本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于抑制消化道腫瘤干細(xì)胞增殖、分化和干性誘導(dǎo)的藥物。

背景技術(shù)：

隨著對腫瘤異質(zhì)性研究的深入，傳統(tǒng)的克隆演進(jìn)學(xué)說受到新興腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）學(xué)說的挑戰(zhàn)。CSCs學(xué)說認(rèn)為腫瘤組織是由處于不同分化層級的腫瘤細(xì)胞組成的，其中CSCs位于腫瘤細(xì)胞群體的頂端，能僅以10-100個(gè)細(xì)胞即可在宿主體內(nèi)形成一個(gè)與人體腫瘤性質(zhì)相同的腫瘤，是造成腫瘤的異質(zhì)性的根本所在。2006年，美國癌癥研究協(xié)會定義CSCs為存在于腫瘤中的一小群具有自我更新、多向分化潛能及高致瘤性的腫瘤細(xì)胞，也稱腫瘤起始細(xì)胞（tumor initiating cells，TICs）。至今為止，已在白血病、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌等多種腫瘤中分離鑒定出CSCs。愈來愈多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，CSCs除具有自我更新、多向分化和高致瘤特性外，也是腫瘤血管生成、耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的根本所在。臨床常規(guī)的化療藥物，如順鉑、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、卡培他濱等，雖然能殺死腫瘤組織中大多數(shù)亞型的腫瘤細(xì)胞，但對CSCs的抑制或殺死作用則非常有限，甚至?xí)T導(dǎo)部分腫瘤亞型細(xì)胞干性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。因此，靶向CSCs的診斷和治療，有望成為完全防治腫瘤的新途徑，已成為腫瘤研究領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種用于抑制消化道腫瘤干細(xì)胞增殖、分化和干性誘導(dǎo)的藥物的技術(shù)方案。

所述的用于抑制消化道腫瘤干細(xì)胞增殖、分化和干性誘導(dǎo)的藥物，其特征在于含有有效成分小檗堿。

所述的藥物，其特征在于所述的消化道腫瘤干細(xì)胞包括胃癌干細(xì)胞、結(jié)腸癌干細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞。

所述的藥物，其特征在于該藥物為原型藥或其藥學(xué)上可接受的鹽。

所述的小檗堿在制備抑制消化道腫瘤干細(xì)胞增殖、分化和干性誘導(dǎo)的藥物中的應(yīng)用。

所述的應(yīng)用，其特征在于所述的消化道腫瘤干細(xì)胞包括胃癌干細(xì)胞、結(jié)腸癌干細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞。

所述的小檗堿在增加常規(guī)化療藥對消化道腫瘤干細(xì)胞的療效和減少常規(guī)化療藥對消化道腫瘤干細(xì)胞的耐藥性中的應(yīng)用。

所述的小檗堿在減少常規(guī)化療藥引起的消化道腫瘤干細(xì)胞干性增強(qiáng)中的應(yīng)用。

所述的一種增加常規(guī)化療藥對消化道腫瘤干細(xì)胞的療效和減少常規(guī)化療藥對消化道腫瘤干細(xì)胞的耐藥性的藥物，其特征在于含有小檗堿和化學(xué)化療藥。

所述的一種減少常規(guī)化療藥引起的消化道腫瘤干細(xì)胞干性增強(qiáng)的藥物，其特征在于含有小檗堿和化學(xué)化療藥。

本發(fā)明一方面提供了一種抑制消化道腫瘤干細(xì)胞增殖、分化和干性誘導(dǎo)的藥物，該藥物能夠抑制消化道腫瘤干細(xì)胞的增值、轉(zhuǎn)移和分化，并且該藥物能夠減少常規(guī)化療藥物所引起的腫瘤細(xì)胞干性化；本發(fā)明另一方面提供了小檗堿的一種新用途。

