本發(fā)明涉及?；撬岬膽?yīng)用，特別涉及牛磺酸作為治療新生兒缺氧缺血性腦損傷藥物的用途。

背景技術(shù)：

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)系指圍生期窒息所引起的缺氧、腦血流減少或短期腦血流灌注中斷所致的腦缺血缺氧性損傷，呈現(xiàn)一系列中樞神經(jīng)異常的臨床癥狀與體征，是嚴(yán)重威脅新生兒健康、導(dǎo)致新生兒死亡和兒童傷殘的常見原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年出生嬰兒1800萬-2000萬，窒息的發(fā)病率為13.9％。其中，大學(xué)有15-25％患兒在新生兒期死亡，有高達(dá)25％的存活兒在以后的成長(zhǎng)過程中出現(xiàn)智力障礙、腦癱、癲癇、智力發(fā)育遲緩、視聽障礙、學(xué)習(xí)障礙而存留永久性神經(jīng)心理障礙。造成這種嚴(yán)重后果的原因除了疾病本身的發(fā)生發(fā)展因素外，還與是否進(jìn)行早期干預(yù)和開始干預(yù)的早晚密切相關(guān)。新生兒HIBD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前臨床主要采用綜合治療，迄今為止對(duì)其損傷后的治療尚無根本性有力措施。如何通過有效的干預(yù)，防止和逆轉(zhuǎn)HIBD引起的腦神經(jīng)損傷及促進(jìn)損傷后修復(fù)，改善預(yù)后，是圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和神經(jīng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大課題，尋求有效的神經(jīng)保護(hù)藥一直是研究的重點(diǎn)。

?；撬?Taurine)又稱β-氨基乙磺酸，最早由牛黃中分離出來，故得名。純品為無色或白色斜狀晶體，無臭，牛磺酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，是一種含硫的非蛋白氨基酸，在體內(nèi)以游離狀態(tài)存在，不參與體內(nèi)蛋白的生物合成。牛磺酸雖然不參與蛋白質(zhì)合成，但它卻與胱氨酸、半胱氨酸的代謝密切相關(guān)。人體合成?；撬岬陌腚装彼醽喠蛩狒让?CSAD)活性較低，主要依靠攝取食物中的牛磺酸來滿足機(jī)體需要。?；撬峋哂写龠M(jìn)嬰幼兒腦組織和智力發(fā)育；提高神經(jīng)傳導(dǎo)和視覺機(jī)能；防止心血管?。挥绊懼愇?；改善內(nèi)分泌狀態(tài)，增強(qiáng)人體免疫；影響糖代謝；抑制白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展、改善記憶；維持正常生殖功能等藥理學(xué)作用。近年來，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)?；撬徇€具有保護(hù)視網(wǎng)膜、保護(hù)心肌、抗氧化、促進(jìn)免疫功能、促進(jìn)脂類消化吸收等多種藥理活性和臨床功能，但關(guān)于其對(duì)新生兒缺血缺氧性腦損傷的保護(hù)作用目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過對(duì)牛磺酸的藥理作用研究，提供牛磺酸作為治療新生兒缺氧缺血性腦損傷藥物的用途。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的：

本發(fā)明提供?；撬嶙鳛橹委熜律鷥喝毖跞毖阅X損傷藥物的用途，所述牛磺酸的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

具體地，所述新生兒缺氧缺血性腦損傷為急性期或修復(fù)期的新生兒缺氧缺血性腦損傷。

進(jìn)一步地，所述?；撬釂未螒?yīng)用劑量為30～120mg/kg.

