；

{1-羥基-3-[甲基(戊基)氨基]丙烷-1，1-二基}雙(膦酸)，伊班膦酸，例如，伊班膦酸鹽/酯；

(3-氨基-1-羥基丙烷-1，1-二基)雙(膦酸)，帕米膦酸，例如，帕米膦酸鹽/酯；

(1-羥基-1-膦?；?2-吡啶-3-基-乙基)膦酸，利塞膦酸，例如，利塞膦酸鹽/酯；

(1-羥基-2-咪唑并[l，2-a]吡啶-3-基-1-膦?；一?膦酸，米諾膦酸；

[3-(二甲基氨基)-1-羥基丙烷-1，1-二基]雙(膦酸)，奧帕膦酸(olpadronicacid)；

[4-氨基-1-羥基-1-(羥基-氧代-磷?；?-丁基]膦酸，阿侖膦酸，例如，阿侖膦酸鹽/酯；

[(環(huán)庚基氨基)亞甲基]雙(膦酸)，英卡膦酸；

(1-羥基乙烷-1，1-二基)雙(膦酸)，羥乙膦酸，例如，羥乙膦酸鹽/酯；以及{[(4-氯苯基)硫代]亞甲基}雙(膦酸)，替魯膦酸。

根據(jù)本發(fā)明，唑來膦酸(inn)或唑來膦酸鹽/酯(由novartis以商品名zometa、zomera、aclasta和reclast市售)為特別優(yōu)選的雙膦酸/鹽/酯。zometa用于預(yù)防患有癌癥(例如，多發(fā)性骨髓瘤和前列腺癌)的患者骨折以及治療骨質(zhì)疏松癥。其還可用于治療惡性高鈣血癥并且可有益于治療來自骨轉(zhuǎn)移的疼痛。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明刺激γδt細胞的藥劑與il-2組合施用。已表明，該組合可特別有效地介導γ9δ2t細胞的擴增和活化。

白細胞介素-2(il-2)為一種白細胞介素，即免疫系統(tǒng)中的一類細胞因子信號轉(zhuǎn)導分子。其是一種吸引淋巴細胞的蛋白質(zhì)，并且為對微生物感染以及區(qū)分外源(非自身)和自身的身體自然應(yīng)答的一部分。il-2通過與淋巴細胞表達的il-2受體結(jié)合來介導其效應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明使用的il-2可為任何支持或能夠刺激γδt細胞的il-2，并且可來自任何物種，優(yōu)選人。il-2可為分離的、重組產(chǎn)生的或合成的il-2，還可為天然存在或修飾的il-2。

術(shù)語“穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑”指藥劑或藥劑組合，其中，與不向細胞提供藥劑或藥劑組合的情況相比，向細胞提供所述藥劑或藥劑組合導致cldn18.2的rna和/或蛋白質(zhì)水平提高，優(yōu)選地導致細胞表面的cldn18.2蛋白質(zhì)水平提高。優(yōu)選地，細胞為癌細胞，特別是表達cldn18.2的癌細胞，例如，本文所述癌癥類型的細胞。術(shù)語“穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑”特別指藥劑或藥劑組合，其中，與不向細胞提供藥劑或藥劑組合的情況相比，向細胞提供所述藥劑或藥劑組合導致所述細胞表面上具有更高密度的cldn18.2。“穩(wěn)定cldn18.2的表達”包括，特別是，藥劑或藥劑組合防止cldn18.2表達降低或減小cldn18.2表達降低的情況，例如，在不提供藥劑或藥劑組合的情況下，cldn18.2的表達將降低，并且提供藥劑或藥劑組合防止cldn18.2表達的所述降低或減小cldn18.2表達的所述降低。“增加cldn18.2的表達”包括，特別是，藥劑或藥劑組合增加cldn18.2表達的情況，例如，在不提供藥劑或藥劑組合的情況下，cldn18.2的表達將降低、基本保持不變或增加，而與不提供藥劑或藥劑組合的情況相比，提供藥劑或藥劑組合增加cldn18.2的表達，使得與在不提供藥劑或藥劑組合下，cldn18.2的表達將降低、基本保持不變或增加的情況相比，得到的表達更高。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑”包括化學治療劑或化學治療劑(例如，細胞抑制劑)的組合?；瘜W治療劑可以以下列方式中的一種來影響細胞：(1)損傷細胞dna使其再不能復制，(2)抑制新dna鏈的合成，使得不能進行細胞復制，(3)阻止細胞的有絲分裂過程，使得細胞不能分裂成兩個細胞。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑”優(yōu)選指藥劑或藥劑的組合(例如，細胞抑制化合物或細胞抑制化合物的組合)，向細胞(特別是癌細胞)提供所述藥劑或藥劑組合導致細胞停滯或累積在細胞周期的一個或更多個時相中，優(yōu)選細胞周期中除g1期和g0期之外，優(yōu)選在除g1期之外的一個或更多個時相中，優(yōu)選在細胞周期g2期或s期中的一個或更多個中(例如，細胞周期中的g1/g2期、s/g2期、g2期或s期)。術(shù)語“細胞停滯或累積在細胞周期的一個或更多個時相中”意指處于所述細胞周期的一個或更多個時相中的細胞的百分數(shù)增加。每個細胞經(jīng)歷包含四個時相的周期以自我復制。稱為g1的第一時相為細胞準備復制其染色體時。第二時相稱為s，在此時相發(fā)生dna合成且dna進行復制。下一時相為g2期，此時rna和蛋白質(zhì)復制。最后時相為m期，其為實際細胞分裂的時相。在此最后時相中，已復制的dna和rna分開(split)并且向細胞分開的端部移動，細胞實際上分裂為兩個相同的功能性細胞?；瘜W治療劑，即dna損傷劑，通常導致細胞在g1期和/或g2期累積。通過干擾dna合成來阻斷細胞生長的化學治療劑(例如，抗代謝物)通常導致細胞在s期的累積。這些藥物的實例為6-巰基嘌呤和5-氟尿嘧啶。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑”包括蒽環(huán)類藥物，例如表柔比星、鉑化合物(例如，奧沙利鉑和順鉑)、核苷類似物(例如，5-氟尿嘧啶或其前藥)、紫杉烷類(例如，多西他賽)和喜樹堿類似物(例如，伊立替康和拓撲替康)以及藥物的組合，例如，包含一種或更多種蒽環(huán)類藥物(例如，表柔比星)、奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶的組合，例如，包含奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶的藥物組合或本文所述的其它藥物組合。

在一個優(yōu)選實施方案中，“穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑”為“誘導免疫原性細胞死亡的藥劑”。

在特定情況下，癌細胞可進入與時空限定的信號組合之發(fā)出相關(guān)聯(lián)的致死應(yīng)激途徑(lethalstresspathway)，所述途徑可通過免疫系統(tǒng)解碼以激活腫瘤特異性免疫應(yīng)答(zitvogell.等.(2010)cell140：798-804)。在這種情況下，癌細胞被觸發(fā)以發(fā)出信號，該信號可被先天免疫效應(yīng)器(例如，樹突細胞)感知從而觸發(fā)與cd8+t細胞和ifn-γ信號傳導相關(guān)的同源免疫應(yīng)答，使得腫瘤細胞死亡可引發(fā)有效的(productive)抗癌免疫應(yīng)答。這些信號包括凋亡前內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)伴侶鈣網(wǎng)蛋白(crt)暴露在細胞表面、凋亡前atp的分泌和凋亡后核蛋白hmgb1的釋放?？傊?，這些過程構(gòu)成了免疫原性細胞死亡(icd)的分子決定因素。蒽環(huán)類藥物、奧沙利鉑和γ輻射能夠誘導所有限定icd的信號，而例如順鉑，不能誘導crt從er向死亡細胞表面轉(zhuǎn)位(需要er應(yīng)激的過程)需要通過毒胡蘿卜素(一種er應(yīng)激誘導物)互補。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“誘導免疫原性細胞死亡的藥劑”指這樣的藥劑或藥劑組合，當向細胞(特別是癌細胞)提供所述藥劑或藥劑組合時，其能夠誘導細胞進入最后導致腫瘤特異性免疫應(yīng)答的致死應(yīng)激途徑。特別地，當向細胞提供誘導免疫原性細胞死亡的藥劑時，其誘導細胞發(fā)出時空限定的信號組合，包括，特別是，凋亡前內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)伴侶鈣網(wǎng)蛋白(crt)暴露在細胞表面、凋亡前atp的分泌和凋亡后核蛋白hmgb1的釋放。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“誘導免疫原性細胞死亡的藥劑”包括蒽環(huán)類藥物和奧沙利鉑。

蒽環(huán)類藥物是一類通常用于癌癥化學治療中的藥物，其也為抗生素。在結(jié)構(gòu)上，所有的蒽環(huán)類藥物共有四環(huán)7，8，9，10-四氫并四苯-5，12-醌結(jié)構(gòu)并且通常需要在特異位點進行糖基化。

蒽環(huán)類藥物優(yōu)選進行下列作用機制中的一種或更多種：1.通過插入dna/rna鏈的堿基對之間來抑制dna和rna的合成，從而防止迅速生長的癌細胞的復制；2.抑制拓撲異構(gòu)酶ii，防止超螺旋dna松弛并由此阻斷dna轉(zhuǎn)錄和復制；3.產(chǎn)生鐵介導的損傷dna和細胞膜的游離氧自由基。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“蒽環(huán)類藥物”優(yōu)選指優(yōu)選通過抑制dna與拓撲異構(gòu)酶ii再結(jié)合來誘導凋亡的藥劑，優(yōu)選抗癌藥劑。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“蒽環(huán)類藥物”一般指具有以下環(huán)結(jié)構(gòu)的一類化合物，

包括類似物和衍生物、藥用鹽、水合物、酯、綴合物及其前藥。

蒽環(huán)類藥物和蒽環(huán)類藥物類似物的實例包括，但并不局限于，柔紅霉素(道諾霉素)、阿霉素(亞德里亞霉素)、表柔比星、伊達比星、紫紅霉素、吡拉柔比星(pyrarubicin)、戊柔比星、n-三氟-乙?；⒚顾?14-戊酸酯、阿克拉霉素、嗎啉代阿霉素(嗎啉代-dox)、氰基嗎啉代-阿霉素(氰基嗎啉代-dox)、2-吡咯啉-阿霉素(2-pdox)、5-亞氨基道諾霉素、米托蒽醌和阿克拉霉素a(阿克拉比星)。米托蒽醌是anthracendione類化合物中的一員，其為缺乏蒽環(huán)類藥物中的糖部分但保留允許插入dna中的二維多環(huán)芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的蒽環(huán)類藥物類似物。

根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選的蒽環(huán)類藥物為下式的化合物：

其中，r1選自h和oh，r2選自h和ome，r3選自h和oh，并且r4選自h和oh。

在一個實施方案中，r1為h，r2為ome，r3為h，并且r4為oh。在另一個實施方案中，r1為oh，r2為ome，r3為h，并且r4為oh。在另一個實施方案中，r1為oh，r2為ome，r3為oh，并且r4為h。在另一個實施方案中，r1為h，r2為h，r3為h，并且r4為oh。

在本發(fā)明的上下文中，特別構(gòu)想的蒽環(huán)類藥物為表柔比星。表柔比星為具有下式的蒽環(huán)類藥物：

并且以商品名ellence(美國)、表阿霉素或表柔比星ebewe(其它地方)市售。特別地，術(shù)語“表柔比星”指化合物(8r，10s)-10-[(2s，4s，5r，6s)-4-氨基-5-羥基-6-甲基-烷-2-基]氧基-6，11-二羥基-8-(2-羥基乙酰基)-1-甲氧基-8-甲基-9，10-二氫-7h-并四苯-5，12-二酮。在一些化學治療方案中，表柔比星比最普遍的蒽環(huán)類藥物阿霉素(doxorubicin)有利，因為表柔比星似乎導致更少的副作用。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“鉑化合物”指其結(jié)構(gòu)中包含鉑的化合物，例如鉑絡(luò)合物，并且包括例如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑的化合物。

術(shù)語“順鉑”指下式的化合物順-二氨二氯鉑(ii)(cddp)：

術(shù)語“卡鉑”指下式的化合物順-二氨(1，1-環(huán)丁烷二羧酸)鉑(ii)：

術(shù)語“奧沙利鉑”指這樣的化合物，其為與下式的二氨基環(huán)己烷載體配體絡(luò)合的鉑化合物：

具體地，術(shù)語“奧沙利鉑”指化合物[(1r，2r)-環(huán)己烷-1，2-二胺](乙二酸絡(luò)(ethanedioato)-o，o′)鉑(ii)。注射用奧沙利鉑還以商品名eloxatine市售。

術(shù)語“核苷類似物”指核苷的結(jié)構(gòu)類似物，其類別包括嘌呤類似物和嘧啶類似物二者。特別地，術(shù)語“核苷類似物”指包括氟尿嘧啶及其前藥的氟嘧啶衍生物。

術(shù)語“氟尿嘧啶”或“5-氟尿嘧啶”(5-fu或f5u)(以商標名adrucil、carac、efudix、efudex和fluoroplex出售)為下式的嘧啶類似物的化合物：

具體地，該術(shù)語指化合物5-氟-1h-嘧啶-2，4-二酮。

術(shù)語“卡培他濱”(xeloda，roche)指化學治療劑，其為在組織中轉(zhuǎn)化為5-fu的前藥。可經(jīng)口施用的卡培他濱具有下式：

具體地，該術(shù)語指化合物[1-(3，4-二羥基-5-甲基四氫呋喃-2-基)-5-氟-2氧代-1h-嘧啶-4-基]氨基甲酸戊酯。

紫杉烷類為一類二萜化合物，其最早來源于天然來源，例如紅豆衫(taxus)屬植物，但一些已經(jīng)人工合成。紫杉烷類藥物的主要作用機制為破壞微管功能，從而抑制細胞分裂過程。紫杉烷類包括多西他賽(taxotere)和紫杉醇(taxol)。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“多西他賽”指具有下式的化合物：

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“紫杉醇”指具有下式的化合物：

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“喜樹堿類似物”指化合物喜樹堿(cpt；(s)-4-乙基-4-羥基-1h-吡喃并[3′，4′：6，7]中氮茚并[1，2-b]喹啉-3，14-(4h，12h)-二酮)的衍生物。優(yōu)選地，術(shù)語“喜樹堿類似物”指包含下面結(jié)構(gòu)的化合物：

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的喜樹堿類似物為dna酶拓撲異構(gòu)酶i(拓撲i)的抑制劑。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的喜樹堿類似物為伊立替康和拓撲替康。

伊立替康為通過抑制拓撲異構(gòu)酶i來防止dna展開的藥物。從化學角度，其為具有下式的天然生物堿喜樹堿的半合成類似物：

具體地，術(shù)語“伊立替康”指化合物(s)-4，11-二乙基-3，4，12，14-四氫-4-羥基-3，14-二氧代1h-吡喃并[3′，4′：6，7]-中氮茚并[1，2-b]喹啉-9-基-[1，4′聯(lián)哌啶]-1′-羧酸酯。

拓撲替康為下式的拓撲異構(gòu)酶抑制劑：

具體地，術(shù)語“拓撲替康”指化合物(s)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4，9-二羥基-1h-吡喃并[3′，4′：6，7]中氮茚并[1，2-b]喹啉-3，14(4h，12h)-二酮單鹽酸鹽。

根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑可為化學治療劑，特別是在癌癥治療中確定的化學治療劑，并且可為藥物組合的一部分，例如，用于治療癌癥的確定的藥物組合。該藥物組合可為化學治療中使用的藥物組合，并且可為用于化學治療方案中的藥物組合，所述化學治療方案選自eox化學治療、ecf化學治療、ecx化學治療、eof化學治療、flo化學治療、folfox化學治療、folfiri化學治療、dcf化學治療和flot化學治療。

eox化學治療中使用的藥物組合包含表柔比星、奧沙利鉑和卡培他濱。ecf化學治療中使用的藥物組合包含表柔比星、順鉑和5-氟尿嘧啶。ecx化學治療中使用的藥物組合包含表柔比星、順鉑和卡培他濱。eof化學治療中使用的藥物組合包含表柔比星、奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶。

表柔比星通常以50mg/m²的劑量給予，順鉑為60mg/m²，奧沙利鉑為130mg/m²，以200mg/m²/天延長靜脈輸注5-氟尿嘧啶并且每日兩次口服卡培他濱625mg/m²，持續(xù)總共八個3周周期。

flo化學治療中使用的藥物組合包含5-氟尿嘧啶、亞葉酸和奧沙利鉑(通常以2,600mg/m²24小時輸注5-氟尿嘧啶，亞葉酸為200mg/m²且奧沙利鉑為85mg/m²，每兩周)。

folfox為由亞葉酸(甲酰四氫葉酸(leucovorin))、5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑構(gòu)成的化學治療方案。以每兩周給予的建議劑量方案如下：第1天：以85mg/m²靜脈內(nèi)輸注奧沙利鉑和以200mg/m²靜脈內(nèi)輸注甲酰四氫葉酸，然后以400mg/m²靜脈內(nèi)推注(bolus)5-fu，然后以600mg/m²22小時持續(xù)靜脈內(nèi)輸注5-fu；第2天：以200mg/m²靜脈內(nèi)輸注甲酰四氫葉酸120分鐘，然后以400mg/m²靜脈內(nèi)推注給予5-fu2至4分鐘，然后以600mg/m²22小時持續(xù)靜脈內(nèi)輸注5-fu。

folfiri化學治療中使用的藥物組合包含5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸和伊立替康。

dcf化學治療中使用的藥物組合包含多西他賽、順鉑和5-氟尿嘧啶。

flot化學治療中使用的藥物組合包含多西他賽、奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶和亞葉酸。

