本發(fā)明涉及銀翹湯方中藥提取物的制備方法及其應(yīng)用，屬于中醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：流行性感冒病毒，簡(jiǎn)稱流感病毒，是一種造成人類及動(dòng)物患流行性感冒的rna病毒，在分類學(xué)上，流感病毒屬于正黏液病毒科，它會(huì)造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳播，在世界各地常會(huì)有周期性的大流行。流行性感冒病毒在免疫力較弱的老人或小孩及一些免疫失調(diào)的病人會(huì)引起較嚴(yán)重的癥狀，如肺炎或是心肺衰竭等。中醫(yī)藥治療流感具備顯著優(yōu)勢(shì)，從傳統(tǒng)方劑的現(xiàn)代藥理廣泛篩選中，銀翹湯具備顯著的抗流感效果。銀翹湯來源于《溫病條辨》(清代著名溫病四大名家”之一的吳鞠通所著)卷二。主要功效用于陽明溫病，下后無汗脈浮者，其中銀翹湯為透表清熱之輕劑。因下之后，積穢去，腑氣通，余邪還表，但以氣陰俱傷，未得外透，證見無汗脈浮，故仿銀翹散意，仍以銀花、連翹解毒而輕宣表氣；配伍竹葉清上焦之熱，生甘草益氣清火，增入麥冬、細(xì)生地滋陰清熱，使還表之邪，得汗而解。主要組分為銀花5錢，連翹3錢，竹葉2錢，生甘草1錢，麥冬4錢，細(xì)生地4錢；主要功用為滋陰透表。主治陽明溫病，下后無汗脈浮者。銀翹湯和銀翹散是不同的方劑，其中銀翹散也為為《溫病條辨》中辛涼解表劑，是臨床上常用經(jīng)典方劑。出自于《溫病條辨·上焦篇》第4條：“太陰風(fēng)溫、溫?zé)?、溫疫、冬溫初起……但熱不惡寒而渴者，辛涼平劑銀翹散主之”。方由銀花、連翹、桔梗、薄荷、竹葉、荊芥穗、豆豉、牛蒡子、蘆根、生甘草10味藥組成。適用于溫邪客表，肺衛(wèi)失宣之溫病初起者。以發(fā)熱、微惡風(fēng)寒、口渴、舌邊尖紅苔薄白、脈浮數(shù)為辨證要點(diǎn)。故方中用荊芥穗、豆豉、薄荷解表發(fā)汗；牛蒡子、桔梗、甘草輕宣肺氣；銀花、連翹、竹葉清熱宣透；蘆根生津止渴。方中清熱解毒藥與發(fā)散表邪藥相配伍，共奏疏散風(fēng)熱、清熱解毒之功。而銀翹湯出自《溫病條辨·中焦篇》第13條：“下后無汗脈浮者，銀翹湯主之”。方由銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地6味藥組成，具有滋陰透表之功，主治溫病陽明腑實(shí)證經(jīng)下后，邪氣還在表，津液受損者。因其邪微津又傷，無需象銀翹散那樣用荊、豉解表，桔梗、牛蒡子宣肺，而是用銀花、連翹、竹葉、甘草即勝任清熱宣透之能。因陰津受損，不能增液作汗，故加入生地、麥冬以養(yǎng)陰增液?？傊?，2種方劑均來源于《溫病條辨》，均為解表清熱作用，為常用治療風(fēng)熱感冒用藥，區(qū)別在于，銀翹散為治療表證輕癥，溫病初起，其用藥主要為疏散清熱中藥，有10味中藥，而該方劑的中成藥及臨床研究，歷來文獻(xiàn)較多，受關(guān)注度較高。而銀翹湯為治療溫病中后期，除了表證外，且陰液津液已傷，用藥除疏散清熱藥外，且加了養(yǎng)陰滋陰用藥。方劑有6味中藥。銀翹湯，同樣為名方古方，藥用價(jià)值很大，主治的“溫病陽明腑實(shí)證經(jīng)下后，邪氣還在表，津液受損者”在臨床上，實(shí)際應(yīng)用廣泛，但對(duì)于該方劑的文獻(xiàn)現(xiàn)代研究較少。本研究專利基于這個(gè)原因，有銀翹散的功能，且還有養(yǎng)陰滋陰之功，更應(yīng)該值得研究和關(guān)注。傳統(tǒng)上，該方劑的制備工藝及服用方法主要是水煎服：且傳統(tǒng)的水提工藝參數(shù)沒有，可見，傳統(tǒng)上其工藝粗糙，且服用、攜帶不方便，服用量大，也不適宜加工成其他劑型。有關(guān)銀翹湯的現(xiàn)代制備工藝，提取物研究，文獻(xiàn)上尚無報(bào)道，其新制劑，新藥，新產(chǎn)品開發(fā)，也是無，其主要活性成分在復(fù)方的體現(xiàn)，研究上也是空白，而復(fù)方中連翹主要成分為連翹苷、連翹酯苷等為；金銀花中主要含綠原酸、木犀草苷等為主的皂苷類成分；甘草主要含甘草黃酮及甘草皂苷類成分；地黃也主要含梓醇、毛蕊花糖苷類成分，本專利工藝對(duì)其主要成分進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化和確認(rèn)，同時(shí)進(jìn)行了制劑學(xué)研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服傳統(tǒng)僅水提液的不足，提供銀翹湯方抗病毒中藥提取物的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明包括如下技術(shù)方案：技術(shù)方案1：提供了銀翹湯方中藥提取物的水提取制備方法，以金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，各原料相對(duì)重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；制備方法包括如下步驟：將上述各味藥材凈選，按比例稱取原料，加10～15倍水量浸泡20-30min，加熱提取3次，第一次提取1h，第二次提取45min，第三次提取30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的3～5倍，獲得初步濃縮提取液；進(jìn)一步干燥至相對(duì)密度為1.0～1.2g/cm3的銀翹湯方中藥提取物。