本發(fā)明涉及一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)，是一種以關(guān)節(jié)疼痛，腫脹，僵直，變形為主要臨床特征的慢性全身性自身免疫性疾病。西醫(yī)將其歸于風(fēng)濕病學(xué)的范疇，早期表現(xiàn)為關(guān)節(jié)游走性疼痛和功能障礙，晚期則表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵直或廢而不用。該病呈慢性、侵襲性、進(jìn)行性，若不及時(shí)治療則可能致殘。流行病學(xué)調(diào)查研究表明，全球RA的發(fā)病率約為0.5～1.0％，在我國(guó)約為0.32％～0.36％，是造成人群?jiǎn)适趧?dòng)力和致殘的主要病因之一。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)RA病因至今尚未完全闡明，發(fā)病可能與免疫調(diào)節(jié)、感染、遺傳、環(huán)境、神經(jīng)精神狀態(tài)等多種因素有關(guān)。RA在祖國(guó)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)儆凇氨宰C”的范疇。中醫(yī)對(duì)其病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，歷代醫(yī)家均宗《素問(wèn)·痹論》“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”、《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》“寸口脈沉而弱……，故曰歷節(jié)”的理論。認(rèn)為：內(nèi)因?yàn)樗伢w虛弱，氣血不足，腠理空虛，肝腎虧虛；外因是風(fēng)寒濕熱之邪入侵，內(nèi)外之因相合而導(dǎo)致此病，虛實(shí)夾雜為該病的主要病機(jī)。

目前，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的常用藥物有非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、改善病情的抗風(fēng)濕藥(disease modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)、糖皮質(zhì)激素。除了常規(guī)藥物的治療，生物制劑、基因治療用于RA雖然已取得了可喜的成就，但值得注意的是，生物制劑價(jià)格昂貴，多數(shù)處于臨床試用階段；基因治療還處于試驗(yàn)性研究階段，且其治療效果與副作用都存在一定的不確定性，兩者都未列入常規(guī)治療中。對(duì)于多個(gè)DMARDS治療失敗或有癥狀性和(或)結(jié)構(gòu)性關(guān)節(jié)破壞時(shí)應(yīng)考慮手術(shù)治療。非甾體抗炎藥(NSAIDs)是RA不可缺少的非特異性的對(duì)癥治療藥物，主要是通過(guò)抑制環(huán)氧化酶以減少花生四烯酸代謝為前列腺素，達(dá)到控制關(guān)節(jié)腫痛的目的。但是，此類藥物只有緩解癥狀的作用，不能阻止疾病的進(jìn)展；并且常引起胃腸道副作用，長(zhǎng)期用藥者胃潰瘍發(fā)病率可達(dá)12％-30％。改善病情的抗風(fēng)濕藥(DMARDs)能控制RA病情進(jìn)展，建議對(duì)早期(癥狀出現(xiàn)少于3個(gè)月)及明確診斷為RA的患者盡早采用此類藥物。這類藥物多為免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑，首選甲氨蝶呤。甲氨蝶呤可以抑制細(xì)胞內(nèi)二氫葉酸還原酶，使嘌呤合成受抑制，同時(shí)具有抗炎和修復(fù)骨破壞的作用；常作為基本藥物，與基它藥物聯(lián)合應(yīng)用，以達(dá)到增效減小副作用的效果。糖皮質(zhì)激素的作用機(jī)制為抑制細(xì)胞及體液免疫，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，能迅速有效地減輕炎癥。在RA治療中，輕癥者原則上不用糖皮質(zhì)激素，對(duì)于重癥者，使用小劑量糖皮質(zhì)激素可以有效緩解RA患者癥狀；但不能消除病因，停藥后會(huì)有反跳現(xiàn)象，且具有明顯的不良反應(yīng)。

在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，中醫(yī)藥在緩解和治療RA患者的健康方面，發(fā)揮了重要的作用。中醫(yī)在治療RA積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，治療藥物有中藥有效部位、單味藥材、經(jīng)驗(yàn)方、中成藥等。研究發(fā)現(xiàn)它們具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等多方面生理活性，對(duì)RA的治療較確切、安全、副作用少，臨床顯示了一定的潛力和優(yōu)勢(shì)。雷公藤、白芍、青風(fēng)藤是治療RA的有效良藥，常以單味或與其它藥配伍運(yùn)用，具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫抑制作用。雷公藤有效部位提取物制劑雷公藤多苷片在臨床上已廣泛應(yīng)用于RA治療，療效顯著。白芍提取物白芍總苷具有明顯的抗炎、止痛作用，并可以通過(guò)多種途徑抑制自身免疫反應(yīng)，對(duì)RA有確切療效。童海燕等將治療組在對(duì)照組(口服來(lái)氟米特、美洛昔康)基礎(chǔ)上加白芍總苷膠囊，療程6個(gè)月，結(jié)果治療組總有效率為95.2％，大大優(yōu)于對(duì)照組(78.6％)。青風(fēng)藤能夠抑制肉芽腫形成和免疫抑制作用，對(duì)非特異性免疫和體液免疫、細(xì)胞免疫均有抑制作用。青藤堿為青風(fēng)藤主要有效成分，以正清風(fēng)痛寧為代表的青藤堿制劑用于治療RA療效較好。多味中藥配伍用于治療疾病是中醫(yī)的一大特色，合理的配伍往往能夠取得理想的效果，有時(shí)還能起到增效減毒作用。任彬自擬四藤湯(青風(fēng)藤、海風(fēng)藤、絡(luò)石藤、雷公藤、秦艽、杜仲、狗脊、薏米等)治療RA患者120例，結(jié)果治療組總有效率73.3％。李涯松對(duì)120例確診RA患者進(jìn)行隨機(jī)分組治療表明甘草對(duì)雷公藤治療RA有減毒增效作用。張艷艷對(duì)其導(dǎo)師宋紹亮的臨床驗(yàn)方清熱消痹湯(雷公藤、青風(fēng)藤、虎杖、金銀花、土茯苓、薏苡仁、蒼術(shù)、白芍、生甘草)用于治療活動(dòng)期RA進(jìn)行了臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療RA效果良好，效果與西藥甲氨喋呤相當(dāng)。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中醫(yī)藥治療RA的臨床研究取得了一定的進(jìn)展，同時(shí)研制出大量的中成藥，如風(fēng)濕寒痛片、疏風(fēng)定痛丸、寒濕痹沖劑等，臨床療效較好，日益受到人們的重視。中醫(yī)藥外治法治療RA也起到了重要的作用，如推拿按摩、中藥薰蒸、穴位貼敷及藥物的外敷等方法。紀(jì)英蓮采用中藥外敷治療活動(dòng)期RA患者，重用威靈仙、雷公藤、羌活等藥物，可明顯改善關(guān)節(jié)腫痛，且簡(jiǎn)便高效，毒副作用小。中醫(yī)的針刺療法在治療RA也有一定的療效，可調(diào)節(jié)中樞鎮(zhèn)痛遞質(zhì)的釋放、改善皮層和海馬的電活動(dòng)、改善微循環(huán)狀態(tài)、調(diào)整下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和神經(jīng)質(zhì)的釋放，從而起到鎮(zhèn)痛、消炎的作用。