術(shù)語“亞葉酸”或“甲酰四氫葉酸”指用于與化學治療劑5-氟尿嘧啶協(xié)同組合的化合物。亞葉酸具有下式：

具體地，該術(shù)語指化合物(2s)-2-{[4-[(2-氨基-5-甲?；?4-氧代-5，6，7，8-四氫-1h-蝶啶-6-基)甲基氨基]苯甲?；鵠氨基}戊二酸。

為了施用穩(wěn)定或增加cldn18.2表達的藥劑，在一個實施方案中，根據(jù)eox方案，與能夠結(jié)合cldn18.2的抗體(特別是imab362)組合施用標準化學治療，持續(xù)最多8個周期。劑量和方案可如下：

在eox階段期間，在每個周期的第一天，經(jīng)15分鐘輸注靜脈內(nèi)施用50mg/m²表柔比星。

在eox階段期間，在每個周期的第一天，經(jīng)2小時輸注靜脈內(nèi)施用130mg/m²奧沙利鉑。

在eox階段期間，從每個周期的第一天晚上開始，早晚每日兩次口服攝入625mg/m²卡培他濱，持續(xù)21天。

在第一個周期的第一天，經(jīng)2小時輸注靜脈內(nèi)施用1000mg/m²抗體。此后，在每個其它周期的第一天，在奧沙利鉑輸注完成之后，經(jīng)2小時輸注靜脈內(nèi)施用600mg/m²抗體。

在化學治療結(jié)束后，每3周或4周，患者將繼續(xù)經(jīng)2小時輸注施用600mg/m²抗體。

在本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)eox方案，與za/il-2和能夠結(jié)合cldn18.2的抗體(特別是imab362)組合施用標準化學治療，持續(xù)最多8個周期(24周)。

術(shù)語“抗原”指包含針對其引起和/或?qū)⒁鹈庖邞?yīng)答之表位的物質(zhì)(agent)，例如，蛋白質(zhì)或肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗原為腫瘤相關(guān)抗原(例如，cldn18.2)，即可來源于細胞質(zhì)、細胞表面和細胞核的癌細胞組成，特別是優(yōu)選細胞內(nèi)大量產(chǎn)生的那些抗原或作為癌細胞上的表面抗原。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“腫瘤相關(guān)抗原”優(yōu)選指在正常條件下在有限數(shù)目的組織和/或器官中或在特定發(fā)育階段中特異性表達的蛋白質(zhì)和在一個或更多個腫瘤或癌癥組織中表達或異常表達的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，腫瘤相關(guān)抗原優(yōu)選與癌細胞的細胞表面締合，并且優(yōu)選不在或僅很少在正常組織中表達。

術(shù)語“表位”指分子中的抗原決定簇，即，指分子中被免疫系統(tǒng)識別(例如，被抗體識別)的部分。例如，表位是被免疫系統(tǒng)識別的抗原上不連續(xù)的三維位點。表位通常由分子的化學活性表面基團(例如，氨基酸或糖側(cè)鏈)組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。構(gòu)象表位與非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在存在變性溶劑的情況下，前者喪失結(jié)合，而后者則不然。蛋白質(zhì)(例如，cldn18.2)的表位優(yōu)選包含所述蛋白質(zhì)的連續(xù)或不連續(xù)部分，并且長度優(yōu)選為5至100，優(yōu)選5至50，更優(yōu)選8至30，最優(yōu)選10至25個氨基酸，例如，表位的長度可優(yōu)選為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個氨基酸。

術(shù)語“抗體”指包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重(h)鏈和兩條輕(l)鏈的糖蛋白，并且包括任何包含其抗原結(jié)合部分的分子。術(shù)語“抗體”包括單克隆抗體和抗體片段或衍生物，包括但不局限于，人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體(例如，scfv′s)和抗原結(jié)合的抗體片段(例如，fab和fab′片段)，術(shù)語“抗體”還包括本文所述的所有重組形式的抗體，例如，在原核生物中表達的抗體、非糖基化抗體以及任何與抗原結(jié)合的抗體片段和衍生物。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為vh)和重鏈恒定區(qū)構(gòu)成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為vl)和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。vh和vl區(qū)可進一步細分為稱為互補決定區(qū)(cdr)的高變區(qū)，其散布在稱為框架區(qū)(fr)的更保守區(qū)域中。每個vh和vl由三個cdr和四個fr構(gòu)成，從氨基端到羧基端按以下列順序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細胞(例如，效應(yīng)細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(c1q)。

本文所述的抗體可為人抗體。本文使用的術(shù)語“人抗體”旨在包括具有來源于人生殖系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本文所述的人抗體可包括不是由人生殖系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機誘變或定點誘變或者通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。

術(shù)語“人源化抗體”指具有基本來源于非人物種免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基于人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列。所述抗原結(jié)合位點可包含融合至恒定結(jié)構(gòu)域的完整可變結(jié)構(gòu)域或僅包含移植(graft)至可變結(jié)構(gòu)域中適當?shù)臉?gòu)架區(qū)的互補決定區(qū)(cdr)?？乖Y(jié)合位點可為野生型的，或者通過一個或更多個氨基酸替換進行修飾，例如，進行修飾以與人免疫球蛋白更為類似。一些形式的人源化抗體保留了全部cdr序列(例如，含有來自小鼠抗體的全部六個cdr的人源化小鼠抗體)。其它形式具有一個或更多個相對于原始抗體而言發(fā)生了改變的cdr。

術(shù)語“嵌合抗體”指這樣的抗體，其中每個重鏈和輕鏈的氨基酸序列中的一部分與來自特定物種或?qū)儆谔囟悇e的抗體中的相應(yīng)序列同源，而該鏈的其余區(qū)段則與另一物種或?qū)儆诹硪活悇e的抗體的相應(yīng)序列同源。通常，輕鏈和重鏈的可變區(qū)均模擬來自一個哺乳動物物種之抗體的可變區(qū)，而恒定部分則與來自另一物種的抗體的序列同源。這種嵌合形式的一個明顯的優(yōu)勢是可使用容易獲得的b細胞或來自非人宿主生物體的雜交瘤從目前已知的來源中方便地產(chǎn)生可變區(qū)，而與其組合的恒定區(qū)來自例如人細胞制備物。所述可變區(qū)具有易于制備的優(yōu)點，并且其特異性不受來源影響，而由于恒定區(qū)為人類的，因此該抗體在注射時引發(fā)人對象免疫應(yīng)答的可能性將比恒定區(qū)來自非人來源時更低。然而，定義并不局限于此具體實例。

術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“結(jié)合部分”)或抗體的“抗原結(jié)合片段”(或簡稱為“結(jié)合片段”)或者類似的術(shù)語指抗體中保留特異性結(jié)合抗原之能力的一個或更多個片段。已表明，抗體的抗原結(jié)合功能可通過全長抗體的片段來實現(xiàn)。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中涵蓋的結(jié)合片段的實例包括(i)fab片段，由vl、hl、cl和ch結(jié)構(gòu)域組成的一價片段；(ii)f(ab′)2片段，包含通過鉸鏈區(qū)處的二硫鍵連接的兩個fab片段的二價片段；(iii)由vh和ch結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(iv)由抗體單臂上的vl和vh結(jié)構(gòu)域組成的fv片段；(v)由vh結(jié)構(gòu)域組成的dab片段(ward等，(1989)nature341：544-546)；(vi)分離的互補決定區(qū)(cdr)以及(vii)兩個或更多個分離的cdr的組合，其可任選地通過合成接頭連接。此外，盡管fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域vl和vh由單獨的基因編碼，但是可使用重組方法通過合成接頭將它們連接，使之成為單個蛋白質(zhì)鏈，其中vl和vh區(qū)配對以形成一價分子(稱為單鏈fv(scfv)；參見例如，bird等(1988)science242：423-426；和huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：5879-5883)。這種單鏈抗體還旨在涵蓋于術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合片段”內(nèi)。另一個實例是結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽，(ii)與該鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈ch2恒定區(qū)，和(iii)與ch2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈ch3恒定區(qū)。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽可為重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)。結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白在us2003/0118592和us2003/0133939中進一步公開。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得這些抗體片段，并以與完整抗體相同的方式根據(jù)用途對片段進行篩選。

術(shù)語“雙特異性分子”旨在包括具有兩種不同的結(jié)合特異性的任何物質(zhì)，例如，蛋白質(zhì)、肽或者蛋白質(zhì)或肽復合物。例如，分子可與(a)細胞表面抗原和(b)效應(yīng)細胞表面上的fc受體結(jié)合或相互作用。術(shù)語“多特異性分子”或“異種特異性分子”旨在包括具有多于兩種不同結(jié)合特異性的任何物質(zhì)，例如，蛋白質(zhì)、肽或者蛋白質(zhì)或肽復合物。例如，所述分子可與(a)細胞表面抗原、(b)效應(yīng)細胞表面上的fc受體和(c)至少一種其它組分結(jié)合或相互作用。因此，本發(fā)明包括，但不局限于，針對cldn18.2和其它靶標(例如，效應(yīng)細胞上的fc受體)的雙特異性、三特異性、四特異性以及其它多特異性分子。術(shù)語“雙特異性抗體”還包括雙抗體。雙抗體為二價的雙特異性抗體，其中vh和vl結(jié)構(gòu)域在單個多肽鏈上表達，但由于使用的接頭太短以致于不能使同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域配對，從而促使結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(參見例如，holliger，p.，等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：6444-6448；poljak，r.j.，等(1994)structure2：1121-1123)。

抗體可與治療部分或治療劑綴合，例如，細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性同位素。細胞毒素或細胞毒劑包括對細胞有害和特別是殺傷細胞的任何試劑。實例包括紫杉醇、細胞松弛素b、短桿菌肽d、溴乙啡啶、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿(cochicin)、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素(anthracin)二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素d、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或同系物。適于形成抗體綴合物的治療劑包括，但不局限于，抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉濱、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(decarbazine))、烷基化劑(例如，氮芥(mechlorethamine)、硫噴妥苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(bsnu)和羅莫司丁(ccnu)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素c和順二氯二胺鉑(ii)(ddp)順鉑)、蒽環(huán)類藥物(例如，柔紅霉素(原來的道諾霉素(daunomycin))和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(原來的放線菌素)、博萊霉素、光輝霉素和氨茴霉素(amc))和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春花堿)。在一個優(yōu)選實施方案中，治療劑為細胞毒劑或放射性毒劑。在另一實施方案中，治療劑為免疫抑制劑。在又一實施方案中，治療劑為gm-csf。在一個優(yōu)選實施方案中，治療劑為阿霉素、順鉑、博萊霉素、硫酸鹽、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺或蓖麻蛋白a。

抗體還可與放射性同位素綴合，例如，碘-131、釔-90或銦-111，以產(chǎn)生細胞毒性放射性藥物。

本發(fā)明的抗體綴合物可用于修飾給定的生物應(yīng)答，并且藥物部分不應(yīng)被解釋為局限于經(jīng)典的化學治療劑。例如，藥物部分可為具有所期望生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)可包括，例如，酶促活性毒素或其活性片段，例如，相思豆毒素、蓖麻蛋白a、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，例如，腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或者生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物，如，例如，淋巴因子、白細胞介素-1(“il-1”)、白細胞介素-2(“il-2”)、白細胞介素-6(“il-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒細胞集落刺激因子(“g-csf”)或其它生長因子。

用于綴合該治療部分至抗體的技術(shù)是公知的，參見，例如，arnon等，″monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy"，monoclonalantibodiesandcancertherapy中，reisfeld等(編輯)，第243-56頁(alanr.liss，inc.1985)；hellstrom等，″antibodiesfordrugdelivery"，controlleddrugdelivery(第2版)中，robinson等(編輯)，第623-53頁(marceldekker，inc.1987)；thorpe，″antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy：areview"，monoclonalantibodies′84：biologicalandclinicalapplications中，pincheraet等(編輯)，第475-506頁(1985)；″analysis，results，andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy"，monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy中，baldwin等(編輯)，第303-16頁(academicpress1985)，和thorpe等，″thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates"，immunol.rev.，62：119-58(1982)。

如本文所用，如果通過免疫動物或通過篩選免疫球蛋白基因文庫來從系統(tǒng)獲得抗體，則抗體“來自”特定的生殖系序列，并且其中選擇的抗體的氨基酸序列與所述生殖系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列具有至少90％、更優(yōu)選至少95％、甚至更優(yōu)選至少96％、97％、98％或99％的同一性。一般而言，與所述生殖系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列相比，來自特定生殖系序列的抗體顯示出不超過10個氨基酸差異，更優(yōu)選，不超過5個氨基酸差異，或者甚至更優(yōu)選不超過4、3、2或1個氨基酸差異。

本文所用的術(shù)語“異源抗體”指連接在一起的兩個或更多個抗體、其衍生物或抗原結(jié)合區(qū)，其中至少兩個具有不同的特異性。這些不同的特異性包括對效應(yīng)細胞上的fc受體的結(jié)合特異性和對靶細胞(例如，腫瘤細胞)上抗原或表位的結(jié)合特異性。

本文所述的抗體可為單克隆抗體。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指單分子組成的抗體分子制備物。單克隆抗體顯示出單一結(jié)合特異性和親和力。在一個實施方案中，單克隆抗體通過包括與無限增殖化(immortalized)細胞融合的獲自非人動物(例如，小鼠)之b細胞的雜交瘤產(chǎn)生。

本文所述抗體可為重組抗體。本文所用的術(shù)語“重組抗體”包括所有通過重組手段制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體，例如，(a)從免疫球蛋白基因為轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動物(例如，小鼠)或由其制備的雜交瘤分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達所述抗體的宿主細胞(例如，轉(zhuǎn)染瘤)分離的抗體，(c)從重組組合抗體文庫分離的抗體，和(d)通過涉及將免疫球蛋白基因序列剪接成其他dna序列的任何其它手段制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。

本文所述抗體可來自不同的物種，包括，但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。

本文所述抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體，并且包括iga，例如，igal或iga2、igg1、igg2、igg3、igg4、ige、igm和igd抗體。在多種實施方案中，抗體為igg1抗體，更特別地為igg1，κ或igg1，λ同種型(即iggl，κ、λ)、igg2a抗體(例如，igg2a，κ、λ)、igg2b抗體(例如，igg2b，κ、λ)和igg3抗體(例如，igg3，κ、λ)或igg4抗體(例如，igg4，κ、λ)。

本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染瘤”包括表達抗體的重組真核宿主細胞，例如，cho細胞、ns/0細胞、hek293細胞、hek293t細胞、植物細胞或真菌，包括酵母細胞。

本文所用的“異源抗體”是以產(chǎn)生這種抗體的轉(zhuǎn)基因生物體定義的。該術(shù)語指這樣的抗體，所述抗體的氨基酸序列或編碼核酸序列對應(yīng)于不由該轉(zhuǎn)基因生物體組成的生物體中可見的氨基酸序列或編碼核酸序列，并且一般來自除所述轉(zhuǎn)基因生物體以外的物種。

本文所用的“異源雜合抗體(heterohybridantibody)”指具有不同生物來源的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠類輕鏈結(jié)合的人重鏈的抗體即為異源雜合抗體。

本發(fā)明包括本文所述的所有抗體和抗體衍生物，為了本發(fā)明的目的其均被涵蓋在術(shù)語“抗體”中。術(shù)語“抗體衍生物”指任何修飾形式的抗體，例如，抗體和另一物質(zhì)或抗體的綴合物，或抗體片段。

本文所述抗體優(yōu)選是分離的。本文所用的“分離的抗體”意指基本不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體(例如，與cldn18.2特異性結(jié)合的分離抗體基本無特異性結(jié)合除cldn18.2以外之抗原的抗體)。然而，與人cldn18.2的表位、同工型或變體特異性結(jié)合的分離抗體可對其它相關(guān)的抗原，例如，來自其它物種(例如，cldn18.2種同源物)具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可基本無其它細胞材料和/或化學物質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方案中，“分離的”單克隆抗體的組合指具有不同特異性并且組合在明確確定的組合物或混合物中的抗體。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“結(jié)合”優(yōu)選指特異性結(jié)合。

根據(jù)本發(fā)明，在標準測定中如果抗體對所述預(yù)定靶標具有顯著的親和力并且與所述預(yù)定靶標結(jié)合，則所述抗體能夠與預(yù)定靶標結(jié)合?！坝H和力”或“結(jié)合親和力”一般通過平衡解離常數(shù)(kd)來測定。優(yōu)選地，術(shù)語“顯著親和力”指以10^-5m或更低、10^-6m或更低、10^-7m或更低、10^-8m或更低、10^-9m或更低、10^-10m或更低、10^-11m或更低或者10^-12m或更低的解離常數(shù)(kd)與預(yù)定靶標結(jié)合。

在標準測定中，如果抗體對靶標不具有顯著的親和力并且不與所述靶標顯著地結(jié)合，特別是不與之可檢測地結(jié)合，則所述抗體(基本上)不能與所述靶標結(jié)合。優(yōu)選地，如果以高至2μg/ml，優(yōu)選10μg/ml，更優(yōu)選20μg/ml，特別是50或100μg/ml或更高的濃度存在，則所述抗體不能與所述靶標可檢測地結(jié)合。優(yōu)選地，如果抗體與靶標以與預(yù)定靶標(所述抗體能夠與其結(jié)合)結(jié)合之kd相比高至少10倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍的kd結(jié)合，則所述抗體對所述靶標不具有顯著的親和力。例如，如果抗體與所述抗體能夠結(jié)合的靶標結(jié)合的kd為10^-7m，則抗體與對其無顯著親和力的靶標結(jié)合的kd為至少10^-6m、10^-5m、10^-4m、10^-3m、10^-2m或10^-1m。