優(yōu)選地，所述?；撬釂未螒?yīng)用劑量為60～120mg/kg。

優(yōu)選地，所述?；撬釂未螒?yīng)用劑量為120mg/kg。

具體地，所述?；撬釂未螒?yīng)用劑量?jī)H限于不引起中樞抑制的劑量。

具體地，所述藥物的劑型為藥劑學(xué)上允許的口服劑型或注射劑型。

本發(fā)明提供的?；撬嶙鳛橹委熜律鷥喝毖跞毖阅X損傷藥物的用途具有以下有益效果：

(1)?；撬嵩诓唤档脱堑膭┝肯履茱@著減少腦梗死體積和細(xì)胞壞死率；

(2)?；撬崮軠p弱氧化應(yīng)激脂質(zhì)過氧化作用，顯著抑制了缺血后腦組織AIF、Bax、Cyt C蛋白的表達(dá)以及促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明?；撬峋哂兄委熜律鷥喝毖跞毖阅X損傷所致神經(jīng)元損傷的作用，可用于制備新生兒缺氧缺血性腦損傷的治療藥物。

附圖說明

圖1：?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷保護(hù)作用的TTC染色圖；

圖2：?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血后腦組織病理變化影響的大腦皮層病理變化HE染色圖,其中，A-C分別代表正常組、模型組、?；撬岣邉┝拷M；

圖3：?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血后腦組織病理變化影響的海馬CA3區(qū)病理變化HE染色,其中，A-C分別代表正常組、模型組、?；撬岣邉┝拷M；

圖4：?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血后腦組織病理變化影響大腦皮層病理變化尼式染色圖,其中，A-C分別代表正常組、模型組、?；撬岣邉┝拷M；

圖5：?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血后腦組織病理變化影響海馬CA3區(qū)病理變化尼式染色圖,其中，A-C分別代表正常組、模型組、?；撬岣邉┝拷M；

圖6：牛磺酸對(duì)新生大鼠大腦缺血側(cè)皮層AIF免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的免疫熒光圖(×400)；

圖7：?；撬釋?duì)新生大鼠大腦缺血側(cè)海馬CA3區(qū)AIF免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的免疫熒光圖(×200)；

圖8：牛磺酸對(duì)新生大鼠腦缺血側(cè)皮層Cyt C免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的免疫熒光圖(×400)；

圖9：牛磺酸對(duì)新生大鼠腦缺血側(cè)海馬CA3區(qū)Cyt C免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的免疫熒光圖(×200)；

圖10：?；撬釋?duì)新生大鼠腦缺血側(cè)皮層Bcl-2免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的疫熒光圖(×400)；

圖11：牛磺酸對(duì)新生大鼠腦缺血側(cè)海馬CA3區(qū)Bcl-2免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的疫熒光圖(×200)；

圖12：牛磺酸對(duì)新生大鼠腦缺血側(cè)皮層Bax免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的免疫熒光圖(×400)；

圖13：牛磺酸對(duì)新生大鼠腦缺血側(cè)皮層海馬CA3區(qū)Bax免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的免疫熒光圖(×200)；

圖14：?；撬釋?duì)新生大鼠缺血側(cè)腦組織AIF蛋白表達(dá)水平的影響(與假手術(shù)組比較：^##P<0.01，與模型組比較：^＊P<0.05，^＊＊P<0.01(n＝6))；

圖15：?；撬釋?duì)新生大鼠缺血側(cè)腦組織Bax蛋白表達(dá)水平的影響(與假手術(shù)組比較：^##P<0.01，與模型組比較：^＊P<0.05，^＊＊P<0.01(n＝6))；

圖16：?；撬釋?duì)新生大鼠缺血側(cè)腦組織Cyt C蛋白表達(dá)水平的影響(與假手術(shù)組比較：^##P<0.01，與模型組比較：^＊P<0.05，^＊＊P<0.01(n＝6))；

圖17：?；撬釋?duì)新生大鼠缺血側(cè)腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響(與假手術(shù)組比較：^##P<0.01，與模型組比較：^＊P<0.05，^＊＊P<0.01(n＝6))；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1

?；撬嶙鳛橹委熜律鷥喝毖跞毖阅X損傷藥物的用途，?；撬岬慕Y(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

其中，新生兒缺氧缺血為急性期缺氧缺血性腦損傷，?；撬釂未螒?yīng)用劑量?jī)H限于不引起中樞抑制的劑量，?；撬釂未螒?yīng)用劑量為新生大鼠30mg/kg，藥物的劑型為注射劑型。