技術(shù)方案2：提供了銀翹湯方中藥提取物的醇提取制備方法，以金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，各原料相對(duì)重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；制備方法包括如下步驟：將上述各味藥材凈選，按比例稱取原料，加10～15倍65％～85％乙醇浸泡20-30min，加熱回流提取2次，每次1h，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液的體積為所述原料重量的3～5倍，獲得初步濃縮提取液；進(jìn)一步干燥至相對(duì)密度為1.0～1.2g/cm3銀翹湯方中藥提取物。技術(shù)方案3：提供了銀翹湯方中藥提取物的水提醇沉制備方法，以金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，各原料相對(duì)重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；制備方法包括如下步驟：1)制備濃縮液：將上述各味藥材凈選，按比例稱取原料，加10～15倍水量浸泡20-30min，加熱提取3次，第一次提取1h，第二次提取45min，第三次提取30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的3～5倍，獲得初步濃縮提取液；2)加乙醇沉淀：加適量乙醇到上述制備的初步濃縮提取液中，使溶劑含醇量為65～75％，靜置24小時(shí)，濾過，濾液回收乙醇，得到精制液，濃縮，干燥即得銀翹湯方中藥提取物。技術(shù)方案4：提供了銀翹湯方中藥提取物的大孔樹脂純化制備方法，以金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，各原料相對(duì)重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；制備方法包括如下步驟：1)制備濃縮液：將上述各味藥材凈選，按比例稱取原料，加10～15倍水量浸泡20-30min，加熱提取3次，第一次提取1h，第二次提取45min，第三次提取30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的3～5倍，獲得初步濃縮提取液；2)大孔樹脂純化：分別加3～5倍體積熱水到上步獲得的初步濃縮提取液中，取上清液；將上清液過大孔樹脂柱吸附，棄流出液；然后用1～5bv的水以0.5～2.5bv/小時(shí)的流速洗滌所述吸附柱，棄水洗液；之后采用50～70％的乙醇，洗脫體積3～5bv，以0.5～2.5bv/小時(shí)的流速洗脫吸附柱，收集該乙醇洗脫液，濃縮、干燥所述乙醇洗脫液，獲得銀翹湯方中藥提取物。技術(shù)方案5：提供了銀翹湯方中藥提取物的大孔樹脂純化制備方法，以金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃為原料制成，生地黃又名細(xì)生地，各原料相對(duì)重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃＝5:3:2:1:4:4；制備方法包括如下步驟：1)制備濃縮液：取上各味中藥飲片，按比例稱取原料，加10～15倍65％～85％乙醇浸泡20-30min，加熱回流提取2次，每次1h，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液的體積為所述原料重量的3～5倍，獲得初步濃縮提取液；2)大孔樹脂純化：分別加3～5倍體積熱水到上步獲得的初步濃縮提取液中，取上清液；將上清液過大孔樹脂柱吸附，棄流出液；上樣后先用5bv的水洗滌所述吸附柱，棄水洗液；然后用1～5bv的水以0.5～2.5bv/小時(shí)的流速洗滌所述吸附柱，棄水洗液；之后采用50～70％的乙醇，洗脫體積3～5bv，以0.5～2.5bv/小時(shí)的流速洗脫吸附柱，收集該乙醇洗脫液，濃縮、干燥所述乙醇洗脫液，獲得銀翹湯方中藥提取物。技術(shù)方案6：本發(fā)明的上述方法制備而得的銀翹湯方中藥提取物中，其含有量以重量計(jì)，連翹苷不低于0.035％、連翹酯苷不低于0.042％、綠原酸不低于0.31％、木犀草苷不低于0.09％、甘草苷不低于0.015％、甘草酸不低于0.036％、梓醇不低于0.034％、毛蕊花糖苷不低于0.002％、麥冬總皂苷不低于0.019％。上述成分的含量控制，采用高效液相色譜法(hplc)測(cè)定由制備得到的提取物中連翹苷、連翹酯苷、綠原酸、木犀草苷、甘草苷、甘草酸、梓醇、毛蕊花糖苷的含量，以不低于為對(duì)照品，測(cè)定得到。技術(shù)方案7：提供了含有上述方法制備而得的銀翹湯方中藥提取物的口服固體制劑，其中口服固體制劑包括：片劑、硬膠囊、軟膠囊、顆粒劑、口服液；顆粒劑、硬膠囊以及片劑輔料選自淀粉、糖粉、乳糖、糊精、甜菊糖、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、碳酸氫鈣、甘露醇、羥丙基甲基纖維素、硬脂酸鎂、微粉硅膠、滑石粉、聚乙二醇類等常用輔料；軟膠囊劑輔料選自聚乙二醇(聚乙二醇2000-6000)、蜂蠟、液體石蠟、植物油、甘油、明膠等?？诜狠o料選用β-環(huán)糊精、山梨醇等，其中片劑具體指普通壓制片、包衣片、糖衣片、薄膜衣片。技術(shù)方案8：提供了上述方法制備而得的銀翹湯方中藥提取物在制備抗流感病毒、抗炎藥物或保健品中的應(yīng)用。說明：本發(fā)明中，生地黃，又名細(xì)生地(《溫病條辨》記載為細(xì)生地)。本發(fā)明中，所用的金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃原料均為它們的中藥飲片。