本發(fā)明屬于植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種杜仲葉有效部位、制備方法及其在制備保護由酒精引起腦神經(jīng)損傷的食品、保健品以及藥物中的新應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乙醇濫用是世界范圍內(nèi)嚴重危害人類健康的問題，引起腦損害、認知缺陷、運動協(xié)調(diào)功能喪失及相應(yīng)的心理功能改變。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是乙醇的主要作用靶點，其基因毒性是乙醇中毒性疾病的重要機制之一。目前，已經(jīng)證明乙醇急性及長期服用對小鼠不同腦區(qū)腦細胞DNA不同程度的損傷, 進而造成腦神經(jīng)細胞壞死和凋亡、炎癥等病理變化，最終導(dǎo)致各種腦部疾病，其中對小腦和大腦皮層基因毒性最強。而腦組織對于基因毒性引起的DNA損傷修復(fù)能力低，所以，DNA修復(fù)系統(tǒng)缺陷導(dǎo)致DNA損傷的積累，最終導(dǎo)致神經(jīng)變性即神經(jīng)毒性。因此，尋找新型、有效預(yù)防和治療酒精引起腦損傷的功能性食品、保健品或藥物具有重要意義。

杜仲葉（Eucommia folium）為杜仲科杜仲( Eucommia ulmoids Oliv.）的干燥葉，味微辛，溫。歸肝、腎經(jīng)。補肝腎，強筋骨，用于肝腎不足，頭暈?zāi)垦?，腰膝酸痛，筋骨痿軟。在我國已?000多年的用藥歷史，是一種傳統(tǒng)的中藥材。2005年開始收載于《中國藥典》中。大量研究表明：杜仲葉與杜仲皮化學(xué)成分，特別是有效成分基本一致，具有相似功效，并且資源更加豐富。其有效成分主要為木脂素類、苯丙素類、酚類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、有機酸等成分?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉具有降血壓、保肝利尿、強筋骨、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)靜安胎、抗衰老等功效，目前并無文獻有關(guān)于杜仲葉保護酒精引起腦神經(jīng)損傷的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種杜仲葉有效部位、制備方法及其在制備保護由酒精引起腦神經(jīng)損傷的食品、保健品以及藥物中的新應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種杜仲葉有效部位的制備方法，其包括如下步驟：將粉碎后的杜仲葉用30－80%乙醇超聲或散式提取，提取液濃縮后用大孔吸附樹脂吸附，然后依次用水洗、20－60%乙醇梯度洗脫，合并梯度洗脫收集的洗脫液，濃縮、干燥后即得到杜仲葉有效部位。

具體的，超聲或散式提取2－3次，每次超聲或散式提取時每1 g 杜仲葉添加30－80%乙醇8－15mL。

具體的，超聲提取時每次20－40min為宜，散式提取時每次3－10min為宜。

大孔吸附樹脂選用常規(guī)型號即可，大孔吸附樹脂型號如可以為HPD100、HPD600、HPD400、D101、AB-8、ADS-17或DM130等。

采用任一上述方法制備得到的杜仲葉有效部位。

上述杜仲葉有效部位在制備預(yù)防和治療由酒精引起的腦神經(jīng)損傷藥物、食品或保健品中的應(yīng)用。

上述杜仲葉有效部位在制備保護與增強腦組織抗氧化功能藥物、食品或保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明從杜仲葉中提取得到杜仲葉有效部位，并采用腹腔注射酒精誘導(dǎo)急性酒精腦神經(jīng)DNA損傷小鼠模型，首次研究杜仲葉對酒精誘導(dǎo)急性腦神經(jīng)DNA損傷小鼠的影響。研究證實了杜仲葉有效部位可以拮抗小鼠小腦、大腦皮層的DNA損傷，其對酒精誘導(dǎo)的小鼠急性腦神經(jīng)損傷具有一定的保護作用；可降低小腦、大腦皮層部位的中MDA、NO、8-OhdG的含量；能不同程度地提高小腦、大腦皮層部位的T-SOD、GSH-PX酶、NQO1、CHAT酶活力，說明杜仲葉有效部位在加強急性酒精神經(jīng)損傷小鼠機體的抗氧化功能，保護機體免受自由基的進一步傷害，同時改善酒精引起的學(xué)習記憶障礙。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步地詳細介紹，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。