“內(nèi)病外治”是祖國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中的一個(gè)重要內(nèi)容，積累了大量的經(jīng)驗(yàn)，并對(duì)其治病機(jī)理有較深入的認(rèn)識(shí)，清代名醫(yī)徐靈胎曾謂“用膏貼之，閉塞其氣，使藥性從孔而入其腠理，通經(jīng)貫絡(luò)，或提而出之，或攻而散之，較之服藥尤有力，此至妙之法也?！边@一段論述已較明確地闡述了皮膚吸收藥物的機(jī)理。外用制劑經(jīng)皮給藥途徑可以產(chǎn)生局部或者全身治療作用，也可避免胃腸道刺激、胃腸滅活及肝臟首過(guò)效應(yīng)。用藥后能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持恒定、可控的血藥濃度，毒副作用低，使用方便，可隨時(shí)終止給藥。但目前中藥外用制劑存在劑型落后現(xiàn)象，大多停留在洗劑、酊劑、鉛硬膏劑、橡皮膏、軟膏劑等水平，主要存在制法不科學(xué)，基質(zhì)不易與中藥提取物混合，載藥量小，成品制劑與皮膚親和性差、質(zhì)量不穩(wěn)定等弊端。

中藥凝膠膏劑(原凝膠膏劑)是一種以水溶性高分子化合物或親水性物質(zhì)為基質(zhì),與中藥或中藥提取物混合后，涂布于布上制成的外用貼劑，起源于日本，而我國(guó)起步于80年代初,90年代初才開(kāi)始規(guī)模生產(chǎn)。凝膠膏劑與傳統(tǒng)貼膏相比有許多優(yōu)點(diǎn)，如透氣性好、載藥量大、耐汗性強(qiáng)，可反復(fù)黏貼，不污染衣物，藥物無(wú)致敏、無(wú)刺激性等副作用，生產(chǎn)中無(wú)“工業(yè)三廢”等，特別適合中藥現(xiàn)代化大生產(chǎn)。然而，目前中藥外用制劑應(yīng)用現(xiàn)代制劑技術(shù)制備的中藥凝膠膏劑尚不多見(jiàn)，因此，研制出療效確切、質(zhì)量穩(wěn)定、使用方便的中藥凝膠膏劑具有積極的意義，并將產(chǎn)生良好的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種新的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物以及凝膠膏劑。

本發(fā)明治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，它是由如下重量配比的原料藥制備而成的制劑：取黃芪20～40份，人參5～15份，白術(shù)7～17份，仙茅5～15份，菟絲子20～40克，白芍10～20份，雷公藤3～9份，龍須藤5～15份，炙甘草5～15份。

優(yōu)選地，它是由如下重量配比的原料藥制備而成的制劑：取黃芪30份，人參10份，白術(shù)12份，仙茅10份，菟絲子30克，白芍15份，雷公藤6份，龍須藤10份，炙甘草10份。

本發(fā)明治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的凝膠膏劑，其特征在于：它是以前述組合物的原料藥的藥粉、原料藥的水或有機(jī)溶劑提取物為活性成分，加上藥學(xué)上常用的輔料或輔助性成分制備而成的凝膠膏劑。

其中，所述輔料由如下重量配比的輔料組成：

NP700 1.5～1.68份、卡波姆940 0.3～0.43份、PVA-124 0.1～0.25份、CMC-Na 0.1～0.33份、高嶺土1～1.4份、甘油6～12份、甘羥鋁0.08～0.1份、檸檬酸0.12～0.15份、篦麻油0.05份。優(yōu)選地，所述輔料由如下重量配比的輔料組成：NP7001.68份、卡波姆940 0.43份、PVA-124 0.1份、CMC-Na 0.33份、高嶺土1.08份、甘油12份、甘羥鋁0.09份、檸檬酸0.14份、篦麻油0.05份。

NP700：聚丙烯酸鈉Viscomate NP-700；

PVA-124：聚乙烯醇的一種，醇解度為98～99(m01)％，平均聚合度(n)2 400～2 500；

CMC-Na：羧甲基纖維素鈉。

其中，所述凝膠膏劑以權(quán)利要求1所述組合物的原料藥的70％乙醇溶液提取物為活性成分。優(yōu)選地，所述70％乙醇溶液提取物按照如下方法制備：取原料藥，粉碎成粗粉，用70％乙醇8倍量回流提取兩次，每次1.5小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮后，制得藥物干浸膏粉8g。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述凝膠膏劑由如下原輔料制備而成：

NP700 1.68份、卡波姆940 0.43份、PVA-124 0.1份、高嶺土1.08份、CMC-Na 0.33份、甘油12.0份、甘羥鋁0.09份、檸檬酸0.14份、蓖麻油0.05份、藥物干浸膏粉3.5份。

本發(fā)明還提供了前述治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的凝膠膏劑的制備方法，步驟如下：

將NP700與CMC-Na混勻后分散在甘油中，然后在攪拌的條件下倒入含有高嶺土的水中溶脹，為A相；將卡波姆940用水溶脹，然后用三乙醇胺調(diào)節(jié)pH約為7，為B相；將PVA-124在80℃的水中溶解，為C相；將甘羥鋁、檸檬酸水溶液與藥物干浸膏粉、氮酮、丙二醇、油酸混勻，為D相；依次在A相中加入B相、C相、D相、蓖麻油，每相需在混勻后加入，混勻后涂布；55℃烘干3小時(shí)，放冷，蓋膜，切割成小塊，即可。

本發(fā)明還提供了前述藥物組合物或者凝膠膏劑在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。其中，所述藥物是抑制滑膜細(xì)胞變性和增生、滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的藥物。

本發(fā)明藥物組合物，配方精當(dāng)，具有明顯的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，本發(fā)明凝膠膏劑可以有效治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，同時(shí)，均勻性、涂展性、柔軟性、膜殘留量及對(duì)皮膚的追隨性優(yōu)良，使用方便，患者依從性好，制備工藝簡(jiǎn)便，應(yīng)用前景良好。

下面通過(guò)具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

附圖說(shuō)明

圖1工藝流程圖

圖2各自大鼠肉芽腫重量比較(mg/100g)

圖3對(duì)CIA大鼠體重(g)的影響(X±S)

圖4各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

圖5對(duì)Ⅱ型膠原關(guān)節(jié)炎大鼠右足體積的影響

圖6 CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理組織切片圖(10倍)

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1本發(fā)明藥物的制備

1處方組成

藥物干浸膏粉制備：

組方：取黃芪30g，人參10g，白術(shù)12g，仙茅10g，菟絲子30克，白芍15g，雷公藤6g，龍須藤10g，炙甘草10g。

取組方，粉碎成粗粉；用70％乙醇8倍量回流提取兩次，每次1.5小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮后，制得干浸膏粉8g。

