本發(fā)明涉及一種弱毒疫苗及其制備方法和用途，特別涉及一種綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗及其制備方法和用途，本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

羊痘病毒(Capripoxvirus,CPV)為痘病毒科脊椎動(dòng)物痘病毒亞科羊痘病毒屬成員。該屬成員有山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)、綿羊痘病毒(Sheep pox virus,SPPV)和牛結(jié)節(jié)性疹塊病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)。羊痘是由羊痘病毒引起的一種急性、接觸性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(FAO/OIE)列為93種必須報(bào)告的動(dòng)物疫病之一，我國(guó)將其列為一類傳染病。其發(fā)病率可達(dá)75％以上，死亡率可達(dá)50％以上，羔羊死亡率可達(dá)100％，同時(shí)還可導(dǎo)致母羊流產(chǎn)。羊痘是古老的疾病之一，1879年Hansen首次報(bào)道了挪威的山羊痘。后來(lái)，陸續(xù)在世界其他地區(qū)報(bào)道了該病。廣泛分布于非洲、中東、印度次大陸、北歐、地中海各國(guó)及德國(guó)、澳大利亞、美國(guó)等，特別是非洲北部、中東和亞洲的部分國(guó)家流行較為嚴(yán)重。與我國(guó)接壤的周邊國(guó)家，如印度、孟加拉、尼伯爾、巴基斯坦、俄羅斯、蒙古等不少國(guó)家均有本病的流行。近年來(lái)我國(guó)的江蘇、廣東、貴州、山東、浙江、廣西、甘肅、黑龍江等地均有本病流行。該病的爆發(fā)和流行使家畜的生產(chǎn)力下降，活畜及畜產(chǎn)品貿(mào)易停滯，給養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。綿羊痘病毒(Sheep pox)是綿羊的一種高度接觸性傳染病。自然狀況下，羊痘病毒具有高度的宿主特異性，山羊痘只引起山羊發(fā)??；綿羊痘只引起綿羊發(fā)病。但這種宿主特異性常隨分離株的不同而變化。