如果在標準測定中抗體能夠與所述預(yù)定靶標結(jié)合而不能夠與其它靶標結(jié)合，即對其它靶標無顯著親和力，并且不能與其它靶標顯著結(jié)合，則所述抗體對所述預(yù)定靶標具有特異性。根據(jù)本發(fā)明，如果抗體能夠與cldn18.2結(jié)合但是(基本上)不能夠與其它靶標結(jié)合，則所述抗體對cldn18.2具有特異性。優(yōu)選地，如果與這些其它靶標的親和力和結(jié)合不能顯著超過與cldn18.2不相關(guān)蛋白質(zhì)的親和力或結(jié)合，則所述抗體對cldn18.2具有特異性，所述與cldn18.2不相關(guān)蛋白質(zhì)例如，牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白、人血清白蛋白(hsa)或非密蛋白跨膜蛋白質(zhì)(例如，mhc分子或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)或任何其它特定的多肽。優(yōu)選地，如果抗體與所述靶標以與抗體對其不具有特異性的靶標結(jié)合之kd相比低至少10倍、100倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍的kd結(jié)合，則所述抗體對預(yù)定靶標具有特異性。例如，如果抗體與所述抗體對其具有特異性的靶標結(jié)合的kd為10^-7m，則抗體與對其不具有特異性的靶標結(jié)合的kd為至少10^-6m、10^-5m、10^-4m、10^-3m、10^-2m或10^-1m。

可使用任何合適的方法通過實驗確定抗體與靶標的結(jié)合；參見，例如，berzofsky等，″antibody-antigeninteractions″infundamentalimmunology，paul，w.e.，編輯，ravenpressnewyork，ny(1984)，kuby，janisimmunology，w.h.freemanandcompanynewyork，ny(1992)以及本文所述方法。可使用常規(guī)技術(shù)容易地測定親和力，例如，通過平衡透析；通過使用biacore2000儀器，使用制造商所描述的通用方法；通過使用放射性標記的靶抗原進行放射免疫測定；或通過技術(shù)人員已知的其他方法?？衫缤ㄟ^scatchard等，annn.y.acad.scl，51：660(1949)的方法對親和力數(shù)據(jù)進行分析。如果在不同條件(例如，鹽濃度、ph)下測量，則測定的特定抗體-抗原相互作用的親和力可不同。因此，親和力和其它抗原結(jié)合參數(shù)(例如，kd、ic50)的測定優(yōu)選使用抗體和抗原標準化溶液以及標準化緩沖液來進行。

本文所用的“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如，igm或igg1)。

本文所用的“同種型轉(zhuǎn)換(isotypeswitching)”指抗體的類別或同種型從一種ig類別轉(zhuǎn)換至其它ig類別之一的現(xiàn)象。

應(yīng)用于某對象時，本文所用的術(shù)語“天然存在的”指該對象可見于自然界這一事實。例如，存在于可從自然界來源分離的生物體(包括病毒)中，并且未經(jīng)人在實驗室中有意修飾的多肽或多核苷酸序列即是天然存在的。

本文所用的術(shù)語“重排的”指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中v區(qū)段在編碼基本上完整的vh結(jié)構(gòu)域或vl結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中分別位于緊鄰d-j區(qū)段或j區(qū)段的位置。重排的免疫球蛋白(抗體)基因座可通過與生殖系dna的比較來鑒定；重排的基因座將具有至少一個重組的七聚體/九聚體同源性元件。

涉及v區(qū)段時，本文所用的術(shù)語“未重排的”或“生殖系構(gòu)型”指其中v區(qū)段未經(jīng)重組從而與d或j區(qū)段緊鄰的構(gòu)型。

根據(jù)本發(fā)明，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體為能夠與cldn18.2中存在的表位，優(yōu)選位于cldn18.2的胞外結(jié)構(gòu)域，特別是第一胞外結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選cldn18.2的第29至78位的氨基酸內(nèi)的表位結(jié)合的抗體。在一些具體實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體為能夠與以下表位結(jié)合的抗體：(i)cldn18.2上的但不存在于cldn18.1上的表位，優(yōu)選seqidno：3、4和5，(ii)位于cldn18.2-環(huán)1上的表位，優(yōu)選seqidno：8，(iii)位于cldn18.2-環(huán)2上的表位，優(yōu)選seqidno：10，(iv)位于cldn18.2-環(huán)d3上的表位，優(yōu)選seqidno：11，(v)涵蓋cldn18.2-環(huán)1和cldn18.2-環(huán)d3的表位，或(vi)位于cldn18.2-環(huán)d3上的非糖基化表位，優(yōu)選seqidno：9。

根據(jù)本發(fā)明，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體優(yōu)選為能夠與cldn18.2結(jié)合但不與cldn18.1結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體對cldn18.2具有特異性。優(yōu)選地，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體優(yōu)選為在細胞表面上表達的能夠結(jié)合cldn18.2的抗體。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體與活細胞表面上存在的cldn18.2的天然表位結(jié)合。優(yōu)選地，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體與一種或更多種選自seqidno：1、3-11、44、46和48-50的肽結(jié)合。優(yōu)選地，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體對前述蛋白質(zhì)、肽或免疫原性片段或其衍生物具有特異性。能夠結(jié)合cldn18.2的抗體可通過包括用蛋白質(zhì)或肽或表達所述蛋白質(zhì)或肽的核酸或宿主細胞免疫動物之步驟的方法獲得，所述蛋白質(zhì)或肽包含選自seqidno：1、3-11、44、46和48-50的氨基酸序列。優(yōu)選地，抗體與癌細胞結(jié)合，特別是上述癌癥類型的細胞，優(yōu)選地，所述抗體基本不與非癌細胞結(jié)合。

優(yōu)選地，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體與表達cldn18.2之細胞的結(jié)合誘導或介導殺傷表達cldn18.2的細胞。表達cldn18.2的細胞優(yōu)選為癌細胞，特別地，選自致瘤性胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸癌和膽囊癌細胞。優(yōu)選地，抗體通過誘導補體依賴性細胞毒性(cdc)介導的裂解、抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc)介導的裂解、凋亡和抑制表達cldn18.2之細胞增殖中的一種或更多種來誘導或介導細胞殺傷。優(yōu)選地，在存在效應(yīng)細胞的情況下，發(fā)生adcc介導的細胞裂解，在特定實施方案中，所述效應(yīng)細胞選自單核細胞、單核的細胞、nk細胞和pmn?？墒褂娩迕撗跄蜍?5-溴-2-脫氧鳥苷，brdu)通過確定細胞在測定中的增殖來體外測量對細胞增殖的抑制。brdu為合成的核苷，其為胸腺嘧啶核苷的類似物，并且在dna復制期間，可被摻入復制中之細胞(在細胞周期的s期)的新合成的dna中，從而取代胸腺嘧啶核苷。使用例如對brdu具有特異性的抗體檢測到摻入的化學物，表明細胞正活躍地復制其dna。

在一些優(yōu)選實施方案中，本文所述抗體可以以下述特性中的一種或更多種為特征：

a)對cldn18.2具有特異性；

b)對cldn18.2的結(jié)合親和力為約100nm或更低，優(yōu)選，約5至10nm或更低，更優(yōu)選，約1至3nm或更低；

c)誘導或介導cldn18.2陽性細胞上cdc的能力；

d)誘導或介導cldn18.2陽性細胞上adcc的能力；

e)抑制cldn18.2陽性細胞生長的能力；

f)誘導cldn18.2陽性細胞凋亡的能力。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體由保藏在德國微生物菌種保藏中心(dsmz)的雜交瘤產(chǎn)生(德國，布倫瑞克市馬舍奧德路1b號，郵編38124；新地址：德國，布倫瑞克市因霍芬大街7b號，郵編38124)，其命名和登記號如下：

a.182-d1106-055，登記號dsmacc2737，保藏于2005年10月19日

b.182-d1106-056，登記號dsmacc2738，保藏于2005年10月19日

c.182-d1106-057，登記號dsmacc2739，保藏于2005年10月19日

d.182-d1106-058，登記號dsmacc2740，保藏于2005年10月19日

e.182-d1106-059，登記號dsmacc2741，保藏于2005年10月19日

f.182-d1106-062，登記號dsmacc2742，保藏于2005年10月19日

g.182-d1106-067，登記號dsmacc2743，保藏于2005年10月19日

h.182-d758-035，登記號dsmacc2745，保藏于2005年11月17日

i.182-d758-036，登記號dsmacc2746，保藏于2005年11月17日

j.182-d758-040，登記號dsmacc2747，保藏于2005年11月17日

k.182-d1106-061，登記號dsmacc2748，保藏于2005年11月17日

l.182-d1106-279，登記號dsmacc2808，保藏于2006年10月26日

m.182-d1106-294，登記號dsmacc2809，保藏于2006年10月26日

n.182-d1106-362，登記號dsmacc2810，保藏于2006年10月26日。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的抗體為由上述雜交瘤產(chǎn)生及可從上述雜交瘤獲得的那些；即，在182-d1106-055的情況下為37g11，在182-d1106-056的情況下為37h8，在182-d1106-057的情況下為38g5，在182-d1106-058的情況下為38h3，在182-d1106-059的情況下為39f11，在182-d1106-062的情況下為43a11，在182-d1106-067的情況下為61c2，在182-d758-035的情況下為26b5，在182-d758-036的情況下為26d12，在182-d758-040的情況下為28d10，在182-d1106-061的情況下為42e12，在182-d1106-279的情況下為125e1，在182-d1106-294的情況下為163e12，在182-d1106-362的情況下為175d10，以及其嵌合和人源化形式。

優(yōu)選的嵌合抗體及其序列在下表中示出。

在一些優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體(特別是嵌合形式的抗體)包括包含如下重鏈恒定區(qū)(ch)的抗體，所述重鏈恒定區(qū)包含來自人重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，例如seqidno：13所示的氨基酸序列或其片段。在另一些優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體(特別是嵌合形式的抗體)包括包含如下輕鏈恒定區(qū)(cl)的抗體，所述輕鏈恒定區(qū)包含來自人輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，例如seqidno：12所示的氨基酸序列或其片段。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體(特別是嵌合形式的抗體)包括包含含有來自人ch的氨基酸序列之ch的抗體，例如seqidno：13所示的氨基酸序列或其片段，并且其包括包含含有來自人cl的氨基酸序列之cl的抗體，例如seqidno：12所示的氨基酸序列或其片段。

在一個實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體為包含以下的嵌合小鼠/人igg1單克隆抗體：κ鼠可變輕鏈、人κ輕鏈恒定區(qū)同種異型km(3)、鼠重鏈可變區(qū)、人igg1恒定區(qū)同種異型glm(3)。

在某些優(yōu)選實施方案中，嵌合形式的抗體包括包含含有選自seqidno：14、15、16、17、18、19和其片段的氨基酸序列之重鏈的抗體，和/或包含含有選自seqidno：20、21、22、23、24、25、26、27、28和其片段的氨基酸序列之輕鏈的抗體。

在某些優(yōu)選實施方案中，嵌合形式的抗體包括包含選自以下可能情況(i)至(ix)的重鏈和輕鏈的組合的抗體：

(i)重鏈包含seqidno：14所示的氨基酸序列或其片段，且輕鏈包含seqidno：21所示的氨基酸序列或其片段，

(ii)重鏈包含seqidno：15所示的氨基酸序列或其片段，且輕鏈包含seqidno：20所示的氨基酸序列或其片段，

(iii)重鏈包含seqidno：16所示的氨基酸序列或其片段，且輕鏈包含seqidno：22所示的氨基酸序列或其片段，

(iv)重鏈包含seqidno：18所示的氨基酸序列或其片段，且輕鏈包含seqidno：25所示的氨基酸序列或其片段，

(v)重鏈包含seqidno：17所示的氨基酸序列或其片段，且輕鏈包含seqidno：24所示的氨基酸序列或其片段，

(vi)重鏈包含seqidno：19所示的氨基酸序列或其片段，輕鏈包含seqidno：23所示的氨基酸序列或其片段，

(vii)重鏈包含seqidno：19所示的氨基酸序列或其片段，且輕鏈包含seqidno：26所示的氰基酸序列或其片段，

(viii)重鏈包含seqidno：19所示的氨基酸序列或其片段，且輕鏈包含seqidno：27所示的氨基酸序列或其片段，以及

(ix)重鏈包含seqidno：19所示的氨基酸序列或其片段，且輕鏈包含seqidno：28所示的氨基酸序列或其片段。

上文使用的“片段”或“氨基酸序列的片段”指抗體序列的一部分，即，表示在n端和/或c端縮短的抗體序列的序列，其在替換抗體中的所述抗體序列時保留所述抗體與cldn18.2的結(jié)合并優(yōu)選保留所述抗體如本文所述的功能，例如cdc介導的裂解或adcc介導的裂解。優(yōu)選地，氨基酸序列的片段包含來自所述氨基酸序列的至少80％，優(yōu)選至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸殘基。選自seqidno：14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的片段優(yōu)選地指其中除去了n端17、18、19、20、21、22或23個氨基酸的所述序列。

在一個優(yōu)選實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體包含含有選自seqidno：29、30、31、32、33、34的氨基酸序列及其片段的重鏈可變區(qū)(vh)。

在一個優(yōu)選實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體包含含有選自seqidno：35、36、37、38、39、40、41、42、43的氨基酸序列及其片段的輕鏈可變區(qū)(vl)。

在某些優(yōu)選實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體包含選自以下可能情況(i)至(ix)的重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)的組合：(i)vh包含seqidno：29所示的氨基酸序列或其片段，且vl包含seqidno：36所示的氨基酸序列或其片段，

(ii)vh包含seqidno：30所示的氨基酸序列或其片段，且vl包含seqidno：35所示的氨基酸序列或其片段，

(iii)vh包含seqidno：31所示的氨基酸序列或其片段，且vl包含seqidno：37所示的氨基酸序列或其片段，

(iv)vh包含seqidno：33所示的氨基酸序列或其片段，且vl包含seqidno：40所示的氨基酸序列或其片段，

(v)vh包含seqidno：32所示的氨基酸序列或其片段，且vl包含seqidno：39所示的氰基酸序列或其片段，

(vi)vh包含seqidno：34所示的氨基酸序列或其片段，且vl包含seqidno：38所示的氨基酸序列或其片段，

(vii)vh包含seqidno：34所示的氨基酸序列或其片段，且vl包含seqidno：41所示的氨基酸序列或其片段，

(viii)vh包含seqidno：34所示的氨基酸序列或其片段，且vl包含seqidno：42所示的氨基酸序列或其片段，

(ix)vh包含seqidno：34所示的氨基酸序列或其片段，且vl包含seqidno：43所示的氨基酸序列或其片段。

在一個優(yōu)選實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體包含含有選自以下實施方案(i)至(vi)的互補決定區(qū)cdr1、cdr2和cdr3組的vh：

(i)cdr1：seqidno：14的45至52位，cdr2：seqidno：14的70至77位，cdr3：seqidno：14的116至125位，

(ii)cdr1：seqidno：15的45至52位，cdr2：seqidno：15的70至77位，cdr3：seqidno：15的116至126位，

(iii)cdr1：seqidno：16的45至52位，cdr2：seqidno：16的70至77位，cdr3：seqidno：16的116至124位，

(iv)cdr1：seqidno：17的45至52位，cdr2：seqidno：17的70至77位，cdr3：seqidno：17的116至126位，

(v)cdr1：seqidno：18的44至51位，cdr2：seqidno：18的69至76位，cdr3：seqidno：18的115至125位，以及

(vi)cdr1：seqidno：19的45至53位，cdr2：seqidno：19的71至78位，cdr3：seqidno：19的117至128位。

在一個優(yōu)選實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體包含含有選自以下實施方案(i)至(ix)的互補決定區(qū)cdr1、cdr2和cdr3組的vl：(i)cdr1：seqidno：20的47至58位，cdr2：seqidno：20的76至78位，cdr3：seqidno：20的115至123位，

(ii)cdr1：seqidno：21的49至53位，cdr2：seqidno：21的71至73位，cdr3：seqidno：21的110至118位，

(iii)cdr1：seqidno：22的47至52位，cdr2：seqidno：22的70至72位，cdr3：seqidno：22的109至117位，

(iv)cdr1：seqidno：23的47至58位，cdr2：seqidno：23的76至78位，cdr3：seqidno：23的115至123位，

(v)cdr1：seqidno：24的47至58位，cdr2：seqidno：24的76至78位，cdr3：seqidno：24的115至123位，

(vi)cdr1：seqidno：25的47至58位，cdr2：seqidno：25的76至78位，cdr3：seqidno：25的115至122位，

(vii)cdr1：seqidno：26的47至58位，cdr2：seqidno：26的76至78位，cdr3：seqidno：26的115至123位，

(viii)cdr1：seqidno：27的47至58位，cdr2：seqidno：27的76至78位，cdr3：seqidno：27的115至123位，以及

(ix)cdr1：seqidno：28的47至52位，cdr2：seqidno：28的70至72位，cdr3：seqidno：28的109至117位。

在一個優(yōu)選實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體包含vh和vl的組合，其中vh和vl分別包含選自以下實施方案(i)至(ix)的互補決定區(qū)cdr1、cdr2和cdr3組：

(i)vh：cdr1：seqidno：14的45至52位，cdr2：seqidno：14的70至77位，cdr3：seqidno：14的116至125位，vl：cdr1：seqidno：21的49至53位，cdr2：seqidno：21的71至73位，cdr3：seqidno：21的110至118位，