2制備工藝

將NP700與CMC-Na混勻后分散在甘油中，然后在攪拌的條件下倒入含有高嶺土的水中溶脹，為A相；將卡波姆940用水溶脹，然后用三乙醇胺調(diào)節(jié)pH約為7，為B相；將PVA-124在80℃的水中溶解，為C相；將甘羥鋁、檸檬酸水溶液與藥物干浸膏粉、氮酮、丙二醇、油酸混勻，為D相；依次在A相中加入B相、C相、D相、蓖麻油，每相需在混勻后加入，混勻后涂布；55℃烘干3小時(shí)，放冷，蓋膜，切割成小塊置密袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

3工藝流程圖

如圖1所示。

實(shí)施例2本發(fā)明藥物的制備

1處方組成

藥物干浸膏粉制備：

組方：取黃芪20g，人參15g，白術(shù)7g，仙茅15g，菟絲子20克，白芍20g，雷公藤3g，龍須藤15g，炙甘草5g。

取組方，粉碎成粗粉；用70％乙醇8倍量回流提取兩次，每次1.5小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮后，制得干浸膏粉8g。

2制備工藝

同實(shí)施例1。

實(shí)施例3本發(fā)明藥物的制備

1處方組成

藥物干浸膏粉制備：

組方：取黃芪40g，人參5，白術(shù)17g，仙茅5g，菟絲子40克，白芍10g，雷公藤9g，龍須藤5g，炙甘草15g。

取組方，粉碎成粗粉；用70％乙醇8倍量回流提取兩次，每次1.5小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮后，制得干浸膏粉8g。

2制備工藝

同實(shí)施例1。

以下通過(guò)試驗(yàn)例具體說(shuō)明本發(fā)明的有益效果：

實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明凝膠膏劑基質(zhì)處方的評(píng)價(jià)

凝膠膏劑(原凝膠膏劑)系指藥材提取物、藥材或和化學(xué)藥物與適宜的親水性基質(zhì)混勻后，涂布于背襯材料上制成的貼膏劑。與傳統(tǒng)貼膏相比有許多優(yōu)點(diǎn)，如載藥量較大、透氣性好、耐汗性強(qiáng)、可反復(fù)黏貼，不污染衣物，無(wú)刺激性和致敏性，生產(chǎn)中無(wú)“工業(yè)三廢”等。特別適合于中藥多組分、大劑量的用藥特點(diǎn)。臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方現(xiàn)已開(kāi)發(fā)成酊劑(院內(nèi)制劑)在臨床上使用，但基于酊劑自身的不足，本研究應(yīng)用現(xiàn)代經(jīng)皮給藥理論與新技術(shù)，制備了臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑。

凝膠膏劑基質(zhì)處方研究是凝膠膏劑研究的前提，好的基質(zhì)應(yīng)具有一定的黏性和內(nèi)聚力，還要有較好的均勻性、涂展性等。但目前凝膠膏劑仍然存在黏性差，內(nèi)聚力不足，反復(fù)揭扯性能差等問(wèn)題，而這些不足主要是受基質(zhì)的影響，因此凝膠膏劑基質(zhì)組成及其合理配比的研究是凝膠膏劑研究的重要環(huán)節(jié)。發(fā)明以自己的經(jīng)驗(yàn)，設(shè)定了一個(gè)基質(zhì)處方，以初黏力和剝離強(qiáng)度為量化指標(biāo)，以膏體的均勻性、涂展性、柔軟性、膜殘留量及對(duì)皮膚的追隨性等為綜合感官評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用均勻設(shè)計(jì)法，對(duì)凝膠膏劑基質(zhì)處方進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1實(shí)驗(yàn)材料

XS105電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；美國(guó)奧豪SPS402F電子天平，美國(guó)奧豪斯；KQ-500DE超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-S電熱恒溫水浴鍋，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DHG-9030電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器，蘇州學(xué)森儀器設(shè)備有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器，廣州市永程實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GB308-77標(biāo)準(zhǔn)鋼球，濟(jì)南蘭光；涂布機(jī)，自制；初黏力和剝離強(qiáng)度測(cè)試裝置，自制。

部分中和聚丙烯酸鈉NP-700，卡波姆(Carbopol-940)，青島天力源生物科技有限公司；甘輕鋁、無(wú)紡布、聚乙烯簿膜，廣州市拜澳生物科技有限公司；聚丙烯酸鈉、高嶺土、檸檬酸、山梨醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、明膠，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯醇(PVA-124)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，上海展云化工有限公司；藥物為干浸膏粉，由復(fù)方藥材經(jīng)70％乙醇提取(組方：取黃芪30g，人參10g，白術(shù)12g，仙茅10g，菟絲子30克，白芍15g，雷公藤6g，龍須藤10g，炙甘草10g。制備方法：取組方，粉碎成粗粉；用70％乙醇8倍量回流提取兩次，每次1.5小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，回收乙醇，濃縮后，制得干浸膏粉8g)，大孔吸咐樹(shù)脂純化后干燥制得；去離子水，自制。

2方法與結(jié)果

2.1凝膠膏劑基質(zhì)初步處方組成及制備工藝

根據(jù)發(fā)明人制劑的經(jīng)驗(yàn)，將基質(zhì)處方初步研究為：NP700 1.5g、高嶺土1.0g、CMC-Na 0.2g、卡波姆940 0.4g、PVA-124 0.1g、甘油12g、甘羥鋁0.08g、檸檬酸0.12g、蓖麻油0.05g。

制備工藝：將NP700與CMC-Na混勻后分散在甘油中，然后在攪拌的條件下倒入混有高嶺土的適量水中溶脹，為A相；將卡波姆940用適量水溶脹，然后用三乙醇胺調(diào)節(jié)PH約為7，為B相；將PVA-124在80℃的水中溶解，冷卻室溫為C相；將檸檬酸、甘羥鋁用適量水溶解后分散在甘油中，為D相；依次在A相中加入B相、C相、D相、蓖麻油，每相需在混勻后加入，混勻后涂布；55℃烘箱內(nèi)放置3小時(shí)，放冷，蓋膜，即得。

依據(jù)以上初步篩選的處方和工藝，制備成的空白基質(zhì)膏面光滑平整，且有較好的黏性和內(nèi)聚強(qiáng)度，皮膚追隨性較好，且無(wú)膏體殘留。

2.2凝膠膏劑基質(zhì)處方

2.2.1含藥凝膠膏劑的制備制備工藝同本章“2.1”項(xiàng)下方法，藥物分散在D相后加入。

2.2.2凝膠膏劑質(zhì)量評(píng)價(jià)方法本試驗(yàn)用初黏力、剝離強(qiáng)度、綜合感觀評(píng)分3個(gè)指標(biāo)的加權(quán)綜合評(píng)分為指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)凝膠膏劑工藝質(zhì)量，把上述3個(gè)指標(biāo)分別賦予加權(quán)值40：30：30，即加權(quán)綜合評(píng)分＝初黏力(最小值/測(cè)得值)×40+剝離強(qiáng)度(測(cè)得值/最大值)×30+綜合感觀評(píng)分值。