實(shí)施例2

牛磺酸作為治療新生兒缺氧缺血性腦損傷藥物的用途，?；撬岬慕Y(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

其中，新生兒缺氧缺血為修復(fù)期缺氧缺血性腦損傷，?；撬釂未螒?yīng)用劑量?jī)H限于不引起中樞抑制的劑量，?；撬釂未螒?yīng)用劑量為新生大鼠60mg/kg，藥物的劑型為針粉劑型。

實(shí)施例3

牛磺酸作為治療新生兒缺氧缺血性腦病藥物的用途，?；撬岬慕Y(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

其中，新生兒缺氧缺血性為修復(fù)期新生兒缺氧缺血性腦損傷，?；撬釂未螒?yīng)用劑量?jī)H限于不引起中樞抑制的劑量，?；撬釂未螒?yīng)用劑量為新生大鼠120mg/kg，藥物的劑型為針粉劑型。

下面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明了上述實(shí)施例1至3的效果：

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物處理

7日齡，新生SD大鼠，12-18g，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：NCXK(寧)2013-0005。喂養(yǎng)條件包括標(biāo)準(zhǔn)飼料，自來水，室溫保持在(24±2)℃，濕度50-60％，每日光照與黑暗時(shí)間各12h。實(shí)驗(yàn)前，將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)3天。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及儀器

?；撬?美國(guó)sigma公司)，以生理鹽水配制，母液濃度120mg/mL，-20℃貯存。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC，購(gòu)自sigma公司)，SOD、MDA、GSH-px、T-AOC、MPO、ATP、Lactic acid試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)，兔抗AIF、Cyt c、Bcl-2、Bax多克隆抗體(購(gòu)自Abcam公司)，酶標(biāo)儀(1510，Thermo Fisher公司)，激光共聚焦顯微鏡(TCS-SP，德國(guó)公司)，電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(Powerpac basic,美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠成像分析儀(JS-860B,上海培清公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

新生大鼠隨機(jī)分為缺氧缺血(HIBD)模型組，?；撬岵煌瑒┝拷M。新生大鼠在手術(shù)造模后按0.1ml/10g體重12h/次腹腔給藥。假手術(shù)組同法給予等量的生理鹽水。在新生大鼠缺氧缺血48h后進(jìn)行腦梗死體積、組織病理與形態(tài)學(xué)改變、分子生物學(xué)表達(dá)變化等藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

1.4新生大鼠缺氧缺血(HIBD)模型建立

參照Rice法，將7日齡SD大鼠放入一個(gè)含乙醚的密閉玻璃缸內(nèi)，吸入麻醉30-90秒后取出，固定于操作臺(tái)上。在頸部自甲狀軟骨下緣正中作一長(zhǎng)約1.0cm皮膚切口，鈍性分離皮下組織和肌肉，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，穿過4.0號(hào)絲線，雙線結(jié)扎血管，中間剪斷，用無損傷線縫合傷口后放回鼠籠，恢復(fù)2小時(shí)，每只動(dòng)物手術(shù)時(shí)間不超過5分鐘。向缺氧箱內(nèi)充92％氮?dú)夂?％氧氣混合氣體，同時(shí)用測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)箱內(nèi)氧濃度，使氧濃度保持在8％，將術(shù)后新生大鼠放入箱內(nèi)，缺氧箱內(nèi)溫度恒定在37℃，持續(xù)2.5小時(shí)。在缺氧結(jié)束后恢復(fù)正常氧供，之后放回母鼠籠里繼續(xù)喂養(yǎng)。假手術(shù)組僅切開頸部皮膚，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎，直接縫合，不缺氧。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，房間溫度應(yīng)保持在26℃，濕度60-70％。

二、實(shí)驗(yàn)過程

(一)腦梗死體積測(cè)定

1.1實(shí)驗(yàn)方法：

用乙醚麻醉新生大鼠并斷頭處死，迅速取出腦組織，去除嗅球、小腦及低位腦干，組織包埋液-20℃冰凍10min。自前極(anterior pole)冠狀面連續(xù)切取5片厚度的2mm腦切片置于2％2，3，5-氯化三苯基四氮唑生理鹽水溶液中37℃避光孵育10min，10％甲醛中性緩沖液(pH7.4)固定過夜。自動(dòng)微距相機(jī)拍攝，Image pro plus5.1圖像分析軟件計(jì)算并統(tǒng)計(jì)腦梗死體積。

