本發(fā)明屬于腫瘤治療及成像藥物制備領(lǐng)域，具體涉及一種PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

光熱治療是一種新興的抗腫瘤治療手段，通過光熱吸收劑有效地吸收近紅外光并將一部分能量轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞不耐受的43℃以上的過高熱，而正常細(xì)胞由于對該溫度耐受可有效避免傷害。將光熱材料應(yīng)用于腫瘤部位并配合局部近紅外照射，即可達(dá)到治療局部腫瘤并減少全身毒性的目的。

作為光熱治療的基本因素，光熱物質(zhì)能否在近紅外光區(qū)域(650-950nm)有較強光吸收光熱治療的效果有很強的影響。金納米材料由于具有局部表面等離子共振吸收及其吸收的可調(diào)控性，而被作為光熱材料廣泛用于腫瘤的光熱治療研究中。近年來有一系列將金和其它金屬制成合金的報道，制得的合金可顯著調(diào)節(jié)金納米材料的光吸收特性并有效提高材料的光熱轉(zhuǎn)換特性。空心金納米球作為一種特殊的納米金材料，由于具有載藥量高，比表面積大以及在近紅外區(qū)吸收可控等優(yōu)點，受到研究者的廣泛關(guān)注。目前關(guān)于將空心金納米球與其他金屬形成納米粒及其光熱效果的研究尚未報道。

高分子材料聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-交替-共-(1，4-苯并-{2，1’，3}-噻二唑)](PFBT，分子量10000-100000)(實施例用上述范圍表示)是一類具有發(fā)光性質(zhì)的π-共軛物質(zhì)，由于其具有發(fā)光能力強以及良好的光穩(wěn)定性和生物相容性等優(yōu)點，近年來有將其應(yīng)用于近紅外成像指導(dǎo)的腫瘤治療中的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備鈷單質(zhì)膠體溶液；

(2)將步驟(1)獲得的鈷單質(zhì)膠體溶液和HAuCl₄溶于水中，在氮氣流保護(hù)下攪拌1-2h，加入CuCl₂，在氮氣流保護(hù)下攪拌反應(yīng)1-2h,通空氣，獲得深藍(lán)色的含空心金銅納米粒的液體，8000-12000rpm離心10-15min，冷凍干燥即得空心金銅納米粒粉末；

(3)將0.75-1.25μmol空心金銅納米粒粉末溶于5-10mL 20％-50％的氯仿甲醇溶液中，加入20-100μg PFBT，室溫下12000-14000rpm攪拌10-12h，離心15-20min，除去上層甲醇和氯仿溶劑，沉淀在真空狀態(tài)下靜置6-12小時除去殘余溶劑，用5mL水超聲分散5min，即得到PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液；

所述PFBT為聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-交替-共-(1，4-苯并-{2，1’，3}-噻二唑)]的縮寫。

所述步驟(2)優(yōu)選為：按比例，將3mL 4×10^-4M鈷單質(zhì)膠體溶液和0.75-1.25μmol HAuCl₄溶于10mL水中，在氮氣流保護(hù)下攪拌1-2h，加入0.3-7.5μmol CuCl₂，在氮氣流保護(hù)下攪拌反應(yīng)1-2h,通空氣，獲得深藍(lán)色的含空心金銅納米粒的液體，8000-12000rpm離心10-15min，冷凍干燥即得空心金銅納米粒粉末。

上述方法制備的PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液。

PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

有益效果

(1)本制備方法簡單易行，容易操控，所需原料方便易得，實驗重現(xiàn)性好。

(2)本發(fā)明通過將疏水性PFBT結(jié)合于空心金銅納米粒上，可克服其生物利用度差的問題并將其應(yīng)用于腫瘤近紅外實時成像治療。

(3)本發(fā)明制備的PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液具有相對于空心金納米粒增強的近紅外吸收特性和熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)，可應(yīng)用于對腫瘤的光熱治療。

(4)本發(fā)明制備的PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液具有良好的生物利用度和生物相容性，光可調(diào)控的熒光特性，可用于近紅外腫瘤實時追蹤成像指導(dǎo)的可視化光熱治療。

附圖說明

圖1(a)HGNs和HGCNs膠體溶液的紫外可見光譜圖；(b)PFBT-HGCNs和HGCNs膠體溶液的紫外可見光譜圖；

圖2(a)為HGNs的電鏡圖；(b)為HGNs的粒徑分布圖；

圖3(a)為HGCNs的電鏡圖；(b)為HGCNs的粒徑分布圖；

圖4(a)為PFBT-HGCNs的電鏡圖；(b)為PFBT-HGCNs的粒徑分布圖。

圖5為HGCNs和PFBT-HGCNs膠體溶液的光熱升溫曲線；

圖6為PFBT-HGCNs在光照和不光照的情況下在不同時間點的細(xì)胞內(nèi)的攝取熒光分布以及近紅外成像性能；

圖7為圖6為MTT法測試的小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)經(jīng)過磷酸緩沖液(PBS,pH＝7.4,對照)以及HGNs加NIR光照,HGCNs加NIR光照,PFBT-HGCNs(給予或不給予NIR光照)處理24小時后的細(xì)胞活力；