2.2.2.1初黏力的測(cè)定本研究參考美國(guó)壓敏膠帶協(xié)會(huì)PSTC-6法，采用“滾球平面停止法”測(cè)定凝膠膏劑的初黏力，滾球從25°斜面上經(jīng)過(guò)20cm滾下，經(jīng)過(guò)水平放置的凝膠膏劑表面,測(cè)定滾球在凝膠膏劑膏面的滾動(dòng)距離，判定凝膠膏劑的黏性大小。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次，以平均值計(jì)算。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇22號(hào)球(球規(guī)格參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T4852-2002)，直徑17.462mm，滾動(dòng)距離越小，黏性越大，以測(cè)定最小值為40分，其余與之相比(最小值/測(cè)得值)×40計(jì)算得分。

2.2.2.2剝離強(qiáng)度的測(cè)定將凝膠膏劑裁剪成3.8cm×8.0cm的塊狀，其中上端1.0cm用于懸掛重物，作為自由端，3.8cm×7.0cm為實(shí)驗(yàn)區(qū)域。取下凝膠膏劑防黏層黏貼在經(jīng)清潔的不銹鋼板上，凝膠膏劑的短邊與不銹鋼板上的刻線齊平，凝膠膏劑的長(zhǎng)邊與不銹鋼板的長(zhǎng)邊平行用壓輥來(lái)回滾動(dòng)壓緊，確保黏接處無(wú)氣泡存在，在自由端反向180°方向系掛重150g的砝碼，并用手托住，放開(kāi)砝碼的同時(shí)用秒表記錄下實(shí)驗(yàn)區(qū)域完全脫離鋼板的時(shí)間，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，以平均值計(jì)算。以秒表測(cè)得最大值為30分，其余與之相比(測(cè)得值/最大值)×30計(jì)算得分。

2.2.2.2綜合感觀評(píng)分此項(xiàng)檢驗(yàn)以膏體的均勻性、柔軟性、涂展性、膜殘留量及對(duì)皮膚追隨性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別進(jìn)行計(jì)分，然后把五項(xiàng)指標(biāo)得分相加即得綜合感觀分值(每項(xiàng)滿分為6分)，滿分為30分。均勻性：指所制備的膏體均勻、稠度適宜，涂布在無(wú)紡布上無(wú)顆粒狀、粗絲狀膠團(tuán)、細(xì)膩、薄厚一致。柔軟性：指所制備的膏體柔軟度適中。涂展性：用自制涂布器涂布時(shí)，拋錨性好，膏體均勻不斷條。膜殘留量：指180°剝離后，根據(jù)殘留在聚乙烯薄膜上的量來(lái)打分。皮膚追隨性：是指成型凝膠膏劑貼于手腕背部，用力甩10下，根據(jù)脫落情況進(jìn)行打分，以不脫落者為滿分。

2.2.3試驗(yàn)安排本實(shí)驗(yàn)以NP700為骨架材料，高嶺土為填充劑，卡波姆940、PVA-124和CMC-Na為增黏劑，甘油為保濕劑，甘羥鋁為交聯(lián)劑，檸檬酸為交聯(lián)調(diào)節(jié)劑，蓖麻油為軟化劑。采用均勻設(shè)計(jì)法，以初黏力、剝離強(qiáng)度、綜合感觀評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)選。在預(yù)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用擬水平法，將各因素的考察范圍分為4個(gè)水平重復(fù)使用，各因素水平范圍為NP700(X₁)1.2～2.1g，卡波姆940(X₂)0.2～0.5g，PVA-124(X₃)0.1～0.25g，CMC-Na(X₄)0.1～0.4g，高嶺土(X₅)0.6～1.8g，甘油(X₆)6～12g，甘羥鋁(X₇)0.06～0.12g；實(shí)驗(yàn)中固定加藥量1g，占凝膠膏劑基質(zhì)的4％；蓖麻油0.05g，交聯(lián)調(diào)節(jié)劑為檸檬酸，用量為甘羥鋁的1.5倍，凝膠膏劑基質(zhì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排見(jiàn)表1。

表1凝膠膏劑基質(zhì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排

2.2.4數(shù)據(jù)分析與結(jié)果

結(jié)果件表2所示：

表2凝膠膏劑基質(zhì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果

由上表可以看出，配方6、11和17的效果較佳，配方17的效果最佳。因此，本發(fā)明凝膠劑的基質(zhì)配方為：NP700:卡波姆940:PVA-124:CMC-Na:高嶺土:甘油:甘羥鋁:檸檬酸：篦麻油＝(1.5～1.68)：(0.3～0.43)：(0.1～0.25)：(0.1～0.33)：(1～1.4)：(6～12)：(0.08～0.1)：(0.12～0.15)：0.05，優(yōu)選為NP700:卡波姆940:PVA-124:CMC-Na:高嶺土:甘油:甘羥鋁:檸檬酸：篦麻油＝1.68：0.43：0.1：0.33：1.08：12.0：0.09：0.14：0.05。

實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明凝膠膏劑成型工藝的評(píng)價(jià)

目前中藥凝膠膏劑主要存在黏性差，內(nèi)聚力不足，反復(fù)揭扯性能差等問(wèn)題，而這些不足除受原料、基質(zhì)配方、配比的影響以外，制備工藝也是影響凝膠膏劑性狀的重要因素之一。按照實(shí)驗(yàn)例1的最佳配方，考察成型工藝對(duì)凝膠膏劑的影響，并最終確定最佳成型工藝。

1實(shí)驗(yàn)材料

同實(shí)驗(yàn)例1。

2方法與結(jié)果

2.1空白基質(zhì)混合方式的考察

凝膠膏劑的基質(zhì)主要是高分子材料組成，這些高分子化合物的加入順序?qū)|(zhì)影響較大，因此，選擇適當(dāng)?shù)奶砑臃椒ㄊ侵瞥赡z膏劑的關(guān)鍵。本凝膠膏劑基質(zhì)處方主要含以下組分：①NP700；②卡波姆940水溶液；③高嶺土；④PVA124水溶液；⑤CMC-Na；⑥甘油；⑦透皮吸收促進(jìn)劑(氮酮、油酸、丙二醇混合物)；⑧甘羥鋁；⑨檸檬酸水溶液。

方式一：將NP700分散在甘油中，在適量水中溶脹；加入卡波姆940水溶液，用三乙醇胺調(diào)節(jié)PH值約7.0，即(①→⑥)+②，調(diào)節(jié)PH值約7.0。

現(xiàn)象：有顆粒狀卡波姆稀出，難以攪拌均勻。先調(diào)節(jié)卡波姆940水溶液PH值后，再加入NP700溶脹液可以改善這一現(xiàn)象。

方式二：將NP700分散在甘油中，在適量水中溶脹；加入已調(diào)節(jié)PH的卡波姆940水凝膠，再加入高嶺土，即((①→⑥)→②)+③。

現(xiàn)象：基質(zhì)中分布白色塊狀物，基質(zhì)粗糙，主要原因是高嶺土在較稠的基質(zhì)中難以分散開(kāi)來(lái)。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，高嶺土能在水中分散均勻；將NP700分散在甘油后，攪拌條件下倒入分散著高嶺土的適量水中，溶脹后可以得到均勻細(xì)膩的白色凝膠。