附圖說明

圖1為熒光定量 PCR 檢測各腫瘤細(xì)胞及其干細(xì)胞中干性基因的表達(dá)；

圖2 為小檗堿和順鉑對原代腫瘤細(xì)胞及其腫瘤干細(xì)胞的抑制作用；

圖3為小檗堿對腫瘤干細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用；

圖4為小檗堿對裸鼠皮下腫瘤組織生長的抑制作用；

圖5為小檗堿對荷瘤裸鼠體重變化的影響；

圖6為小檗堿對裸鼠皮下腫瘤組織中相關(guān)基因表達(dá)的影響；

圖7 為小檗堿對腫瘤干細(xì)胞化療敏感性的作用。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1 腫瘤干細(xì)胞的分離鑒定

人胃腺癌細(xì)胞系 SGC7901、MKN28；人結(jié)腸癌HT29、SW620；人肝癌細(xì)胞系Huh7、SMMC-7721，使用本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞凍存庫。

本研究采用國際常用的無血清饑餓培養(yǎng)法，從現(xiàn)有細(xì)胞系中分離、富集腫瘤干細(xì)胞。具體操作如下：分別取對數(shù)生長期的上述各類型的癌細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，分別制成單細(xì)胞懸液，使用 PBS 洗滌離心去除殘留的血清后，作細(xì)胞計(jì)數(shù)，取 2 萬個(gè)細(xì)胞接種于 10 cm 超低粘附培養(yǎng)皿中，添加含 B27（1×）及 EGF 5ng/ml 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基 10 ml，培養(yǎng) 3-5 天，即可見有細(xì)胞球生長，為第一代腫瘤干細(xì)胞球；每隔 5 天對細(xì)胞球進(jìn)行傳代，用移液器吹打細(xì)胞球以求吹散細(xì)胞球，注意操作輕柔，盡量吹打成單個(gè)細(xì)胞；離心收集細(xì)胞球，按 1:3 比例傳代接種于 DMEM/F12 干細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，到 10-14 天時(shí)，吹打細(xì)胞球成單細(xì)胞，離心后接種于含 10% FBS 的完全培養(yǎng)基中，貼壁 1h，去除沒有貼壁的凋亡細(xì)胞，使用貼壁細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

分別取各類型腫瘤干細(xì)胞適量，提取總RNA，進(jìn)行cDNA合成，PCR 反應(yīng)條件如下：

a．定量引物：

b．定量反應(yīng)程序

反應(yīng)體系：cDNA 1μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、2xSYBR mix 10μl、水8μl，總量為20μl。

反應(yīng)程序：

預(yù)變性 95℃ 1min，變性 95℃ 10sec，退火55℃ 10sec，延伸 72℃ 30sec，40 個(gè)循環(huán)。在循環(huán)結(jié)束后立即進(jìn)行融解曲線測定，檢測溫度為 65℃-95℃，升溫速率為 0.5℃/sec，恒溫時(shí)間為 1sec/次。

經(jīng)無血清饑餓培養(yǎng)法，大部分腫瘤細(xì)胞死亡，少數(shù)細(xì)胞團(tuán)抱成球生長；收集細(xì)胞球（即為腫瘤干細(xì)胞CSC），按 1:3 比例傳代接種于 DMEM/F12 干細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增至所需實(shí)驗(yàn)數(shù)量。采用熒光定量PCR技術(shù)，比較CSC和原代細(xì)胞系細(xì)胞中的干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Klf4、Oct4、NANOG、Sox2 以及干性相關(guān)基因 Bmi-1 的表達(dá)。結(jié)果如圖1顯示，各細(xì)胞系誘導(dǎo)的腫瘤干細(xì)胞中Klf4、Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1的表達(dá)均顯著高于原代細(xì)胞系的表達(dá)，證明這些細(xì)胞球具有干細(xì)胞特性。

