本發(fā)明涉及植物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種紅樹莓葉中具有抗AD活性的總黃酮的提取工藝。

背景技術(shù)：

老年癡呆癥是一種非特異性的疾病綜合癥，患者主要是認知功能受到損傷從而表現(xiàn)為記憶、語言等能力明顯下降，而阿爾茨海默病(AD)則是其中最主要的一種癥狀。AD的病變還未完全明確，β樣淀粉蛋白(Aβ)被認為是AD發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子，可以引起記憶功能損傷和腦部組織的病理性改變，現(xiàn)在關(guān)于AD的治療方法也是多方面的，其中膽堿酯酶抑制藥仍是首選的治療方法。但這些藥物只能改善患者的認知、記憶功能障礙等癥狀，并且作用靶點單一，并不能從根本上阻斷AD的發(fā)展進程，故而尋找新的有效治療AD藥物仍是廣大醫(yī)藥學(xué)者重要的研究目標(biāo)。傳統(tǒng)中藥治療方法在中國已有幾千年的應(yīng)用歷史，由于其有效成分較多，具有多靶點、多環(huán)節(jié)的作用特點，因而在治療AD方面自然成為最具潛力的方式之一。我國植物資源豐富，在植物中尋找抗AD活性成分一直是植物化學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)研究的主流。

紅樹莓(R.idaeus L.)又稱懸鉤子、木莓等，為薔薇科懸鉤子屬多年生落葉果樹，其果實中除含有這些豐富的營養(yǎng)成分外，還含有一些特殊的功效成分，如揮發(fā)油類、多酚類、萜類、黃酮類等，以及高于其他水果的SOD、水楊酸和樹莓酮等。這些活性成分，使樹莓具有很高的醫(yī)療保健功能。我國應(yīng)用樹莓作為中藥(覆盆子)已有上千年的歷史，在《本草綱目》、《神農(nóng)本草經(jīng)》、《名醫(yī)別錄》等古書中對樹莓的藥用價值有詳細記載。據(jù)《本草綱目》記載：其(樹莓)莖、根、葉、籽皆可入藥,味甘性平，無毒；固腎精，補肝明目，縮尿。民間用于治療腹瀉、目赤、酒精中毒等。在古希臘、中國、印度以及美洲(印第安人)地區(qū)，人們使用樹莓葉治療傷口，腹瀉以及分娩時用作子宮松弛劑和興奮劑；在歐洲民間，樹莓地上部分和葉子也用于治療高血壓。在我國民間樹莓根用于治療高血壓，如新疆蒙古族常用其治療高血壓、肝炎等。樹莓的果實現(xiàn)在已可被利用，但其葉的價值尚未引起人們的足夠重視。

目前對紅樹莓的研究與開發(fā)利用主要集中在紅樹莓果實，因其富含營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)而深受研究者青睞，而樹莓葉大多數(shù)時候被舍棄，沒有被開發(fā)利用，目前尚未見紅樹莓葉中總黃酮富集工藝及抗老年癡呆活性的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本團隊通過抑制Aβ蛋白聚集活性進行活性導(dǎo)向追蹤，發(fā)現(xiàn)紅樹莓葉提取物的70％D101大孔樹脂洗脫部分有較好的抑制Aβ蛋白聚集活性，再經(jīng)過聚酰胺及CHP20樹脂等對有效部位進一步富集，使總黃酮含量達到80％以上，同時活性大幅提高。確定該有效部位(總黃酮)為紅樹莓葉的抑制Aβ蛋白聚集的有效部位，同時，我們對精制后的總黃酮進行了老年癡呆模型大鼠的水迷宮實驗，結(jié)果顯示紅樹莓葉總黃酮具有顯著的抗AD活性。

一種紅樹莓葉中具有抗AD活性的總黃酮的提取工藝，包括以下步驟：

A、取紅樹莓葉原料陰干，用5-10倍體積量的乙醇水溶液提取2-3次，乙醇溶液的體積濃度為50％-100％，提取采用加熱回流提?。?/p>

B、將提取液合并后減壓濃縮，除去乙醇，減壓濃縮干燥即得浸膏；

C、浸膏加水混懸后，上D101大孔樹脂，水洗脫5-8個體積后再用體積濃度50％-70％乙醇溶液洗脫至流出液無色，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮干燥即得到粗黃酮浸膏(總黃酮含量35％以上)；