方式三：將NP700分散在甘油后，攪拌條件下倒入分散著高嶺土的適量水中溶脹；加入已調(diào)節(jié)PH的卡波姆940水凝膠；加入PVA-124與CMC-Na混合溶液(將CMC-Na溶解在PVA-124水溶液)，即(((①→⑥)→③)+②)+(⑤→④)。

現(xiàn)象：CMC-Na在PVA-124水溶液中溶解得很慢，攪拌下產(chǎn)生大量的氣泡；當(dāng)將CMC-Na單獨(dú)溶解后與其它基質(zhì)混合，效果較好，但同時(shí)也造成基質(zhì)含水量高，基質(zhì)較稀。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CMC-Na能溶解在甘油中，當(dāng)與NP700一起分散在甘油后，攪拌條件下倒入分散著高嶺土的適量水中溶脹，可以得到均勻細(xì)膩的基質(zhì)，同時(shí)節(jié)約了CMC-Na溶脹時(shí)間和用水量。

方式四：將NP700與甘羥鋁一起分散在甘油中，即(①+⑧)→⑥。

現(xiàn)象：有白色塊狀物稀出。可能是NP700與甘羥鋁溶解在甘油中，相互交聯(lián)。因此，NP700與甘羥鋁不能同時(shí)溶解在同一相中^[80]。當(dāng)甘羥鋁溶解在透皮吸收促進(jìn)劑后加入基質(zhì)中不會(huì)出現(xiàn)硬塊。

方式五：將NP700與CMC-Na分散在甘油后，攪拌條件下倒入分散著高嶺土的適量水中溶脹；加入已調(diào)節(jié)PH的卡波姆940水凝膠；加入PVA-124水溶液；加入混有甘羥鋁的透皮吸收促進(jìn)劑，最后加入檸檬酸水溶液，即((((((①+⑤)→⑥)→③)+②)+④)+(⑧→⑦))+⑨。

現(xiàn)象：當(dāng)加入⑨時(shí)，基質(zhì)表面立刻出現(xiàn)膜，手拈幾乎無(wú)黏性，很難攪拌；即使分次少量加入也未能很好改善。這可能是檸檬酸促進(jìn)了Al⁺³的生成，加速了NP700的交聯(lián)；因此，需要用其它基質(zhì)將檸檬酸分散后加入其它基質(zhì)。

方式六：混合方式與方式五相似，只是將檸檬酸與甘羥鋁一起分散在透皮吸收促進(jìn)劑后加入。

現(xiàn)象：最終得到的基質(zhì)均勻細(xì)膩，易于涂布，黏性較高。

因此，以方式六的方式混合，得到的空白基質(zhì)最佳。

2.2藥物加入方式與加入量的考察

中藥因其成分復(fù)雜，其加入方式和加入量對(duì)凝膠膏劑的性能具有很大的影響，應(yīng)充分考慮藥物性質(zhì)、與基質(zhì)相容性以及基質(zhì)載藥量之間的關(guān)系。

本試驗(yàn)用的藥物為中藥干浸膏，直接加入基質(zhì)中很難分散均勻，且藥物以顆粒狀分布，影響藥物的釋放。因此，需要用一些溶劑，如甘油、丙二醇、乙醇等溶解后加入基質(zhì)中，讓藥物充分分散。當(dāng)用適量乙醇溶解藥物后加入基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)黏性降低；本試驗(yàn)最終將藥物分散甘油、透皮吸收促進(jìn)劑中，然后分次加入基質(zhì)中，可以得到均勻細(xì)膩的膏體。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物與NP700一起溶解于甘油中，有包裹藥物的小團(tuán)狀物出現(xiàn)，且無(wú)黏性；可能原因是中藥中的金屬離子與NP700發(fā)生了交聯(lián)，因此，藥物宜最后加入。

按本節(jié)“2.1”項(xiàng)下方式六制備凝膠膏劑，單位因素考察凝膠膏劑載藥量。結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，載藥量對(duì)凝膠膏劑的粘度、強(qiáng)度、外觀性狀均有一定的影響，當(dāng)載藥量較小，膏體的性能變化不大；隨著載藥量增加，基質(zhì)的各項(xiàng)性能指標(biāo)下降，如爛膏、皮膚追隨性差等；但載藥量過(guò)小的話，則無(wú)法達(dá)到使用要求；當(dāng)給于較大的面積時(shí)，則造成基質(zhì)浪費(fèi)和成本的增加。綜合考慮兩方面的因素，每處方基質(zhì)中加入3.5g藥物比較合適，制得的臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑均勻、細(xì)膩、氣泡較少。

表3基質(zhì)載藥量考察結(jié)果表

2.3干燥溫度、時(shí)間的考察

含濕量是凝膠膏劑重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)凝膠膏劑的黏性影響較大，適宜的含水量有利于藥物的釋放，增加患者的舒適感。為保證適宜的凝膠膏劑的含水量，剛制備好的凝膠膏劑常需要干燥，因此，考察干燥溫度、時(shí)間對(duì)凝膠膏劑的含濕量、黏性就顯得很重要。

將制備好的臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑分別在40℃、55℃、70℃的烘箱內(nèi)干燥3h，結(jié)果70℃烘干的凝膠膏劑黏性較小，且有些卷起；而40℃烘干的凝膠膏劑較軟，有膜殘留。因此，本文選擇55℃烘干凝膠膏劑，考察其最佳烘干時(shí)間。

按處方制備凝膠膏劑，放入55℃烘箱中干燥，分別于第1、2、3、4、5、6、7、9.5、13h，取出，放涼，稱定重量，并測(cè)定初黏力。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4干燥時(shí)間與含濕率、初黏力的關(guān)系

表4可知，干燥4h前，凝膠膏劑含濕率隨干燥時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，4h后基本不變，可能是由于保濕劑的作用。干燥1h后，凝膠膏劑較軟、黏性大、手拈膏面破壞；干燥2h后，膏體較1h硬些，但依然有膜殘留、膏體破壞；而干燥3h時(shí)，凝膠膏劑各方面的性能均較好，此時(shí)凝膠膏劑的含濕率為25.53％。因此確定臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑最佳干燥工藝為55℃干燥3h。

3小結(jié)與討論

由于基質(zhì)黏度大，在攪拌過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生氣泡，影響膏體物理性狀和外觀。本試驗(yàn)分別采用真空干燥箱中25℃減壓、水浴加熱、超聲等方法除去氣泡，但除氣泡效果均不明顯。膏體在真空條件下大體積膨脹，水浴加熱、超聲除氣泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且效果不明顯，因此，在凝膠膏劑制備過(guò)程中要盡量減少氣泡的產(chǎn)生。

本基質(zhì)組分較復(fù)雜，各基質(zhì)組分的添加順序?qū)Ω囿w的性狀影響較大，在添加過(guò)程中不能簡(jiǎn)單的混合，所以本實(shí)驗(yàn)固定其它工藝因素，單獨(dú)考察各基質(zhì)組分的添加順序?qū)δz膏劑性狀的影響。發(fā)現(xiàn)NP700遇水聚團(tuán)，不易溶脹，與CMC-Na混合后分散在甘油中，然后溶解在水中，可得到均勻的基質(zhì)，這樣也避免了單獨(dú)加入CMC-Na引入氣泡。藥物的加入方式也較重要，特別是中藥提取物，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將浸膏粉加入到PVA-124混合液中立即成團(tuán)析出，溶解呈清水狀，沒(méi)有黏性；將浸膏粉溶解在甘油和促進(jìn)劑的混合液中，再加入基質(zhì)中可得到均勻的膏體。

