本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程技術(shù)領(lǐng)域,特別是軟骨修復(fù)材料制備技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料及其制備方法。
背景技術(shù):
軟骨是覆蓋在關(guān)節(jié)之間的結(jié)蹄組織,由于其缺少血管、干細胞和生長因子,因此其一旦受損就難以復(fù)原。治療軟骨缺損主要治療方法是通過手術(shù)治療或組織工程技術(shù)。手術(shù)治療最常見的包括關(guān)節(jié)鏡清創(chuàng)術(shù)、骨髓刺激治療和軟骨及軟骨細胞移植,但均存在缺陷,如關(guān)節(jié)鏡清創(chuàng)手雖對早期關(guān)節(jié)炎效果顯著,但缺乏長期的療效;骨髓刺激治療只能緩解軟受損帶來的痛苦但不能治愈損傷;自體移植則受到供體來源所限,難以實現(xiàn)大面積的軟骨缺損修復(fù),異體軟骨移植則會出現(xiàn)免疫排異等不良反應(yīng)。
組織工程軟骨要求將細胞培養(yǎng)、生物支架材料和生長因子三者結(jié)合,但目前在細胞選擇、支架制作、生長因子的負載和釋放等各方面均需深入研究。其中一個難點就是外源性生長因子在體內(nèi)半衰期短,不利于細胞增殖和分化。目前,有多種控釋方式被用于軟骨組織工程中,如水凝膠包埋,微球負載等,但這些方法均存在著不足之處。首先,常規(guī)方法制備的水凝膠或者微球其孔隙率,結(jié)構(gòu)尺寸和微孔結(jié)構(gòu)的連通性均只能控制在一定范圍而不能精確在某一特定數(shù)值。而在生長因子負載到支架材料時,由于人為操作的影響,生長因子的負載率有一定隨機性。在整個制備的的過程中,需要先制成支架材料,再進行生長因子負載,整個過程所需時間較長。雖然上述的傳統(tǒng)的組織工程軟骨修復(fù)材料的制備方法簡單,但是在組織結(jié)構(gòu)、生物學性能與軟骨組織存在差距。
三維打印技術(shù)(3D-printing)在生物組織工程中的研究國內(nèi)外已有大量的研究報道,其中生物三維打印已在個性化醫(yī)療模型、仿生支架、藥物緩釋模式等方面應(yīng)用,這為軟骨修復(fù)材料的發(fā)展帶來了新方向。生物三維打印其所打印的材料主要是以細胞、生物材料或是生長因子,利用計算機輔助軟件建模后,控制打印機沉積細胞或者生物材料的速度和位置,來實現(xiàn)仿生活性支架或是仿生材料的制造。在組織工程的應(yīng)用上,生物三維打印能一步到位地根據(jù)實際所需精準地構(gòu)建修復(fù)材料的內(nèi)外結(jié)構(gòu),而且能使生長因子均勻分布,所構(gòu)建的組織修復(fù)材料與正常人體組織高度相似。而且采用生物三維打印來制備組織工程軟骨,可以克服支架制備耗時長,精度不高等問題。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白是目前發(fā)現(xiàn)唯一能夠單獨誘導成骨生長的生長因子,其中BMP-2的成骨能力最為突出。而基因重組后所得的rhBMP-2在誘導成骨時間、成骨的量、血管和骨髓樣組織形成等方面明顯優(yōu)于天然BMP-2。BMP-2參與BMP-2/Smads/Msx2/Osterix信號通路和BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信號通路,通過激活Smads信號,轉(zhuǎn)導和調(diào)節(jié)成骨基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其成骨作用;能誘導間充質(zhì)細胞向軟骨細胞分化,使新生軟骨內(nèi)的蛋白多糖和膠原纖維的含量更加趨近正常軟骨細胞合成的Ⅱ型膠原和蛋白多糖含量,長期維持體外培養(yǎng)的軟骨細胞表型。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的組織工程軟骨修復(fù)材料制備精度不高,生物活性成分分布不均,材料制備需時過長等缺陷,提供一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料及其制備方法,該軟骨修復(fù)材料免疫原性低,材料來源豐富,具有良好的生物相容性,骨誘導能力和血管化能力。本發(fā)明通過三維打印技術(shù)制備得到的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料,可根據(jù)受損部位實際情況進行建模,能真正地達到個性化治療。
為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料為多層矩形結(jié)構(gòu),由海藻酸鈉和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBMP-2)構(gòu)成。
進一步的,所述的軟骨修復(fù)材料按重量份數(shù)計由海藻酸鈉10份和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBMP-2)0.01~0.1份組成。
優(yōu)選的,所述的海藻酸鈉的分子量為2~3×105g/mol,購自美國Sigma公司,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBMP-2)購自美國PeproTech公司。
