本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及鹽酸納美芬的新用途，具體涉及鹽酸納美芬的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鹽酸納美芬主要用于已知或疑似阿片類藥物過量或中毒的急救促醒、急性顱腦與脊髓損傷、腦缺血、腦梗塞等神經(jīng)功能損壞性疾病、昏迷、休克及術(shù)后麻醉催醒、酒精中毒、戒毒后防復(fù)吸治療等癥狀。

迄今為止，尚未見鹽酸納美芬及其藥物組合物與肺癌的相關(guān)性報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鹽酸納美芬的藥物組合物，該藥物組合物中含有鹽酸納美芬和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，鹽酸納美芬和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療肺癌。

本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種鹽酸納美芬的藥物組合物，包括鹽酸納美芬、化合物(Ⅰ)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型；所述化合物(Ⅰ)的結(jié)構(gòu)式如下：

進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤(rùn)滑劑。

進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。

進(jìn)一步地，所述的化合物(Ⅰ)的制備方法包含以下操作步驟：(a)將玄參粉碎，用65～85％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)。

進(jìn)一步地，化合物(Ⅰ)的制備方法中，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。

上述鹽酸納美芬的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的鹽酸納美芬的藥物組合物中含有鹽酸納美芬和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，鹽酸納美芬和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有治療作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)肺癌的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證

分離方法：(a)將玄參(3kg)粉碎，用75％乙醇熱回流提取(20L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(4L)，依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水飽和的正丁醇(4L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用6％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1(8個(gè)柱體積)、25:1(8個(gè)柱體積)、15:1(8個(gè)柱體積)和5:1(10個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1(8個(gè)柱體積)、5:1(10個(gè)柱體積)和2:1(5個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)(純度大于98％)。

結(jié)構(gòu)確證：HR-ESI-MS顯示[M+H]⁺為m/z 247.1259，結(jié)合核磁特征可得分子式為C₁₅H₁₈O₃，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δ_H(ppm，CD₂Cl₂，500MHz)：H-1a(1.12，m)，H-1b(1.83，m)，H-2(1.84，m，2H)，H-4(5.71，s)，H-5(2.59，d，J＝10.6Hz)，H-9(2.18，m)，H-10(1.67，m)，H-12a(5.41，t，J＝2.0Hz)，H-12b(5.02，t，J＝2.0Hz)，H-13a(4.35，dd，J＝13.4，2.0Hz)，H-13b(4.58，dd，J＝13.4，2.0Hz)，H-14(1.02，d，J＝6.4Hz)，H-15(1.84，s)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δ_C(ppm，CD₂Cl₂，125MHz)：26.8(CH₂，1-C)，30.1(CH₂，2-C)，135.9(C，3-C)，145.1(CH，4-C)，48.2(CH，5-C)，79.2(C，6-C)，111.1(C，7-C)，204.2(C，8-C)，36.6(CH，9-C)，40.3(CH，10-C)，146.2(C，11-C)，112.1(CH₂，12-C)，68.2(CH₂，13-C)，14.7(CH₃，14-C)，18.4(CH₃，15-C)。該化合物的氫譜中有一個(gè)乙烯基甲基信號(hào)[δ_H1.84(3H，br，s，Me-15)]，一個(gè)雙峰甲基信號(hào)[δ_H1.02(3H，d，J＝6.4Hz，Me-14)]，一個(gè)末端雙鍵質(zhì)子信號(hào)[δ_H5.41(1H，t，J＝2.0Hz，H-12a)和5.02(1H，t，J＝2.0Hz，H-12b)]，一個(gè)含氧亞甲基質(zhì)子信號(hào)[δ_H4.35(1H，dd，J＝13.4，2.0Hz，H-13a)和4.58(1H，dd，J＝13.4，2.0Hz，H-13b)]以及一個(gè)烯屬次甲基質(zhì)子信號(hào)[δ_H5.71(1H，br，s，H-4)]。該化合物的碳譜顯示15個(gè)碳信號(hào)，包括兩個(gè)甲基，四個(gè)亞甲基(一個(gè)烯烴碳，一個(gè)連氧碳)，四個(gè)次甲基(一個(gè)烯烴碳)以及五個(gè)季碳(兩個(gè)烯烴碳，一個(gè)酮羰基和兩個(gè)連氧季碳)。綜合高分辨質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)顯示，該化合物可能為一個(gè)倍半萜類化合物。查閱文獻(xiàn)可知，該化合物和已知化合物L(fēng)yophyllone B具有相似的結(jié)構(gòu)。比較兩者核磁數(shù)據(jù)可知，相較于已知化合物，新化合物中C-8位連氧碳信號(hào)的缺失的同時(shí)多了一個(gè)酮羰基碳信號(hào)。在該化合物的HMBC譜中，H-14/C-8，H-9/C-8，H-10/C-8的相關(guān)性說明多出來的酮羰基是位于C-8位的。解析至此，已解析出7個(gè)不飽和度中的6個(gè)，故而該化合物中還有一個(gè)額外的環(huán)。分析核磁數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，該化合物C-6和C-7位的碳譜數(shù)據(jù)發(fā)生很大的變化，都向高場(chǎng)位移。結(jié)合高分辨，以及核磁譜圖，可以確定在該化合物的C-6和C-7位存在一個(gè)三元氧環(huán)。NOESY譜中，H-10/H₃-14，H-5/H-9之間的相關(guān)性說明H-10以及14-CH₃都是位于β位的。此外，五元含氧環(huán)與六元環(huán)是順式稠合的，同時(shí)C-6和C-7之間的三元氧環(huán)是α型的。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：