(ii)vh：cdr1：seqidno：15的45至52位，cdr2：seqidno：15的70至77位，cdr3：seqidno：15的116至126位，vl：cdr1：seqidno：20的47至58位，cdr2：seqidno：20的76至78位，cdr3：seqidno：20的115至123位，

(iii)vh：cdr1：seqidno：16的45至52位，cdr2：seqidno：16的70至77位，cdr3：seqidno：16的116至124位，vl：cdr1：seqidno：22的47至52位，cdr2：seqidno：22的70至72位，cdr3：seqidno：22的109至117位，

(iv)vh：cdr1：seqidno：18的44至51位，cdr2：seqidno：18的69至76位，cdr3：seqidno：18的115至125位，vl：cdr1：seqidno：25的47至58位，cdr2：seqidno：25的76至78位，cdr3：seqidno：25的115至122位，

(v)vh：cdr1：seqidno：17的45至52位，cdr2：seqidno：17的70至77位，cdr3：seqidno：17的116至126位，vl：cdr1：seqidno：24的47至58位，cdr2：seqidno：24的76至78位，cdr3：seqidno：24的115至123位，

(vi)vh：cdr1：seqidno：19的45至53位，cdr2：seqidno：19的71至78位，cdr3：seqidno：19的117至128位，vl：cdr1：seqidno：23的47至58位，cdr2：seqidno：23的76至78位，cdr3：seqidno：23的115至123位，

(vii)vh：cdr1：seqidno：19的45至53位，cdr2：seqidno：19的71至78位，cdr3：seqidno：19的117至128位，vl：cdr1：seqidno：26的47至58位，cdr2：seqidno：26的76至78位，cdr3：seqidno：26的115至123位，

(viii)vh：cdr1：seqidno：19的45至53位，cdr2：seqidno：19的71至78位，cdr3：seqidno：19的117至128位，vl：cdr1：seqidno：27的47至58位，cdr2：seqidno：27的76至78位，cdr3：seqidno：27的115至123位，以及

(ix)vh：cdr1：seqidno：19的45至53位，cdr2：seqidno：19的71至78位，cdr3：seqidno：19的117至128位，vl：cdr1：seqidno：28的47至52位，cdr2：seqidno：28的70至72位，cdr3：seqidno：28的109至117位。

在另一些優(yōu)選實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體優(yōu)選包含針對cldn18.2的單克隆抗體(優(yōu)選本文所述針對cldn18.2的單克隆抗體)的重鏈可變區(qū)(vh)和/或輕鏈可變區(qū)(vl)的一個或更多個互補決定區(qū)(cdr)，優(yōu)選至少包含cdr3可變區(qū)，且優(yōu)選包含本文所述重鏈可變區(qū)(vh)和/或輕鏈可變區(qū)(vl)的一個或更多個互補決定區(qū)(cdr)，優(yōu)選至少包含cdr3可變區(qū)。在一個實施方案中，所述一個或更多個互補決定區(qū)(cdr)選自本文所述互補決定區(qū)cdr1、cdr2和cdr3組。在一個特別優(yōu)選實施方案中，能夠結(jié)合cldn18.2的抗體優(yōu)選包含針對cldn18.2的單克隆抗體(優(yōu)選本文所述針對cldn18.2的單克隆抗體)的重鏈可變區(qū)(vh)和/或輕鏈可變區(qū)(vl)的互補決定區(qū)cdr1、cdr2和cdr3，并優(yōu)選包含本文所述重鏈可變區(qū)(vh)和/或輕鏈可變區(qū)(vl)的互補決定區(qū)cdr1、cdr2和cdr3。

在一個實施方案中，如本文所述包含一個或更多個cdr、一組cdr或cdr組的組合的抗體包含所述cdr及其插入構(gòu)架區(qū)(interveningframeworkregion)。優(yōu)選地，該部分還將包含至少約50％的第一和第四構(gòu)架區(qū)之一或兩者，所述50％為第一構(gòu)架區(qū)的c端50％和第四構(gòu)架區(qū)的n端50％。通過重組dna技術(shù)進行的抗體的構(gòu)建可導致在可變區(qū)的n端或c端引入接頭編碼的殘基，所述接頭的引入是為了便于克隆或其他操作步驟，包括引入接頭連接本發(fā)明的可變區(qū)與其他蛋白質(zhì)序列，所述其他蛋白質(zhì)序列包括免疫球蛋白重鏈、其他可變結(jié)構(gòu)域(例如，在產(chǎn)生雙抗體中)或蛋白質(zhì)標簽。

在一個實施方案中，如本文所述包含一個或更多個cdr、一組cdr或cdr組之組合的抗體包含在人抗體構(gòu)架中的所述cdr。

本文中提到的在其重鏈中包含特定鏈或特定區(qū)域或特定序列的抗體優(yōu)選指這樣的情況，其中所述抗體的所有重鏈均包含所述特定鏈、區(qū)域或序列。這相應(yīng)地也適用于抗體的輕鏈。

本文所用的術(shù)語“核酸”旨在包括dna和rna。核酸可為單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈dna。

根據(jù)本發(fā)明，依照其最通常的含義來使用術(shù)語“表達”，包括產(chǎn)生rna或者產(chǎn)生rna和蛋白質(zhì)/肽。其還包括核酸的部分表達。此外，表達可瞬時進行或穩(wěn)定地進行。

本文就特定氨基酸序列(例如，序列表中所示出的那些)給出的教導解釋為還指所述特定序列的變體，所述變體產(chǎn)生與所述特定序列在功能上等同的序列，例如顯示出與所述特定氨基酸序列相同的或類似的特性的氨基酸序列。一個重要的特性是保留抗體與其靶標的結(jié)合或維持抗體的效應(yīng)功能。優(yōu)選地，特定序列變體的序列在替換抗體中的所述特定序列時保留所述抗體與cldn18.2的結(jié)合，并優(yōu)選保留所述抗體如本文所述的功能，例如，cdc介導的裂解或adcc介導的裂解。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理解，特別是可以修飾cdr、高變區(qū)和可變區(qū)的序列而不喪失結(jié)合cldn18.2的能力。例如，cdr區(qū)與本文所述抗體的區(qū)域相同或高度同源?！案叨韧础币庵缚梢栽赾dr中進行1至5，優(yōu)選1至4，例如，1至3或1或2個替換。此外，可對高變區(qū)和可變區(qū)進行修飾，使得它們與本文具體公開的抗體區(qū)域示出顯著的同源性。

出于本發(fā)明的目的，氨基酸序列的“變體”包括氨基酸插入變體、氨基酸添加變體、氨基酸缺失變體和/或氨基酸替換變體。在蛋白質(zhì)的n端和/或c端包含缺失的氨基酸缺失變體還被稱為n端和/或c端截短變體(truncationvariant)。

氨基酸插入變體包括在特定氨基酸序列中插入單個或兩個或更多個氨基酸。在具有插入的氨基酸序列變體的情況下，向氨基酸序列的特定位點中插入一個或更多個氨基酸殘基，但是隨機插入并對所產(chǎn)生的產(chǎn)物進行合適的篩選也是可能的。

氨基酸添加變體包括一個或更多個氨基酸(例如，1、2、3、5、10、20、30、50或更多個氨基酸)的氨基端和/或羧基端融合。

氨基酸缺失變體的特征為從序列中除去一個或更多個氨基酸，例如，除去1、2、3、5、10、20、30、50或更多個氨基酸。所述缺失可在蛋白質(zhì)的任何位置。

氨基酸替換變體的特征為除去序列中的至少一個殘基，并且在其位置插入其他殘基。優(yōu)選在氨基酸序列中同源蛋白質(zhì)或肽之間非保守的位置處進行修飾和/或用具有類似特性的其它氨基酸取代氨基酸。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)變體中的氨基酸改變?yōu)楸Ｊ匕被岣淖儯?，替換帶有類似電荷的或不帶電荷的氨基酸。保守氨基酸改變涉及替換與其側(cè)鏈中相關(guān)的氨基酸家族之一。天然存在的氨基酸一般分為四個家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、非極性氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不帶電的極性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時同時被歸類為芳香族氨基酸。

優(yōu)選地，給定的氨基酸序列和所述給定的氨基酸序列之變體氨基酸序列之間的相似度優(yōu)選同一性為至少約60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。優(yōu)選地針對氨基酸區(qū)域給出相似度或同一性，所述區(qū)域為參考氨基酸序列全長的至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或約100％。例如，如果參考氨基酸序列由200個氨基酸組成，優(yōu)選地針對至少約20、至少約40、至少約60、至少約80、至少約100、至少約120、至少約140、至少約160、至少約180或約200個氨基酸給出相似度或同一性，優(yōu)選連續(xù)的氨基酸。在一些優(yōu)選實施方案中，針對參考氨基酸序列的全長給出相似度或同一性?？捎帽绢I(lǐng)域已知的工具進行用于確定序列相似性(優(yōu)選序列同一性)的比對，優(yōu)選使用最佳序列比對，例如，使用align，采用標準設(shè)定，優(yōu)選emboss：needle，matrix：blosum62，缺口打開(gapopen)10.0，缺口延伸(gapextend)0.5來進行。

“序列相似性”指相同的或顯示保守氨基酸替換的氨基酸的百分比。兩條氨基酸序列之間的“序列同一性”指所述序列之間相同的氨基酸的百分比。

術(shù)語“百分比同一性”意指在最佳比對之后獲得的所比較的兩條序列之間相同的氨基酸殘基所占的百分比，該百分比完全是統(tǒng)計學意義上的，并且兩條序列之間的差異隨機分布在其全長上。兩條氨基酸序列之間的序列比較通過在對其進行最佳比對后比較其序列來常規(guī)地進行，所述比較通過區(qū)段或通過“比較窗”來進行以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性。除手工產(chǎn)生以外，用于比較的序列的最佳比對還可通過以下手段產(chǎn)生：smith和waterman，1981，adsapp.math.2，482的局部同源性算法，neddleman和wunsch，1970，j.mol.biol.48，443的局部同源性算法，pearson和lipman，1988，proc.natlacad.sci.usa85，2444的相似性搜索法，或者使用這些算法的計算機程序(在wisconsingenetics軟件包中的gap，bestfit，fasta，blastp，blastn和tfasta，geneticscomputergroup，575sciencedrive，madison，wis.)。

通過以下方法計算百分比同一性：測定進行比較的兩條序列之間相同的位置數(shù)，用該數(shù)除以進行比較的的位置數(shù)，并用所得結(jié)果乘以100，從而獲得這兩條序列之間的百分比同一性。

術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”指具有包含一個或更多個轉(zhuǎn)基因(優(yōu)選重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)基因)或轉(zhuǎn)染色體(整合或不整合至動物的天然基因組dna中)的基因組的動物，并且其優(yōu)選能夠表達所述轉(zhuǎn)基因。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可具有人輕鏈轉(zhuǎn)基因和人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重鏈轉(zhuǎn)染色體，使得當用cldn18.2抗原和/或表達cldn18.2的細胞免疫時，所述小鼠產(chǎn)生人抗cldn18.2抗體?？蓪⑷酥劓溵D(zhuǎn)基因整合到小鼠的染色體dna中(如轉(zhuǎn)基因小鼠(例如，humab小鼠(例如，hco7或hcol2小鼠))的情況那樣)，或者可以染色體外維持人重鏈轉(zhuǎn)基因(如wo02/43478中所述的轉(zhuǎn)染色體(例如，km)小鼠的情況那樣)。所述轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠可通過進行v-d-j重組和同種型轉(zhuǎn)換而能夠產(chǎn)生針對cldn18.2的多種同種型的人單克隆抗體(例如，igg、iga和/或ige)。

本文所用的“減少”、“降低”或“抑制”指水平(例如，表達水平或細胞增殖水平)的總體降低或引起總體降低的能力，優(yōu)選5％或更高，10％或更高，20％或更高，更優(yōu)選50％或更高，最優(yōu)選75％或更高的降低。

術(shù)語，例如“增加”或“增強”優(yōu)選指增加或增強約至少10％，優(yōu)選至少20％，優(yōu)選至少30％，更優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。

mab的作用機制

盡管下文提供了關(guān)于本發(fā)明抗體治療效力背后的機制方面的一些考慮，但不應(yīng)認為這以任何方式限制了本發(fā)明。

本文所述的抗體優(yōu)選地與免疫系統(tǒng)的組成相互作用，優(yōu)選通過adcc或cdc。本文所述抗體還可用于靶向有效負載(例如，放射性同位素、藥物或毒素)從而直接殺傷腫瘤細胞或者可與傳統(tǒng)化學治療劑協(xié)同使用，通過互補性作用機制攻擊腫瘤，所述作用機制可包括由于化學治療劑對t淋巴細胞的細胞毒性副作用而受損的抗腫瘤免疫應(yīng)答。然而，本文所述抗體還可簡單地通過在細胞表面結(jié)合cldn18.2而發(fā)揮作用，從而例如阻斷細胞增殖。

抗體依賴性細胞介導的細胞毒性

本文所述的adcc描述了效應(yīng)細胞特別是淋巴細胞的細胞殺傷能力，其優(yōu)選需要被抗體標記的靶細胞。

adcc優(yōu)選在抗體與腫瘤細胞上的抗原結(jié)合以及抗體fc結(jié)構(gòu)域與免疫效應(yīng)細胞表面上的fc受體(fcr)接合時發(fā)生。已鑒定出幾個fc受體家族，且特定的細胞群特征性地表達確定的fc受體?？蓪dcc視為直接誘導不同程度的直接腫瘤破壞的機制，所述破壞導致抗原呈遞并誘導腫瘤指向性t細胞應(yīng)答。優(yōu)選地，adcc的體內(nèi)誘導將引起腫瘤指向性t細胞應(yīng)答和宿主來源的抗體應(yīng)答。

補體依賴性細胞毒性

cdc是可通過抗體指引的另一細胞殺傷方法。igm是用于補體活化的最有效的同種型。igg1和igg3在通過經(jīng)典的補體活化途徑指引cdc方面也都很有效。優(yōu)選地，在該級聯(lián)中，抗原-抗體復合物的形成導致緊鄰參與抗體分子(例如，igg分子)ch2結(jié)構(gòu)域的多個c1q結(jié)合位點暴露出來(c1q是補體c1的三種亞組分之一)。優(yōu)選地，這些暴露的c1q結(jié)合位點將先前低親和力的c1q-igg相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N高親和力相互作用，這觸發(fā)了涉及一系列其它補體蛋白質(zhì)的級聯(lián)事件并且引起效應(yīng)細胞趨化劑/活化劑c3a和c5a的蛋白水解釋放。優(yōu)選地，該補體級聯(lián)最終形成膜攻擊復合物，其在細胞膜中產(chǎn)生孔，有利于水和溶質(zhì)自由穿行于細胞內(nèi)外。

本文所述的抗體可通過多種技術(shù)產(chǎn)生，包括常規(guī)的單克隆抗體法，例如，kohler和milstein，nature256：495(1975)的標準體細胞雜交技術(shù)。盡管原則上優(yōu)選體細胞雜交方案，但是也可采用其它技術(shù)來產(chǎn)生單克隆抗體，例如，b淋巴細胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化或使用抗體基因文庫的噬菌體展示技術(shù)。

用于制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的優(yōu)選動物系統(tǒng)為鼠系統(tǒng)。在小鼠中產(chǎn)生雜交瘤是已經(jīng)非常成熟的方案。分離用于融合的免疫脾細胞的免疫方案和技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的。融合伴侶(fusionpartner)(例如，鼠骨髓瘤細胞)和融合方法也是已知的。

用于制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的其它優(yōu)選動物系統(tǒng)為大鼠系統(tǒng)和兔系統(tǒng)(例如，spieker-polet等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.92：9348(1995)中所描述的，還參見，rossi等，am.j.clin.pathol.124：295(2005))。

在又一優(yōu)選實施方案中，可使用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色小鼠包括分別稱為humab小鼠和km小鼠的小鼠，并且在本文中統(tǒng)稱為“轉(zhuǎn)基因小鼠”?？砂凑誻o2004035607中對cd20詳細描述的那樣在所述轉(zhuǎn)基因小鼠中進行人抗體的產(chǎn)生。

用于產(chǎn)生單克隆抗體的又一策略為直接從產(chǎn)生具有確定特異性的抗體的淋巴細胞中分離編碼抗體的基因，例如，參見babcock等，1996；anovelstrategyforgeneratingmonoclonalantibodiesfromsingle，isolatedlymphocytesproducingantibodiesofdefinedspecificities。重組抗體工程的細節(jié)還可參見welschof和kraus，recombinantantibodesforcancertherapyisbn-0-89603-918-8和bennyk.c.loantibodyengineeringisbn1-58829-092-1。

可以如所述的，利用來自抗原序列(即，抗體待指向的序列)的載體綴合肽、重組表達的抗原或其片段的富集制備物和/或表達抗原的細胞免疫小鼠以產(chǎn)生抗體?；蛘?，可利用編碼抗原或其片段的dna免疫小鼠。如果使用抗原的純化制備物或富集制備物的免疫不產(chǎn)生抗體，還可用表達抗原的細胞(例如，細胞系)免疫小鼠來促進免疫應(yīng)答。

可以用通過尾靜脈或眶后取血獲得的血漿和血清樣品在免疫方案的全程中監(jiān)測免疫應(yīng)答?？墒褂镁哂凶銐蛐r的免疫球蛋白的小鼠進行融合。可以在處死并摘出脾前3天，利用抗原表達細胞經(jīng)腹膜內(nèi)或經(jīng)靜脈內(nèi)對小鼠進行加強免疫以提高分泌特異性抗體的雜交瘤的比率。