羊傳染性膿皰病(Contagious ecthyma,CE)又名羊傳染性膿皰性皮炎(Contagious pustular dermatitis)，俗稱“羊口瘡(Orf)”，是由副痘病毒成員羊傳染性膿皰病毒(Orf virus,ORFV)感染引起山羊、綿羊和人的一種急性、接觸性和嗜上皮性的人獸共患傳染病,以在患羊的口唇、蹄、乳房、外陰等處皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和疣狀結(jié)痂為特征。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為需申報(bào)類動(dòng)物疾病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。該病最早發(fā)現(xiàn)于歐洲，目前，幾乎在所有養(yǎng)羊國(guó)家和地區(qū)均存在。自然情況下主要侵害綿羊和山羊，山羊較為多發(fā)。此外，駱駝、牛、鹿、麝牛、貓、幼犬、猴和人均有易感性。本病常呈群發(fā)性流行的趨勢(shì)，3～6月齡羔羊最易感染，常引起群體發(fā)病，尤其是飼養(yǎng)密集的羊群。范春玲等報(bào)道了我國(guó)2006年在北京市亞福動(dòng)物養(yǎng)殖中心暴發(fā)該病，該病傳播速度快，發(fā)病率高達(dá)95.4％。近年來(lái)隨著肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和羊頻繁流動(dòng)，該病時(shí)有發(fā)生，甚至在一些大型種羊場(chǎng)都有該病的流行，給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。更為嚴(yán)重的是，此病可以通過(guò)傷口感染飼養(yǎng)人員，感染者表現(xiàn)為手背、指間和前臂部皰疹和破潰。例如2005年8月福建省永安市有8名羊場(chǎng)養(yǎng)殖工人因感染羊傳染性膿皰病毒而發(fā)病?？梢?jiàn)，羊傳染性膿皰不但嚴(yán)重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，而且威脅人類的身體健康，是一種危害較為嚴(yán)重的人畜共患傳染病。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外綿羊痘、羊口瘡頻繁爆發(fā)，而綿羊痘、羊口瘡尚無(wú)有效的治療方法，免疫接種是預(yù)防羊口瘡唯一行之有效的措施。目前尚無(wú)一種能夠一針?lè)纼刹〉木d羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗。目前綿羊痘、羊口瘡疫苗的研發(fā)和應(yīng)用主要集中在常規(guī)疫苗，如滅活疫苗和細(xì)胞弱毒疫苗，以及新型疫苗，如囊膜亞單位疫苗、核酸疫苗和重組疫苗上。但是目前，羊痘、羊口瘡新型疫苗的研制還處于試驗(yàn)階段，且新型疫苗往往制備過(guò)程繁瑣、技術(shù)要求高，應(yīng)用于臨床還有很長(zhǎng)一段路要走。羊痘、羊口瘡滅活疫苗雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者均有研究，但其免疫效果有限，從未真正應(yīng)用于臨床。目前，在臨床上應(yīng)用較為廣泛的仍然是羊痘、羊口瘡弱毒疫苗，因?yàn)樗哂杏昧可?，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫能力，且產(chǎn)生免疫保護(hù)力的時(shí)間持久的特點(diǎn)。在國(guó)內(nèi)，雖然羊口瘡弱毒疫苗在青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)研究所和甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所均有研制，但其生產(chǎn)工藝復(fù)雜、落后，凍干保護(hù)劑不耐熱等諸多生產(chǎn)工藝瓶頸問(wèn)題，是該疫苗無(wú)法量產(chǎn)，目前該疫苗處于有品無(wú)苗的局面。另外，該弱毒都是上世紀(jì)80年代前后的毒株，目前國(guó)內(nèi)流行毒可能發(fā)生變異，很難保證其免疫的有效性。綿羊痘弱毒疫苗在國(guó)內(nèi)幾家疫苗廠家均有生產(chǎn)，但該疫苗生產(chǎn)過(guò)程需要羊睪丸原代細(xì)胞，凍干保護(hù)劑不耐熱等工藝問(wèn)題，使該疫苗生產(chǎn)、運(yùn)輸及保存成本過(guò)高。綿羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗研究，尚屬空白。國(guó)內(nèi)外學(xué)者現(xiàn)已證實(shí)，羊痘弱毒疫苗對(duì)處于同科的羊口瘡病毒具有部分交叉免疫保護(hù)。因此，研制一種抗原譜廣、免疫原性好、制苗工藝簡(jiǎn)單的綿羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗，對(duì)預(yù)防國(guó)內(nèi)羊痘、羊口瘡爆發(fā)和流行具有一加一大于二的現(xiàn)實(shí)意義。

本發(fā)明選用自行分離獲得的ORFV湖北通山縣分離毒株(Orf virus HB09株)和SPPV甘肅武威分離毒株(Sheeppox Virus GS-WW 2010株)作為疫苗研制的候選毒株，利用牛/羊睪丸支持細(xì)胞系和雞胚成纖維原代細(xì)胞傳代致弱，培育出符合“獸用新生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”的ORFV和GTPV弱毒疫苗株，配比一定比例的耐熱凍干保護(hù)劑制備凍干弱毒疫苗。攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示所制備的綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗能夠產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)力。因此，本發(fā)明利用ORFV、SPPV流行毒株研制安全、高效的弱毒疫苗對(duì)于綿羊痘、羊口瘡的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有羊痘、羊口瘡弱毒疫苗的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗及其制備方法，以實(shí)現(xiàn)用簡(jiǎn)單實(shí)用的制備方法生產(chǎn)出產(chǎn)量高、抗原譜廣、穩(wěn)定性好、成本低、安全可靠的疫苗。

本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的一種綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗，其特征在于其有效成分包括綿羊痘病毒細(xì)胞傳代致弱毒以及羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒，其中，所述綿羊痘病毒細(xì)胞傳代致弱毒為綿羊痘病毒細(xì)胞傳代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2015年1月14日，保藏編號(hào)為CCTCC NO：V201504；所述的羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒為羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2014年3月19日，保藏編號(hào)為CCTCC NO：V201406。