實施例1

一種杜仲葉有效部位的制備方法，其包括如下步驟：將500 g干燥的杜仲葉粉碎后，分別用4000 mL 40%（v/v，下同）乙醇超聲提取2次，第一次超聲提取20min，第二次超聲提取30 min，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮，經(jīng)HPD100大孔吸附樹脂吸附，然后依次用水洗至流出液無顏色（棄掉），再依次用6倍柱體積20%乙醇、6倍柱體積50%乙醇梯度洗脫，合并梯度洗脫收集的洗脫液，減壓濃縮回收溶劑、干燥得98.8 g提取物，即為杜仲葉有效部位。

以沒食子酸作為對照品，采用分光光度法測得杜仲葉有效部位中總酚酸含量為：71%。

實施例2

一種杜仲葉有效部位的制備方法，其包括如下步驟：將200 g干燥的杜仲葉粉碎后，分別用1800 mL 60%（v/v，下同）乙醇散式提取2次，第一次散式提取3 min，第二次散式提取5 min，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮，經(jīng)HPD600大孔吸附樹脂吸附，然后依次用水洗至流出液無顏色（棄掉），再依次用6倍柱體積25%乙醇、6倍柱體積55%乙醇梯度洗脫，合并梯度洗脫收集的洗脫液，減壓濃縮回收溶劑、干燥得35.2 g提取物，即為杜仲葉有效部位。

以沒食子酸作為對照品，采用分光光度法測得杜仲葉提取物中總酚酸含量為：69%。

實施例3

一種杜仲葉有效部位的制備方法，其包括如下步驟：將100 g干燥的杜仲葉粉碎后，分別用1000 mL 70%（v/v，下同）乙醇超聲提取2次，第一次超聲提取20 min，第二次超聲提取40 min，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮，經(jīng)D101大孔吸附樹脂吸附，然后依次用水洗至流出液無顏色（棄掉），再依次用6倍柱體積30%乙醇、6倍柱體積60%乙醇梯度洗脫，合并梯度洗脫收集的洗脫液，減壓濃縮回收溶劑、干燥得10.5g提取物，即為杜仲葉有效部位。

以沒食子酸作為對照品，采用分光光度法測得杜仲葉提取物中總酚酸含量為：73%。

效果實驗一：杜仲葉有效部位對酒精誘導(dǎo)的小鼠急性腦神經(jīng)DNA損傷的影響。

實驗原料：實施例1制得的杜仲葉有效部位作為實驗原料。

實驗動物：昆明種小鼠，體重 22±2 g，SPF級，由河南省實驗動物中心提供，生產(chǎn)批號：SCXK（豫）2010-0002。

實驗試劑：氯化鈉，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；低熔點瓊脂糖，鄭州博遠泰隆科貿(mào)有限公司進口分裝；正常熔點瓊脂糖，鄭州博遠泰隆科貿(mào)有限公司美國原裝進口；乙二胺四乙酸二鈉，天津歐博凱化工有限公司；氫氧化鈉，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；磷酸氫二鈉，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，開封東大化工有限公司；溴化乙錠，鄭州博遠泰隆科貿(mào)有限公司進口分裝；Triton X-100，AMRESCO solarbio；二甲基亞砜，Amresco solarbio公司；磷酸二氫鉀，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；TRIS，Sigma solarbio；硫酸二甲酯，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；無水乙醇，安徽安特食品股份有限公司。

實驗儀器：多功能水浴鍋，鄭州長城科技工貿(mào)有限公司。JY200C型電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。AB135-S型梅特勒-托利多B-S系列天平。JY-SP7型水平電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。FV10型OLYMPUS熒光顯微鏡，日本。載玻片與蓋玻片，江蘇海門帆一實驗器材廠。Multiskan Go1510酶標儀，Thermo Scientific。LRH-150恒溫孵育箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。TGL-16G臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。渦流混合器，Thermolyne。