為了產(chǎn)生產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，可從經(jīng)免疫的小鼠中分離出脾細胞和淋巴結(jié)細胞，并將其與合適的無限增殖細胞系(例如，小鼠骨髓瘤細胞系)融合。然后，可針對抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選獲得的雜交瘤。然后可以通過elisa對單個孔進行篩選以獲得分泌抗體的雜交瘤。使用抗原表達細胞通過免疫熒光和facs分析，可對抗抗原的特異性抗體進行鑒定?？蓪⒎置谠摽贵w的雜交瘤重新鋪板，再次篩選，并且如果單克隆抗體仍為陽性的，則可通過有限稀釋進行亞克隆。接著，可在組織培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以產(chǎn)生抗體用于表征。

還可使用例如本領(lǐng)域中公知的重組dna技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合在宿主細胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生抗體(morrison，s.(1985)science229：1202)。

例如，在一個實施方案中，可將目的基因(例如，抗體基因)連接至表達載體(例如，真核表達質(zhì)粒)中，例如，采用wo87/04462、wo89/01036和ep338841中公開的gs基因表達系統(tǒng)或本領(lǐng)域公知的其它表達系統(tǒng)來進行。可將具有所克隆抗體基因的純化質(zhì)粒引入真核宿主細胞中，例如，cho細胞、ns/0細胞、hek293t細胞或hek293細胞或者其它真核細胞(例如，來自植物的細胞、真菌或酵母細胞)中。用于引入這些基因的方法可為本領(lǐng)域中所述的方法，例如，電穿孔、lipofectine、lipofectamine或其他。在將這些抗體基因引入宿主細胞后，可對表達抗體的細胞進行鑒定和選擇。這些細胞代表此后可擴增其表達水平并擴大規(guī)模以生產(chǎn)抗體的轉(zhuǎn)染瘤?？蓮倪@些培養(yǎng)上清液和/或細胞中分離并純化出重組抗體。

或者，克隆的抗體基因可在其它表達系統(tǒng)中表達，包括原核細胞，例如，微生物，如大腸桿菌(e.coli)。此外，抗體可在非人轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生，例如，在羊和兔的乳汁中或在雞蛋中產(chǎn)生，或者轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生，參見例如，verma，r.，等(1998)j.immunol.meth.216：165-181；pollock，等(1999)j.immunol.meth.231：147-157；和fischer，r，等(1999)biol.chem.380：825-839。

嵌合

當用毒素或放射性同位素進行標記時，鼠單克隆抗體可在人體內(nèi)用作治療抗體。未標記的鼠抗體在重復應(yīng)用時在人體內(nèi)具有高免疫原性，導致治療效果降低。主要的免疫原性是由重鏈恒定區(qū)介導的。如果對各抗體進行嵌合或人源化，則鼠抗體在人體內(nèi)的免疫原性可降低或完全避免。嵌合抗體為不同部分來自不同動物物種的抗體，例如，具有來自鼠抗體可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。將鼠抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)與人重鏈和輕鏈的恒定區(qū)連接在一起從而獲得抗體的嵌合(例如，如kraus等，inmethodsinmolecularbiologyseries，recombinantantibodiesforcancertherapyisbn-0-89603-918-8所述)。在一個優(yōu)選實施方案中，嵌合抗體可通過連接人κ輕鏈恒定區(qū)至鼠輕鏈可變區(qū)產(chǎn)生。在另一優(yōu)選實施方案中，嵌合抗體可通過連接人λ輕鏈恒定區(qū)至鼠輕鏈可變區(qū)產(chǎn)生。用于產(chǎn)生嵌合抗體的優(yōu)選重鏈恒定區(qū)為igg1、igg3和igg4。用于產(chǎn)生嵌合抗體的其它優(yōu)選重鏈恒定區(qū)為igg2、iga、igd和igm。

人源化

抗體主要通過位于六個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(cdr)的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個原因，在各抗體之間，cdr內(nèi)的氨基酸序列比cdr外的序列更多樣化。由于cdr序列負責大多數(shù)抗體-抗原相互作用，因此有可能通過通過構(gòu)建表達載體來表達模擬特定天然存在的抗體之特性的重組抗體，所述表達載體包含來自所述特定天然存在抗體的cdr序列，其移植到來自具有不同特性的不同抗體的框架序列上(參見，例如，riechmann，l.等(1998)nature332：323-327；jones，p.等(1986)nature321：522-525；和queen，c.等(1989)proc.natl.acad.sci.u.s.a.86：10029-10033)。這樣的框架序列可獲自包含生殖系抗體基因序列的公共dna數(shù)據(jù)庫。這些生殖系序列不同于成熟的抗體基因序列，因為它們不包含完整裝配的可變基因，其是在b細胞成熟期間通過v(d)j連接而形成的。生殖系基因序列還將在均勻穿過可變區(qū)的個別處不同于高親和力次級全套抗體(secondaryrepertoireantibody)的序列。

可使用標準結(jié)合測定來確定抗體結(jié)合抗原的能力(例如，elisa、western印跡、免疫熒光和流式細胞術(shù)分析)。

為了純化抗體，可將選擇的雜交瘤培養(yǎng)在兩升旋轉(zhuǎn)瓶中以純化單克隆抗體。或者，可以在基于透析的生物反應(yīng)器中產(chǎn)生抗體。在用蛋白質(zhì)g瓊脂糖或蛋白質(zhì)a瓊脂糖進行親和色譜之前，可將上清液過濾并濃縮(如有需要)。可通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查經(jīng)洗脫的igg，以確保純度?？蓪⒕彌_液更換成pbs，并可以用1.43消光系數(shù)通過od280來測定濃度?？蓪慰寺】贵w分成等分試樣并貯存于-80℃。

可使用定點誘變或多點定向誘變來確定選擇的單克隆抗體是否與獨特的表位結(jié)合。

可利用多種市售試劑盒(例如，zymed，rochediagnostics)進行同種型elisa來確定抗體的同種型?？捎每剐∈骾g包被微量滴定板的孔。封閉后，使所述板與單克隆抗體或純化的同種型對照于環(huán)境溫度下反應(yīng)兩小時。然后，可使孔與小鼠igg1、igg2a、igg2b或igg3、iga或小鼠igm特異性過氧化物酶綴合探針反應(yīng)。在洗滌之后，將所述板用abts底物(1mg/ml)顯影，并于od405至650下進行分析?；蛘撸砂凑罩圃焐趟鍪褂胕sostrip小鼠單克隆抗體同種型試劑盒(roche，cat.no.1493027)。

可使用流式細胞術(shù)來證明經(jīng)免疫的小鼠的血清中存在抗體或存在單克隆抗體與活細胞表達抗原的結(jié)合。可將天然或轉(zhuǎn)染后表達抗原的細胞系和缺乏抗原表達的陰性對照(在標準生長條件下培養(yǎng))與雜交瘤上清液中或含有1％fbs的pbs中不同濃度的單克隆抗體混合，并可于4℃下孵育30分鐘。在洗滌之后，可使apc-或alexa647-標記的抗igg抗體在與第一抗體染色相同的條件下與抗原結(jié)合的單克隆抗體結(jié)合。通過流式細胞術(shù)，用facs裝置利用光散射和側(cè)向散射特性對單個活細胞設(shè)置門控來分析樣品?？刹捎霉厕D(zhuǎn)染方法以在單次測定中區(qū)分抗原特異性單克隆抗體和非特異性結(jié)合物。可如上所述對用編碼抗原和熒光標志物的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的細胞進行染色。經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞可在與抗體染色細胞不同的熒光通道中檢測到。由于大多數(shù)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞同時表達兩種轉(zhuǎn)基因，因此抗原特異性單克隆抗體優(yōu)選與表達熒光標志物的細胞結(jié)合，而非特異性抗體以相當?shù)谋嚷逝c未轉(zhuǎn)染的細胞結(jié)合?？衫檬褂脽晒怙@微術(shù)的替代測定補充或替代流式細胞術(shù)測定?？赏耆缟纤鋈旧毎⑼ㄟ^熒光顯微術(shù)來檢查細胞。

可使用免疫熒光顯微術(shù)分析來證明經(jīng)免疫的小鼠的血清中存在抗體或存在單克隆抗體與表達抗原的活細胞結(jié)合。例如，將自發(fā)或在轉(zhuǎn)染后表達抗原的細胞系和缺乏抗原表達的陰性對照于標準生長條件下培養(yǎng)于腔室載玻片(chamberslide)中補充有10％胎牛血清(fcs)、2mml-谷氨酰胺、100iu/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基中。然后用甲醇或多聚甲醛固定細胞或不做處理。然后，可將細胞與針對抗原的單克隆抗體于25℃下反應(yīng)30分鐘。在洗滌之后，使細胞與alexa555標記的抗小鼠igg第二抗體(molecularprobes)于相同條件下反應(yīng)。然后，通過熒光顯微術(shù)檢查細胞。

可制備來自表達抗原的細胞的細胞提取物和適當?shù)年幮詫φ?，并進行十二烷基硫酸鈉(sds)聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳之后，將分開的抗原轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉，并用待測單克隆抗體測試。可使用抗小鼠igg過氧化物酶檢測igg結(jié)合并用ecl底物顯影。

還可以按照技術(shù)人員公知的方式，通過免疫組織化學來檢測抗體與抗原的反應(yīng)性，例如，使用來自常規(guī)手術(shù)過程期間的患者或來自攜帶接種有自發(fā)表達或在轉(zhuǎn)染后表達抗原之細胞系的異種移植腫瘤的小鼠的非癌組織或癌組織樣品的多聚甲醛或丙酮固定的冷凍切片或用多聚甲醛固定的石蠟包埋組織切片。對于免疫染色，可孵育與抗原反應(yīng)的抗體，然后根據(jù)供應(yīng)商的說明加入辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗體(dako)。

可對抗體介導吞噬和殺傷表達cldn18.2之細胞的能力進行測試。單克隆抗體活性的體外檢測可在體內(nèi)模型檢測前提供初步篩選。

抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)：

簡言之，來自健康供體的多形核細胞(pmn)、nk細胞、單核細胞、單核的細胞或其它效應(yīng)細胞可通過ficollhypaque密度離心然后裂解污染性紅血細胞來純化。可將經(jīng)洗滌的效應(yīng)細胞懸浮于補充了10％熱滅活的胎牛血清，或者5％熱滅活的人血清的rpmi中，并以不同的效應(yīng)細胞：靶細胞的比例與⁵¹cr標記的表達cldn18.2的靶細胞混合?；蛘?，可用熒光增強配體(batda)標記靶細胞?？捎脽晒庥嫓y定從死亡細胞中釋放的增強配體與銪形成的高熒光螯合物。另一替代技術(shù)可利用具有熒光素酶的靶細胞的轉(zhuǎn)染。然后，可僅通過活細胞將添加的熒光黃氧化。然后，以不同濃度添加經(jīng)純化的抗cldn18.2igg?？墒褂貌幌嚓P(guān)的人igg作為陰性對照。根據(jù)使用的效應(yīng)細胞類型，于37℃下，可進行測定4至20小時?？赏ㄟ^測定培養(yǎng)上清液中⁵¹cr的釋放或eutda螯合物的存在來測定樣品的細胞溶解?；蛘撸蔁晒恻S氧化產(chǎn)生的發(fā)光可為活細胞的量度。

還可用多種組合來測試抗cldn18.2單克隆抗體以確定使用多個單克隆抗體是否增強細胞溶解。

補體依賴性細胞毒性(cdc)：

可使用多種已知的技術(shù)來測試單克隆抗cldn18.2抗體介導cdc的能力。例如，可以以技術(shù)人員已知的方式從血液中獲得補體血清?？墒褂貌煌姆椒▉泶_定mabs的cdc活性。例如，可測定⁵¹cr的釋放或可使用碘化丙啶(pi)排除測定來評價提高的膜滲透性。簡言之，可洗滌靶細胞，并將5x10⁵/ml與不同濃度的mab于室溫或37℃下孵育10至30分鐘。然后，添加血清或血漿至終濃度為20％(v/v)，并使細胞于37℃下孵育20至30分鐘?？上騠acs管中的pi溶液添加來自每個樣品的全部細胞。然后，可立即使用facsarray通過流式細胞術(shù)分析來分析該混合物。

在一種替代測定中，可根據(jù)貼壁細胞確定cdc的誘導。在所述測定的一個實施方案中，在進行測定前24小時，以3×10⁴/孔的密度將細胞接種于組織培養(yǎng)平底微量滴定板中。第二天，去除生長培養(yǎng)基并將細胞與抗體一式三份地孵育。將對照細胞分別與生長培養(yǎng)基或包含0.2％皂苷的生長培養(yǎng)基孵育用于確定背景裂解和最大裂解。室溫孵育20分鐘后，去除上清液，并向細胞添加20％(v/v)dmem中的人血漿或血清(預(yù)熱至37℃)并于37℃下再孵育20分鐘。向碘化丙啶溶液(10μg/ml)添加來自每個樣品的全部細胞。然后，用含有2.5μg/溴乙啡啶的pbs替換上清液，并在使用tecansatire在600nm下測量520nm處激發(fā)后的熒光發(fā)射。如下計算百分比特異性裂解：％特異性裂解＝(樣品熒光-背景熒光)/(最大裂解熒光-背景熒光)x100。

通過單克隆抗體來誘導凋亡和抑制細胞增植：

可將單克隆抗cldn18.2抗體與例如cldn18.2陽性腫瘤細胞(例如，snu-16、dan-g、kato-iii)或轉(zhuǎn)染了cldn18.2的腫瘤細胞于37℃下孵育約20小時以測試引發(fā)凋亡的能力?？梢允斋@細胞，用膜聯(lián)蛋白-v結(jié)合緩沖液(bdbiosciences)洗滌，并與和fitc或apc綴合的膜聯(lián)蛋白-v(bdbiosciences)在黑暗中孵育15分鐘?？上騠acs管中的pi溶液(10μg/ml于pbs中)添加來自每個樣品的全部細胞，并立即通過流式細胞術(shù)進行評價(如上)。或者，可利用市售的試劑盒來檢測單克隆抗體對細胞增殖的一般抑制。delfia細胞增殖試劑盒(perkin-elmer，cat.no.ad0200)為基于測量在微板中的增殖細胞dna合成期間5-溴-2-脫氧尿苷(brdu)的摻入的非同位素免疫測定。使用銪標記的單克隆抗體來檢測摻入的brdu。使用固定溶液固定細胞并使dna變性以能夠檢測抗體。洗去未結(jié)合的抗體，并添加delfia誘導劑以從標記抗體中解離銪離子至溶液中，其中它們與delfia誘導劑的組分形成高熒光螯合物。在檢測中，利用時間分辨熒光術(shù)測定的熒光與每個孔的細胞中dna的合成成比例。

臨床前研究

還可在體內(nèi)模型(例如，在攜帶有用表達cldn18.2細胞系接種的異種移植腫瘤的免疫缺陷性小鼠中，例如，dan-g、snu-16或kato-iii，或在轉(zhuǎn)染后，例如，hek293)中對結(jié)合cldn18.2的單克隆抗體進行檢測以確定它們控制表達cldn18.2之腫瘤細胞生長的效力。

可以在將表達cldn18.2的腫瘤細胞異種移植至免疫受損的小鼠或其它動物中后，利用本文所述抗體進行體內(nèi)研究。可向無腫瘤小鼠施用抗體，然后注射腫瘤細胞以測量所述抗體防止腫瘤或腫瘤相關(guān)癥狀形成的效果?？上蚓哂心[瘤的小鼠施用抗體以確定各抗體降低腫瘤生長、轉(zhuǎn)移或腫瘤相關(guān)癥狀的治療效力?？贵w施加可與其它物質(zhì)，如細胞抑制(cystostatic)藥物、生長因子抑制劑、細胞周期阻斷劑、血管發(fā)生抑制劑或其它抗體的施加組合以測定組合的協(xié)同效力和潛在毒性?？捎每贵w或?qū)φ赵噭┙臃N動物，并針對與cldn18.2抗體治療可能相關(guān)的癥狀進行徹底研究以分析抗體介導的毒副作用。體內(nèi)施加cldn18.2抗體可能的副作用特別包括在表達cldn18.2的組織(包括胃)的毒性。在人和其它物種(例如，小鼠)中識別cldn18.2的抗體對預(yù)測由在人中施加單克隆cldn18.2抗體介導的潛在副作用特別有用。

可按照“glenne.morris的epitopemappingprotocols(methodsinmolecularbiology)isbn-089603-375-9”和olwynm.r.westwood，frankc.hay的“epitopemapping：apracticalapproach″practicalapproachseries，248中詳細描述的那樣，對抗體識別的表位作圖。

可以以任意合適的藥物組合物的形式施用本文所述的化合物和藥劑。

藥物組合物一般以均勻的劑型提供，并且可以以本身已知的方式制備。藥物組合物可例如是溶液或混懸劑形式的。

藥物組合物可包含鹽、緩沖物質(zhì)、防腐劑、載體、稀釋劑和/或賦形劑，所有這些均優(yōu)選為可藥用的。術(shù)語“可藥用的”指不與藥物組合物的活性成分的作用相互作用的材料無毒性。

不可藥用的鹽可用于制備可藥用的鹽，并且也包括在本發(fā)明中。這類可藥用鹽以非限制性方式包括由以下酸制備的那些：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等?？伤幱名}還可制備成堿金屬鹽或堿土金屬鹽，例如，鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。

