本發(fā)明涉及苦參堿二聚體A和B在制備抗炎或抗腫瘤藥物制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

苦豆子是豆科槐屬植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)的干燥全草、根及種子，其別名又稱苦甘草、苦豆根、苦豆草等(中國藥學(xué)雜志，1993，26：328-329)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂其能安五臟，定志益精(寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，26：214-217)?？喽棺有院?、味苦、有毒，具有清熱解毒、抗菌消炎作用，民間用其治療胃痛、腹瀉等癥(時珍國醫(yī)國藥，2010，21：2217-2218)。該物種為中國植物圖譜數(shù)據(jù)庫收錄的有毒植物，全草均有毒。其主要分布在寧夏、甘肅、山西、青海、新疆、河南、內(nèi)蒙古、河北、陜西等省區(qū)；國外分布于蒙古、哈薩克斯坦及歐洲部分地區(qū)(甘肅畜牧獸醫(yī)，2008，6：36-37)。長期以來研究證明其具有抗炎、抗癌、保肝、抗病毒、抗心率失常、抑菌以及鎮(zhèn)痛等多種藥理作用。

苦豆子的化學(xué)成分主要是蛋白質(zhì)、糖類、有機酸、黃酮類、色素和生物堿等?？喽棺由飰A屬于喹諾里西啶(Quinolizidine)生物堿，由三價氮原子形成的稠合的二個哌啶環(huán)，又稱雙稠哌啶，仍屬于哌啶或吡啶(Piperdine)的衍生物?？鄥A是苦豆子的生物堿中的其中一種，目前已經(jīng)分離出6種新的苦參堿二聚體，即苦參堿二聚體A-F(或稱之為苦參堿二聚體1-6)，其中苦參堿二聚體A-E是新發(fā)現(xiàn)的天然苦參堿二聚體。在之前研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿二聚體A-F對抗乙肝病毒的作用，至于這些化合物是否還有其他藥效作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供苦參堿二聚體A和B的新用途，所述苦參堿二聚體A和B的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

本發(fā)明的目的之一是提供苦參堿二聚體A或B在制備抗炎藥物制劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之二是提供苦參堿二聚體A或B在制備抗腫瘤藥物制劑的應(yīng)用。

本發(fā)明中所述的抗腫瘤藥物制劑包括肺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、胃癌和食道癌等各種腫瘤的藥物制劑。具體地，所述抗腫瘤藥物制劑可抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞、人鼻咽癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞、人白血病細(xì)胞、人食道癌細(xì)胞、人前列腺癌細(xì)胞、人黑色毒瘤細(xì)胞、人口腔上皮癌細(xì)胞的生長。

所述藥物制劑含有治療有效量的苦參堿二聚體A或B，還包含藥用輔料或其它可配伍的藥物。

所述藥用輔料是指常規(guī)的藥用賦形劑，如溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑和粘合劑中的一種或兩種組合。

所述其它可配伍的藥物，指的是以有效劑量的苦參堿二聚體A或B為藥物原料，再配伍其它天然藥物或化學(xué)藥品。

所述的抗炎藥物制劑或抗腫瘤藥物制劑均包括多種臨床藥物劑型，如膠囊劑、顆粒劑、片劑、注射劑、脂質(zhì)體納米粒、緩釋劑、控釋劑或分散片等。

本發(fā)明目的之三是提供一種藥物組合物。

具體地，所述藥物組合物，含有作為活性成分的權(quán)利要求1的苦參堿二聚體A、其藥學(xué)上可接受的鹽或它們的溶劑合物，以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。

作為本發(fā)明另一個實施例，所述藥物組合物，其含有作為活性成分的權(quán)利要求2的苦參堿二聚體B、其藥學(xué)上可接受的鹽或它們的溶劑合物，以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。

其中，所述藥用賦形劑包括溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑和粘合劑中的一種或兩種以上的組合。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及技術(shù)效果：