實(shí)施例2：藥理作用

本實(shí)施例使用右腋皮下接種肺癌瘤株細(xì)胞建立lewis肺癌小鼠模型，測(cè)定各組的抑瘤率和Bcl-2及Bax表達(dá)水平，觀察藥物上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2的表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長(zhǎng)的抗腫瘤作用。

1、材料與方法

1.1動(dòng)物

C57BL/6純系小鼠，雄性6～8周，(20±2)g，北京維通利華公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2試劑與樣品

鹽酸納美芬購自中國(guó)藥品生物制品檢定所?；衔?Ⅰ)自制，制備方法見實(shí)施例1。兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體(SANTACRUZ公司)、二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒，DAB顯示劑(北京中杉金橋公司)。瘤株Lewis肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院腫瘤研究所提供并傳代保種；Lewis肺癌維持在C57BL/6小鼠體內(nèi)，每2周傳代1次。

1.3小鼠分組及模型制備

C57BL/6小鼠隨機(jī)分組，每組12只，分別為模型對(duì)照組(NS組)、鹽酸納美芬組、化合物(Ⅰ)組、鹽酸納美芬與化合物(Ⅰ)組合物組。每只小鼠右腋皮下接種肺癌瘤株細(xì)胞，建立lewis肺癌小鼠模型，從接種腫瘤次日開始，分別腹腔注射給藥。生理鹽水(NS)組：0.9％生理鹽水0.2mL，連續(xù)10d；鹽酸納美芬組：40mg/(kg·d)，連續(xù)給藥10d；化合物(Ⅰ)組：40mg/(kg·d)，連續(xù)給藥10d；鹽酸納美芬與化合物(Ⅰ)組合物組：40mg/(kg·d)鹽酸納美芬+40mg/(kg·d)化合物(Ⅰ)，連續(xù)給藥10d。末次給藥后24h，小鼠稱重，處死。

1.4瘤重測(cè)定實(shí)驗(yàn)

末次給藥后24h將小鼠稱重，斷頸處死，剝?nèi)×鰤K稱重。

抑瘤率(％)＝(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100％。

1.5Lewis肺癌Bcl-2、Bax表達(dá)變化的測(cè)定實(shí)驗(yàn)

免疫組化法測(cè)定Bcl-2、Bax表達(dá)。瘤塊以石蠟包埋制成4μm厚的切片，脫蠟、水化后，3％H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復(fù)，后續(xù)步驟按照二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒說明書操作。陰性對(duì)照以0.01mol/LPBS(pH＝7.4)代替一抗。在光學(xué)顯微鏡下觀察鹽水對(duì)照組和各給藥實(shí)驗(yàn)組樣本的免疫組化切片。

結(jié)果判定：每張切片在5～10個(gè)高倍視野下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100～200個(gè)細(xì)胞，共1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞數(shù)所占比例。Bcl-2在胞漿出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色。Bax在胞漿和(或)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1對(duì)Lewis肺癌模型小鼠實(shí)體瘤的影響

與模型對(duì)照組比較，鹽酸納美芬與化合物(Ⅰ)組合物組瘤重明顯減小(P＜0.01)，抑瘤率明顯增加(P＜0.01)；與模型對(duì)照組比較，鹽酸納美芬組、化合物(Ⅰ)組瘤重減小(P＜0.05)，抑瘤率增加(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

2.2對(duì)Lewis肺癌模型小鼠Bcl-2及Bax表達(dá)的影響

與模型對(duì)照組比較，鹽酸納美芬與化合物(Ⅰ)組合物組Bcl-2表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，Bax表達(dá)明顯升高(P＜0.01)；與模型對(duì)照組比較，鹽酸納美芬組、化合物(Ⅰ)組Bcl-2表達(dá)降低(P＜0.05)，Bax表達(dá)升高(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1對(duì)小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長(zhǎng)及Bcl-2、Bax表達(dá)水平的影響(x±s，n＝10)

肺癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多因素多階段的復(fù)雜過程，近年來研究表明，肺癌的發(fā)生可能是由于細(xì)胞凋亡與增殖失衡造成的。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自身的一種主動(dòng)的、生理性死亡機(jī)制，細(xì)胞調(diào)亡過程受促調(diào)亡因子和調(diào)亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)。其中Bcl-2和Bax屬于Bcl-2同一家族，與人類多種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系的基因。Bcl-2是從人類濾泡型非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤克隆到的原癌基因，其通過穩(wěn)定線粒體膜的功能，阻止線粒體釋放Caspase、凋亡誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素C等作用抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2通過抑制細(xì)胞凋亡而參與腫瘤的發(fā)生。Bax基因具有拮抗Bcl-2的作用，是促凋亡基因。當(dāng)Bax蛋白大量表達(dá)，并與Bcl-2蛋白形成異源二聚體時(shí)加速細(xì)胞死亡，Bcl-2和Bax的表達(dá)程度對(duì)決定細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后存活與否起關(guān)鍵作用。目前，多數(shù)研究表明，Bcl-2與Bax的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)，Bcl-2過量表達(dá)，細(xì)胞存活；Bax蛋白過量表達(dá)，細(xì)胞死亡。

結(jié)果表明，鹽酸納美芬、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有抑制作用；鹽酸納美芬和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)肺癌的抑制效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物。

上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。