其中，所述的綿羊痘病毒細(xì)胞傳代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株已記載在公開(kāi)號(hào)為CN104800842A，發(fā)明名稱為“一種山羊痘、綿羊痘二價(jià)細(xì)胞弱毒疫苗及其制備方法和應(yīng)用”的專利申請(qǐng)中，并于2015年7月29日公開(kāi)。

其中，羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株，已記載在公開(kāi)號(hào)為CN104017776A，發(fā)明名稱為“一種羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒疫苗及其制備方法和應(yīng)用”的專利申請(qǐng)中，并于2016年4月6日公開(kāi)。

此外，本發(fā)明還提供了一種制備綿羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)病毒抗原的制備

選生長(zhǎng)良好布滿單層的新生牛睪丸支持細(xì)胞系和羔羊睪丸支持細(xì)胞系，傾去營(yíng)養(yǎng)液，按原營(yíng)養(yǎng)液體積的1-10％分別接種所述的羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株以及綿羊痘病毒細(xì)胞傳代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株的細(xì)胞病毒液，吸附5-15分鐘后加DMEM維持液，調(diào)pH至7.0～7.2，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37℃、5％CO2濃度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)40～72h，細(xì)胞病變達(dá)到75％以上時(shí)收獲病毒，置-20℃冰箱反復(fù)凍融兩次，然后進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)，達(dá)到《中華人民共和國(guó)獸醫(yī)生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo)，且病毒滴度不低于10^-3.5TCID₅₀/0.1ml時(shí)，作為綿羊痘、羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒抗原，備用；

(2)疫苗的配制和凍干

將步驟(1)制備的各項(xiàng)指標(biāo)都合格的綿羊痘、羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒抗原以體積比1︰1混合，再與耐熱凍干保護(hù)劑以體積比1︰1的比例混勻后，以2mL/瓶無(wú)菌條件下封裝于鏈瓶?jī)?nèi)，在低溫冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行凍干，即為綿羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗，將其在2℃-8℃下保存。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的新生牛睪丸支持細(xì)胞系為新生牛睪丸支持細(xì)胞系NBSC，該細(xì)胞系保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為CCTCC NO：C201438。該細(xì)胞系已記載在公開(kāi)號(hào)為CN103952377A，發(fā)明名稱為“一種用于羊傳染性膿皰病毒分離培養(yǎng)和增殖的細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用”的專利申請(qǐng)中，并于2016年3月30日公開(kāi)。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的羔羊睪丸支持細(xì)胞系為羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系，命名為羔羊睪丸支持細(xì)胞LSC，分類命名為羔羊睪丸支持細(xì)胞LSC，該細(xì)胞系保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為CCTCC NO：C2016120，保藏時(shí)間為2016年6月3日。

本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所獲得的羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)，對(duì)接種羊痘病毒較為敏感，用該細(xì)胞系所增殖的病毒滴度較采用羔羊睪丸原代細(xì)胞高約1.5個(gè)病毒滴度；比Vero細(xì)胞高2.5個(gè)病毒滴度；比BHK₂₁細(xì)胞高2.3個(gè)病毒滴度。利用該細(xì)胞系分離羊痘病毒(GTPV或SPPV)可以保證病毒的均一、穩(wěn)定，同時(shí)可以避免因多次利用原代細(xì)胞而使所分離的病毒帶有其他病原的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)利用該傳代細(xì)胞系制備疫苗，可簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，同時(shí)還保證了制備得到的羊痘疫苗的質(zhì)量保持穩(wěn)定，

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，按原營(yíng)養(yǎng)液體積的5％分別接種所述的羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株以及綿羊痘病毒細(xì)胞傳代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株的病毒液，吸附10分鐘后加DMEM維持液，調(diào)pH至7.0～7.2，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37℃、5％CO2濃度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述耐熱凍干保護(hù)劑中含有海藻糖30～70g/L，脫脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明膠5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，維生素C 1～5g/L，剩余成分為超純水。更優(yōu)選的，所述耐熱凍干保護(hù)劑中含有海藻糖50g/L，脫脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸1.5g/L，維生素C 2.5g/L，剩余成分為超純水。

