本發(fā)明涉及一種防護腸輻射損傷的方法及TPA的用途。

背景技術：

當今社會，核能的開發(fā)和利用非常廣泛，隨著核事件發(fā)生可能性的增加，尋找新的抗輻射藥物，能夠減輕對重要器官如骨髓與胃腸道的潛在致命影響，顯得尤為必要與迫切。在醫(yī)療領域，放療是治療惡性腫瘤最常用的治療手段之一，但放療導致的不良反應給患者帶來了巨大的身心傷害，降低放療的副作用仍是臨床亟待解決的難題。胃腸道和造血系統(tǒng)對輻射高度敏感，輻射造成的胃腸道綜合征和骨髓抑制是暴露輻射后死亡的主要原因。在一般情況下，快速分裂的細胞(腸粘膜和骨髓細胞)最容易受到輻射的傷害，盡管在放療技術快速發(fā)展的今天，放射性腸病仍是阻礙腫瘤患者進一步治療的一個重要因素。數(shù)據(jù)顯示，60-80％的腹部盆腔腫瘤患者接受放療時出現(xiàn)腸毒性癥狀和腸功能紊亂。放射性腸病的風險限制了腫瘤的進一步治療和降低了癌癥患者的生活質(zhì)量。

高劑量輻射引起的急性腸損傷，主要由于腸粘膜干細胞的死亡。臨床特點主要有：惡心、嘔吐、腹瀉，持續(xù)數(shù)天的潛伏期，之后出現(xiàn)胃腸道癥狀，敗血癥，電解質(zhì)失衡等，并最終死亡。氨磷汀(自由基清除劑)，是目前批準用于放射治療的經(jīng)典藥物，在防止臨床胃腸放射毒性表現(xiàn)出一定的效果，但副作用嚴重和治療時間窗狹窄。因此，發(fā)展低毒、高效的輻射防護劑是必要的。

因此，為了解決上述現(xiàn)有技術的諸多不足和缺陷，有必要研究一種防護腸輻射損傷的方法。

技術實現(xiàn)要素：

考慮到至少一個上述問題而完成了本發(fā)明，并且本發(fā)明的一個目的在于提供防護腸輻射損傷的方法，該防護腸輻射損傷的方法通過TPA上調(diào)小腸干細胞基因Dclk1,Msi1,Lgr5,Bmi1和Notch1，并進一步上調(diào)關鍵信號蛋白PKC-βII和Erk1/2，以及蛋白p90RSK，促進小腸上皮細胞增殖，防護腸輻射損傷。

需要說明的是，本發(fā)明中的術語“防護”是指保護和修復，即通過保護和修復來降低腸的輻射損傷。

根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了TPA在防護腸輻射損傷上的用途，其特征在于根據(jù)上述方法防護腸輻射損傷。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明的TPA具有抗輻射作用，防止輻射損傷致使小腸隱窩干細胞的大量死亡，減緩體重降低并有助于體重恢復。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選實施例的防護腸輻射損傷的方法在小鼠上的實驗結(jié)果比較圖，具體的是流式細胞術的凋亡率檢測結(jié)果圖。

圖2是是根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選實施例的防護腸輻射損傷的方法在小鼠上的另一實驗結(jié)果比較圖，具體的是對于輻射后IEC-6細胞增殖的影響圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選實施例的防護腸輻射損傷的方法在小鼠上的又一實驗結(jié)果比較圖，具體的是TPA對輻射后小鼠存活與體重的影響圖。

圖4是根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選實施例的防護腸輻射損傷的方法在小鼠上的又一實驗結(jié)果比較圖，具體的是TPA對輻射后小腸干細胞基因的影響圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，通過優(yōu)選實施例來描述本發(fā)明的最佳實施方式，這里的具體實施方式在于詳細地說明本發(fā)明，而不應理解為對本發(fā)明的限制，在不脫離本發(fā)明的精神和實質(zhì)范圍的情況下，可以做出各種變形和修改，這些都應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

巴豆L屬大戟科，原產(chǎn)于東南亞的綠葉灌木。12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)是從該植物所提取的巴豆油的主要活性成分。TPA具有廣泛的生物學活性,在動物體內(nèi)可誘導多種細胞因子的生成。TPA對急性腸輻射損傷具有保護作用并對其可能的保護機制進一步驗證。體內(nèi)外實驗表明，TPA具有抗輻射作用，防止輻射損傷致使小腸隱窩干細胞的大量死亡，有利于隱窩再生，并延長小鼠生存期，減緩體重降低并有助于體重恢復。此外，觀察到與小腸隱窩干細胞相關的基因Dclk1、Notch1、Lgr5、Bmi1和Msi1不同程度的上調(diào)和PKC、Erk1/2、p90RSK信號通路蛋白的活化，進一步提示TPA對于小腸輻射損傷具有保護作用。