本發(fā)明中，所涉及的乙醇的百分濃度單位％均為體積百分濃度％v/v。本發(fā)明具備以下優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明的中藥提取物以金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料制備。其中金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬(lonicerajaponica)及同屬植物干燥花蕾或帶初開的花、連翹為木樨科連翹屬植物連翹(forsythiasuspensa)的干燥果實(shí)、竹葉為禾本科植物淡竹葉(lophatherumgracilebrongn.)的干燥莖葉、甘草為豆科植物甘草(glycyrrhizauralensisfisch.)、脹果甘草(glycyrrhizainflatabat.)或光果甘草(glycyrrhizaglabral.)的干燥根和根莖、麥冬為百合科植物麥冬(ophiopogonjaponicus(l.f)ker-gawl.)的干燥塊根、地黃為玄參科植物地黃(rehmanniaglutinosalibosch.)的新鮮或干燥塊根。獲得的中藥提取物為所含各種藥材活性成分協(xié)同起效的混合物，它不同于活性單體，其藥效也不同于各種藥材活性成分藥效的簡(jiǎn)單加和。2、本發(fā)明的“銀翹湯”方中藥提取物均以金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，經(jīng)查驗(yàn)相關(guān)文獻(xiàn)可知“銀翹湯”處方來源于清朝吳鞠通編著的《溫病條辨》，其具體配方及比例如下:根據(jù)邱隆寫的“中國(guó)歷代度量衡單位量值表及說明”一文中可知，在明朝1兩等于37.3g，相當(dāng)于1錢等于3.73g，按此計(jì)量換算可得每日處方用量為金銀花五錢[18.7g]，連翹三錢[11.2g]，竹葉二錢[7.5g]，生甘草一錢[3.7g]，麥冬四錢[14.9g]，生地黃(細(xì)生地)4錢[14.9g]，各原料相對(duì)重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4。3、本發(fā)明采用了水提、醇提、水提醇沉、大孔樹脂純化等多種方法，從根本上保證“銀翹湯”方中藥湯劑的優(yōu)越性，為制備成高質(zhì)量的不同劑型產(chǎn)品提供保障。本發(fā)明提供的提取物的制備工藝能有效地富集主要活性成分如：連翹苷、連翹酯苷、綠原酸、木犀草苷、甘草苷、甘草酸、梓醇、毛蕊花糖苷等；質(zhì)量控制采用高效液相分析方法進(jìn)行含量測(cè)定，簡(jiǎn)單易控。4、本發(fā)明提供的大孔樹脂純化制備方法中采用樹脂純化方法，該方法簡(jiǎn)便、快捷、重現(xiàn)性好；所選用的大孔樹脂吸附量大，解吸率大，可反復(fù)使用，降低工藝成本；所用的溶劑乙醇，價(jià)廉無毒。經(jīng)大孔樹脂純化的制備方法得到的提取物與原方劑的水煎物相比，體積小、中藥內(nèi)在質(zhì)量高，產(chǎn)品吸潮性減少、穩(wěn)定性增加，容易制成外觀美觀的各種劑型。5、本發(fā)明的制備方法所制備的銀翹湯方中藥提取物具抗炎、抗病毒等功能。而且毒性低，具有很好的用藥安全性，這充分提示了本工藝制備的提取物的臨床用藥的安全性。因此，本發(fā)明中所述的“銀翹湯”方中藥提取物適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。具體實(shí)施方式通過下面的實(shí)施例可以更好的理解本發(fā)明的本質(zhì)，但不以任何方式限制本發(fā)明。材料來源：金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬(lonicerajaponica)及同屬植物干燥花蕾或帶初開的花、連翹為木樨科連翹屬植物連翹(forsythiasuspensa)的干燥果實(shí)、竹葉為禾本科植物淡竹葉(lophatherumgracilebrongn.)的干燥莖葉、甘草為豆科植物甘草(glycyrrhizauralensisfisch.)、脹果甘草(glycyrrhizainflatabat.)或光果甘草(glycyrrhizaglabral.)的干燥根和根莖、麥冬為百合科植物麥冬(ophiopogonjaponicus(l.f)ker-gawl.)的干燥塊根、地黃為玄參科植物地黃(rehmanniaglutinosalibosch.)的新鮮或干燥塊根。其中材料均通過商業(yè)途徑購買。實(shí)施例1水提取方法制備“銀翹湯”方中藥提取物方法1：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以水為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，1.9噸水量浸泡20min，加熱提取3次(第一次1h，第二次45min，第三次30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的3倍，獲得初步濃縮提取液；進(jìn)一步干燥至相對(duì)密度為1.0g/cm3的“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16010106)。