所述的耐熱凍干保護(hù)劑的制備方法包括：(1)對(duì)可高壓滅菌的物質(zhì)：海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脫脂奶粉、明膠按各自比例溶于超純水中，加熱至50～60℃溶解后，116℃滅菌30分鐘；(2)將不耐高溫的物質(zhì)精氨酸、維生素C也按各自比例溶于超純水中，用孔徑為0.22μm濾膜過(guò)濾除菌：各組分別將(1)、(2)兩組份混合，得到所述的耐熱凍干保護(hù)劑。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、選用流行毒株的細(xì)胞傳代致弱毒來(lái)制備疫苗，保證了疫苗的免疫保護(hù)力；

2、利用本實(shí)驗(yàn)室研制的針對(duì)SPPV和ORFV病毒的耐熱凍干保護(hù)劑，解決了痘病毒活疫苗僅能在-15℃條件下保存和運(yùn)輸?shù)钠款i技術(shù)，使該疫苗儲(chǔ)存、運(yùn)輸更方便。

3、在疫苗的制備方法中分別采用新生牛睪丸支持細(xì)胞系NBSC以及羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)制備羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株以及綿羊痘病毒細(xì)胞傳代致弱疫苗株Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株的病毒液，提高了病毒滴度，并且可以保證病毒的均一、穩(wěn)定，同時(shí)可以避免因多次利用原代細(xì)胞而使所分離的病毒帶有其他病原的風(fēng)險(xiǎn)。此外利用該傳代細(xì)胞系制備疫苗，可簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，同時(shí)還保證了制備得到的羊痘疫苗的質(zhì)量保持穩(wěn)定。

本發(fā)明將為臨床上針對(duì)綿羊痘、羊口瘡病的防控以及綿羊痘、羊口瘡病毒在羊群中的清除提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為37℃、38.5℃和39.5℃條件下羔羊睪丸原代細(xì)胞體外生長(zhǎng)曲線；

圖2為羔羊睪丸支持細(xì)胞及其自然傳代細(xì)胞的體外培養(yǎng)；

A：消化后培養(yǎng)0小時(shí)的支持細(xì)胞；B：培養(yǎng)2h的支持細(xì)胞；C：培養(yǎng)12h的支持細(xì)胞；D：培養(yǎng)72h的支持細(xì)胞；E：培養(yǎng)2h的自然傳代細(xì)胞(LSC)；F：培養(yǎng)72h的自然傳代細(xì)胞(LSC)；

圖3為羔羊睪丸支持細(xì)胞及其自然傳代細(xì)胞的鑒定。

A：分離純化培養(yǎng)的第3代支持細(xì)胞HE染色；B：自然傳代第10代LSC細(xì)胞HE染色；C：分離純化培養(yǎng)的第3代支持細(xì)胞FasL蛋白檢測(cè)；D：分離純化培養(yǎng)的第三代支持細(xì)胞FasL蛋白檢測(cè)結(jié)果；E：自然傳代第10代LSC細(xì)胞FasL蛋白檢測(cè)；F：自然傳代第10代LSC細(xì)胞FasL蛋白檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨具體實(shí)施例的描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不多本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案和細(xì)節(jié)形式和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1羊睪丸支持細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

1.1羊睪丸原代細(xì)胞的制備

選健康母羊(體質(zhì)健康且口蹄疫、布氏桿菌、結(jié)核檢測(cè)為陰性)所生的健康公羔羊，屠宰后采集陰囊(陰囊根部結(jié)扎，陰囊外部用75％酒精消毒)，恒溫箱內(nèi)，2小時(shí)內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。用眼科鑷子和剪刀將睪丸實(shí)質(zhì)剪切成約1mm×3mm的小塊，在D-hanks液中輕輕吹打數(shù)次，去除上清，將小組織塊放入50mL離心管中加入10倍體積的含0.1wt％IV型膠原酶(GIBCO)、0.25wt％胰酶(GIBCO)的消化液4℃消化12h或過(guò)夜，用等體積含10％(v/v)新生牛血清(GIBCO)的DMEM培養(yǎng)液(HyClone)終止消化。用吸管柔和吹打數(shù)次后，用200目銅網(wǎng)過(guò)濾。收集消化液1000r/min離心10min，棄上清，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液漂洗2次，棄上清，加入含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。