根據(jù)干性基因表達(dá)鑒定結(jié)果，選取干性基因表達(dá)最高的第三代誘導(dǎo)細(xì)胞球(CSC-3)，輕輕吹打制備成單細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至200ul 中含所需細(xì)胞數(shù)(見表1)，用無菌注射器將 200μl 細(xì)胞懸液接種于 4～6 周齡裸鼠腋下或者腹股溝(裸鼠均為雄性)，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)無菌條件的 ICU 單元，每隔 3-5 天觀察動物生長及成瘤情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，在裸鼠體內(nèi) 1×10⁴-5×10⁴個(gè)腫瘤干細(xì)胞即可引起腫瘤的發(fā)生；而原代腫瘤細(xì)胞需在5×10⁶個(gè)細(xì)胞數(shù)目的條件下接種，才能引起小鼠皮下腫瘤生長。證明本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的腫瘤干細(xì)胞比原代腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的致癌特性。

表1裸鼠皮下移植不同腫瘤細(xì)胞數(shù)的成瘤情況

注：- 表示未檢測；m/n，m表示成瘤的裸鼠數(shù)量，n表示用于實(shí)驗(yàn)的裸鼠數(shù)量。

實(shí)施例2 小檗堿對原代腫瘤細(xì)胞及其腫瘤干細(xì)胞的體外抑制作用

選用對數(shù)生長期的貼壁腫瘤干細(xì)胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI l640培養(yǎng)基配成50000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μl，37℃，5％CO2培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度藥物的無血清培養(yǎng)基，對照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設(shè)3-6個(gè)平行孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)48h。每孔加入20 μl新鮮配制的含0.2 mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸去上清，并加入150 μl DMSO，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗(yàn)波長為570 nm，參比波長為450 nm測定光密度值。

圖2結(jié)果所示，在同等給藥劑量（50μM）下, 小檗堿無論是對原代腫瘤細(xì)胞，還是對腫瘤干細(xì)胞體外增殖的抑制作用均明顯高于順鉑；而順鉑對腫瘤干細(xì)胞體外增殖的抑制作用明顯弱于對原代腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用，但小檗堿則對兩者的抑制作用基本相當(dāng)；此外，兩者聯(lián)合給藥后（各25μM劑量），可提高對原代腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的抑制作用。證明小檗堿可以顯著抑制腫瘤干細(xì)胞的體外增殖，且與順鉑聯(lián)用，可以提高順鉑的化療效果。

實(shí)例3 小檗堿對腫瘤干細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

各腫瘤干細(xì)胞分別用含10%FBS1640培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)24h后，分別用小檗堿(50μM)、順鉑(50μM)、小檗堿+順鉑(25μM+25μM)聯(lián)合用藥處理24h后，每組收集細(xì)胞1x10⁵ cells，用PBS清洗兩次，用1x Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5μl FITC Annexin V和5μl PI輕輕混勻，25°C處理15min后進(jìn)行流式分析。每組樣品平行檢測5次。

圖3結(jié)果所示，小檗堿可誘導(dǎo)各腫瘤干細(xì)胞發(fā)生凋亡，其細(xì)胞凋亡率均在50%以上，而順鉑誘導(dǎo)各腫瘤干細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用則相對較弱；小檗堿和順鉑聯(lián)用后，可明顯增加腫瘤干細(xì)胞的凋亡率，證明小檗堿對化療藥的腫瘤干細(xì)胞抑制具有增效作用。