(1)本發(fā)明的苦參堿二聚體A和B具有良好的體內(nèi)外抗炎、抗腫瘤活性，具有良好的藥用前景。

(2)本發(fā)明的苦參堿二聚體A和B在治療劑量下未觀察到明顯的毒副作用，尤其是對肝臟、肺和腎臟的毒副作用。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

本發(fā)明實施例用到的苦參堿二聚體A和B均由暨南大學(xué)藥學(xué)院提供，通過UV、MS、¹H NMR和¹³C NMR等光譜方法并結(jié)合文獻(xiàn)(the journal of organic chemistry，2016，81：6273-6280)鑒定其結(jié)構(gòu)，純度經(jīng)HPLC-DAD峰面積歸一化法測得均在98％以上。

實驗例1苦參堿二聚體A對LPS致RAW264.7細(xì)胞炎癥的抑制作用

試驗方法：取5x10⁶個對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，設(shè)空白組、對照組和不同濃度的樣品組，每組設(shè)8個平行孔。置37℃、5％(v/v)CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，加入脂多糖LPS(1μg/ml)預(yù)處理1h后，加入苦參堿二聚體A(10μM)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-6和TNF-α。

試驗結(jié)果苦參堿二聚體A對LPS所致RAW264.7細(xì)胞炎癥具有顯著的抑制作用(表1)。

表1苦參堿二聚體A對LPS所致RAW264.7細(xì)胞炎癥的抑制作用

實驗例2苦參堿二聚體B對LPS致RAW264.7細(xì)胞炎癥的抑制作用

試驗方法：取5x10⁶個對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，設(shè)空白組、對照組和不同濃度的樣品組，每組設(shè)8個平行孔。置37℃、5％(v/v)CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，加入脂多糖LPS(1μg/ml)預(yù)處理1h后，加入苦參堿二聚體B(10μM)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-6和TNF-α。

試驗結(jié)果苦參堿二聚體B對LPS所致RAW264.7細(xì)胞炎癥具有顯著的抑制作用(表2)。

表2苦參堿二聚體B對LPS所致RAW264.7細(xì)胞炎癥的抑制作用

實驗例3苦參堿二聚體A對LPS致大鼠急性肺損傷的抑制作用

試驗方法：雄性Wistar大鼠(180克-220克)隨機分為：對照組，苦參堿二聚體A組。對照組使用生理鹽水(1ml/天)灌胃；苦參堿二聚體A組使用苦參堿二聚體A(40mg/kg/天)腹腔注射。5天之后，苦參堿二聚體A組使用脂多糖LPS(5mg/kg)進(jìn)行氣管滴注，制造急性肺損傷模型。用灌洗液灌洗肺泡后，將灌洗液離心(3000rpm，4℃)10min，ELISA法檢測灌洗液中IL-6、TNF-α。

試驗結(jié)果苦參堿二聚體A對LPS所致大鼠急性肺損傷炎癥具有顯著的抑制作用(表3)。

表3苦參堿二聚體A對LPS所致大鼠急性肺損傷炎癥的抑制作用

實驗例4苦參堿二聚體B對LPS致大鼠急性肺損傷的抑制作用

試驗方法：雄性Wistar大鼠(180克-220克)隨機分為：對照組，苦參堿二聚體B組。對照組使用生理鹽水(1ml/天)灌胃；苦參堿二聚體B組使用苦參堿二聚體B(40mg/kg/天)腹腔注射。5天之后，苦參堿二聚體B組使用脂多糖LPS(5mg/kg)進(jìn)行氣管滴注，制造急性肺損傷模型。用灌洗液灌洗肺泡后，將灌洗液離心(3000rpm，4℃)10min，ELISA法檢測灌洗液中IL-6、TNF-α。