1.2不同培養(yǎng)條件下羊睪丸原代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將1.1節(jié)中制備的羊睪丸原代細(xì)胞懸液以1-2×10⁶個(gè)/mL的密度接種到培養(yǎng)瓶中，分三組，每組5瓶，分別置37℃、38.5℃、39.5℃，5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，換液，棄未貼壁細(xì)胞，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)純化、傳代培養(yǎng)3代。

將上述制備的新生羊睪丸支持細(xì)胞(第三代)以1×10⁵個(gè)/mL細(xì)胞濃度接種于6塊24孔板中，分別置于37℃、38.5℃和39.5℃5％CO₂、飽和濕度條件下培養(yǎng)(不同溫度各培養(yǎng)2塊)，試驗(yàn)自接種起，每隔24h各取3個(gè)孔細(xì)胞，貼壁支持細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)，取平均值，連續(xù)10d。測(cè)定不同培養(yǎng)溫度條件下支持細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。優(yōu)化最佳純化培養(yǎng)溫度和羊睪丸支持細(xì)胞差速貼壁純化培養(yǎng)條件。

1.3羔羊睪丸支持細(xì)胞的分離、純化培養(yǎng)

將1.1節(jié)中制備的細(xì)胞懸液以1-2×10⁶個(gè)/mL的密度接種到培養(yǎng)瓶中，分三組，每組5瓶，分別置37℃、38.5℃、39.5℃，5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，換液，棄未貼壁細(xì)胞，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)純化、傳代培養(yǎng)3代。然后進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.4羔羊睪丸支持細(xì)胞的鑒定

將1.3節(jié)中分離、純化培養(yǎng)的支持細(xì)胞細(xì)胞系進(jìn)行HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)，采用FasL蛋白進(jìn)行支持細(xì)胞的免疫組化鑒定。

免疫組化方法如下：將培養(yǎng)3d的支持細(xì)胞用4％多聚甲醛溶液固定10min，PBS漂洗3次×5min，山羊血清室溫下封閉孵育20min，加入兔抗大鼠FasL多克隆抗體(abcam公司，1∶100稀釋)一抗混合工作液，37℃孵育3h，PBS漂洗3次，加入FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(abcam公司，1∶50稀釋)二抗混合工作液37℃孵育30min，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，綠色熒光下觀察FasL染色結(jié)果。計(jì)算每視野中FasL陽(yáng)性細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，得到支持細(xì)胞的純度。

1.5羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系的建立

1.3節(jié)中分離純化的羔羊睪丸支持細(xì)胞，在傳代至17-18代時(shí)，細(xì)胞分裂增殖能力下降(羔羊睪丸支持細(xì)胞張滿單層需要4-5d)時(shí)，每周換液一次，持續(xù)一個(gè)月后，將持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞消化，有限稀釋后在96孔板上培養(yǎng)(每孔培養(yǎng)細(xì)胞小于5個(gè))，挑選生長(zhǎng)良好，傳代后依然生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，且生長(zhǎng)能力接近低代次睪丸支持細(xì)胞(分離純化的睪丸支持細(xì)胞的第3到13代)。該細(xì)胞即羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系。將該細(xì)胞HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)，采用FasL蛋白進(jìn)行支持細(xì)胞的免疫組化鑒定；同時(shí)對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步傳代試驗(yàn)，跟蹤其傳代培養(yǎng)特性。

1.6結(jié)果

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，37℃和38.5℃培養(yǎng)條件下，羔羊睪丸原代細(xì)胞潛伏期均為2天，之后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；而39.5℃培養(yǎng)條件下的羔羊睪丸原代細(xì)胞潛伏期比37℃和38.52培養(yǎng)條件下的短，提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；隨培養(yǎng)溫度的升高，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞增殖速率增大；原代接種5天后,37℃組、38.5℃組和39.5℃組支持細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期，但39.5℃組支持細(xì)胞平臺(tái)期維持約1天，之后迅速進(jìn)入退化衰亡期；38.5℃組平臺(tái)期維持約4天，之后進(jìn)入衰亡期；而37℃組測(cè)定時(shí)間區(qū)間內(nèi)一直處于平臺(tái)期(圖1)。在羔羊睪丸原代細(xì)胞中數(shù)量最多的是睪丸支持細(xì)胞，因此，該曲線也可說(shuō)明在不同溫度條件下羊睪丸支持細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。由此證明，純化羔羊睪丸支持細(xì)胞的最佳溫度為38.5℃。