前期的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，干燥時(shí)間、浸膏粉用量對(duì)凝膠膏劑性狀影響較大，這可能原因是干燥時(shí)間影響凝膠膏劑的黏性和水分，凝膠膏劑含有水分過(guò)高，保護(hù)膜撕不開(kāi)或藥膏殘留于皮膚上；水分過(guò)低，黏性下降，用藥后皮膚舒適度降低，藥物的滲透量降低，從而影響制劑的療效；中藥浸膏用量過(guò)高，賦形性差、黏性差，從而影響凝膠膏劑的成型和穩(wěn)定性；用量過(guò)低，則造成基質(zhì)浪費(fèi)。另外，適宜的攪拌速度、煉和時(shí)間也是保證凝膠膏劑質(zhì)量的重要因素，攪拌速度過(guò)快，容易使高分子基質(zhì)的分子鏈斷裂而降低凝膠膏劑的黏性，易引入氣泡，速度過(guò)慢則基質(zhì)不易混勻，影響凝膠膏劑的外觀；煉和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則基質(zhì)的延展性變差，使涂布變得困難，過(guò)短則混合不均勻。

實(shí)驗(yàn)例3本發(fā)明凝膠膏劑初步藥效學(xué)研究

本部分實(shí)驗(yàn)研究包括兩部分：臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑(本發(fā)明實(shí)施例1制備的凝膠膏劑)對(duì)大鼠棉球肉芽腫形成的影響，考察其抗慢性炎癥作用；以及臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑(本發(fā)明實(shí)施例1制備的凝膠膏劑)對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)大鼠模型的治療作用。

第一節(jié) 臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑對(duì)大鼠棉球肉芽腫形成的影響

1實(shí)驗(yàn)材料

XS105電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；美國(guó)奧豪SPS402F電子天平，美國(guó)奧豪斯；DHG-9030電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；眼科剪、眼科鑷子、刮毛刀。

臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑自制，每片(規(guī)格：8cm×12cm)含雷公藤甲素246.59μg，含青藤堿155.89mg；空白凝膠膏劑，自制；傷濕止痛膏，河南羚銳制藥股份有限公司產(chǎn)品；戊巴比妥鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；75％乙醇和碘酒；棉球:每個(gè)重量為(25.0士1.0)mg，高壓滅菌后，加入慶大霉素和青霉素混合液0.1mL并置烘箱60烤至恒重。

Wistar大鼠，雌雄各半，SPF級(jí)，體重(180±20)g，均由福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2方法與結(jié)果

2.1大鼠棉球肉芽腫模型的建立

取Wistar大鼠40只，體重(180土20)g，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉(30mg/kg體重)麻醉，用刮毛刀刮去大鼠背部毛，用并用75％乙醇和碘酒擦拭消毒后，用眼科剪剪開(kāi)一小口，用眼科鑷子將25mg已干燥稱重的滅菌棉球(加慶大霉素和青霉素混合液0.1ml并烘干)從小切口植入皮下，隨即縫合皮膚。

2.2分組給藥

建模后對(duì)40只Wistar大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，并在動(dòng)物造模當(dāng)天蘇醒后開(kāi)始給藥，將藥物貼于大鼠背部后，并用醫(yī)用膠布固定；每日給藥1次，連續(xù)14d。其中模型組為空白凝膠膏劑，大小2cm×3cm；陽(yáng)性組為傷濕止痛膏，大小2cm×3cm；高、中、低劑量給藥組分別給于大小為1cm×3cm、2cm×3cm、3cm×3cm的臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑。

2.3肉芽腫剝離、稱重及統(tǒng)計(jì)分析

末次給藥3h后頸椎脫臼處死動(dòng)物，取出植入的棉球，仔細(xì)剝離附著組織，，置60℃烤箱烘12h至恒重，減去棉球重，即為肉芽腫重量，以mg(肉芽腫)/100g(體重)表示。以各組肉芽腫重量進(jìn)行t檢驗(yàn)，并比較其抑制率。結(jié)果見(jiàn)表5，圖2。由表5可知，陽(yáng)性組及高中低給藥組肉芽腫重量均明顯低于模型組(P＜0.05)，說(shuō)明臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑對(duì)肉芽的形成有明顯的抑制作用。

表5各自大鼠肉芽腫重量比較(mg/100g)

注：與模型組比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01

第二節(jié) 臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑對(duì)CIA大鼠模型的影響

1實(shí)驗(yàn)材料

CS-1EAS型電子天平，北京市菲姆斯科技開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品，精度0.1g；YLS-7B型大鼠足跖體積測(cè)量?jī)x，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；RM2125型切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司；CTM-2型倒置顯微鏡，OlymPus，日本。

弗氏完全佐劑(FAC)和Ⅱ型膠原均購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑自制，每片(規(guī)格：8cm×12cm)含雷公藤甲素246.59μg，含青藤堿155.89mg；空白凝膠膏劑，自制；傷濕止痛膏，河南羚銳制藥股份有限公司產(chǎn)品；液體石蠟、甲醛，上海國(guó)藥集團(tuán)。

Wistar大鼠，雌雄各半，SPF級(jí)，體重(180±20)g，均由福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2方法

2.1 CIA大鼠模型的建立^[88]

取48只Wistar大鼠，隨時(shí)分成六組，用刮毛刀刮去大鼠背部毛，以供貼藥。將弗氏完全佐劑(FAC)與2mg/ml的Ⅱ型膠原乳液等體積混合，制成1mg/ml的膠原乳劑，除正常組外，按每只大鼠0.2ml乳劑(含CⅡ0.2mg)于尾根部皮下注射造模。7d后強(qiáng)化1次，除正常組外，按每只大鼠0.1ml乳劑(含CⅡ0.1mg)于尾根部皮內(nèi)注射造模。

2.2給藥劑量和方式

除正常組外，動(dòng)物初次免疫后次日起開(kāi)始給藥，將藥物貼于大鼠背部后，并用醫(yī)用膠布固定；每日給藥1次，連續(xù)28d。其中模型組為空白凝膠膏劑，大小2cm×3cm；陽(yáng)性組為傷濕止痛膏，大小2cm×3cm；高、中、低劑量給藥組分別給于大小為1cm×3cm、2cm×3cm、3cm×3cm的臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑。

2.3 CIA大鼠炎癥指標(biāo)測(cè)定

2.3.1大鼠體重的測(cè)定在給藥前及給藥后4，8，12，16，20，24，28天，分別測(cè)量各鼠體質(zhì)量。

2.3.2關(guān)節(jié)炎指數(shù)測(cè)定大鼠初次免疫后第4d開(kāi)始(每隔3天)觀察大鼠四肢關(guān)節(jié)病變程度。病變程度按0～4級(jí)評(píng)分法評(píng)分，四肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)之和代表每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，積分越高，關(guān)節(jié)癥狀越嚴(yán)重，最高分值為16分。平分標(biāo)準(zhǔn)^[89]：0分，關(guān)節(jié)正常無(wú)紅腫；1分，趾關(guān)節(jié)紅腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹、關(guān)節(jié)嚴(yán)重變形。