試驗結(jié)果苦參堿二聚體B對LPS所致大鼠急性肺損傷炎癥具有顯著的抑制作用(表4)。

表4苦參堿二聚體B對LPS所致大鼠急性肺損傷炎癥的抑制作用

實驗例5苦參堿二聚體A對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

試驗方法：取10⁶個對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，設(shè)空白組、對照組和不同濃度的樣品組，每組設(shè)8個平行孔。置37℃、5％(v/v)CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度苦參堿二聚體A，繼續(xù)培養(yǎng)48h。于終止前每孔加30μL MTT(5g/L)，作用4h后除去上清液并添加100μL DMSO溶解反應(yīng)產(chǎn)物，使用酶標(biāo)儀在570nm波長處檢測各孔OD值，按下公式計算抑制率：

生長抑制率％＝(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100％

試驗結(jié)果苦參堿二聚體A對多種腫瘤細(xì)胞及其耐藥株的生長均具有顯著抑制作用，并且對不同細(xì)胞具有選擇性的抑制作用(表5)。

表5 MTT法測定苦參堿二聚體A對多種腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用

實驗例6苦參堿二聚體B對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

試驗方法：取10⁶個對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，設(shè)空白組、對照組和不同濃度的樣品組，每組設(shè)8個平行孔。置37℃、5％(v/v)CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度苦參堿二聚體B，繼續(xù)培養(yǎng)48h。于終止前每孔加30μL MTT(5g/L)，作用4h后除去上清液并添加100μL DMSO溶解反應(yīng)產(chǎn)物，使用酶標(biāo)儀在570nm波長處檢測各孔OD值，按下公式計算抑制率：

生長抑制率％＝(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100％

試驗結(jié)果苦參堿二聚體B對多種腫瘤細(xì)胞及其耐藥株的生長均具有顯著抑制作用，并且對不同細(xì)胞具有選擇性的抑制作用(表6)。

表6 MTT法測定苦參堿二聚體B對多種腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用

實驗例7苦參堿二聚體A體內(nèi)抗腫瘤作用

試驗方法：取體重18-22g的裸鼠(購自南方醫(yī)科大學(xué))，隨機分組，每組8只。分別在其右前肢腋下接種人肝癌細(xì)胞Huh 7 1×10⁷個，24小時后腹腔注射給藥，苦參堿二聚體A每天給藥一次，5-氟尿嘧啶(5-Fu，購于北京百靈威科技有限公司)隔天給藥，連續(xù)注射21天后停藥，處死動物，取瘤稱重。抑瘤率按如下公式計算：抑瘤率(％)＝(1–給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％。統(tǒng)計分析采用t檢驗處理，P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。結(jié)果見表7。

表7苦參堿二聚體A對人肝癌細(xì)胞Huh 7裸鼠移植瘤生長的抑制作用(n＝8)

與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01有顯著性差異

試驗結(jié)果：結(jié)果表明，苦參堿二聚體A(20mg/kg/day)對人肝癌細(xì)胞Huh 7裸鼠移植瘤生長有明顯的抑制作用。給藥組和對照組小鼠體重?zé)o明顯差異，未見小鼠外觀、活動狀態(tài)等方面異常，且肝臟、肺及腎臟組織未見明顯變化，說明苦參堿二聚體A的毒副作用較小。

實驗例8苦參堿二聚體B體內(nèi)抗腫瘤作用

試驗方法：取體重18-22g的裸鼠(購自南方醫(yī)科大學(xué))，隨機分組，每組8只。分別在其右前肢腋下接種人肝癌細(xì)胞Huh 7 1×10⁷個，24小時后腹腔注射給藥，苦參堿二聚體B每天給藥一次，5-氟尿嘧啶(5-Fu，購于北京百靈威科技有限公司)隔天給藥，連續(xù)注射21天后停藥，處死動物，取瘤稱重。抑瘤率按如下公式計算：抑瘤率(％)＝(1–給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％。統(tǒng)計分析采用t檢驗處理，P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。結(jié)果見表8。