參見圖1－3,本發(fā)明提供了一種防護腸輻射損傷的方法。該防護腸輻射損傷的方法可包括：通過TPA上調(diào)小腸干細胞基因Dclk1,Msi1,Lgr5,Bmi1和Notch1，并進一步上調(diào)關鍵信號蛋白PKC-βII和Erk1/2，以及蛋白p90RSK，促進小腸上皮細胞增殖，防護腸輻射損傷。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供了還一種TPA在防護腸輻射損傷上的用途，其通過前述方法防護腸輻射損傷。

實施例1

1、實驗細胞及培養(yǎng)條件

大鼠空腸上皮細胞系(IEC-6)為貼壁細胞，其培養(yǎng)條件為：采用H-DMEM培養(yǎng)基，含10％FBS，1％雙抗，1U/ml常規(guī)胰島素，置于37℃，5％CO₂細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，常規(guī)三天換液，1：3-6傳代，傳代時加胰酶1毫升。孵箱內(nèi)消化2-3分鐘，勿消化過度，待80％貼壁細胞融合后立即終止消化。每次實驗均取對數(shù)生長期細胞。

2、實驗動物及飼養(yǎng)條件

SPF級BALB/c小鼠，雌性，6-8周齡，體重18-20g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。每籠5只標準飼料紫外照射除菌后喂養(yǎng)，飲用水消毒后供小鼠自由飲用。

3、輻射及隱窩計數(shù)

照射條件：軍事醫(yī)學科學院輻照中心⁶⁰Coγ照射，照射劑量為10Gy和7.5Gy。按Withers HR方法鏡下計數(shù)小腸隱窩數(shù)。隱窩再生標準為:隱窩細胞數(shù)≥10個、胞漿少、嗜堿性明顯以及有核分裂象、細胞呈密集狀。不能再生的隱窩為無細胞或細胞分散、增大、胞漿嗜酸性。隱窩細胞數(shù)≥5個相連的、Ki67陽性的細胞核。

4、統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果用平均值±標準差表示，GraphPad Prism6軟件進行作圖與統(tǒng)計分析。三組數(shù)據(jù)用單因素方差分析比較，p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

參見圖1，IEC-6細胞，輻射后48小時檢測。A：Untreated；B：TPA(1nM)；C：Control；D：不同組別細胞凋亡對比圖(定量)。三次獨立重復實驗。Mean±SEM.**P≤0.01。TPA緩解輻射引起的IEC-6細胞的凋亡。輻射前12小時用TPA(1nM)處理細胞，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。在48小時，TPA組細胞具有較低的凋亡率(14.13％±0.47％)，對照組細胞凋亡率為(19.83％±0.68％)，空白對照組細胞凋亡率為(6.80％±0.80％)。

參見圖2，IEC-6細胞，TPA濃度為1nM。三次獨立重復試驗。Mean±SEM.*P≤0.05；**P≤0.01。TPA促進輻射后IEC-6細胞的增殖。輻射前12小時用TPA(1nM)處理細胞，用CCK-8檢驗各組細胞增殖情況。TPA組IEC-6細胞增殖的能力在最初4天內(nèi)逐步上升。對照組的IEC-6細胞增殖的能力增加明顯低于TPA組。

TPA能夠緩解輻射對于細胞周期的阻滯。通過流式細胞儀檢測到輻射導致細胞阻滯在G1期，以第3天檢測結(jié)果為例：空白對照組細胞G1期比例為41.63％，TPA組為45.80％，對照組為50.88％，TPA組介于空白對照組與對照組之間。第4天與第5天結(jié)果與第3天一致。TPA促進了輻射后IEC-6細胞由G1向S期的過渡。

實驗表明，TPA促進輻射后IEC-6細胞由G1期轉(zhuǎn)向S期。輻射前12小時用TPA(1nM)處理細胞,用流式細胞儀檢測細胞周期情況。TPA一定程度解除了輻射引起的IEC-6細胞的周期阻滯。輻射導致細胞周期阻滯在G1期，根據(jù)流式細胞儀分析TPA組(3-5天)，TPA促進細胞由G1期轉(zhuǎn)向S期。