方法2：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以水為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，2.85噸水量浸泡30min，加熱提取3次(第一次1h，第二次45min，第三次30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的5倍，獲得初步濃縮提取液；進(jìn)一步干燥至相對(duì)密度為1.2g/cm3的“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16010208)。方法3：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以水為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，2.47噸水量浸泡25min，加熱提取3次(第一次1h，第二次45min，第三次30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的4倍，獲得初步濃縮提取液；進(jìn)一步干燥至相對(duì)密度為1.1g/cm3的“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16010309)。實(shí)施例2醇提取方法制備“銀翹湯”方中藥提取物方法1：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以65％乙醇為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，1.9噸65％乙醇浸泡20min，加熱回流提取2次，每次1h(每次的回流提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，提取液合并，靜置24小時(shí)，過濾取上清液，將上清液濃縮到原藥材的3倍，獲得初步濃縮提取液；進(jìn)一步干燥至相對(duì)密度為1.0g/cm3的“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16020423)。方法2：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以85％乙醇為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，2.85噸85％乙醇浸泡30min，加熱回流提取2次，每次1h(每次的回流提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，提取液合并，靜置24小時(shí)，過濾取上清液，將上清液濃縮到原藥材的5倍，獲得初步濃縮提取液；進(jìn)一步干燥至相對(duì)密度為1.2g/cm3的“銀翹湯”中藥醇提取物(批號(hào)為16020524)。方法3：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以75％乙醇為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，2.47噸75％乙醇浸泡25min，加熱回流提取2次，每次1h(每次的回流提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，提取液合并，靜置24小時(shí)，過濾取上清液，將上清液濃縮到原藥材的4倍，獲得初步濃縮提取液；進(jìn)一步干燥至相對(duì)密度為1.1g/cm3的“銀翹湯”中藥醇提取物(批號(hào)為16020625)。實(shí)施例3水提醇沉方法制備“銀翹湯”方中藥提取物方法1：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以水為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，加1.9噸:噸水量浸泡20min，加熱提取3次(第一次1h，第二次45min，第三次30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的3倍，獲得初步濃縮提取液；邊攪拌邊緩慢加入適量乙醇，使溶劑含醇量為65％，靜置24小時(shí)，濾過，濾液回收乙醇，得到精制液，濃縮，干燥獲得“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16030518)。方法2：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以水為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，加2.85噸水量浸泡30min，加熱提取3次(第一次1h，第二次45min，第三次30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的5倍，獲得初步濃縮提取液；邊攪拌邊緩慢加入適量乙醇，使溶劑含醇量為75％，靜置24小時(shí)，濾過，濾液回收乙醇，得到精制液，濃縮，干燥獲得”銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16030620)。方法3：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以水為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，加2.47噸水量浸泡25min，加熱提取3次(第一次1h，第二次45min，第三次30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的4倍，獲得初步濃縮提取液；邊攪拌邊緩慢加入適量乙醇，使溶劑含醇量為70％，靜置24小時(shí)，濾過，濾液回收乙醇，得到精制液，濃縮，干燥獲得“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16030722)。