表1.?；撬釋?duì)缺氧缺血腦缺血損傷新生大鼠梗死體積的影響

(n＝6)

(與假手術(shù)組比較：^##p<0.01；與模型組比較：*p<0.05,**p<0.01)

1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由表1和圖1可以看出，單次腹腔注射?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血所致腦梗死體積的增加呈雙向反應(yīng)，隨劑量增加腦梗死體積降低，至120mg/kg時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng)(與模型組對(duì)比^*P﹤0.05或^**P﹤0.01)，此后隨劑量的增加保護(hù)作用減弱或幾無。提示?；撬?120mg/kg、60mg/kg、30mg/kg)均具有降低新生大鼠缺氧缺血后腦梗死體積的作用。

(二)氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

2.1實(shí)驗(yàn)方法：

將新生大鼠麻醉后冰上斷頭快速取腦，生理鹽水短暫清洗缺血側(cè)大腦后保存于-80℃液氮中待用。使用硫酸浸泡過的玻璃勻漿器按按9：1(V/W)加入組織裂解液冰上操作，反復(fù)勻漿20次至肉眼不見組織塊，離心取上清液。使用牛血清白蛋白按考馬斯亮藍(lán)法在酶標(biāo)儀512nm處檢測(cè)待測(cè)樣品吸光度，做總蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(R²>0.99)并測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組新生大鼠腦組織蛋白濃度，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由表2可知，單次腹腔注射?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血后所致的生化指標(biāo)變化呈現(xiàn)雙向反應(yīng)，隨劑量增加腦組織中抗氧化劑(SOD、GSH-px、T-AOC)活性增強(qiáng)，丙二醛(MDA)含量、髓過氧化物酶(MPO)活性降低，至120mg/kg時(shí)腦組織內(nèi)的氧自由基清除劑活性最強(qiáng)，丙二醛(MDA)含量、髓過氧化物酶(MPO)活性最低(與模型組對(duì)比^*P﹤0.05或^**P﹤0.01)，此后隨劑量的增加抗氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用減弱或幾無。提示?；撬?120mg/kg、60mg/kg、30mg/kg)均具有減輕缺氧缺血新生大鼠腦組織的氧化應(yīng)激損傷作用。

表2.?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血損傷腦組織中MDA含量、SOD、GSH-Px、T-AOC、MPO活性的影響(n＝6)

(與假手術(shù)組比較：^##p<0.01；與模型組比較：*p<0.05,**p<0.01)

(三)氧化代謝指標(biāo)檢測(cè)

3.1實(shí)驗(yàn)方法：

將新生大鼠麻醉后冰上斷頭快速取腦，生理鹽水短暫清洗缺血側(cè)大腦后保存于-80℃液氮中待用。使用硫酸浸泡過的玻璃勻漿器按按9：1(V/W)加入組織裂解液冰上操作，反復(fù)勻漿20次至肉眼不見組織塊，離心取上清液。使用牛血清白蛋白按考馬斯亮藍(lán)法在酶標(biāo)儀512nm處檢測(cè)待測(cè)樣品吸光度，做總蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(R²>0.99)并測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組新生大鼠腦組織蛋白濃度，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。

3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由表2可知，單次腹腔注射?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血后所致的氧化代謝變化呈現(xiàn)雙向反應(yīng)，隨劑量增加腦組織中ATP含量增強(qiáng)，乳酸(LA)含量降低，至120mg/kg時(shí)腦組織內(nèi)改善能量代謝的能力最強(qiáng)，乳酸(LA)含量(與模型組對(duì)比^*P﹤0.05或^**P﹤0.01)，此后隨劑量的增加抗氧化代謝損傷的保護(hù)作用減弱或幾無。提示?；撬?120mg/kg、60mg/kg、30mg/kg)均具有減輕缺氧缺血新生大鼠腦組織的氧化代謝紊亂作用。