2.3.3大鼠右后足爪容積的測(cè)定用大鼠足跖體積測(cè)量?jī)x于造模前，造模后每4d測(cè)定大鼠右后足跖容積，測(cè)定3次，計(jì)算平均值。

2.3.4關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)大鼠處死后，取右踝關(guān)節(jié)，10％甲醛固定，脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片后HE染色，觀察大鼠關(guān)節(jié)炎癥、滑膜病變、骨質(zhì)破壞等變化情況，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1一般變化

初次免疫后一星期大鼠關(guān)節(jié)無(wú)紅腫，活動(dòng)無(wú)明顯異常狀態(tài)出現(xiàn)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組和給藥組大鼠活動(dòng)和進(jìn)食量減少，體重下降，毛發(fā)干枯，精神萎靡；后足趾關(guān)節(jié)開(kāi)始出現(xiàn)紅腫，逐步蔓延到尾部，少數(shù)可累及前肢，并且日趨嚴(yán)重，關(guān)節(jié)功能活動(dòng)障礙，不能正常行走。陽(yáng)性組及臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑組大鼠治療后上述癥狀有較明顯緩解。

3.2對(duì)CIA大鼠體重的影響

初次免疫后4d，各組大鼠活動(dòng)、食欲未出現(xiàn)明顯異常，精神較佳；第8d時(shí)，正常組大鼠體重雖高于CIA大鼠，但也沒(méi)有顯著性。隨后與正常組相比，CIA大鼠表現(xiàn)食欲下降、體重減輕、活動(dòng)減少、精神倦怠，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01))。與模型組相比，除第12、14d高中劑量組、陽(yáng)性組有顯著性外，治療組CIA大鼠體重?zé)o明顯差別。結(jié)果見(jiàn)表6，續(xù)表6，圖3。

6對(duì)CIA大鼠體重(g)的影響

注：空白組比較^＊P＜0.01；與模型組比較^#P＜0.05

續(xù)表6對(duì)CIA大鼠體重(g)的影響

注：空白組比較^＊P＜0.01；與模型組比較^#P＜0.05

3.3 CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)

初次免疫后第l2d，CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高較大；第20d后，與模型組相比較，陽(yáng)性組與高、中劑量組CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均有不同程度的降低，呈顯著性差異(P＜O.05或P＜0.01)。低劑量組治療效果較陽(yáng)性組與高、中劑量組弱，與模型組相比，在第20d時(shí)，關(guān)節(jié)指數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)；表明臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑對(duì)關(guān)節(jié)炎癥有一定的抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表7，續(xù)表7，圖4。

表7各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

注：與模型組比較，^*P≤0.05，^**P≤0.01

續(xù)表7各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

注：與模型組比較，^*P≤0.05，^**P≤0.01

3.4對(duì)CIA大鼠右足體積的影響

初次免疫后12d，CIA大鼠足趾關(guān)節(jié)開(kāi)始腫脹明顯，并逐漸延及整個(gè)足掌甚至踝關(guān)節(jié)；在第20d左右，足趾腫脹達(dá)到最高峰，體積明顯大于正常組，呈顯著性差異(P＜0.01)，說(shuō)明造模成功?？傮w來(lái)看，臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑對(duì)CIA大鼠模型有明顯的治療作用，初次免疫后第24d起，高中低劑量組足趾腫脹較模型組都有不同程度的減輕，呈顯著性差異(P＜O.05或P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表8，續(xù)表8，圖5。

表8對(duì)CIA大鼠右足體積的影響

注：正常組比較^＊P＜0.01；與模型組比較^#P＜0.05，^##P＜0.01

續(xù)表8對(duì)CIA大鼠右足體積的影響

注：正常組比較^＊P＜0.01；與模型組比較^#P＜0.05，^##P＜0.01

3.5對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)的影響

如圖6所示，HE染色結(jié)果顯示，正常組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，關(guān)節(jié)表面光滑，滑膜細(xì)胞扁平狀整齊排列；滑膜組織未見(jiàn)增生，且無(wú)充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象。模型組關(guān)節(jié)軟骨變薄，表面毛糙凹凸不平、部分區(qū)域破壞缺損；滑膜細(xì)胞排列紊亂，組織明顯增生，充血并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，陽(yáng)性組與高中低劑量組對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)病變都有改善作用，表明臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑對(duì)CIA大鼠有一定的治療作用。陽(yáng)性組與高、中劑量組病變程度相當(dāng)，表現(xiàn)為:關(guān)節(jié)局部病變，未見(jiàn)明顯軟骨破壞，軟骨面光滑，滑膜細(xì)胞輕度到中度變性和增生，關(guān)節(jié)腔內(nèi)未見(jiàn)炎性滲出物，滑膜間質(zhì)有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。低劑量組關(guān)節(jié)軟骨有中度到重度破壞，滑膜細(xì)胞有中度到重度變性和增生，并有中度到重度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)少見(jiàn)炎性滲出物。

4小結(jié)與討論

RA是一種累及周圍關(guān)節(jié)為主的慢性全身性自身免疫性疾病，病理變化主要是滑膜炎，關(guān)節(jié)軟骨破壞，直至骨質(zhì)的破壞。目前，治療RA的實(shí)驗(yàn)研究所選用的模型主要有佐劑性關(guān)節(jié)炎(adj uvant arthritis，AA)模型和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)兩種模型。AA大鼠模型的方法簡(jiǎn)單易行，其病理變化也類似于RA，在我國(guó)也被用于RA或防治RA藥物的研究，但在病理生理學(xué)上與RA有一定的差別，尚具有一定的局限性。而CIA大鼠模型是目前公認(rèn)的研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的最佳模型，與人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎極其相似，主要體現(xiàn)在免疫病理反應(yīng)、病理?yè)p傷、臨床癥狀等方面。

本實(shí)驗(yàn)以CIA大鼠作為研究RA的動(dòng)物模型，研究臨床類風(fēng)濕驗(yàn)方凝膠膏劑的抗RA作用。造模后7-8d，CIA大鼠足趾關(guān)節(jié)開(kāi)始腫脹，12d與空白組相比有顯著性差異(P＜0.01)，并逐漸延及整個(gè)足掌甚至踝關(guān)節(jié)，20-21d腫脹達(dá)到最高峰，關(guān)節(jié)功能活動(dòng)障礙，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。同時(shí)CIA大鼠表現(xiàn)食欲下降、體重減輕、活動(dòng)減少、精神倦怠。病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨變薄，表面毛糙凹凸不平、部分區(qū)域破壞缺損；滑膜細(xì)胞排列紊亂，組織明顯增生，充血并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各給藥組可以減輕CIA大鼠足趾關(guān)節(jié)腫脹程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)，但低劑量組療效低于陽(yáng)性組和高中劑量組。光鏡下觀察顯示，各給藥組對(duì)踝關(guān)節(jié)的病變均有不同程度的減輕，未見(jiàn)明顯軟骨破壞，軟骨面光滑，對(duì)滑膜細(xì)胞變性和增生、滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有較好的抑制作用。