實(shí)施例4大孔樹脂方法一制備“銀翹湯”方中藥提取物方法1：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以水為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，1.9噸水量浸泡20min，加熱提取3次(第一次1h，第二次45min，第三次30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的3倍，獲得初步濃縮提取液；將初步濃縮提取液加3倍熱水稀釋，加入適量中藥澄清劑殼聚糖，離心，去沉淀，取上清液，上樣于d101大孔樹脂柱(在上樣前分別用酸，堿，水，醇對(duì)樹脂柱進(jìn)行前處理)，上樣后先用1bv純水沖洗，水溶液棄除，改用3bv的50％乙醇洗脫，洗脫液流速為0.5bv/h，收集該乙醇洗脫液。繼續(xù)減壓回收溶劑，收集浸膏，干燥獲得“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16040817)。方法2：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以水為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，2.85噸水量浸泡30min，加熱提取3次(第一次1h，第二次45min，第三次30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的5倍，獲得初步濃縮提取液；將初步濃縮提取液加5倍熱水稀釋，加入適量中藥澄清劑殼聚糖，離心，去沉淀，取上清液，上樣于d101大孔樹脂柱(在上樣前分別用酸，堿，水，醇對(duì)樹脂柱進(jìn)行前處理)，上樣后先用5bv純水沖洗，水溶液棄除，改用5bv的70％乙醇洗脫，洗脫液流速為2.5bv/h，收集該乙醇洗脫液。繼續(xù)減壓回收溶劑，收集浸膏，干燥獲得“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16040927)。方法3：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以水為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，2.47噸水量浸泡25min，加熱提取3次(第一次1h，第二次45min，第三次30min，每次的提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，合并提取液，濃縮獲得的提取液至所述提取液體積為所述原料重量的4倍，獲得初步濃縮提取液；將初步濃縮提取液加4倍熱水稀釋，加入適量中藥澄清劑殼聚糖，離心，去沉淀，取上清液，上樣于d101大孔樹脂柱(在上樣前分別用酸，堿，水，醇對(duì)樹脂柱進(jìn)行前處理)，上樣后先用2.5bv純水沖洗，水溶液棄除，改用4bv的60％乙醇洗脫，洗脫液流速為1.5bv/h，收集該乙醇洗脫液。繼續(xù)減壓回收溶劑，收集浸膏，干燥獲得“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16041021)。實(shí)施例5大孔樹脂方法二制備“銀翹湯”方中藥提取物方法1：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以65％乙醇為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，1.9噸65％乙醇浸泡20min，加熱回流提取2次，每次1h(每次的回流提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，提取液合并，靜置24小時(shí)，過濾取上清液，將上清液濃縮到原藥材的3倍，獲得初步濃縮提取液；將濃縮提取液加3倍熱水稀釋，加入適量中藥澄清劑殼聚糖，離心，去沉淀，取上清液，上樣于d101大孔樹脂柱(在上樣前分別用酸，堿，水，醇對(duì)樹脂柱進(jìn)行前處理)，上樣后先用5bv水(用1％鹽酸調(diào)節(jié)ph為5)洗滌所述吸附柱，棄水洗液；再用中性1bv水溶液洗脫，水溶液棄除，改用3bv的50％乙醇洗脫，洗脫流速為0.5bv/h，收集該乙醇洗脫液。繼續(xù)減壓回收溶劑，收集浸膏，干燥獲得“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16051103)。方法2：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以85％乙醇為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，2.85噸85％乙醇浸泡30min，加熱回流提取2次，每次1h(每次的回流提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，提取液合并，靜置24小時(shí)，過濾取上清液，將上清液濃縮到原藥材的5倍，獲得初步濃縮提取液；將濃縮提取液加5倍熱水稀釋，加入適量中藥澄清劑殼聚糖，離心，去沉淀，取上清液，上樣于d101大孔樹脂柱(在上樣前分別用酸，堿，水，醇對(duì)樹脂柱進(jìn)行前處理)，上樣后先用5bv水(用1％鹽酸調(diào)節(jié)ph為6)洗滌所述吸附柱，棄水洗液；再用中性5bv水溶液洗脫，水溶液棄除，改用洗5bv的70％乙醇洗脫，洗脫流速為2.5bv/h，收集該乙醇洗脫液。