圖8為PBS，HGNs,HGCNs和PFBT-HGCNs膠體溶液經(jīng)小鼠靜脈注射6小時后，于腫瘤局部施加NIR光照5分鐘后的近紅外熱成像圖；

圖9為實施例9中不同樣品處理后的治療效果圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。除特別標(biāo)明外，所用試劑和測試設(shè)備均為市售。

PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液簡稱：PFBT-HGCNs。

空心金銅納米粒膠體溶液簡稱：HGCNs。

空心金納米粒膠體溶液簡稱：HGNs。

實施例1

一種鈷單質(zhì)膠體溶液的制備，(采用氧化還原法，本方法是文獻(xiàn)中報道過的)包括以下步驟：

取4×10^-3mmol氯化鈷與1.6×10^-2mmol檸檬酸鈉溶于10mL水中，通氮氣并混合均勻得混合液；取1×10^-4mmol硼氫化鈉加入到上述混合液中，混合均勻，靜置1h,溶液由淺紅色變?yōu)樯詈稚吹玫?×10^-4M鈷單質(zhì)膠體溶液。

實施例2

一種PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備鈷單質(zhì)膠體溶液，見實施例1；

(2)將3mL 4×10^-4M鈷單質(zhì)膠體溶液和0.75μmol HAuCl₄溶于10mL水中，在氮氣流保護(hù)下攪拌1h，加入0.3μmol CuCl₂，在氮氣流保護(hù)下攪拌反應(yīng)1h,通空氣，獲得深藍(lán)色的含空心金銅納米粒的液體，8000rpm離心10min，冷凍干燥即得空心金銅納米粒粉末；

(3)將0.75μmol空心金銅納米粒粉末溶于5mL 20％的氯仿甲醇溶液中，加入20μg PFBT，室溫下12000rpm攪拌10h，離心15min，除去上層甲醇和氯仿溶劑，沉淀在真空狀態(tài)下靜置6小時除去殘余溶劑，用5mL水超聲分散5min，即得PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液；所述PFBT為聚[(9，9-二辛基芴基-2，7-二基)-交替-共-(1，4-苯并-{2，1’，3}-噻二唑)]的縮寫。

實施例3

一種PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備鈷單質(zhì)膠體溶液，見實施例1；

(2)將3mL 4×10^-4M鈷單質(zhì)膠體溶液和1μmol HAuCl₄溶于10mL水中，在氮氣流保護(hù)下攪拌1.5h，加入4μmol CuCl₂，在氮氣流保護(hù)下攪拌反應(yīng)1.5h,通空氣，獲得深藍(lán)色的含空心金銅納米粒的液體，10000rpm離心13min，冷凍干燥即得空心金銅納米粒粉末；

(3)將1μmol空心金銅納米粒粉末溶于7mL 30％的氯仿甲醇溶液中，加入60μg PFBT，室溫下13000rpm攪拌11h，離心18min，除去上層甲醇和氯仿溶劑，沉淀在真空狀態(tài)下靜置10小時除去殘余溶劑，用5mL水超聲分散5min，即得PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液。

實施例4

一種PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備鈷單質(zhì)膠體溶液，見實施例1；

(2)將3mL 4×10^-4M鈷單質(zhì)膠體溶液和1.25μmol HAuCl₄溶于10mL水中，在氮氣流保護(hù)下攪拌2h，加入7.5μmol CuCl₂，在氮氣流保護(hù)下攪拌反應(yīng)2h,通空氣，獲得深藍(lán)色的含空心金銅納米粒的液體(膠體溶液，命名為HGCNs)，12000rpm離心15min，冷凍干燥即得空心金銅納米粒粉末；

(3)將1.25μmol空心金銅納米粒粉末溶于10mL 50％的氯仿甲醇溶液中，加入100μg PFBT，室溫下14000rpm攪拌12h，離心20min，除去上層甲醇和氯仿溶劑，沉淀在真空狀態(tài)下靜置12小時除去殘余溶劑，用5mL水超聲分散5min，即得PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液(PFBT-HGCNs)。

實施例5(對照)

一種PFBT-空心金納米粒膠體溶液的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備鈷單質(zhì)膠體溶液，見實施例1；

(2)將3mL 4×10^-4M鈷單質(zhì)膠體溶液和1.25μmol HAuCl₄溶于10mL水中，在氮氣流保護(hù)下攪拌2h，通空氣，獲得淺藍(lán)色的含空心金納米粒的膠體溶液，命名為HGNs。

實施例4制備的PFBT-HGCNs表征：

HGCNs和PFBT-HGCNs的紫外-可見分光光度計測得的吸收圖譜見圖1a和圖1b,HGCNs的吸收峰相對于HGNs右移15nm左右,這有利于增加其在近紅外區(qū)的光吸收并增加其光熱轉(zhuǎn)換特性，從PFBT-HGCNs紫外圖譜中可觀察到PFBT和HGCNs的特征吸收峰；用馬爾文激光粒度儀和透射電鏡測得的粒徑分布和微觀形態(tài)見于圖2(HGNs)，圖3(HGCNs)和圖4(PFBT-HGCNs),電鏡圖表明HGCNs呈空心完整球形且分布均一，相對于HGNs,金殼增厚4nm左右，PFBT-HGCNs電鏡圖還可看到外觀嵌膠狀PFBT的存在。馬爾文激光粒度儀測得的HGNs,HGCNs和PFBT-HGCNs的粒徑分別為61nm,75nm和91nm。.