適用于藥物組合物中的緩沖物質(zhì)包括鹽中的乙酸、鹽中的檸檬酸、鹽中的硼酸和鹽中的磷酸。

適用于藥物組合物中的防腐劑包括苯扎氯銨、氯丁醇、對羥基苯甲酸酯和硫柳汞。

可注射制劑可包含可藥用賦形劑，例如，ringer乳酸鹽。

術(shù)語“載體”指天然或合成性質(zhì)的有機或無機組分，其中將活性組分組合以促進、增強或?qū)崿F(xiàn)應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“載體”還包括適于向患者施用的一種或更多種相容的固體或液體填料、稀釋劑或包封物質(zhì)。

可用于腸胃外施用的載體物質(zhì)為，例如，無菌水、ringer、ringer乳酸鹽、無菌氯化鈉溶液、聚亞烷基二醇、氫化萘以及，特別是，生物相容的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氯乙烯/多氧-丙烯共聚物。

術(shù)語“賦形劑”在本文中使用時意指可存在于藥物組合物中但不是活性成分的所有物質(zhì)，例如，載體、結(jié)合劑、潤滑劑、增稠劑、表面活性劑、防腐劑、乳化劑、緩沖劑、調(diào)味劑或著色劑。

本文所述的藥劑和組合物可通過任意常規(guī)途徑施用，例如，通過腸胃外施用，包括通過注射或輸注。施用優(yōu)選腸胃外施用，例如，靜脈內(nèi)施用、動脈內(nèi)施用、皮下施用、皮內(nèi)施用或肌內(nèi)施用。

適于腸胃外施用的組合物一般包括活性化合物的無菌水或非水制備物，其優(yōu)選與接受者的血液等滲。相容的載體和溶劑的實例為ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，通常使用無菌固定油類作為溶液或懸浮介質(zhì)。

本文所述的藥劑和組合物以有效量施用?！坝行Я俊敝竼为毣蚺c其它劑量一起獲得預(yù)期反應(yīng)或預(yù)期效果的量。在治療特定疾病或特定病癥的情況下，預(yù)期的反應(yīng)優(yōu)選關(guān)于抑制疾病進程。這包括減緩疾病的發(fā)展和，特別是，中止或逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展。治療疾病或病癥中的預(yù)期反應(yīng)還可為延遲或預(yù)防所述疾病或所述病癥的發(fā)病。

本文所述藥劑或組合物的有效量將取決于待治療的病癥、疾病的嚴重程度、患者的個體參數(shù)(包括年齡、生理狀況、尺寸和體重)、治療的持續(xù)時間、伴隨治療的類型(如果存在的話)，具體施用途徑以及類似因素。因此，本文所述藥劑的施用劑量可取決于多個這種參數(shù)。在患者對初始劑量反應(yīng)不夠的情況下，可使用更高劑量(或通過不同的更局部化的施用途徑獲得有效的更高劑量)。

本文所述的藥劑和組合物可施用于患者(例如，在體內(nèi))以治療或預(yù)防多種病癥，例如，本文所述的那些。優(yōu)選的患者包括患有可通過施用本文所述的藥劑和組合物校正(correct)或改善之病癥的人患者。這包括涉及以改變cldn18.2的表達模式為特征之細胞的病癥。

例如，在一個實施方案中，本文所述抗體可用于治療患有癌癥疾病的患者，例如，本文所述的以存在表達cldn18.2的癌細胞為特征的癌癥疾病。

根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物和治療方法還可用于免疫或疫苗接種從而預(yù)防本文所述的疾病。

通過以下實施例對本發(fā)明進一步說明，所述實施例不解釋為限制了本發(fā)明的范圍。

實施例

實施例1：通過用化學治療劑進行體外處理來穩(wěn)定人胃癌細胞系的cldn18.2表達

在含有或不含細胞抑制化合物的情況下，在37℃和5％co2下，在含有20％fcs(perbio)和2mmglutamax(invitrogen)的rpmi1640培養(yǎng)基(invitrogen)中培養(yǎng)katoiii細胞(人胃癌細胞系)。在10或100ng/ml的濃度下測試表柔比星(pfizer)，在10或100ng/ml的濃度下測試5-fu(來自neocorpag的neofluor)，并在50或500ng/ml的濃度下測試奧沙利鉑(hospira)。還使用全部3種化合物的組合(eof：表柔比星10ng/ml、奧沙利鉑500ng/ml、5-fu10ng/ml)。在37℃和5％co2下，在6孔組織培養(yǎng)板中將8×10⁵個katoiii細胞培養(yǎng)96小時而不更換培養(yǎng)基，或者培養(yǎng)72小時后在標準培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，從而從細胞周期停滯釋放細胞。用edta/胰蛋白酶收集細胞、洗滌并分析。

為了進行cldn18.2的細胞外檢測，用單克隆抗cldn18.2抗體imab362(ganymed)或同種型匹配的對照抗體(ganymed)對細胞進行染色。使用來自dianova的山羊抗huigg-apc作為第二試劑。

基于細胞dna含量的測量值來確定細胞周期時相。這樣使得人們能夠區(qū)分處于細胞周期g1期、s期或g2期的細胞。在s期，dna復制發(fā)生，而在g2期，細胞生長并且為有絲分裂作準備。按照制造商的方案，使用來自bdbiosciences的cycletestplusdna試劑盒進行細胞周期分析。使用bdfacscantoii(bdbiosciences)和flowjo(treestar)軟件進行流式細胞術(shù)獲取和分析。

圖1a和1b中的欄示出了處于細胞周期g1期、s期或g2期之細胞各自的百分比。經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的katoiii細胞顯示出主要在g1期的細胞周期停滯。用5-fu處理的細胞主要被阻斷在s期。經(jīng)表柔比星或eof處理的katoiii細胞顯示出主要在g2期的細胞周期停滯。經(jīng)奧沙利鉑處理的katoiii細胞顯示出細胞主要在g1期和g2期富集。由圖1c中可見，s期或g2期中的細胞周期停滯導致cldn18.2穩(wěn)定或上調(diào)。細胞只要從細胞周期的任意階段釋放(圖1b)，katoiii細胞之細胞表面上的cldn18.2表達就上調(diào)(圖1d)。

利用5-fu+ox(10ng/ml5-fu和500ng/ml奧沙利鉑)、eof(10ng/ml表柔比星、500ng/ml奧沙利鉑和10ng/ml5-fu)或flo(10ng/ml5-fu、50ng/ml亞葉酸和500ng/ml奧沙利鉑)處理nugc-4和katoiii細胞，持續(xù)96小時。分離經(jīng)化學治療預(yù)治療的nugc-4和katoiii細胞的rna并將其轉(zhuǎn)變?yōu)閏dna。用定量實時pcr分析cldn18.2的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果以與管家基因hprt轉(zhuǎn)錄水平相比較的相對表達示于圖2a中。圖2b示出了未經(jīng)處理的和經(jīng)處理的nugc-4細胞的cldn18.2western印跡和肌動蛋白內(nèi)參對照。發(fā)光信號的強度以關(guān)于肌動蛋白的百分比示出。

用eof、flo以及5-fu+ox組合化學治療對nugc-4和katoiii細胞進行預(yù)處理導致cldn18.2的rna和蛋白質(zhì)水平增加，如同通過定量實時pcr(圖2a)和western印跡(圖2b)所示出的那樣。

通過流式細胞術(shù)分析結(jié)合在經(jīng)eof(10ng/ml表柔比星、500ng/ml奧沙利鉑和10ng/ml5-fu)或flo(10ng/ml5-fu、50ng/ml亞葉酸和500ng/ml奧沙利鉑)處理96小時之nugc-4和katoiii胃癌細胞上的imab362。如圖2c中所示出的那樣，胃癌細胞系表面上imab362可靶向的cldn18.2蛋白的量有所增加。該作用在經(jīng)eof或flo預(yù)處理的細胞中最突出。

用伊立替康或多西他賽將katoiii細胞預(yù)處理4天，并對其cldn18.2表達和細胞周期停滯進行分析。用伊立替康處理細胞導致劑量依賴性抑制細胞生長和細胞周期在s/g2期停滯(圖3)。用多西他賽處理細胞導致劑量依賴性抑制細胞生長和細胞周期在g2期停滯(圖3)。

實施例2：用化學治療劑預(yù)處理人胃癌細胞導致更高效力的imab362介導的adcc

使用nugc-4胃癌細胞作為靶細胞來研究imab362介導的adcc，用10ng/ml5-fu和500ng/ml奧沙利鉑(5-fu+ox)、10ng/ml表柔比星、500ng/ml奧沙利鉑和10ng/ml5-fu(eof)或10ng/ml5-fu、50ng/ml亞葉酸和500ng/ml奧沙利鉑(flo)預(yù)處理所述細胞96小時(效應(yīng)細胞：靶標比40：1)或不做處理。從7個健康供體獲得未經(jīng)處理的和經(jīng)eof、flo或5-fu+ox預(yù)處理之nugc-4細胞的ec50值。

如圖4a所示，與未經(jīng)處理的靶細胞相比，經(jīng)預(yù)處理的細胞的劑量/應(yīng)答曲線向上并向左移動。這導致更高的最大裂解并且ec50值降低至未經(jīng)處理的細胞的三分之一(圖4b)。

通過ficollhypaque密度離心純化來自健康人供體的外周血單核細胞(pbmc)，包括nk細胞、單核細胞、單核的細胞或其它效應(yīng)細胞。將經(jīng)洗滌的效應(yīng)細胞接種于x-vivo培養(yǎng)基中。在該環(huán)境下，使用內(nèi)源表達cldn18.2并且來源于胃的katoiii細胞作為靶細胞。靶細胞穩(wěn)定地表達熒光素酶和僅被活細胞氧化的熒光黃。添加不同濃度的純化抗cldn18.2抗體imab362，并使用不相關(guān)的嵌合hulgg1抗體作為同種型對照抗體。通過測量由熒光黃氧化產(chǎn)生的熒光來測定樣品的細胞溶解，其為imab362誘導細胞毒性后剩余之活細胞的量的值。將經(jīng)伊立替康(1000ng/ml)、多西他賽(5ng/ml)或順鉑(2000ng/ml)預(yù)處理3天的katoiii與未經(jīng)處理的培養(yǎng)基培養(yǎng)的靶細胞進行比較，并對imab36誘導的adcc進行量化。

與培養(yǎng)基培養(yǎng)的靶細胞相比，經(jīng)伊立替康、多西他賽或順鉑預(yù)處理3天的katoiii顯示出更低水平的活細胞(圖5a)，并且與培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞相比，經(jīng)伊立替康、多西他賽或順鉑預(yù)處理的細胞中密蛋白18.2表達增加(圖5b)。

此外，用伊立替康、多西他賽或順鉑預(yù)處理katoiii細胞增強了imab362誘導adcc的效力(圖5c和5d)。

實施例3：化學治療導致更高功效的imab362誘導的cdc

通過用10ng/ml5-fu和500ng/ml奧沙利鉑(5-fu+ox)將katoiii胃癌細胞預(yù)處理48小時來分析化學治療劑對imab362誘導的cdc的作用。使用經(jīng)化學治療劑預(yù)處理的katoiii細胞產(chǎn)生的imab362誘導之cdc的代表性劑量應(yīng)答曲線示于圖6中。將腫瘤細胞預(yù)處理48小時增強了imab362誘導cdc的效力，從而導致與未經(jīng)處理的細胞相比，經(jīng)預(yù)處理的腫瘤細胞更高的最大細胞裂解。

實施例4：免疫效應(yīng)細胞進行imab362介導的adcc的能力不因用化學治療劑處理而被損害

eof或flo方案中使用的化學治療劑高度有效地抑制靶細胞增殖。為了研究化學治療對效應(yīng)細胞的不良作用，用10ng/ml表柔比星、500ng/ml奧沙利鉑和10ng/ml5-fu(eof)或10ng/ml5-fu、50ng/ml亞葉酸和500ng/ml奧沙利鉑(flo)處理來自健康供體的pbmc72小時，然后應(yīng)用于adcc測定中。圖7a示出了4個健康供體的ec50值，而圖7b示出了用eof或flo預(yù)處理的效應(yīng)細胞之imab362誘導的adcc的代表性劑量/應(yīng)答曲線。nugc-4胃癌細胞之imab362誘導的adcc不會因eof或flo化學治療而受到損害。

實施例5：za/il-2處理的組合導致外周血單核細胞(pbmc)培養(yǎng)物最佳地擴增

在體外，對za/il-2對pbmc培養(yǎng)物增殖的作用進行評價。從健康人供體采集pbmc，并用單次劑量的za處理培養(yǎng)物。每3至4天添加il-2。具體地，將來自3個不同健康人供體(#1、#2和#3)的pbmc在含有1μmza加高(300u/ml)或低(25u/ml)劑量的il-2的rpmi培養(yǎng)基中(1×10⁶個細胞/ml)培養(yǎng)14天；參照圖8a。另外，將相同供體的pmbc在含有300u/mlil-2的加/不加za的rpmi培養(yǎng)基中再培養(yǎng)14天；參照圖8b。通過在第6、8、11和14天對活細胞進行計數(shù)來確定細胞數(shù)目的增加。

與補充低劑量的il-2的培養(yǎng)物相比，在補充高劑量的il-2的培養(yǎng)基中，細胞擴增了約2至5倍多(圖8a)。與含za培養(yǎng)基中的細胞生長相比，不含za培養(yǎng)基中的細胞擴增低大約2倍(圖8b)。這些數(shù)據(jù)表明必須組合施加za和il-2二者從而確保細胞的適當擴增。

實施例6：za/il-2處理導致pbmc培養(yǎng)物中vγ9vδ2t細胞大量擴增

在補充有300u/mlil-2并且含有或不含1μmza的rpmi培養(yǎng)基中將pbmc培養(yǎng)14天。在第0天和第14天，通過多色facs測定vγ9+vδ2+t細胞在cd3+淋巴細胞群中的百分比(圖9a)和cd16+細胞在cd3+vγ9+vδ2+t細胞群中的百分比(圖9b)。將每個供體的結(jié)果記錄在散點圖中。圖9c示出了表示cd3+vγ9+vδ2+和cd3+cd16+vγ9+vδ2+t細胞的數(shù)目在淋巴細胞群中隨時間增加(富集)的散點圖。將接種第0天的細胞量和第14天收集的細胞量考慮在內(nèi)。

需要在pbmc培養(yǎng)物中添加il-2用于淋巴細胞的存活和生長。所述淋巴細胞在補充300u/mlil-2的培養(yǎng)物中有效擴增。使用vγ9和vδ2特異性抗體進行的facs分析表明添加za/il-2特異性地誘導vγ9vδ2t細胞的累積(圖9a)。14天后，cd3+淋巴細胞群可占vγ9vδ2t細胞的高達80％。一部分vγ9vδ2t細胞表達cd16，而根據(jù)供體，這些細胞在cd3+淋巴細胞群中的富集為10至700倍(圖9b和9c)。與不含za情況下生長的培養(yǎng)物相比，cd16+vγ9+vδ2+t細胞在培養(yǎng)物中的富集高10至600倍(圖9c)。我們認為體外za/il-2處理pbmc導致adcc介導fcγiii受體cd16在顯著比例的γδt細胞中上調(diào)。

實施例7：il-2以劑量依賴性方式影響vγ9vδ2t細胞擴增

培養(yǎng)物中za的添加為誘導vγ9vδ2t細胞產(chǎn)生的最重要因素。眾所周知，t細胞的生長和存活需要il-2。

將在補充有1μmza和濃度增加的il-2的rpmi培養(yǎng)基中將pbmc培養(yǎng)14天。在第0天和第4天添加il-2。在第0天和第14天，通過多色facs染色來確定cd16+vγ9+vδ2+t細胞在cd3+淋巴細胞群中的富集。用600u/mlil-2培養(yǎng)后，將收集的cd16+vγ9+vδ2+t細胞的量設(shè)定為100％以比較不同供體；參照圖10(左圖)。此外，對在濃度增加的il-2中生長14天之分離的培養(yǎng)物的adcc活性進行測試；參照圖10(右圖)。

通過劑量應(yīng)答分析，我們確定il-2還刺激vγ9vδ2t細胞亞群的生長和存活。通過在培養(yǎng)基中添加低濃度的il-2，發(fā)現(xiàn)il-2劑量和cd16+vγ9vδ2t細胞在cd3+淋巴細胞群中的百分比相關(guān)(圖10，左圖)。與在低濃度il-2下生長的細胞相比，在較高濃度il-2(150-600u/ml)中生長之細胞的adcc活性得到改善(圖10，右圖)。

實施例8：za在都刺激vγ9vδ2t細胞擴增的單核細胞和癌細胞中誘導ipp產(chǎn)生

將新鮮的pbmc(實驗#1)或經(jīng)za/il-2刺激14天的vγ9vδ2t細胞培養(yǎng)物(實驗#2至5)(無單核細胞，效應(yīng)細胞∶單核細胞比為1∶0)與0.2倍(4∶1)或5倍(比1∶4)量的單核細胞±1μmza孵育。14天后，通過多色facs確定共培養(yǎng)物中vγ9vδ2t細胞的富集，而將培養(yǎng)物的擴增考慮在計算內(nèi)。對于每個實驗，將與單核細胞以1∶4的比培養(yǎng)的vγ9vδ2t細胞的富集因子設(shè)定為100％。培養(yǎng)物中單核細胞的增加導致vγ9vδ2t細胞富集多于10倍。該作用明顯為za依賴性的；參照圖11a。