繼續(xù)減壓回收溶劑，收集浸膏，干燥獲得“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16051205)。方法3：取金銀花、連翹、竹葉、生甘草、麥冬、生地黃(細(xì)生地)為原料，以75％乙醇為溶劑提取所述原料，各原料重量比為金銀花：連翹：竹葉：生甘草：麥冬：生地黃(細(xì)生地)＝5:3:2:1:4:4；將上述各味藥材凈選，按比例稱取金銀花50公斤、連翹30公斤、竹葉20公斤、生甘草10公斤、麥冬40公斤、生地黃40公斤，2.47噸75％乙醇浸泡25min，加熱回流提取2次，每次1h(每次的回流提取時(shí)間從沸騰后開始計(jì)算)，提取液合并，靜置24小時(shí)，過濾取上清液，將上清液濃縮到原藥材的4倍，獲得初步濃縮提取液；將濃縮提取液加5倍熱水稀釋，加入適量中藥澄清劑殼聚糖，離心，去沉淀，取上清液，上樣于d101大孔樹脂柱(在上樣前分別用酸，堿，水，醇對(duì)樹脂柱進(jìn)行前處理)，上樣后先用5bv水(用1％鹽酸調(diào)節(jié)ph為5.5)洗滌所述吸附柱，棄水洗液；再用中性3bv水溶液洗脫，水溶液棄除，改用洗4bv的60％乙醇洗脫，洗脫流速為1.5bv/h，收集該乙醇洗脫液。繼續(xù)減壓回收溶劑，收集浸膏，干燥獲得“銀翹湯”方中藥提取物(批號(hào)為16051228)。實(shí)施例6“銀翹湯”方中藥提取物的口服制劑制備方法1)“銀翹湯”方中藥提取物顆粒劑的制備處方：(銀翹湯提取物分別取自于實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4、實(shí)施例5的“銀翹湯”方中藥提取物)銀翹湯提取物：500.0g淀粉：200.0g磷酸氫鈣：150.0g糊精：100.0g乳糖：50.0g稱取處方量銀翹湯提取物，加入處方量的輔料，加60％乙醇制軟材，過20目制粒，50～60℃鼓風(fēng)干燥(水份控制在5％～8％)，過16目篩整粒，即得銀翹湯顆粒。2)“銀翹湯”方中藥提取物包衣片的制備處方：(銀翹湯提取物分別取自于實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4、實(shí)施例5的“銀翹湯”方中藥提取物)銀翹湯提取物：500.0g預(yù)膠化淀粉：200.0g微晶纖維素：230.0g甜菊糖：25.0g蔗糖：25.0g硬脂酸鎂：10.0g微粉硅膠：10.0g包衣劑：諾彩tm胃溶包衣劑(適量)稱取處方量的銀翹湯提取物，加入處方量的輔料(硬脂酸鎂、微粉硅膠外加)，加60％乙醇制軟材，過20目制粒，50～60℃鼓風(fēng)干燥(水份控制在5％～8％)，過16目篩整粒，與外加輔料硬脂酸鎂、微粉硅膠混合均勻，壓片，包衣，即得銀翹湯包衣片。3)“銀翹湯”方中藥提取物膠囊劑的制備處方：(銀翹湯提取物分別取自于實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4、實(shí)施例5的“銀翹湯”方中藥提取物)銀翹湯提取物：500.0g羥丙甲纖維素：40.0g(一半外加一半內(nèi)加)預(yù)膠化淀粉：190.0g微晶纖維素：200.0g乳糖：25.0g糖粉：25.0g硬脂酸鎂：10.0g滑石粉：10.0g稱取處方量銀翹湯提取物，加入處方量的輔料(硬脂酸鎂、滑石粉外加)，加60％乙醇制軟材，過20目制粒，50～60℃鼓風(fēng)干燥(水份控制在5％～8％)，過16目篩整粒，與外加輔料硬脂酸鎂、微粉硅膠混合均勻，用充填機(jī)進(jìn)行填充，即得銀翹湯膠囊。4)“銀翹湯”方中藥提取物軟膠囊劑的制備處方：(銀翹湯提取物分別取自于實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4、實(shí)施例5的“銀翹湯”方中藥提取物)銀翹湯提取物：500.0g植物油：140.0g山梨醇：100.0g甘油：50.0g液體石蠟：60.0g明膠：150.0g稱取處方量銀翹湯提取物與處方量的植物油、山梨醇混合均勻，將明膠與甘油分別盛裝于貯液槽中，兩液通過同心管狀的雙層噴頭以不同速度噴出，使一定量的膠液將一定量的藥液包裹后，滴入另一種不相互溶的冷卻液(液體石蠟)中，膠液接觸冷卻液后因表面張力作用變?yōu)榍蛐?，并逐漸凝固而成軟膠囊。5)“銀翹湯”方中藥提取物口服液的制備處方：(銀翹湯提取物分別取自于實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4、實(shí)施例5的“銀翹湯”方中藥提取物)銀翹湯提取物：500.0gβ-環(huán)糊精：140.0g蔗糖：100.0g蒸餾水260.0g稱取處方量銀翹湯提取物，加入處方量的輔料，加蒸餾水溶解，攪拌均勻，即得銀翹湯提取物口服液。實(shí)施例7“銀翹湯”方提取物的活性成分測(cè)定1.色譜條件agilent1260高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器(dad)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，c18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；連翹苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110773-20101)的檢測(cè)波長(zhǎng)：277nm，流動(dòng)相：乙腈-水(25：75)；連翹酯苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110663-20201)的檢測(cè)波長(zhǎng)：330nm，流動(dòng)相：乙腈-0.4％冰醋酸溶液(15：85)