經(jīng)38.5℃高溫培養(yǎng)結(jié)合6h差速貼壁，進(jìn)過(guò)三代純化后得到的支持細(xì)胞，剛接種細(xì)胞為圓點(diǎn)狀，折光性強(qiáng)(圖2A)；培養(yǎng)2h開(kāi)始貼壁(圖2B)，伸出突起，胞質(zhì)開(kāi)始鋪展；培養(yǎng)6h后完全貼壁，培養(yǎng)12h后即可進(jìn)入增殖期，細(xì)胞增殖較快，胞質(zhì)開(kāi)始擴(kuò)張，形態(tài)呈現(xiàn)多變形狀(圖2C)；培養(yǎng)24h后，可見(jiàn)胞體較大、呈長(zhǎng)柱狀貼壁生長(zhǎng)、兩側(cè)有多個(gè)突起、折光性較強(qiáng)的細(xì)胞，此即睪丸支持細(xì)胞。培養(yǎng)48h后，睪丸支持細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，呈膜狀生長(zhǎng)于瓶壁,細(xì)胞相互連接成網(wǎng)狀，胞核清晰可見(jiàn)，位于胞體的中央或稍偏位。睪丸支持細(xì)胞的折光性隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，圓型的細(xì)胞貼壁數(shù)量逐漸減少，睪丸支持細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的95％以上，亦有少量成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)；3-4d后，長(zhǎng)滿瓶壁，形成單層細(xì)胞(圖2D)。分離純化的羔羊睪丸支持細(xì)胞，在傳代至18代時(shí)，細(xì)胞分裂增殖能力下降(羔羊睪丸支持細(xì)胞張滿單層需要4-5d)時(shí)，每周換液一次，持續(xù)一個(gè)月后，將持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞消化，有限稀釋后在96孔板上培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)良好，傳代后依然生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，培養(yǎng)2h開(kāi)始貼壁(圖2E)，72h長(zhǎng)滿單層(圖2F)，且生長(zhǎng)能力接近低代次睪丸支持細(xì)胞(圖2D)，該細(xì)胞即羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系。

經(jīng)HE染色，分離純化的支持細(xì)胞和自然傳代培養(yǎng)的LSC，兩者形態(tài)基本一致(圖3A，3B)，其大多呈卵圓形，胞質(zhì)完全鋪開(kāi)，染色呈紅色，而細(xì)胞核染色較深，呈藍(lán)色，形狀呈圓形或橢圓形位于細(xì)胞質(zhì)中央或偏位，核仁明顯，間接免疫熒光檢測(cè)睪丸支持細(xì)胞和自然傳代培養(yǎng)的LSC均高表達(dá)FasL蛋白，均可看到綠色熒光，支持細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)到95％以上(圖3C-F)。

由上證明，用分離純化的羔羊睪丸支持細(xì)胞，進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，將持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞消化，有限稀釋后在96孔板上培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)良好，傳代后依然生長(zhǎng)良好的細(xì)胞。該細(xì)胞即羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系，命名為羔羊睪丸支持細(xì)胞LSC。該細(xì)胞系已于2016年6月3日送交位于武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NO：C2016120。