TPA增加了小腸隱窩的存活。為了探討TPA對輻射后BALB/c小鼠空腸隱窩的影響，不同劑量的TPA于輻射前3天連續(xù)尾靜脈注射給藥(治療組，n＝3；對照組，n＝3)。觀察到對照組小鼠存活隱窩平均為9.29±1.8；在TPA最佳劑量組(100μg/Kg)，觀察到存活隱窩平均為35.09±2.3。而在輻射后連續(xù)三天給藥(測試藥物修復作用)，則沒有發(fā)現(xiàn)明顯的隱窩數(shù)量增加(數(shù)據(jù)未顯示)。同時在輻射后3.5天，處死小鼠取腸管時，可以觀察到不同劑量組小腸都有程度不同的管壁變薄、水腫與腸管黏連等臨床表現(xiàn)，而100μg/Kg劑量組腸管水腫、黏連等炎性表現(xiàn)最輕。

TPA最佳劑量組(100μg/Kg)3.5天隱窩數(shù)平均為35.09，是對照組的3.78倍。

參見圖3，AB：不同組別雌性小鼠存活時間對比圖；C：不同組別雌性小鼠相對體重對比圖(體重測量的初始體重百分比)。Mean±SEM.*P≤0.05；**P≤0.01。TPA最佳劑量組(100μg/Kg)中位生存期為11天，是對照組2.2倍；TPA最佳劑量組體重下降較對照組緩慢，且在第5天開始有意義回升。

TPA延長了小鼠存活時間和減緩小鼠體重下降。選取7.5Gy劑量檢測小鼠的生存周期。觀察到對照組小鼠平均存活時間為5.4天(中位生存期為5天)，最佳劑量組(100μg/Kg)小鼠平均存活時間為12.6天(中位生存期為11天)。同時在輻射后開始每天對小鼠測量體重，分析數(shù)據(jù)結(jié)果如下：從輻射后第1天起，各組小鼠的體重均迅速下降，但TPA組比對照組平均體重下降更慢，且TPA組小鼠的體重從第5天開始回升。得到的這些結(jié)果表明，TPA明顯延長了小鼠的生存周期與防止致命的體重下降。

參見圖4，IEC-6細胞，TPA濃度為1nM。三次獨立重復試驗。Mean±SEM.*P≤0.05。實驗表明，輻照后24小時，檢測到小腸干細胞基因Dclk1,Msi1,Lgr5,Bmi1和Notch1不同程度的上調(diào)。

TPA增加了小腸干細胞基因的表達。在輻射后24小時提取RNA，通過PT-PCR實驗，觀測到與腸干細胞相關的一些公認基因Dclk1，Msi1，Lgr5，Bmi1和Notch1顯著上調(diào)(Dclk1上調(diào)3.86倍、Msi1上調(diào)2.08倍、Lgr5上調(diào)1.76倍、Bmi1上調(diào)2.62倍、Notch1上調(diào)1.94倍)，且與對照組差異有統(tǒng)計學意義。

實驗表明，輻射后，對信號通路蛋白做了連續(xù)4-5天的檢測。TPA組關鍵信號通路蛋白PKC-βII和Erk1/2活化上調(diào)，通路蛋白p90RSK活化上調(diào)，在第1天活化強度最大。

體內(nèi)外實驗證實，12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)能夠明顯增加IEC-6細胞的增殖、減緩輻射導致的凋亡和細胞周期阻滯，并且能夠顯著增加3.5天小腸隱窩存活數(shù)量、延長小鼠生存期、延緩體重下降。同時檢測到小腸隱窩干細胞相關基因Dclk1、Msi1、Lgr5、Bmi1和Notch1不同程度的上調(diào)，信號通路蛋白PKC、ERK1/2、p90RSK也相應的活化上調(diào)。充分說明TPA對急性腸輻射損傷具有保護作用。

實施例2

通過人體對照實驗，選擇三組放療病人，其中第一組使用氨磷汀防護腸輻射，第二組未采用任何防護藥物；第三組使用12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)。實驗結(jié)果表明，腸粘膜細胞死亡率分別為13.9％，19.9％，14.1％，病人急性腸損傷的癥狀(惡心、嘔吐、腹瀉)分別是：輕微，明顯，輕微。出現(xiàn)的副作用分別是：嚴重，無，輕微。

綜上所述，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明的TPA具有抗輻射作用，防止輻射損傷致使小腸隱窩干細胞的大量死亡，減緩體重降低并有助于體重恢復。

本發(fā)明不限于上述具體實施例?？梢岳斫獾氖牵诓幻撾x本發(fā)明的精神和實質(zhì)范圍的情況下，可以做出各種變形和修改，這些都應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。