此外，用5μmza預(yù)處理人胃癌細胞(nugc-4-熒光素酶)和鼠胃癌細胞(cls103-鈣熒光素染色)2天，或不做處理。對人vγ9vδ2t細胞(第14天)進行macs純化并與癌細胞共培養(yǎng)24小時。通過測量剩余的熒光素酶活性或鈣熒光素熒光來確定vγ9vδ2t細胞對未經(jīng)za處理的或經(jīng)za處理的靶細胞的細胞毒性；參照圖11b。靶細胞(nugc-4和cls103)用5μmza預(yù)處理2天，或不做處理，之后與絲裂霉素c(50mi)孵育4小時以使增殖停止。添加經(jīng)macs純化的人14日齡vγ9vδ2t靜息細胞和³h-胸腺嘧啶核苷至靶細胞并于37℃下孵育共培養(yǎng)物48小時。通過使用microbeta閃爍計數(shù)器測量dna中³h-胸腺嘧啶核苷的摻入來確定增殖。將未經(jīng)za處理的靶細胞和無vγ9vδ2t細胞的增殖設(shè)定為100％；參照圖11c。

如圖11b和11c所示，就細胞毒性(5至10倍)和增殖(1.4至1.8倍)方面而言，經(jīng)za脈沖處理的人癌細胞活化了vγ9vδ2t細胞，而鼠癌細胞系cls103未能引發(fā)對vγ9vδ2t細胞的這些效果。

實施例9：za/il-2處理影響pbmc培養(yǎng)物的組成

pbmc培養(yǎng)物中特定細胞類型的生長和分化取決于細胞因子的存在。這些組分被添加至培養(yǎng)基中(例如，血清中存在的生長因子，il-2)或由免疫系統(tǒng)自身分泌。進化(evolve)為何種類型的細胞還取決于pbmc的初始組成和先天遺傳(geneticendowment)。在存在300u/mlil-2以及有或沒有1μmza的情況下，培養(yǎng)10個不同供體的pbmc14天來分析效應(yīng)細胞(nk細胞和vγ9vδ2t細胞)中的總體增加。使用cd3、cd16、cd56、vγ9和vδ2抗體，通過多色facs染色來鑒定淋巴細胞群中效應(yīng)細胞的量。cd3-cd56+cd16+細胞表示nk細胞，而cd3+vγ9+vδ2+表示vγ9vδ2t細胞。

多色facs分析表明用il-2處理后，主要是nk細胞發(fā)育，而在經(jīng)za/il-2處理的培養(yǎng)物中，vγ9vδ2t細胞明顯地擴增(圖12)。

實施例10：za/il-2處理產(chǎn)生vγ9vδ2+效應(yīng)記憶t細胞

可借助于兩種表面標志物，常見的淋巴細胞抗原cd45ra的高分子量同工型和趨化因子受體ccr7來描述t淋巴細胞的亞群。ccr7+幼稚和中樞記憶(cm)t細胞的特征在于其能夠在淋巴結(jié)中重復循環(huán)并且遇到抗原。相比之下，效應(yīng)記憶(em)和效應(yīng)t淋巴細胞ra+(temra)使ccr7下調(diào)，并似乎專門移動至外周非淋巴樣組織，例如，移動至被感染的部位或腫瘤部位?；赾d27和cd28的差別表達，em細胞還可被進一步細分。cd28和cd27表面表達逐漸喪失與細胞之細胞溶解能力的上調(diào)伴隨存在。此外，cd57的水平與粒酶和穿孔蛋白的表達有關(guān)，并因此代表顯示細胞毒性/細胞成熟的第三標志物。

用300u/mlil-2以及有或滅有1μmza下培養(yǎng)pbmc14天。在第0天(pmbc)和第14天，通過多色facs分析來確定不同表面標志物的表達。幼稚細胞為cd45ra+ccr7+，中樞記憶細胞(cm)為cd45ra-ccr7+，temra為cd45ra+ccr7-，并且效應(yīng)記憶細胞(em)對兩種標志物均為陰性；參照圖13a。而且，通過對cd27和cd57標志物染色來確定vγ9vδ2t細胞的細胞溶解活性；參照圖13b和13c。此外，通過用cd16(抗體結(jié)合)和cd56(粘附)對cd3+細胞進行染色來分析對adcc活性重要的nk細胞樣特征的發(fā)生；參照圖13d。

vγ9vδ2t細胞的多色facs分析表明za/il-2處理明顯刺激em型(cd27-和cd57+)的vγ9vδ2t細胞發(fā)育(圖13b至13c)。除了增強的細胞溶解活性之外，還觀察到cd3+群中cd16和cd56水平的增加，這可從adcc中涉及的nk細胞(cd3-cd16+cd56+)得知(圖13d)。

總而言之，這些數(shù)據(jù)表明za處理pbmc導致cd16+vγ9+vδ2+效應(yīng)記憶t細胞的發(fā)育，其能夠遷移至外周非淋巴樣組織并且顯示出具有高細胞溶解活性的標志物。與imab362腫瘤靶向抗體組合，這些細胞被極好地利用來遷移從而靶向和殺傷腫瘤細胞。

實施例11：經(jīng)za/il-2擴增的vγ9vδ2t細胞是imab362介導的cldn18.2依賴性adcc的有效效應(yīng)物

與nk細胞類似，經(jīng)za/il-2擴增的vγ9vδ2t細胞對cd16呈陽性(參見圖9和13)，cd16是通過其細胞結(jié)合抗體觸發(fā)adcc的fcγriii受體。已進行了一系列實驗來評價vγ9vδ2t細胞與imab362聯(lián)合是否能夠誘導有效的adcc。

將來自2個不同供體(#1和#2)的pmbc培養(yǎng)于含有300u/mlil-2以及有或沒有1μmza的培養(yǎng)基中。14天后，收集細胞，并與濃度逐漸增加(0.26ng/ml至200μg/ml)的imab362一起被添加至表達cldn18.2的nugc-4細胞。在熒光素酶測定中確定特異性殺傷；參照圖14a。圖14b和14c給出了用生長于300u/mlil-2以及有或沒有1μmza中的27個供體進行的adcc測定的概圖。nugc-4用作靶細胞。對于每個供體，由劑量-應(yīng)答曲線計算ec50值(b)并且將在200μg/mlimab362劑量下的最大特異性殺傷率(c)記錄在散點圖中。

使用經(jīng)za/il-2培養(yǎng)14天的pbmc觀察到針對cldn18.2陽性nugc-4細胞具有強imab362依賴性的adcc活性(圖14a)。使用經(jīng)za/il-2處理的pbmc培養(yǎng)物，adcc取決于vγ9vδ2t細胞的存在(圖12和15)。如果在不含za的情況下培養(yǎng)細胞，則對于大多數(shù)供體，adcc活性降低。在這些培養(yǎng)物中，殘留的adcc活性為nk細胞依賴性的(圖11和14)。通過測試多于20個供體，adcc測定表明與僅用il-2培養(yǎng)的pbmc相比，za/il-2處理的pbmc的ec50和最大特異性殺傷率均有所改善。

此外，用1μmza和300u/mlil-2培養(yǎng)兩個不同供體(#1+#2)的pbmc。將這些效應(yīng)細胞培養(yǎng)物與cldn18.2陽性(nugc-4、katoiii)和陰性(sk-br-3)人靶細胞系(e∶t比40∶1)一起用于adcc測定中。添加逐漸增加量(0.26ng/ml至200μg/ml)的imab362抗體。在熒光素酶測定中測量adcc；參照圖15a。用在不同時間點從經(jīng)za/il-2處理的培養(yǎng)物中收集的nugc-4靶細胞和效應(yīng)細胞進行如(a)所述的相同實驗；參照圖15b。使用nugc-4作為靶細胞進行與(a)中所述相同的實驗；參照圖15c。直接使用經(jīng)za/il-2擴增的細胞或使用tcrγδmacs分選(miltenyibiotech)從培養(yǎng)物純化的vγ9vδ2t細胞。在淋巴細胞中獲得純度超過97.0％的vγ9vδ2t細胞。

觀察到了針對cldn18.2陽性人腫瘤細胞系，而不是cldn18.2陰性人腫瘤細胞系的強adcc活性(圖15a)。此外，用同種型對照抗體未獲得adcc活性(未示出)。在za/il-2處理過程中，對于一部分供體，adcc裂解活性隨時間增加(圖15b)。imab362的劑量/效應(yīng)曲線向上并向左移動表現(xiàn)出隨時間改善的ec50值和最大裂解速率。與未經(jīng)處理的pbmc相比，通過za/il-2處理富集的vγ9vδ2效應(yīng)t細胞能夠達到cldn18.2陽性靶細胞的更高最大殺傷率，而且對于同樣的殺傷率，它們需要更低濃度的imab362。

為了確定vγ9vδ2t細胞是裂解活性的儲存庫(reservoir)，在第14天，通過磁性細胞分選從經(jīng)za/il-2培養(yǎng)的pbmc群分離出純度＞97％的這些細胞。由于更高的純度，與imab362聯(lián)合的adcc活性得到保留并且部分地有所提高。這些數(shù)據(jù)證實vγ9vδ2t細胞主要負責adcc活性，所述活性用14日齡pbmc培養(yǎng)物可觀察到(圖15c)。

實施例12：用za/il-2處理靶細胞系不影響cldn18.2的表面表達

imab362觸發(fā)的作用模式嚴格依賴于細胞外可檢測到cldn18.2的存在和量。因此，使用內(nèi)源表達cldn18.2的nugc-4和katoiii細胞系，通過流式細胞術(shù)來分析za/il-2處理對cldn18.2表面密度的影響。具體地，對經(jīng)za/il-2或za/il-2+eof或za/il-2+5-fu/ox預(yù)處理72小時的未經(jīng)透化之nugc-4胃癌細胞上結(jié)合的imab362進行流式細胞術(shù)分析。

在體外進行的za/il-2處理揭示cldn18.2表面定位的量未變化；參照圖16。

實施例13：通過za/il-2處理pbmc增加imab362介導的adcc不被eof預(yù)處理損害

化學治療劑損害細胞增殖。相比之下，za/il-2處理觸發(fā)vγ9vδ2t細胞擴增。為了分析這些對立的相互作用對效應(yīng)細胞的影響，將6個健康供體的pbmc與za/il-2或za/il-2+eof培養(yǎng)8天，然后應(yīng)用于adcc測定中(e∶t比15∶1)。確定導致未經(jīng)處理nugc-4靶細胞50％的adcc介導之裂解的imab362濃度(ec50)。

由于用za/il-2處理pmbc，nugc-4細胞的imab362誘導的adcc增強，所述增強不由pbmc與eof的組合處理而顯著改變(圖17)。

實施例14：在裸鼠中，體內(nèi)imab362靶向cldn18.2陽性腫瘤以及imab362對人腫瘤細胞異種移植物的抗腫瘤作用

為了研究imab362的體內(nèi)腫瘤細胞靶向，將80μg680標記的抗體經(jīng)靜脈內(nèi)施用于用人胃癌細胞系nugc-4皮下異種移植的裸鼠。nugc-4細胞顯示出cldn18.2以及her2/neu(曲妥珠單抗的靶標)的表面表達，但是對cd20呈陰性。如下進行對照研究：向經(jīng)nugc-4移入的小鼠組注射dyelight680標記的曲妥珠單抗(陽性對照組)或680標記的利妥昔單抗(陰性對照)。如同經(jīng)靜脈注射抗體后24小時，使用熒光成像系統(tǒng)，通過小鼠活體成像所證明的那樣，imab362強烈地并且專一地在腫瘤異種移植物中累積(圖18)。imab362有效保持在靶陽性腫瘤中，并且即使在120小時后仍以相當大的強度被檢測到(圖18)。在注射24小時后，還僅在異種移植物中檢測到曲妥珠單抗。在注射后120小時內(nèi)，迅速洗去曲妥珠單抗信號。未檢測到利妥昔單抗信號。

此外，imab362用于處理具有cldn18.2陽性異種移植腫瘤的裸鼠。進行早期處理模型研究(早在腫瘤細胞接種后的3天施用imab362)。此外，在腫瘤細胞接種后多至9天，當腫瘤體積達到約60至120mm³時，開始晚期腫瘤處理實驗。

經(jīng)皮下向裸鼠接種1×10⁷個hek293～cldn18.2轉(zhuǎn)染子。在接種腫瘤后3天開始處理每組10只小鼠。交替進行靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)施用途徑，用200μgimab362、英夫利昔單抗作為同種型對照和pbs處理小鼠，每周兩次，持續(xù)6周。雖然用pbs或同種型對照處理的組中的所有小鼠均在70至80天內(nèi)死亡，但是用imab362處理的動物具有生存益處(圖19)。不僅死亡時間延長，而且在210天的整個觀察期間，十分之四的小鼠存活下來。

當平均腫瘤體積達到88mm³(62至126mm³)時，開始每組9至10只小鼠的處理。在處理之前，將小鼠分成測試組以保證所有組中具有相當?shù)哪[瘤大小。交替進行靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)施用途徑，用200μgimab362、同種型對照或pbs處理小鼠，每周兩次，持續(xù)6周。用pbs或同種型對照處理的組中的所有小鼠均在50至100天內(nèi)死亡。用imab362處理的動物具有生存益處，具有將近加倍的中值存活(47天對25天)。在整個觀察期間，這些小鼠中有三只存活下來(圖20)。重要地是，體內(nèi)抗腫瘤功效取決于腫瘤細胞上靶標的存在。在用cldn18.2陰性hek293腫瘤細胞移入的小鼠中未見imab362處理的抗腫瘤作用。

使用nugc-4胃腫瘤模型來研究imab362對具有cldn18.2內(nèi)源表達之癌細胞的功效。nugc-4細胞在裸鼠中積極地生長。

經(jīng)皮下注射1×10⁷個nugc-4胃癌細胞至無胸腺裸鼠的左脅腹中(imab362組n＝9，對照組n＝8)。在經(jīng)靜脈內(nèi)注射接種腫瘤后6天開始每周兩次交替靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)施加imab362(200μg每次注射)和對照。每周兩次監(jiān)視腫瘤大小。圖21a中示出的數(shù)據(jù)為平均值和sem。與用對照處理過的小鼠相比，經(jīng)imab362處理的小鼠的腫瘤生長被顯著抑制(＊p＜0.05)。圖21b示出了接種腫瘤后第21天的腫瘤體積。經(jīng)imab362處理過的小鼠的腫瘤體積顯著小于對照小鼠的腫瘤(＊p＜0.05)。

當接種1×10⁷個腫瘤細胞于小鼠時，未經(jīng)處理小鼠的中值存活不超過25天。當腫瘤體積達到約109mm³的平均大小(63mm³至135mm³)時，開始用imab362、西妥昔單抗、曲妥珠單抗或同種型以及緩沖對照處理。根據(jù)大小，將小鼠劃分處理組(圖21)。imab362顯示出顯著降低腫瘤生長速率。與鹽水或抗體對照相比，所述積極生長的腫瘤模型中未觀察到腫瘤生長的顯著降低。腫瘤生長的延遲與經(jīng)imab362處理過的小鼠非顯著增加的中值存活有關(guān)(31天對25天)。

用兩個人胃癌異種移植模型，使用具有慢病毒轉(zhuǎn)導之imab362靶向cldn18.2的nci-n87或nugc-4細胞(nci-n87～cldn18.2和nugc-4～cldn18.2)檢測imab362的抗腫瘤活性。

通過向每處理組的8只裸鼠肋腹(雌性，6周齡)注射1×10⁷個nci-n87～cldn18.2細胞皮下接種nci-n87～cldn18.2異種移植腫瘤。在接種腫瘤后5天，通過靜脈內(nèi)注射800μgimab362或用200μl0.9％nacl作為鹽水對照組開始處理。在整個觀察時間內(nèi)，每周繼續(xù)靜脈內(nèi)施用。每半周監(jiān)測腫瘤大小和動物健康狀況。圖22a示出了imab362處理對腫瘤生長的作用。每周兩次測量皮下腫瘤的大小(平均值+sem，＊＊＊p＜0.001)。圖22b示出了kaplan-meier存活曲線。當腫瘤體積達到1400mm³時，處死小鼠。

因此，持續(xù)的imab362處理高度顯著(p＜0.001)抑制nci-n87～cldn18.2胃癌異種移植物的腫瘤生長(圖22a)。腫瘤生長中的延遲與imab362處理過的小鼠顯著(p＜0.05)更長的存活時間相關(guān)(圖22b)。

imab362免疫治療迅速生長的nugc-4～cldn18.2異種移植物導致在處理的第14天顯著(p＜0.05)更小的腫瘤大小。在第一個兩周imab362處理后，nugc-4～cldn18.2的腫瘤發(fā)展非常積極。然而，抑制nugc-4～cldn18.2腫瘤生長直至處理的第14天導致經(jīng)imab362處理過的小鼠具有顯著(p＜0.05)更久的存活。

總之，imab362對治療胃癌異種移植物是高度有效的，在內(nèi)源cldn18.2陽性腫瘤模型中，表現(xiàn)為顯著延遲腫瘤發(fā)展和延長存活。在非常積極的腫瘤模型系統(tǒng)中，imab362的這些抗腫瘤作用稍不明顯，但是盡管如此，也是顯著的，強調(diào)了imab362的強抗腫瘤能力。

實施例15：與化學治療組合的imab362在小鼠腫瘤模型中的抗腫瘤作用

在體外，imab362介導的adcc對經(jīng)化學治療劑組合(包括eof和5-fu+ox)預(yù)處理過的人胃癌細胞更有效。因此，在小鼠腫瘤模型中，體內(nèi)研究了這些化合物與imab362組合的抗腫瘤作用。