為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的另一技術(shù)方案為:一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料的制備方法,所述的制備方法通過以下步驟實現(xiàn):凝固收集平臺的準備;生物活性打印材料的制備;通過3D打印機技術(shù)將生物活性打印材料打印在凝固收集平臺上,層層累加后,形成多層矩形結(jié)構(gòu)的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料。
進一步的,所述凝固收集平臺的制備具體步驟為:在一次性細胞培養(yǎng)皿中,加入質(zhì)量濃度為0.5%的聚乙烯亞胺溶液至剛好浸沒培養(yǎng)皿的底部,將盛有聚乙烯亞胺溶液的培養(yǎng)皿置于37℃的細胞培養(yǎng)箱中放置24小時,使培養(yǎng)皿內(nèi)壁覆蓋上聚乙烯亞胺層,將培養(yǎng)皿中多余的聚乙烯亞胺溶液棄去,用去離子水沖洗培養(yǎng)皿2~3次;再加入質(zhì)量濃度為2%的氯化鈣溶液,加入氯化鈣溶液的體積為培養(yǎng)皿容積的二分之一,將盛有氯化鈣溶液的培養(yǎng)皿置于3D打印機的工作平臺上,形成凝固收集平臺。
更進一步的,所述生物活性打印材料的制備具體如下:
(1)按配方量將海藻酸鈉溶于去離子水中,配成質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉溶液;
(2)按配方量將干態(tài)的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBMP-2)加入去離子水中,配成質(zhì)量濃度為2% 的rhBMP-2生長因子溶液;
(3)將步驟(2)配成的rhBMP-2生長因子溶液與步驟(1)配成的海藻酸鈉溶液等體積混合,得到生物活性打印材料。
優(yōu)選的,所述的3D打印機技術(shù)采用氣體動力噴射打印,溫度控制在35~37℃,通過CAD或Solidwords 電腦輻照軟件建立打印模型。
優(yōu)選的,所述的聚乙烯亞胺的分子量為25kD。
本發(fā)明的有益效果為:
(1)本發(fā)明公開的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料具有免疫原性低,原材料豐富,價格低廉,制備方法簡單的優(yōu)點。
(2)本發(fā)明以海藻酸鈉作為軟骨修復(fù)材料的基質(zhì),與重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBMP-2)復(fù)合后,利用三維打印技術(shù)進行仿生打印,這不僅克服了傳統(tǒng)軟骨修復(fù)材料因為沒有生物活性而不能達到真正地修復(fù)治療效果,同時通過三維打印技術(shù)所制得的軟骨修復(fù)材料,可以根據(jù)患者受損部位實際情況建模,能真正達到個性化治療。
(3)本發(fā)明制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料,是采用生物三維打印技術(shù),通過將基質(zhì)材料和生長因子復(fù)合后再進行仿生打??;相比于傳統(tǒng)的組織工程軟骨材料制備方法,本發(fā)明所公開的制備方法具有支架微結(jié)構(gòu)精確成型,生長因子在支架中能均為分布,且能達到緩釋效果,能有效克服外源性生長因子在體內(nèi)半衰期短的難題。
附圖說明
圖1為實施例1~3所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料與對比例的rhBMP-2體外釋放實驗結(jié)果對比圖;
圖2為實施例1~3所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料與對比例的ALP值檢測結(jié)果對比圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的說明。
實施例1
一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料為多層矩形結(jié)構(gòu),由海藻酸鈉和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白構(gòu)成;按重量份數(shù)計由海藻酸鈉10份和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白0.01份組成;所述的海藻酸鈉的分子量為2~3×105g/mol,購自美國Sigma公司,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白購自美國PeproTech公司。
實施例2
一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料為多層矩形結(jié)構(gòu),由海藻酸鈉和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白構(gòu)成;按重量份數(shù)計由海藻酸鈉10份和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白0.05份組成;所述的海藻酸鈉的分子量為2~3×105g/mol,購自美國Sigma公司,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白購自美國PeproTech公司。
實施例3