第三節(jié) 雙藤痹痛凝膠對(duì)CIA大鼠外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用研究

凝膠膏劑是一種以水溶性高分子化合物或親水性物質(zhì)為基質(zhì),與中藥或中藥提取物混合后,涂布于布上制成的外用貼劑，具有透氣性好、載藥量大、耐汗性強(qiáng)，可反復(fù)黏貼，不污染衣物，藥物無(wú)致敏、無(wú)刺激性等副作用。前期臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抑制CIA模型大鼠足趾腫脹和關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，降低其關(guān)節(jié)炎指數(shù)的作用^[2]。近年的研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能與數(shù)量對(duì)RA等自身免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要的影響，特別是對(duì)CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3⁺Treg細(xì)胞的影響，它可能成為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新策略和途徑，因此，本文旨在探討是否通過(guò)調(diào)節(jié)CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3⁺Treg細(xì)胞，而發(fā)揮抗RA的作用。

1材料與儀器

1.1動(dòng)物

Wistar大鼠50只，雌雄各半，SPF級(jí)，體重(220±20)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005，均由福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.2藥物與試劑

試劑 弗氏完全佐劑(FAC)，Ⅱ型膠原(美國(guó)SIGMA公司)；APC-抗CD₄mAb、PE-FoxP3 mAb、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒均購(gòu)于Bioscience公司，F(xiàn)ITC-抗CD₂₅mAb購(gòu)于Biolegend公司，紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3儀器

CS-1EAS型電子天平(北京市菲姆斯科技開(kāi)發(fā)公司，精度0.1g)；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(上海儀分科學(xué)儀器有限公司)；Infinite M200Pro多功能酶標(biāo)儀(TECAN)；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

2方法

2.1大鼠CIA模型的建立

取50只Wistar大鼠，隨機(jī)分成五組，用刮毛刀刮去大鼠背部毛，以供貼藥。將弗氏完全佐劑(FAC)與2mg/ml的Ⅱ型膠原乳液等體積混合，制成1mg/ml的膠原乳劑，除正常組外，按每只大鼠0.2ml乳劑(含CⅡ0.2mg)于尾根部皮下注射造模。7d后強(qiáng)化1次，除正常組外，按每只大鼠0.1ml乳劑(含CⅡ0.1mg)于尾根部皮內(nèi)注射造模。

除正常組外，動(dòng)物初次免疫后次日起開(kāi)始給藥，將藥物貼于大鼠背部后，并用醫(yī)用膠布固定；每日給藥1次，連續(xù)28d。其中模型組為空白凝膠膏劑，大小為2cm×3cm；高、中、低劑量給藥組分別給于大小為1cm×3cm、2cm×3cm、3cm×3cm的雙藤痹痛凝膠膏劑。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3⁺Treg

摘眼球取血,肝素抗凝收集；取血100μL，加入含有0.5μLCD4-FITC和2.5μL CD25-APC單克隆抗體的離心管中，室溫避光孵育30min；加入1mL紅細(xì)胞溶解液混勻，以1500r/min離心5min，棄其上清液；加入1mL透化緩沖液(1×)，以1500r/min離心5min,以試管底部不見(jiàn)紅色為度；棄其上清液,加固定/透化工作液500μL震勻，4℃下避光孵育12h(或過(guò)夜)。加流式染色緩沖液以1500r/min離心5min，清洗，于上述細(xì)胞懸液，加入含有1μL FoxP3-PE單克隆抗體(設(shè)IgG2α為同型對(duì)照)震勻，室溫避光孵育30min，加流式染色緩沖液清洗，加0.1moL/L PBS調(diào)定至300μL,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清IL-6表達(dá)水平

眼眶采血，1500rpm/min離心15min制備血清，待測(cè)上清液、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)抗體使用量均為100μL，參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IL-6的含量。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)結(jié)果均以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1外周血CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3⁺Treg細(xì)胞水平

采用三色熒光法標(biāo)記進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠外周血CD₄⁺CD₂₅⁺T細(xì)胞水平顯著下降，CD₄⁺CD₂₅⁺T細(xì)胞中FoxP3⁺T表達(dá)明顯下降(P<0.05或P<0.01)，CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3^-T和CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3⁺T表達(dá)水平明顯明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠外周CD₄⁺CD₂₅⁺T細(xì)胞水平顯著升高，同時(shí)CD₄⁺CD₂₅⁺T細(xì)胞中FoxP3⁺T表達(dá)水平明顯升高，CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3⁺T表達(dá)水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)。而雙藤痹痛凝膠中劑量組除了CD₄⁺T細(xì)胞及CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3⁺T顯著下降外(P<0.01)，其余無(wú)明顯變化。

表9大鼠外周血CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3⁺Treg細(xì)胞水平(n＝10，％，)

注：與正常組比較：^*P<0.05，^**P<0.01；與模型組比較:^#P<0.05,^##P<0.01

表10大鼠外周血CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3⁺Treg細(xì)胞水平(n＝10，％，)

注：與正常組比較：^*P<0.05，^**P<0.01；與模型組比較:^#P<0.05,^##P<0.01

3.2大鼠血清中IL-6表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表11；與正常組比較，模型組的IL-6水平顯著升高(p<0.01)，雙藤痹痛凝膠高、中劑量組與模型組比較，均能顯著降低IL-6表達(dá)水平(p<0.05或p<0.01)，而低劑量組無(wú)明顯變化。

表11大鼠血清中IL-6表達(dá)水平(n＝10，)

注：模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，^*p<0.05，^**p<0.01；與模型對(duì)照組比，^#p<0.05，^##p<0.01。

4討論

已有文獻(xiàn)研究表明，CD₄⁺CD₂₅⁺T細(xì)胞的數(shù)量減少或者功能的異?？赡苁怯捎谄鋮⑴c了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生^[5]，而FoxP3(Forkhead boxP3，F(xiàn)oxP3)則是目前公認(rèn)的CD₄⁺CD₂₅⁺T細(xì)胞特異性標(biāo)志，其基因表達(dá)調(diào)控著免疫T細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟，一旦CD₄⁺CD₂₅⁺FoxP3⁺Treg細(xì)胞表達(dá)下降，可能直接影響機(jī)體免疫耐受，最終導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。因此，研究CD₄⁺CD₂₅⁺T細(xì)胞及其特異性標(biāo)志物FoxP3，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物在一定劑量下可降低CD₄⁺T細(xì)胞水平，同時(shí)升高CD₄⁺CD₂₅⁺T細(xì)胞水平和CD₄⁺CD₂₅⁺T細(xì)胞中FoxP3⁺表達(dá)水平，降低IL-6水平。這可能就是前期研究發(fā)現(xiàn)，具有抑制CIA模型大鼠足趾腫脹和關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，降低其關(guān)節(jié)炎指數(shù)作用機(jī)制之一。

綜上，本發(fā)明藥物組合物可以治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，為臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供了一種新的選擇，應(yīng)用前景良好。