D、上步所得浸膏加醇溶解后，與2倍重量的聚酰胺填料混合，常溫拌樣干燥，取5倍重量的聚酰胺填料作為柱填料，10％-20％乙醇溶液洗脫5-8個體積后，再用濃度70％-90％的乙醇溶液洗脫至流出液無色，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮干燥得到純度更高的總黃酮浸膏(總黃酮含量60％以上)；

E、上步所得浸膏加水混懸后，上CHP20樹脂，水洗脫5-8個體積后再用體積濃度40％-60％乙醇溶液洗脫至流出液無色，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮干燥即得到高純度精制黃酮浸膏(總黃酮含量80％以上)。

所得的提取物利用FeCl₃顏色反應(yīng)呈陽性，且HCl-Mg反應(yīng)呈陽性，確定所得提取物為總黃酮。利用可見分光光度法(中國藥典一部附錄Ⅴ_A)，以蘆丁(自制，純度98％)為對照品，并采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法，根據(jù)黃酮類化合物與鋁鹽反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物，檢測波長510nm，用于檢測各個色譜洗脫柱所獲得總黃酮的含量。

本發(fā)明將紅樹莓葉原料用50％-100％乙醇溶液浸泡，再對其加熱回流提取，減壓濃縮得到粗提物后用水混懸，經(jīng)大孔樹脂以水醇系統(tǒng)洗脫可初步得到粗總黃酮，再通過聚酰胺及CHP20樹脂柱色譜獲得更高純度的總黃酮。

本方案相比于傳統(tǒng)方案的有益之處在于：

(1)本發(fā)明采用的原料為紅樹莓副產(chǎn)物樹莓葉，成本低廉，其價值尚未引起人們的足夠重視，其制成品在市場上尚未存在。

(2)利用我國樹莓資源豐富的特點，研究紅樹莓葉加工利用的新技術(shù)、新工藝，以求生產(chǎn)出新型的樹莓葉加工品是突破樹莓當(dāng)前發(fā)展局限的一條途徑，從長遠的發(fā)展來看,大力發(fā)展我們自己的樹莓葉加工產(chǎn)業(yè)潛力巨大，前景廣闊。

(3)在抑制Aβ蛋白抑制活性追蹤的指導(dǎo)下對原藥材中的有效部位進行了充分的提純、濃縮及富集，得到其總黃酮(其有效部位)，利用分光光度法測定總黃酮含量，其含量達到80％，遠優(yōu)于其粗提物直接入藥。

(4)用本方法獲得的總黃酮，具有顯著的抑制Aβ蛋白聚集活性，以及在老年癡呆模型大鼠的水迷宮實驗中顯示了良好的抗AD活性，同時，樹莓作為一種藥食同源植物，其毒副作用必然較小，在抗老年癡呆癥藥物的研究開發(fā)中勢必具有廣闊的前景。

(5)本發(fā)明方法設(shè)計合理，具有工藝簡單、成本低、能耗低和生產(chǎn)過程污染低的特點。

附圖說明

圖1：紅樹莓葉精黃酮對水迷宮實驗中大鼠潛伏期的影響圖(mean±SD，n＝10)，注：與假手術(shù)組相比，**p<0.01；與模型組相比，**p<0.01。

圖2：紅樹莓精黃酮對水迷宮實驗中大鼠在目標(biāo)象限所待時間的影響圖(mean±SD，n＝10)，注：與假手術(shù)組相比，**p<0.01；與模型組相比，**p<0.01。

圖3：紅樹莓精黃酮對水迷宮實驗中大鼠穿過平臺位置次數(shù)的影響圖(mean±SD，n＝10)，注：與假手術(shù)組相比，**p<0.01；與模型組相比，**p<0.01。

具體實施方式

實施例1紅樹莓葉總黃酮的富集

取紅樹莓葉1000g粉碎，加8000mL 60％乙醇溶液，回流提取2小時，過濾后濾渣再加3000mL 60％乙醇溶液回流提取1小時，合并兩次濾液，減壓回收乙醇，得到浸膏。將此浸膏用1000mL水混懸后上D101大孔樹脂，水洗脫5個體積后再分別用體積分數(shù)為60％乙醇溶液洗脫至流出液近無色，收集洗脫液，減壓回收乙醇，噴霧干燥得到干燥粉末，得到95.2g總黃酮。