實(shí)施例2綿羊痘病毒的增殖

綿羊痘病毒可在牛、綿羊、山羊源的組織細(xì)胞上生長(zhǎng)，其中原代或次代羔羊睪丸細(xì)胞(LT)和羔羊腎細(xì)胞(LK)最為敏感；病料接種細(xì)胞后最早可在感染后3d出現(xiàn)少量細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),之后4-6天CPE迅速擴(kuò)展到整個(gè)細(xì)胞層，觀察是否出現(xiàn)CPE最多持續(xù)到14d。典型的CPE為細(xì)胞變圓、細(xì)胞聚集呈束狀結(jié)構(gòu)、細(xì)胞收縮或膨脹、細(xì)胞核空泡化、染色質(zhì)片段化、細(xì)胞單層失去連貫性、細(xì)胞漿中出現(xiàn)包涵體(Adl a等，1971；Joshi等，1994)。除此之外，羊痘病毒也可以在BHK-21細(xì)胞和Vero細(xì)胞上增殖。一些毒株還能在胎牛肌肉細(xì)胞、犢牛腎細(xì)胞和牛腎上皮(MDBK)細(xì)胞系中生長(zhǎng)。

因此，本發(fā)明人選用Vero細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、羔羊睪丸原代細(xì)胞、分離純化的睪丸支持細(xì)胞和羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)五種細(xì)胞接種同一毒株、同一代次的綿羊痘病毒進(jìn)行平行對(duì)比，來(lái)比較這三種細(xì)胞對(duì)該病毒的增殖情況。同時(shí)，將分離純化培養(yǎng)的新生牛睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)一步研究該細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)特性及利用該細(xì)胞系增殖病毒的特性。

2.1綿羊痘病毒對(duì)Vero細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、羔羊睪丸原代細(xì)胞、分離純化的睪丸支持細(xì)胞和羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)敏感性試驗(yàn)

將生長(zhǎng)良好鋪滿單層的BHK-21細(xì)胞、Vero細(xì)胞上增殖、羔羊睪丸原代細(xì)胞、分離純化的睪丸支持細(xì)胞和羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)(CCTCC NO：C2016120)各三瓶(營(yíng)養(yǎng)液體積為10ml)，傾去營(yíng)養(yǎng)液，按原營(yíng)養(yǎng)液體積的10％接種綿羊痘病毒細(xì)胞傳代致弱毒Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株(CCTCC NO：V201504)制苗弱毒1ml/瓶，另外一瓶做對(duì)照。病毒吸附30分鐘后加DMEM維持液，調(diào)pH至7.0～7.2，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37℃、5％CO₂濃度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)40～72h，逐日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞病變(Cytopathic effect,CPE)情況。當(dāng)CPE達(dá)到75％時(shí)收獲病毒，置-20℃冰箱凍融兩次，然后進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)合格后，用Reed-Muench法測(cè)定利用三種不同細(xì)胞增殖病毒的TCID₅₀/0.1ml。結(jié)果見(jiàn)表1所示：

表1三種細(xì)胞對(duì)SPPV病毒的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Vero細(xì)胞在接種病毒后60h出現(xiàn)細(xì)胞即呈現(xiàn)折光性增強(qiáng)、變圓、聚堆等細(xì)胞病變(Cytopathic effect,CPE)，后期細(xì)胞發(fā)生皺縮，甚至脫落，CPE達(dá)到75％以上，需要140h；BHK₂₁細(xì)胞出現(xiàn)CPE在73h左右，CPE達(dá)到75％以上，需要145h；羔羊牛睪丸原代細(xì)胞和羔羊睪丸支持細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(Cytopathic effect,CPE)時(shí)間相當(dāng)都在接種病毒后36小時(shí)，但羔羊睪丸原代細(xì)胞CPE病變速度較睪丸支持細(xì)胞慢。CPE達(dá)到約75％羔羊睪丸原代細(xì)胞約96小時(shí)左右，而分離純化的羔羊睪丸支持細(xì)胞在72小時(shí)左右；分離純化的的羔羊睪丸支持細(xì)胞和本發(fā)明的羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)，其生長(zhǎng)特性，接種羊痘病毒后的CPE出現(xiàn)時(shí)間和收獲病毒時(shí)間等各項(xiàng)參數(shù)都無(wú)差異。收獲病毒，凍融兩次后用Reed-Muench法測(cè)定利用三種不同細(xì)胞增殖病毒的TCID₅₀/0.1ml。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Vero細(xì)胞增殖SPPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml為2.0；BHK₂₁細(xì)胞增殖SPPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml為2.0；羔羊睪丸原代細(xì)胞增殖SPPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml為3.2；羔羊睪丸支持細(xì)胞增殖SPPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml為4.50；本發(fā)明的羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)增殖SPPV病毒lgTCID₅₀/0.1ml為4.50。