表2.?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血損傷腦組織中LA、ATP含量的影響(n＝6)

(與假手術(shù)組比較：^##p<0.01；與模型組比較：*p<0.05,**p<0.01)

(四)HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)病理變化

4.1實(shí)驗(yàn)方法：

蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE staining)，石蠟切片于65℃烘箱中烘烤20min，之后將玻片依次浸泡于二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(5min)，無水乙醇Ⅰ(1min)，無水乙醇Ⅱ(1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗3次，之后于蘇木素中浸泡5min，水洗3次，在1％的鹽酸酒精溶液中浸泡20s，水洗，伊紅溶液中浸泡2min，水速洗，之后石蠟切片繼續(xù)依次浸泡于80％乙醇(30s)，95％乙醇(30s)，無水乙醇Ⅰ(1min)，無水乙醇Ⅱ(3min)，二甲苯Ⅰ(2min)和二甲苯Ⅱ(2min)，最后用中性樹膠封片，每組新生大鼠腦組織石蠟切片HE染色完成后，置于顯微鏡下觀察，每張切片分別取200×和400×兩個(gè)視野，每個(gè)視野分別取3-6個(gè)區(qū)域進(jìn)行拍照記錄。

4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖2-3所示，單次腹腔注射?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血所致的腦組織結(jié)構(gòu)病理變化影響呈現(xiàn)雙向反應(yīng)，對(duì)比缺氧缺血模型組?；撬峤M腦缺血區(qū)域的皮層和海馬區(qū)損傷性病理變化減輕，細(xì)胞水腫、空泡樣減少，核固縮邊集減弱，細(xì)胞壞死和中性粒趨附炎性滲出現(xiàn)象減少，細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞排列分布均勻。提示牛磺酸(120mg/kg)具有減輕新生大鼠缺氧缺血后腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)病理性損傷的作用。

(五)尼式染色觀察組織結(jié)構(gòu)壞死變化

5.1實(shí)驗(yàn)方法：

尼式染色(Nissl staining)，石蠟切片于65℃烘箱中烘烤20min，之后將玻片依次浸泡于二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(5min)，無水乙醇Ⅰ(1min)，無水乙醇Ⅱ(1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗3次，之后于尼式染液中50℃烤箱孵育1h，水洗3次，在1％的鹽酸酒精溶液中浸泡20s，水洗，最后用中性樹膠封片，每組新生大鼠腦組織石蠟切片HE染色完成后，置于顯微鏡下觀察，每張切片分別取200×和400×兩個(gè)視野，每個(gè)視野分別取3-6個(gè)區(qū)域進(jìn)行拍照記錄。

5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖4-5所示，單次腹腔注射?；撬釋?duì)新生大鼠缺氧缺血所致的腦組織結(jié)構(gòu)壞死變化影響呈現(xiàn)雙向反應(yīng)，對(duì)比缺氧缺血模型組隨牛磺酸劑量增加缺血側(cè)海馬區(qū)損傷性結(jié)構(gòu)壞死減輕，神經(jīng)元皺縮、腫脹、核固縮減弱，尼氏小體缺失受損減輕，細(xì)胞壞死、凋亡現(xiàn)象減少，細(xì)胞排列分布均勻，至120mg/kg時(shí)腦組織內(nèi)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病理性損傷最輕，與缺氧缺血模型組對(duì)比，劑量大于120mg/kg或者小于30mg/kg抗損傷的保護(hù)作用減弱或幾無，提示?；撬峋哂袦p輕新生大鼠缺氧缺血后腦組織壞死的神經(jīng)保護(hù)作用。