實(shí)例4 小檗堿對裸鼠皮下腫瘤組織生長的抑制作用

根據(jù)實(shí)例1移植瘤結(jié)果，分別選取干性基因表達(dá)最高的第三代誘導(dǎo)的腫瘤干細(xì)胞，輕輕吹打制備成單細(xì)胞懸液，500 rcf離心 5 min 收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，再以PBS重懸細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，用無血清培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至200μl，其所含細(xì)胞數(shù)為5×10⁴個(gè)腫瘤干細(xì)胞，用無菌注射器將 200μl 細(xì)胞懸液接種于 4 周齡雄性裸鼠腋下或者腹股溝，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)無菌條件的ICU單元，每隔 3-5 天觀察動物生長及成瘤情況。觀察成瘤裸鼠瘤塊體積約100mm³大小開始給藥，實(shí)驗(yàn)設(shè)置成瘤不給藥對照組、小檗堿治療組(10mg/kg)、順鉑治療組(10mg/kg)、卡培他濱(1000mg/kg)，每3天給藥一次，共給藥6次。每次給藥后觀察記錄實(shí)驗(yàn)組裸鼠體重和瘤體體積變化。

圖4結(jié)果所示，小檗堿在10mg/kg的給藥劑量下能顯著抑制各裸鼠皮下腫瘤的體積，且作用強(qiáng)于順鉑（10mg/kg）。圖5結(jié)果所示，與模型組相比較，小檗堿治療組荷瘤裸鼠鼠體重相對略重，而順鉑給藥組體重明顯減輕，證明小檗堿毒對荷瘤裸鼠的毒副作用相對較小。

實(shí)例5 小檗堿對裸鼠皮下腫瘤組織中相關(guān)基因表達(dá)的影響

分別取各組腫瘤干細(xì)胞適量，提取總RNA，進(jìn)行cDNA合成。根據(jù)實(shí)例1的PCR條件和引物序列，采用熒光定量PCR技術(shù)，測定各組腫瘤組織中相關(guān)干性基因Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1 mRNA的表達(dá)。盡管如實(shí)例4中圖4結(jié)果所示，給予順鉑治療后可明顯縮小干細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤大小，但結(jié)果如圖6顯示，各順鉑給藥組腫瘤組織中Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1 mRNA的表達(dá)均顯著高于對照組腫瘤組織的表達(dá)，證明順鉑可誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞的干性增強(qiáng)，對于后續(xù)腫瘤的耐藥、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)增加風(fēng)險(xiǎn)性；而給予小檗堿治療后，腫瘤組織中的Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1mRNA的表達(dá)均顯著高于對照組和順鉑給藥組腫瘤組織的表達(dá)，證明小檗堿可逆轉(zhuǎn)腫瘤干細(xì)胞干性的表達(dá)。

實(shí)例6 化療敏感性實(shí)驗(yàn)

將無血清富集的腫瘤干細(xì)胞收集于15ml的離心管中，在水平離心機(jī)上以1000rpm離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，利用ACCUTASE細(xì)胞消化液置于37°C消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔3000個(gè)細(xì)胞的密度均勻種植于96孔板，每板中各種細(xì)胞分別5個(gè)復(fù)孔，每孔100μl的無血清培養(yǎng)基，低粘附96孔板在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；種板后第1天，去除培養(yǎng)基，更換為含有不同濃度梯度順鉑（DDP）的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；取出96孔板，MTT每孔20μl，輕輕搖晃后將培養(yǎng)板至于細(xì)胞培養(yǎng)箱；4h后將培養(yǎng)板至680型酶標(biāo)儀檢測490nm吸光度值。

對化療藥物耐藥也是腫瘤干細(xì)胞的特征之一。因此，耐藥是腫瘤復(fù)發(fā)的根源，也是腫瘤治療的難點(diǎn)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的順鉑體外抑制腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度（IC₅₀值）在10μg/ml左右，而圖7結(jié)果所示，在該劑量下，順鉑對各腫瘤干細(xì)胞的抑制作用僅20%以下，即高達(dá)80%的腫瘤干細(xì)胞仍存活，證明各腫瘤干細(xì)胞對順鉑的耐藥性明顯增加，而在同等條件下，給予小檗堿處理，對各腫瘤干細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于順鉑，證明小檗堿具有更強(qiáng)的抗腫瘤干細(xì)胞耐藥性的特點(diǎn)。