利用FeCl3顏色反應(yīng)呈陽性，且HCl-Mg反應(yīng)呈陽性，確定所得提取物為總黃酮。利用可見分光光度法(中國藥典一部附錄Ⅴ_A)，以蘆丁(自制，純度98％)為對照品，并采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法，根據(jù)黃酮類化合物與鋁鹽反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物，檢測波長510nm，檢測結(jié)果顯示所得餾分中，其總黃酮含量為38％。經(jīng)抑制Aβ蛋白聚集實驗，具體實驗方法如下：

1、Aβ的預(yù)處理

將預(yù)先保存于-80℃冰箱中的Aβ取出，以1mg/mL的濃度溶于HFIP中。室溫下靜置30min待其二級結(jié)構(gòu)完全去除后，真空冷凍干燥去除HFIP，并置于-20℃冰箱中保存。

2、磷酸緩沖液(PBS,pH＝7.4,0.1M)制備

緩沖液的制備(PBS,buffer)：pH＝7.4，濃度為0.1mol/mL。參照中華人民共和國藥典2010年版第二部附錄，取磷酸二氫鉀1.36g，加0.l mol/L氫氧化鈉溶液79mL，用水稀釋至200mL，用精密pH酸度計進行校正，即得。

3、Aβ反應(yīng)試液的制備

取預(yù)處理后的Aβ凍干粉，用pH＝7.4的0.1mol/mL PBS將其配制成50μmol/L的Aβ試液，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

4、顯色劑配置

精密稱取Th-T粉末，用pH＝7.4的0.1mol/mL PBS，配制成為10μmol/L的Th-T試液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5、化合物溶液的配制

用pH＝7.4的0.1mol/mL PBS和DMSO，將VE和待測樣品分別配置濃度為10^-3，10^-4，10^-5，10^-6和10^-7mol/L，DMSO的最終體積分數(shù)不大于0.001。

6、測定方法

組別設(shè)置：

(1)空白對照組：PBS 60μL,Aβ10μL,PBS+DMSO 10μL

(2)樣品抑制組：PBS 60μL,Aβ10μL,藥物10μL

(3)空白本底組：PBS 60μL,PBS 10μL,PBS+DMSO 10μL

(4)樣品本底組：PBS 60μL,PBS 10μL,藥物10μL

于96孔板分別加入上述各組溶液，置于恒溫孵育箱中37℃孵育24h，然后向各組中加入80μL Th-T溶液，置于恒溫孵育箱中37℃孵育5min，用酶標(biāo)儀于(λex＝450nm；λem＝485nm)處測定各組熒光值。每組重復(fù)3次。

7、結(jié)果分析：

以Aβ單獨孵育后用Th-T測定的485nm處熒光值作為對照：為了避免化合物本身具有的熒光對結(jié)果的干擾，以扣除單獨受試化合物用Th-T測定的熒光值作為本底。抑制率的計算公式如下：

結(jié)果顯示：其對該蛋白的抑制率達到49.5％，其中陽性對照藥(姜黃素)抑制率為60.1％，結(jié)果顯示本實施例獲得的總黃酮抑制Aβ蛋白的活性稍弱于陽性藥。

實施例2紅樹莓葉總黃酮的富集

取實施例1所制備的粗品黃酮95.2g，加醇溶解后，與2倍重量的聚酰胺填料混合，常溫拌樣干燥，取5倍重量的聚酰胺填料作為柱填料，15％乙醇溶液洗脫5個體積后，再用濃度80％的乙醇溶液洗脫至流出液無色，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮干燥得到純度更高的總黃酮浸膏62.8g。

利用可見分光光度法(中國藥典一部附錄Ⅴ_A)，以蘆丁(自制，純度98％)為對照品，并采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法，根據(jù)黃酮類化合物與鋁鹽反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物，檢測波長510nm，檢測結(jié)果顯示所得餾分總黃酮含量為62％。經(jīng)抑制Aβ蛋白聚集實驗，具體實驗方法參照實施例1：