通過向每處理組9只小鼠的脅腹皮下注射1×10⁷個nci-n87～cldn18.2細胞來接種nci-n87～cldn18.2異種移植腫瘤。在接種腫瘤后第4、11、18和25天，根據(jù)eof方案，用1.25mg/kg表柔比星、3.25mg/kg奧沙利鉑和56.25mg/kg5-氟尿嘧啶腹膜內(nèi)處理具有腫瘤的小鼠，然后，在施用化學治療后24小時，靜脈內(nèi)注射800μgimab362。每周繼續(xù)imab362處理。每半周監(jiān)測腫瘤大小和動物健康狀況。圖23a示出了組合治療對腫瘤生長的作用。每周兩次測量皮下腫瘤的大小(平均值+sem；＊p＜0.05)。圖23b示出了kaplan-meier存活曲線。當腫瘤達體積達到1400mm³時，處死小鼠。

與對照小鼠相比，用imab362或eof方案處理的具有nci-n87～cldn18.2腫瘤的裸鼠表現(xiàn)出被高度顯著抑制的腫瘤生長。與僅用eof方案處理相比，額外的imab362處理與eof化學處理組合導致顯著(p＜0.05)更高的腫瘤生長抑制(圖23a)。鹽水對照組中小鼠的中值存活為59天。每周imab362處理小鼠顯著延長中值存活至76天，類似于eof組中小鼠的存活(同樣具有76天的中值存活)。但是用imab362和eof組合處理將中值存活增加至81天(圖23b)。

通過向每處理組的10只裸鼠(雌性，6周齡)的脅腹皮下注射1×10⁷個nugc-4～cldn18.2細胞來接種異種移植腫瘤。在第3、10、17和24天，用化學處理劑處理小鼠。每周繼續(xù)imab362處理。圖24a示出了皮下nugc-4～cldn18.2異種移植物的腫瘤生長曲線(平均值+sem)。圖24b示出了kaplan-meier存活曲線(log-rank(mantel-cox)檢驗，＊＊p＜0.01)。

皮下nugc-4～cldn18.2異種移植腫瘤非常積極地生長。然而，與鹽水處理的對照組相比，imab362處理具有腫瘤的裸鼠顯著抑制腫瘤生長。在用eof的組合治療中，由eof處理產(chǎn)生的生長抑制掩蓋了imab362對nugc-4～cldn18.2腫瘤生長的作用，表現(xiàn)為與僅用eof處理相比，腫瘤生長抑制未增加(圖24a)。然而，與僅用eof處理的小鼠的存活相比，用imab362和eof方案處理的小鼠的中值存活高度顯著地(p＜0.01)延長(圖24b)。

實施例16：在體內(nèi)，za/il-2擴增的vγ9vδ2t細胞改善晚期腫瘤的imab362介導控制

我們采用nsg小鼠來研究在小鼠系統(tǒng)中γδt細胞產(chǎn)生的imab362和za/il-2的組合活性。nsg小鼠缺少成熟t細胞、b細胞、天然殺傷(nk)細胞和多個細胞因子信號途徑，并且它們的先天免疫中存在很多缺陷，而初次免疫和二次免疫組織中的小生境(niche)允許通過人免疫細胞群集。

用1×10⁷個經(jīng)cldn18.2轉(zhuǎn)染的hek293細胞皮下接種nsg小鼠。在同一天，小鼠接受8×10⁶個通過在補充za的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天的vγ9vδ2t細胞富集的人pbmc。此外，對小鼠注射50μg/kgza和5000uil-2(proleukin)。每半周施用il-2，并且每周施用za以保持人t細胞的功能。當hek293～cldn18.2變得肉眼可見時，開始每半周用200μgimab362處理。除了所述處理的9只小鼠外，建立小鼠的兩個對照組。一組不接受人γδt細胞，另一組用同種型對照抗體代替imab362處理。在存在人γδt細胞和za的情況下，用imab362處理的小鼠中cldn18.2陽性腫瘤的派生(outgrowth)被顯著抑制，幾乎消失，然而，在用同種型對照抗體處理的或缺少人t細胞效應(yīng)物的小鼠中，腫瘤積極地生長并且小鼠不得不過早死亡(圖25)。

實施例17：在小鼠腫瘤模型中imab362與化學治療組合的抗腫瘤作用

利用鼠cldn18.2慢病毒轉(zhuǎn)導的cls-103細胞(cls-103～cldnl8.2)來檢測imab362與化學治療組合在免疫活性遠系繁殖nmri小鼠的皮下胃癌同種異體移植物中的抗腫瘤活性。

通過向每處理組的10只nmri小鼠的脅腹皮下注射1×10⁶個cls-103～cldnl8.2細胞來接種cls-103～cldnl8.2同種異體移植腫瘤。在接種腫瘤后第3、10、17和24天，用1.25mg/kg表柔比星、3.25mg/kg奧沙利鉑和56.25mg/kg5-氟尿嘧啶(eof)腹膜內(nèi)處理具有腫瘤的小鼠，然后，在施用每個化學治療后24小時，靜脈內(nèi)注射800μgimab362。每半周通過皮下注射3000ie來施用il-2。整個觀察期間，在化學治療結(jié)束后繼續(xù)進行imab362和il-2處理。每半周監(jiān)測腫瘤大小和動物健康狀況。當腫瘤達體積達到1400mm³或腫瘤變成潰瘍性時，處死小鼠。

由圖26可見，與鹽水對照組相比，僅用imab362或eof處理具有cls-103～cldnl8.2腫瘤的nmri小鼠未顯現(xiàn)出顯著的腫瘤增長抑制。相反，eof化學治療和imab362處理的組合導致顯著更高的腫瘤生長抑制作用并且延長具有腫瘤之小鼠的存活。這些觀察結(jié)果表明eof化學治療和imab362免疫治療的組合存在附加的或甚至協(xié)同的治療作用。il-2處理未顯示出對腫瘤生長的作用。

新國際專利申請

加尼梅德藥物公司(ganymedpharmaceuticalsag)等

“用于治療癌癥的涉及針對密蛋白18.2之抗體的聯(lián)合治療”

我方卷號：342-75pct

生物材料的附加頁

其他保藏物的證明

1)保藏物(dsmacc2738、dsmacc2739、dsmacc2740、dsmacc2741、dsmacc2742、dsmacc2743、dsmacc2745、dsmacc2746、dsmacc2747、dsmacc2748)的保藏單位的名稱和地址：

dsmz-德國微生物菌種保藏中心

德國

布倫瑞克市

馬舍奧德路1b號

郵編38124

2)保藏物(dsmacc2808、dsmacc2809、dsmacc2810)的保藏單位的名稱和地址：

dsmz-德國微生物菌種保藏中心

德國

布倫瑞克市

因霍芬大街7b號

郵編38124

對所有上文提到保藏物的其他說明：

-與小鼠(musmusculus)脾細胞融合的小鼠(musmusculus)骨髓瘤p3x63ag8u.1

-分泌針對人密蛋白18a2抗體的雜交瘤

3)保藏人：

所有上述保藏物均由以下保藏人進行：

加尼梅德藥物公司

freiligrathstraβe12

55131mainz

德國

序列表

<110>加尼梅德藥物公司

約翰?古騰堡大學美因茲醫(yī)學大學轉(zhuǎn)化腫瘤學公司

<120>用于治療癌癥的涉及針對密蛋白18.2之抗體的聯(lián)合治療

<130>342-75pct

<150>pct/ep2012/002211

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<213>人（homosapiens）

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202530

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>12

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151015

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202530

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354045

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859095

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100105

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>13

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151015

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202530

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65707580

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859095

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100105110

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325

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<213>人工

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<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

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<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

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<213>人工

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<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

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serserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislyspro

210215220

serasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplys

225230235240

thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglypro

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valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu

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tyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulys

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serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu

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aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys

420425430

serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu

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lys

465

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

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metglytrpsercysileileleupheleuvalalathralathrgly

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100105110

tyrtyrcysthrargsertrpargglyasnserpheasptyrtrpgly

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sertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproala

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195200205

proserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhis

210215220

lysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercys

225230235240

asplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleugly

245250255

glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet

260265270

ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis

275280285

gluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluval

290295300

hisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyr

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argvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly

325330335

lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproile

340345350

glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval

355360365

tyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalser

370375380

leuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglu

385390395400

trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro

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valleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrval

420425430

asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet

435440445

hisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuser

450455460

proglylys

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

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metglutrpargilepheleupheileleuserglythralaglyval

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serserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislys

210215220

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245250255

proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetile

260265270

serargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisglu

275280285

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lysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyr

355360365

thrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleu

370375380

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435440445

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glylys

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<220>

<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

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100105110

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thrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnval

210215220

asnhislysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolys

225230235240

sercysasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleu

245250255

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

260265270

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproala

340345350

proileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

355360365

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370375380

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

385390395400

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405410415

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleu

420425430

thrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysser

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450455460

leuserproglylys

465

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

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lysleugluleulysargthrvalalaalaproservalpheilephe

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<212>prt

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<220>

<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

<400>21

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130135140

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165170175

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<212>prt

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<220>

<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

<400>22

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leulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyr

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proargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnser

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aspserlysaspserthrtyrserleuserserthrleuthrleuser

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<212>prt

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<220>

<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

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phethrleuthrileserservalglnalagluaspleualavaltyr

100105110

tyrcyslysglnsertyrasnleutyrthrpheglyglyglythrlys

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leugluilelysargthrvalalaalaproservalpheilephepro

130135140

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serlysaspserthrtyrserleuserserthrleuthrleuserlys

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glyleuserserprovalthrlysserpheasnargglyglucys

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lysleugluilelysargthrvalalaalaproservalpheilephe

130135140

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aspserlysaspserthrtyrserleuserserthrleuthrleuser

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<220>

<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

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65707580

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100105110

tyrcysglnglntyrtyrsertyrproleuthrpheglyalaglythr

115120125

lysleugluleulysargthrvalalaalaproservalpheilephe

130135140

proproseraspgluglnleulysserglythralaservalvalcys

145150155160

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165170175

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180185190

aspserlysaspserthrtyrserleuserserthrleuthrleuser

195200205

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<220>

<223>人工序列的描述:嵌合單克隆抗體

<400>28

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151015

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202530

metservalglygluargvalthrleuthrcyslysalasergluasn

354045

valvalthrtyrvalsertrptyrglnglnlysprogluglnserpro

505560

lysleuleuiletyrglyalaserasnargtyrthrglyvalproasp

65707580

argphethrglyserglyseralathraspphethrleuthrileser

859095

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100105110

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115120125

thrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglugln

130135140

leulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyr

145150155160

proargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnser

165170175

glyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthr

180185190

tyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulys

195200205

hislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserpro

210215220

valthrlysserpheasnargglyglucys

225230

<210>29

<211>117

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>29

glnvalglnleuglnglnserglyalagluleumetlysproglyala

151015

servallysilesercyslysalathrglytyrthrphesersertyr

202530

trpileglutrpvallysglnargproglyhisglyleuglutrpile

354045

glygluileleuproglyserglyserthrasntyrasnglulysphe

505560

lysglylysalathrphethralaaspthrserserasnthralatyr

65707580

metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys

859095

alaargtyrasptyrprotrpphealatyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserala

115

<210>30

<211>118

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>30

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr

202530

glymetasntrpvallysglnalaproglylysglyleulystrpmet

354045

glytrpileasnthrasnthrglygluprothrtyralaglugluphe

505560

lysglyargphealapheserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnileasnasnleulysasngluaspthralathrtyrphecys

859095

alaargleuglypheglyasnalametasptyrtrpglyglnglythr

100105110

servalthrvalserser

115

<210>31

<211>116

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>31

glnvalglnleuglnglnserglyalagluleualaargproglyala

151015

servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

tyrileasntrpvallysglnargthrglyglnglyleuglutrpile

354045

glygluiletyrproglyserglyasnthrtyrtyrasnglulysphe

505560

lysglylysalathrleuthralaasplysserserserthralatyr

65707580

metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrphecys

859095

alaargsertyrglyalapheasptyrtrpglyglnglythrthrleu

100105110

thrvalserser

115

<210>32

<211>118

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>32

glnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvalargproglyala

151015

servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr

202530

trpileasntrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile

354045

glyasniletyrproseraspsertyrthrasntyrasnglnlysphe

505560

lysasplysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr

65707580

metglnleuserserprothrsergluaspseralavaltyrtyrcys

859095

thrargsertrpargglyasnserpheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

thrleuthrvalserser

115

<210>33

<211>118

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>33

glnvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala

151015

servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

valilesertrpvallysglnargthrglyglnglyleuglutrpile

354045

glygluiletyrproglyserglyserthrtyrtyrasnglulysphe

505560

lysglylysalathrleuthralaasplysserserasnthralatyr

65707580

metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrphecys

859095

alaargglyvalleuleuargalametasptyrtrpglyglnglythr

100105110

servalthrvalserser

115

<210>34

<211>120

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>34

glnvalhisleuglnglnserglysergluleuargserproglyser

151015

servallysleusercyslysasppheaspsergluvalpheprophe

202530

alatyrmetsertrpileargglnlysproglyhisglypheglutrp

354045

ileglyaspileleuproserileglyargthriletyrglyglulys

505560

phegluasplysalathrleuaspalaaspthrvalserasnthrala

65707580

tyrleugluleuasnserleuthrsergluaspseralailetyrtyr

859095

cysalaargglygluglytyrglyalatrpphealatyrtrpglygln

100105110

glythrleuvalthrvalserala

115120

<210>35

<211>113

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>35

aspilevalmetthrglnserproserserleuthrvalthralagly

151015

glulysvalthrmetsercyslysserserglnserleuleuasnser

202530

glyasnglnlysasntyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln

354045

proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargphethrglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserservalglnalagluaspleualavaltyrtyrcysglnasn

859095

asptyrsertyrproleuthrpheglyalaglythrlysleugluleu

100105110

lys

<210>36

<211>106

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>36

glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserprogly

151015

glulysvalthrilethrcysseralaserserservalsertyrmet

202530

histrppheglnglnlysproglythrserprolysleutrpiletyr

354045

serthrserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyser

505560

glyserglythrsertyrserleuthrileserargmetglualaglu

65707580

aspalaalathrtyrtyrcysglnglnargsersertyrproprothr

859095

pheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>37

<211>107

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>37

aspilevalmetthrglnserglnlysphemetserthrservalgly

151015

aspargvalserilethrcyslysalaserglnasnvalargthrala

202530

valalatrptyrglnglnlysproglyglnserprolysalaleuile

354045

tyrleualaserasnarghisthrglyvalproaspargphethrgly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileserasnvalglnser

65707580

gluaspleualaasptyrphecysleuglnhistrpasntyrproleu

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>38

<211>113

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>38

aspilevalmetserglnserproserserleualavalservalgly

151015

glulysvalthrmetsercyslysserserglnserleuleutyrser

202530

serasnglnlysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

serprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargphethrglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserservallysalagluaspleualavaltyrtyrcysglngln

859095

tyrtyrsertyrproleuthrpheglyalaglythrlysleugluleu

100105110

lys

<210>39

<211>113

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>39

aspilevalmetthrglnserproserserleuthrvalthralagly

151015

glulysvalthrmetsercyslysserserglnserleuleuasnser

202530

glyasnglnlysasntyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln

354045

proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargphethrglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserservalglnalagluaspleualavaltyrtyrcysglnasn

859095

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100105110

lys

<210>40

<211>112

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>40

aspilevalmetserglnserproserserleualavalseralagly

151015

glulysvalthrmetsercyslysserserglnserleuleuasnser

202530

argthrarglysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

serprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargphethrglyserglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserservalglnalagluaspleualavaltyrtyrcyslysgln

859095

sertyrasnleutyrthrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105110

<210>41

<211>113

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>41

aspilevalmetserglnserproserserleualavalservalgly

151015

glulysvalthrmetsercyslysserserglnserleuleutyrser

202530

serasnglnlysasntyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

354045

serprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval

505560

proaspargphethrglyserglyseralathraspphethrleuthr

65707580

ileserservalglnalagluaspleualaasptyrhiscysglygln

859095

glytyrsertyrprotyrthrpheglyglyglythrlysleugluile

100105110

lys

<210>42

<211>113

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>42

aspilevalmetserglnserproserserleualavalservalgly

151015

glulysvalthrmetsercyslysserserglnserleuleutyrser

202530

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354045

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505560

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tyrtyrsertyrproleuthrpheglyalaglythrlysleugluleu

100105110

lys

<210>43

<211>107

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>人工序列的描述:pcr產(chǎn)物的翻譯

<400>43

asnilevalmetthrglnserprolyssermetsermetservalgly

151015

gluargvalthrleuthrcyslysalasergluasnvalvalthrtyr

202530

valsertrptyrglnglnlysprogluglnserprolysleuleuile

354045

tyrglyalaserasnargtyrthrglyvalproaspargphethrgly

505560

serglyseralathraspphethrleuthrileserservallysala

65707580

gluaspleualavaltyrtyrcysglnglntyrtyrsertyrproleu

859095

thrpheglyalaglythrlysleugluleulys

100105

<210>44

<211>15

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>表位

<400>44

metaspglntrpserthrglnaspleutyrasnasnprovalthr

151015

<210>45

<211>15

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>表位

<400>45

serthrglnaspleutyrasnasnprovalthralavalpheasn

151015

<210>46

<211>15

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>表位

<400>46

leutyrasnasnprovalthralavalpheasntyrglnglyleu

151015

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<211>15

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>表位

<400>47

provalthralavalpheasntyrglnglyleutrpargsercys

151015

<210>48

<211>15

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>表位

<400>48

valpheasntyrglnglyleutrpargsercysvalarggluser

151015

<210>49

<211>15

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>表位

<400>49

glnglyleutrpargsercysvalarggluserserglyphethr

151015

<210>50

<211>15

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>表位

<400>50

argsercysvalarggluserserglyphethrglucysarggly

151015