一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料為多層矩形結(jié)構(gòu),由海藻酸鈉和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白構(gòu)成;按重量份數(shù)計由海藻酸鈉10份和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白0.1份組成;所述的海藻酸鈉的分子量為2~3×105g/mol,購自美國Sigma公司,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白購自美國PeproTech公司。
實施例4
實施例1~實施例3任一例一種具有生物活性的軟骨修復(fù)材料,其制備方法的具體步驟如下:
(1)凝固收集平臺的準備:在一次性細胞培養(yǎng)皿中,加入質(zhì)量濃度為0.5%的聚乙烯亞胺溶液至剛好浸沒培養(yǎng)皿的底部,將盛有聚乙烯亞胺溶液的培養(yǎng)皿置于37℃的細胞培養(yǎng)箱中放置24小時,使培養(yǎng)皿內(nèi)壁覆蓋上聚乙烯亞胺層,將培養(yǎng)皿中多余的聚乙烯亞胺溶液棄去,用去離子水沖洗培養(yǎng)皿2~3次;再加入質(zhì)量濃度為2%的氯化鈣溶液,加入氯化鈣溶液的體積為培養(yǎng)皿容積的二分之一,將盛有氯化鈣溶液的培養(yǎng)皿置于3D打印機的工作平臺上,形成凝固收集平臺,待用;所述的聚乙烯亞胺的分子量為25kD;
(2)生物活性打印材料的制備:按配方量將海藻酸鈉溶于去離子水中,配成質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉溶液;按配方量將干態(tài)的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBMP-2)加入去離子水中,配成質(zhì)量濃度為2% 的rhBMP-2生長因子溶液;將配成的rhBMP-2生長因子溶液與配成的海藻酸鈉溶液等體積混合,得到生物活性打印材料,備用;
(3)軟骨修復(fù)材料的打?。和ㄟ^CAD或Solidwords 電腦輻照軟件建立打印模型,3D打印機采用氣體動力噴射打印方式,溫度控制在35~37℃,將步驟(2)制備的生物活性打印材料打印在步驟(1)制備的凝固收集平臺上,層層累加后,形成多層矩形結(jié)構(gòu)的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料。
實施例5
對比例:為負載了rhBMP-2的海藻酸鈉/殼聚糖復(fù)合軟骨修復(fù)材料(支架材料參考申請?zhí)枮镃N201310641686.8所公開的軟骨組織工程支架材料及其制備方法的制備方法所制得,再將rhBMP-2負載到海藻酸鈉/殼聚糖軟骨修復(fù)材料上)。
實驗組1~3:為實施例1~3所得的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料,采用實施例4的方法制備而成。
將上述實施例1~3所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料與對比例進行rhBMP-2釋放實驗,對比實施例1~3和對比例對創(chuàng)面的修復(fù)效果。實驗結(jié)果如圖1示。
從上圖結(jié)果可知,對比例從實驗開始至rhBMP-2完全釋放均較同時間點的實驗組1~3的釋放率高,且在5天到10天這段時間有一個明顯的突釋過程,到16天時已完全釋放,不能達到長效持續(xù)釋放的效果。而實施例1~3雖然在5-7天、15-20天這兩個時間段分別有兩個突釋的過程,但之后均有一個緩釋的平臺期,整個釋放過程屬于緩釋過程。由此可見,本發(fā)明通過3D打印機技術(shù)所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料,具有長效持續(xù)釋放rhBMP-2的效果,能克服rhBMP-2在體內(nèi)半衰期短的不足之處。
實施例6
對比例:為負載了rhBMP-2的海藻酸鈉/殼聚糖復(fù)合軟骨修復(fù)材料(支架材料參考申請?zhí)枮镃N201310641686.8所公開的軟骨組織工程支架材料及其制備方法的制備方法所制得,再將rhBMP-2負載到海藻酸鈉/殼聚糖軟骨修復(fù)材料上)。
實驗組1~3:為實施例1~3所得的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料,采用實施例4的方法制備而成。
將上述實施例1~3所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料與對比例分別與MG-63(人成骨肉瘤細胞)進行共培養(yǎng)7天后對其ALP值進行檢測,以此評價實施例1~3和對比例的成骨誘導能力。實驗結(jié)果如圖2示。
堿性磷酸酶(alkaline phosphate ALP)是分化成骨細胞的標志物,能促進骨基質(zhì)的礦化。從上圖可知,與對比例相比,實施例1~3的ALP值明顯較對比例要高。由此可見,本發(fā)明通過3D打印機技術(shù)所制備的具有生物活性的軟骨修復(fù)材料具有較高的骨誘導能力。
顯然,本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例,而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定;對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動,這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉;凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等,均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。