(六)免疫熒光法測(cè)定新生大鼠腦缺血損傷側(cè)腦組織細(xì)胞AIF、Bcl-2、Cyt C表達(dá)水平

6.1實(shí)驗(yàn)方法：

石蠟切片65℃烘箱加熱45min，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，切片浸入含有0.01M/L的枸櫞酸鈉緩沖液的高壓鍋中煮沸4min，自然冷卻至室溫，完成抗原熱修復(fù)。山羊血清封閉非特異性抗原，室溫放置20min，勿沖，按一定的稀釋比例滴加一抗，4℃過夜，次日取出，37℃復(fù)溫45min，用PBS沖洗3次，每次5min。滴加1：20的FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗，濕盒中避光37℃孵育1h，之后PBS沖洗，滴加熒光染料Dapi處理15min封片，每張切片在海馬和皮層各取6個(gè)區(qū)域400×和200×視野下激光共聚焦觀察、拍照，并用IPP軟件統(tǒng)計(jì)各組新生大鼠缺血側(cè)大腦皮層中各相關(guān)蛋白的平均光密度值。

6.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖6至圖13所示，用免疫熒光檢測(cè)組織細(xì)胞AIF、Bcl-2、Cyt C免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的強(qiáng)度，各組新生大鼠腦缺血側(cè)皮層區(qū)、海馬CA3區(qū)組織切片在激光共聚焦下均可見陽性信號(hào)表達(dá)。對(duì)比假手術(shù)組，缺氧缺血(HIBD)模型組、?；撬?120mg/kg)給藥組AIF、Cyt C陽性信號(hào)顯著增強(qiáng)，Bcl-2陽性信號(hào)顯著減弱；由圖4至圖5可知，對(duì)比缺氧缺血(HIBD)模型組，?；撬?120mg/kg)給藥組其AIF、Cyt C免疫陽性細(xì)胞在以上2個(gè)區(qū)域表達(dá)數(shù)量及其陽性信號(hào)強(qiáng)度顯著下降；由圖6可知，對(duì)比缺氧缺血(HIBD)模型組，?；撬?120mg/kg)給藥組Bcl-2免疫陽性細(xì)胞在以上3個(gè)區(qū)域表達(dá)數(shù)量及其陽性信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。提示苦參堿的保護(hù)作用可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，降低AIF、Cyt C的表達(dá)與活化，減少再灌注期神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,，從而促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)元的存活，對(duì)缺血再灌注腦損傷起到一定的保護(hù)作用。

(七)Western blot檢測(cè)新生大鼠腦缺血損傷側(cè)腦組織AIF、Bcl-2、Cyt C、Bax蛋白的表達(dá)

7.1實(shí)驗(yàn)方法：

使用凱基全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣本總蛋白質(zhì)濃度并標(biāo)定蛋白統(tǒng)一濃度。SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，用將硝酸纖維素膜(NC膜)進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出硝酸纖維素膜，將膜置入5％脫脂奶粉封閉液中封閉1h。封閉結(jié)束孵育5％脫脂奶粉稀釋的一抗，4℃過夜，室溫復(fù)溫1h，洗膜孵育二抗。用PBST洗NC膜3次，每次10min。滴加蛋白化學(xué)發(fā)光劑(ECL)，NC膜固定于片盒內(nèi)，壓入膠片進(jìn)行曝光。取出膠片，放入顯影液和定影液中各1min，最后清水清洗。凝膠圖像分析成像系統(tǒng)(培清，JS-860B)對(duì)膠片上每個(gè)目的條帶進(jìn)行掃描和圖像分析。

7.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖14至圖17所示，與假手術(shù)組比較，缺氧缺血(HIBD)模型組、牛磺酸(120mg/kg)給藥組AIF、Cyt C、Bax蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少(^##P<0.01)；如圖7至圖10所示，與模型組比較，?；撬?120mg/kg)組新生大鼠腦缺血側(cè)腦組織AIF、Cyt C、Bax蛋白表達(dá)明顯減少(^*P﹤0.05,^**P﹤0.01)；如圖10所示，與模型組比較，?；撬?120mg/kg)組新生大鼠腦缺血側(cè)腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少(^*P﹤0.05,^**P﹤0.01)。提示苦參堿的保護(hù)作用可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，降低AIF、Cyt C、Bax的表達(dá)與活化，減少缺氧缺血損傷后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,從而促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)元的存活，對(duì)新生兒缺氧缺血性腦損傷起到一定的保護(hù)作用。

以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。