結(jié)果顯示：其對該蛋白的抑制率達到59.2％，其中陽性對照藥(姜黃素)抑制率為60.1％，結(jié)果顯示本實施例獲得的總黃酮抑制Aβ蛋白的活性與陽性藥相當(dāng)。

實施例3紅樹莓葉總黃酮的富集

取實施例2所制備的黃酮62.8g，加水混懸后，上CHP20樹脂，水洗脫5個體積后再用體積濃度55％乙醇洗脫至流出液無色，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮干燥既得到高純度精制黃酮浸膏33.8g。

利用可見分光光度法(中國藥典一部附錄Ⅴ_A)，以蘆丁(自制，純度98％)為對照品，并采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法，根據(jù)黃酮類化合物與鋁鹽反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物，檢測波長510nm，檢測結(jié)果顯示所得餾分總黃酮含量為82％。經(jīng)抑制Aβ蛋白聚集實驗，具體實驗方法參照實施例1。

結(jié)果顯示：其對該蛋白的抑制率達到87.4％，其中陽性對照藥(姜黃素)抑制率為60.1％，結(jié)果顯示本實施例獲得的總黃酮抑制Aβ蛋白的活性強于陽性藥。

取本次實施例精制后總黃酮含量超過80％的樣品，進行實施例4的老年癡呆模型大鼠的水迷宮實驗。

實施例4老年癡呆模型大鼠的水迷宮實驗

取SD大鼠，雄性，體重250-300g，建立大鼠老年癡呆模型，動物隨機分為6組：

假手術(shù)組(Sham)：動物不造模，灌胃給生理鹽水，每日一次，連續(xù)給藥30天；

模型組(Model)：動物造模后，灌胃給生理鹽水，每日一次，連續(xù)給藥30天；

陽性對照組(Donepezil)：動物造模后，灌胃給多奈哌齊1.5mg/kg，每日一次，連續(xù)給藥30天；

紅樹莓葉三種色譜柱精制總黃酮(RLTF)低劑量組：動物造模后，灌胃給紅樹莓葉總黃酮10mg/kg，每日一次，連續(xù)給藥30天；

紅樹莓葉三種色譜柱精制總黃酮(RLTF)中劑量組：動物造模后，灌胃給紅樹莓葉總黃酮50mg/kg，每日一次，連續(xù)給藥30天；

紅樹莓葉三種色譜柱精制總黃酮(RLTF)高劑量組：動物造模后，灌胃給紅樹莓葉總黃酮100mg/kg，每日一次，連續(xù)給藥30天。

應(yīng)用水迷宮實驗觀察大鼠的認知功能。水迷宮儀器由一圓形水池和一可移動的圓形平臺組成，水池直徑100cm，水深40cm，水溫控制在23±1℃，平臺直徑15cm，水面高出平臺2cm。實驗時，平臺放置于第一象限的中間，水池上方設(shè)置自動攝像系統(tǒng)并連接計算機，跟蹤記錄大鼠的游泳軌跡，自動計算出大鼠在水池中游過的路程及找到平臺所需要的時間。正式實驗前，將動物放置在平臺上使其適應(yīng)10s，然后將大鼠放入水中，觀察90s內(nèi)的運動情況。記錄大鼠找到平臺所需要的時間，若動物90s內(nèi)未找到平臺，將其輕輕放置于平臺上并持續(xù)15s，再放回籠中。每天訓(xùn)練動物三次，連續(xù)3天，然后開始正式實驗。觀察大鼠自放入水池中至找到平臺所需要的時間，超過90s，則時間計為90s，每天一次，連續(xù)5天。實驗結(jié)束后，各動物休息一天，再進行記憶實驗。將平臺撤出，大鼠從第三象限放入水池，觀察并記錄120s內(nèi)各大鼠在第一象限所在的時間以及經(jīng)過平臺所在位置的次數(shù)。

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在5天實驗中，找到平臺的時間明顯增加(潛伏期)，穿過第一象限次數(shù)及在第一象限所待的時間明顯下降。與模型組比較，紅樹莓葉精制總黃酮50mg/kg、100mg/kg劑量組可明顯降低大鼠的潛伏期，增加通過第一象限的次數(shù)及延長在第一象限所待的時間，差異有顯著性(P＜0.01)。其效果與多哌奈齊組相似。具體參見圖1、圖2及圖3。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。