；綠原酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110763-20201)的檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm，流動(dòng)相：乙腈-0.4％冰醋酸溶液(13：87)；木犀草苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110709-201206)的檢測(cè)波長(zhǎng)350nm，流動(dòng)相：乙腈-0.5％冰醋酸溶液(梯度洗脫：10：90(0min)～20：80(15min)-20：80(30min)～30：70(40min))；甘草苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111670-200503)、甘草酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111530-200706)的檢測(cè)波長(zhǎng)237nm，流動(dòng)相：乙腈-0.05％磷酸溶液(梯度洗脫：19：81(0min)-19：81(8min)～50：50(35min)～100：0(36min)～19：81(40min))；梓醇(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111857-201l02)的檢查波長(zhǎng)為：210nm，流動(dòng)相：乙腈-0.1％磷酸溶液(1：99)；毛蕊花糖苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111846-201102)的檢查波長(zhǎng)：334nm，流動(dòng)相：乙腈-0.1％醋酸溶液(16:84)；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。麥冬總皂苷的測(cè)定條件：紫外-可見分光光度法，在397nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度2.“銀翹湯”方中藥提取物樣品的制備1)本發(fā)明提取物按本發(fā)明實(shí)例1、2、3、4、5所述的方法分別制得上述中藥提取物各1個(gè)批號(hào)。3.標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制取連翹苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每lml含0.2mg的溶液，即得；取連翹酯苷a對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每lml含0.1mg的溶液，即得(臨用配制)；取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成每lml含40μg的溶液，即得(10℃以下保存)；取木犀草苷對(duì)照品適量，精密稱定，加70％乙醇制成每lml含40μg的溶液，即得；取甘草苷對(duì)照品、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加70％乙酵分別制成每lml含甘草苷20μg、甘草酸銨0.2mg的溶液，即得(甘草酸重量＝＝甘草酸銨重量/1.0207)；取梓醇對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每lml含10μg的溶液，即得；取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每lml含10μg的溶液，即得。取魯斯可皂苷元對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每lml含50μg的溶液，即得。4.測(cè)定方法分別取各批號(hào)的上述中藥提取物樣品適量，精密稱定約10-25mg，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，加甲醇40ml，常溫下超聲30min，取出冷卻到室溫，加甲醇至刻度，搖勻，吸取適量，定容至50ml，搖勻，即可測(cè)定。根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各成分含量。結(jié)果見表1：麥冬總皂苷的測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對(duì)照品溶液0.5ml、lml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分別置具塞試管中，于水浴中揮干溶劑，精密加人高氯酸10ml，搖勻，置熱水中保溫15分鐘，取出，冰水冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在397nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取各批號(hào)的上述中藥提取物樣品適量，精密稱定約10-25mg，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，加甲醇40ml，常溫下超聲30min，取出冷卻到室溫，加甲醇至刻度，搖勻，吸取適量，定容至50ml，搖勻。精密量取供試品溶液2-5ml，置10ml具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中魯斯可皂苷元的重量，計(jì)算，即得。