實施例6

測試空心金銅納米粒膠體溶液和PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液的光熱升溫曲線：

取0.5ml實施例4中制備的空心金銅納米粒膠體溶液和PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液放在5mL離心管中(光程1cm，面積1cm²)，使用670nm激光(激光功率為1W/cm²)連續(xù)照射5分鐘，用一臺配有熱電偶微探針的溫度監(jiān)測器，每隔0.5分鐘記錄一次溶液的溫度變化。

圖5為空心金銅納米粒膠體溶液和PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液的光熱升溫曲線?？梢娍招慕疸~納米粒膠體溶液和PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液均可在NIR照射下快速升溫，有望將其應(yīng)用于光熱治療。

實施例7

測試PFBT-空心金銅納米粒在細(xì)胞內(nèi)的攝取情況以及近紅外成像性能：

將實施例4制得的PFBT-空心金銅納米粒膠體溶液以最佳的給藥濃度加入到培養(yǎng)好小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)的六孔板中，腫瘤細(xì)胞的個數(shù)為每孔1×10⁶個。培養(yǎng)0.5,1,2h后吸出培養(yǎng)基并用PBS清洗3遍。并用激光共聚焦顯微鏡分別考察PFBT-金銅納米粒在NIR照射和不照射情況下的近紅外成像性能。

圖6為實施例4制得的PFBT-空心金銅納米粒在細(xì)胞內(nèi)的攝取情況以及近紅外成像圖?？梢奛IR照射可顯著增加PFBT-空心金銅納米粒在細(xì)胞內(nèi)的熒光強度，有望將PFBT-空心金銅納米粒應(yīng)用于近紅外腫瘤實時追蹤成像。

實施例8

測定不同濃度下的PFBT-空心金銅納米粒對于小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)的毒性：

采用MTT的方法對HGNs加NIR光照,HGCNs加NIR光照,PFBT-HGCNs(給予或不給予NIR光照)(實施例4制備)的體外細(xì)胞毒性進(jìn)行表征。

取對數(shù)生長期細(xì)胞以1×10⁴個/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔。將不同濃度的HGNs，HGCNs和PFBT-HGCNs膠體溶液分別與4T1細(xì)胞孵育6h后，對于需要激光處理的樣品組在給藥4個小時后進(jìn)行(1W/cm²，1.5min)，另三個復(fù)孔不做處理。繼續(xù)孵育18h后，加入20μL四甲基偶氮唑鹽溶液(MTT，5mg/mL)繼續(xù)孵育3.5-4h后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm處測量各孔的吸光值。

實驗證明(圖7)，本發(fā)明PFBT-HGCNs膠體溶液可直接影響4T1細(xì)胞的增殖，NIR光照組的PFBT-HGCNs比無光照組細(xì)胞增殖抑制率約增加55％左右。相比于HGNs，本發(fā)明的HGCNs和PFBT-HGCNs在NIR光照下表現(xiàn)出很好的抑制腫瘤細(xì)胞的功效。

實施例9

PFBT-空心金銅納米粒對于體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的熱療作用：

200μL HGNs,HGCNs和實施例4中所制備的PFBT-HGCNs膠體溶液通過尾靜脈注射到接種小鼠乳腺癌細(xì)胞(類型為BALB/C，體重20g)體內(nèi)，并在注射6h后在小鼠腫瘤部位給予NIR(670nm,5min)照射處理，用近紅外成像儀觀察腫瘤局部的升溫情況。結(jié)果顯示，在同樣的金濃度下，PFBT-HGCNs和HGCNs組比對照材料PBS和HGNs具有更好的升溫效果(圖8)。以上結(jié)果表明PFBT-HGCNs膠體溶液能夠有效用于對腫瘤的光熱治療。

實施例10

負(fù)荷腫瘤的裸鼠(類型為BALB/C，體重20g)被分為兩組(每組4只)，然后分別經(jīng)過不同方式處理：

(a)靜脈注射生理鹽水(saline)但不經(jīng)過激光照射；

(b)靜脈注射實施例4制備的PFBT-HGCNs膠體溶液；注射6小時后施加NIR光照5分鐘，隨后觀察并記錄各組老鼠的腫瘤治愈情況。從圖9可以看出，經(jīng)過21天治療后，對照組裸鼠的腫瘤體積顯著增大，而PFBT-HGCNs治療組組裸鼠的腫瘤肉眼基本上看不到了。因此表明，實施例4制備的PFBT-HGCNs膠體溶液對腫瘤的光熱治療效果良好，能有效抑制腫瘤的生長。

實驗證明，用實施例2、3制備的PFBT-HGCNs分別替代實施例4制備的PFBT-HGCNs所進(jìn)行的實施例6、7、8、9、10的實驗，其效果與實施例4相似。