表8苦參堿二聚體B對人肝癌細(xì)胞Huh 7裸鼠移植瘤生長的抑制作用(n＝8)

與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01有顯著性差異

試驗結(jié)果：結(jié)果表明，苦參堿二聚體B(20mg/kg/day)對人肝癌細(xì)胞Huh 7裸鼠移植瘤生長有明顯的抑制作用。給藥組和對照組小鼠體重?zé)o明顯差異，未見小鼠外觀、活動狀態(tài)等方面異常，且肝臟、肺及腎臟組織未見明顯變化，說明苦參堿二聚體B的毒副作用較小。

實施例9膠囊劑的制備

苦參堿二聚體A或B 2g，乳糖20g，羥甲基淀粉鈉0.1g，淀粉漿適量，硬脂酸鎂0.1g混合，過篩制粒，干燥后混勻裝入膠囊，每個膠囊含苦參堿二聚體A或B 0.02g，每日口服1-2粒，每日兩次。

實施例10片劑的制備

苦參堿二聚體A或B 5g，乳糖200g，淀粉漿適量，硬脂酸鎂1g，混合，過篩，干燥后壓片。每片含苦參堿二聚體A或B 0.02g。每日口服1-2片，每日兩次。

實施例11注射液的制備

苦參堿二聚體A或B 2g，丙二醇50g，研磨，再加少量注射用水稀釋，混勻，然后加入氯化鈉適量，溶解后再加入注射用水至1000ml，調(diào)PH值5.5-6.5，濾過，灌封，滅菌，即得1000支注射用針劑。

實施例12脂質(zhì)體納米粒的制備

苦參堿二聚體A或B 1g，大豆卵磷脂500mg，溶于25ml乙醇中，另取硬脂酸200mg和大豆卵靈脂500mg溶于25ml環(huán)己烷中，混合攪拌均勻。于37℃恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使藥物及輔料在燒瓶壁形成均勻脂質(zhì)薄膜，于真空干燥器中放置過夜，除盡有機溶劑；另取聚乙二醇單硬脂酸酯3750mg,攪拌溶解在175ml水中，加入上述薄膜中，超聲10min，定容至250ml，得淡黃色透明溶液。將此溶液冷凍干燥可得凍干粉。用球磨機研磨24小時，制得粒徑均勻的納米粒，混勻并分裝。每袋含苦參堿二聚體A或B 0.005g?？诜?，一次一袋，每日兩次。

實施例13緩釋劑的制備

將苦參堿二聚體A或B 50g，羥丙基甲基纖維素30g，乳糖10g，加適量粘合劑制備軟材，過20目篩制粒。干燥，整粒，加入硬脂酸鎂0.3g，混合均勻，壓片。每片含苦參堿二聚體A或B 0.005g。每日口服1-2片，每日一次。

實施例14控釋劑的制備

苦參堿二聚體A或B 1g，乳糖40g和淀粉漿適量直接裝到旋轉(zhuǎn)制粒機/包衣器制備顆粒，將稀釋到15％固體的塑化乙基纖維素包衣劑懸浮液噴霧到苦參堿二聚體顆粒的旋轉(zhuǎn)床上。在噴霧期間，用泊洛沙姆188制成的分散體載體膜包衣苦參堿二聚體顆粒，形成平均顆粒度大約為450μm的持續(xù)釋放的顆粒?；靹蜓b入膠囊，每個膠囊含苦參堿二聚體A或B 0.005g，每日口服1-2粒，每日兩次。

實施例15分散片的制備

取苦參堿二聚體A或B 50g，羥乙酸淀粉鈉50g，預(yù)凝膠淀粉340g，低取代羧丙基纖維素25g，糖精鈉3g，薄荷香精3g，混合均勻制粒，并控制粒度在35-80μm范圍內(nèi)，直接壓片。每片含苦參堿二聚體A或B 0.005g。每日口服1-2片，每日兩次。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。