結(jié)果見表1：表1銀翹湯提取物各組分含量測(cè)定結(jié)果故“銀翹湯”方中藥提取物，其含有以重量計(jì)，連翹苷不低于0.035％、連翹酯苷不低于0.042％、綠原酸不低于0.31％、木犀草苷不低于0.09％、甘草苷不低于0.015％、甘草酸不低于0.036％、梓醇不低于0.034％、毛蕊花糖苷不低于0.002％、麥冬總皂苷不低于0.019％。實(shí)施例8“銀翹湯”方中藥提取物的抗炎實(shí)驗(yàn)研究注昆明小鼠170只，分模型組、消炎通、樣品1-1(批號(hào)：16010106)、樣品1-2(批號(hào)：16010208)、樣品1-3(批號(hào)：16010309)、樣品2-1(批號(hào)：16020423)、樣品2-2(批號(hào)：16020524)、樣品2-3(批號(hào)：16020625)、樣品3-1(批號(hào)：16030518)、樣品3-2(批號(hào)：16030620)、樣品3-3(批號(hào)：16030722)、樣品4-1(批號(hào)：16040817)、樣品4-2(批號(hào)：16040927)、樣品4-3(批號(hào)：16041021)、樣品5-1(批號(hào)：16051103)、樣品5-2(批號(hào)：16051205)、樣品5-3(批號(hào)：16051228)共十七組。每組動(dòng)物各10只，各組小鼠連續(xù)灌胃給藥10天，末次給藥后于小鼠右耳涂布二甲苯0.02ml/只致炎。間隔3h后頸椎脫臼法處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑8mm打孔器在兩耳同一部位打下耳片并稱重。結(jié)果見表2。與模型組相比，陽性對(duì)照組、樣品1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1，3-2，3-3，4-1，4-2，4-3，5-1，5-2，5-3對(duì)小鼠耳腫脹度與陰性對(duì)照組有極顯著差異(p<0.05)；說明各樣品顯著的抗炎作用，同時(shí)，樣品4-1，4-2，4-3和5-1，5-2，5-3抗炎效果均強(qiáng)于樣品1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1，3-2，3-3。表2對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(n＝10)組別劑量(g/kg)腫脹度(mg)模型組——7.05±2.12消炎通2.0003.25±1.45***樣品1-11.4006.49±1.12*樣品1-21.4006.46±1.26*樣品1-31.4006.42±1.33*樣品2-11.1006.62±1.12*樣品2-21.1006.58±1.06*樣品2-31.1006.66±1.21*樣品3-10.9005.01±1.17*樣品3-20.9005.08±1.04*樣品3-30.9005.09±1.34*樣品4-10.5304.39±1.23**樣品4-20.5304.32±1.19**樣品4-30.5304.35±1.08**樣品5-10.4504.12±1.37**樣品5-20.4504.17±1.46**樣品5-30.4504.19±1.24**與模型組相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。實(shí)施例9提取物的抗流感病毒實(shí)驗(yàn)研究采用a3型流感病毒液(廣東省微生物研究所提供)感染小鼠為模型，觀察樣品1-1(批號(hào)：16010106)、樣品1-2(批號(hào)：16010208)、樣品1-3(批號(hào)：16010309)、樣品2-1(批號(hào)：16020423)、樣品2-2(批號(hào)：16020524)、樣品2-3(批號(hào)：16020625)、樣品3-1(批號(hào)：16030518)、樣品3-2(批號(hào)：16030620)、樣品3-3(批號(hào)：16030722)、樣品4-1(批號(hào)：16040817)、樣品4-2(批號(hào)：16040927)、樣品4-3(批號(hào)：16041021)、樣品5-1(批號(hào)：16051103)、樣品5-2(批號(hào)：16051205)、樣品5-3(批號(hào)：16051228)及陽性對(duì)照藥(病毒唑)對(duì)感染小鼠肺指數(shù)、肺病變程度的影響，結(jié)果見表3，表明：十五個(gè)樣品均有顯著抑制肺病變程度，顯示該方劑的十五個(gè)樣品均有較好的抗流感病毒效果。同時(shí)，樣品4-1，4-2，4-3和5-1，5-2，5-3抗流感病毒效果均強(qiáng)于樣品1-1，1-2，1-3，2-1，2-2，2-3，3-1，3-2，3-3表3對(duì)流感病毒的作用(n＝10)組別劑量(mg/kg)腫脹度(mg)模型組——1.96±0.12病毒唑組801.08±1.60***樣品1-1601.79±1.56*樣品1-2601.76±1.70*樣品1-3601.73±1.32*樣品2-1601.72±1.03*樣品2-2601.74±1.12*樣品2-3601.70±1.18*樣品3-1601.68±1.04*樣品3-2601.70±1.22*樣品3-3601.65±1.34*樣品4-1601.38±1.41**樣品4-2601.42±1.13**樣品4-3601.36±1.27**樣品5-1601.25±1.31**樣品5-2601.21±1.27**樣品5-3601.27±1.12**與模型組相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。當(dāng)前第1頁12