實驗方法：雄性小鼠20只，分為5組，每組4只。即：空白組、模型組（乙醇6.0g/kg）、陽性組（維生素E 50mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲葉低劑量組（100mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲葉高劑量組（400mg/kg+乙醇6.0g/kg）。杜仲葉有效部位用0.5%CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）雙蒸水溶解。陽性組灌胃給予維生素E 50mg/kg；杜仲葉低和高劑量組分別灌胃給予杜仲葉有效部位100mg/kg和400mg/kg，連續(xù)灌胃三天；空白組及模型組灌胃給予等體積0.5%CMC-Na雙蒸水，連續(xù)灌胃三天。最后一次給藥后半小時，模型組、陽性組、杜仲葉低和高劑量組腹腔注射乙醇6.0g/kg，空白組腹腔注射等容積的生理鹽水。乙醇臨用前用生理鹽水配制成20%乙醇水溶液。給予乙醇四小時后斷頭取腦分離小腦和大腦皮層，迅速移至冰冷的器皿中，制備細胞混合液，凝膠制片，細胞裂解，DNA堿解旋，電泳，中和，固定，染色，閱片，CASP彗星分析軟件分析，以尾矩為測量指標進行評價，用SPSS 17.0版本軟件分析給藥組與對照組之間的差異性水平，采用單因素方差分析來判斷總體顯著性差異，結(jié)果見表1。

表1. 杜仲葉提取物抗酒精引起的小鼠小腦和大腦皮層DNA損傷活性(mean±S.E.M, n=4)

表1結(jié)果表明：杜仲葉有效部位高、低劑量組均具有顯著拮抗酒精引起的小鼠小腦和大腦皮層的神經(jīng)元DNA損傷。

效果實驗二：杜仲葉提取物的抗氧化試驗。

實驗動物：成年昆明小鼠，雄性，體重22 ± 2 g，140只，分為5組，每組28只。即：空白組、模型組（乙醇6.0g/kg）、陽性組（維生素E 50mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲葉低劑量組（100mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲葉高劑量組（400mg/kg+乙醇6.0g/kg）。

主要試劑盒：一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、醌氧化還原酶1(NQO1)、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT），以上試劑均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；8-羥基-2-脫氧鳥嘌呤核苷(8-OHdG)試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

主要儀器：UV-2000 型紫外可見分光光度計 (尤尼可上海儀器有限公司) ；Multiskan Go1510 酶標儀 (Thermo Scientific)；LRH-150 恒溫培養(yǎng)箱 (上海一恒科技有限公司)；TGL- 16G臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

實驗方法：給藥方法同上所述。實驗操作按照試劑盒說明書進行，測定小鼠小腦和大腦皮層中NO、MDA、8-OHdG的含量，以及SOD、GSH-PX、CHAT、NQO1活力，結(jié)果見表2和表3。

表2 杜仲葉有效部位對酒精引起小鼠腦神經(jīng)DNA損傷的小腦和大腦皮層NO、MDA、SOD、GSH-PX酶的影響(mean±S.E.M, n=4)

表2的結(jié)果顯示：給藥組與模型組比較，杜仲葉有效部位高、低劑量組均能顯著降低酒精急性給藥后小鼠小腦和大腦皮層NO、MDA含量；并且均能顯著提高神經(jīng)DNA損傷小鼠小腦和大腦皮層的SOD酶和GSH-PX酶活性。表明，杜仲葉有效部位對小鼠腦組織氧化性DNA損傷均有保護作用，通過增強小鼠機體的抗氧化功能，保護腦組織被自由基的進一步傷害。

表3 杜仲葉有效部位對酒精引起小鼠腦神經(jīng)DNA損傷的小腦和大腦皮層ChAT、8-OhdG和NQO1酶的影響(mean±S.E.M, n=4)

表3的結(jié)果顯示：杜仲葉給藥組腦區(qū)中NQO1水平升高，較模型組有顯著性差異。杜仲葉灌胃給予的高、低劑量組發(fā)現(xiàn)腦區(qū)DNA的氧化損傷標記物8-OHdG含量降低，與模型組比較具有顯著性差異，說明灌胃給予杜仲葉后，酒精引起的小鼠腦組織DNA氧化性損傷減少。乙酰膽堿是中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在腦組織內(nèi)分布廣泛，與學(xué)習、記憶功能密切相關(guān)，ChAT是合成乙酰膽堿的關(guān)鍵酶，是衡量膽堿能神經(jīng)元功能的主要標志。由實驗結(jié)果可看出，模型組的腦區(qū)ChAT活性顯著降低，灌胃給予杜仲葉高、低劑量后發(fā)現(xiàn)ChAT活性顯著增加，且與模型組比較具有顯著性差異，表明杜仲葉有效部位能緩解酒精引起的學(xué)習記憶障礙。