以上實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)與分離純化的睪丸支持細(xì)胞對(duì)羊痘病毒在試驗(yàn)所選五株細(xì)胞中最為敏感，且病毒增殖效率最高，病毒滴度比試驗(yàn)和生產(chǎn)常用的羔羊睪丸原代細(xì)胞高1.3個(gè)滴度，同時(shí)比采用BHK21、Vero傳代細(xì)胞系高2.5個(gè)滴度。

2.2羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)的傳代及其對(duì)SPPV的增殖試驗(yàn)

用分離純化的羔羊睪丸支持細(xì)胞，在傳代至17-18代時(shí)，細(xì)胞分裂增殖能力下降(羔羊睪丸支持細(xì)胞張滿單層需要4-5d)時(shí)，每周換液一次，持續(xù)一個(gè)月后，將持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞消化，用有限稀釋后在96孔板上培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)良好，傳代后依然生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，且生長(zhǎng)能力接近低代次睪丸支持細(xì)胞(分離純化的LSC第3到13代)。該細(xì)胞即羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)。

將分離的羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)(CCTCC NO：C2016120)繼續(xù)傳代(每代細(xì)胞都按1:2進(jìn)行消化傳代)，每隔5代細(xì)胞，將鋪滿單層細(xì)胞以1ml/瓶(25ml細(xì)胞瓶，營(yíng)養(yǎng)液體積為10ml)接種山羊痘病毒細(xì)胞傳代致弱毒Goatpox Virus HN-XY2010F43株(保藏號(hào)：CCTCC V201503)細(xì)胞毒液各兩瓶，一瓶做對(duì)照，進(jìn)行細(xì)胞傳代試驗(yàn)，方法同2.1節(jié)。每個(gè)試驗(yàn)代次細(xì)胞統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)時(shí)間(鋪滿單層)、接種病毒后病變時(shí)間、以及測(cè)定傳代細(xì)胞接種病毒后收獲病毒毒價(jià)，比較不同代次的傳代細(xì)胞對(duì)SPPV增殖差異，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2自然傳代分離的羔羊睪丸支持細(xì)胞系(LSC)生長(zhǎng)特性及病毒增殖情況

由上表可以看出，羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)繼續(xù)傳代可以傳代30代以上，其生長(zhǎng)特性維持不變，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)間維持在65h左右，并且隨著傳代次數(shù)的增加，其對(duì)SPPV病毒增殖能力維持不變，致細(xì)胞病變(CPE)時(shí)間及最后CPE達(dá)到75％以上收獲病毒所需時(shí)間差異不大，基本維持在65～70h以內(nèi)；接種同一代次的SPPV病毒，其毒價(jià)基本維持在4.20-4.60。結(jié)果說(shuō)明，該分離的羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)在傳代30代時(shí)，其生長(zhǎng)性能及其對(duì)病毒的增殖效率均維持在良好狀態(tài)。由此可以證明，該細(xì)胞系生物學(xué)特性比較穩(wěn)定，該細(xì)胞系無(wú)論對(duì)于分離培養(yǎng)羊痘病毒，還是生產(chǎn)羊痘疫苗來(lái)說(shuō)都是比較好的細(xì)胞系。

實(shí)施例3綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗實(shí)驗(yàn)室試制

3.1綿羊痘、羊傳染性膿皰病毒弱毒抗原的制備

選生長(zhǎng)良好布滿單層的新生牛睪丸支持細(xì)胞系NBSC(CCTCC NO：C201438)和羔羊睪丸支持細(xì)胞系為羔羊睪丸支持細(xì)胞自然傳代細(xì)胞系(LSC)(CCTCC NO：C2016120)，傾去營(yíng)養(yǎng)液，按原營(yíng)養(yǎng)液體積的5％分別接種羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65的病毒液(CCTCC NO：V201406)和綿羊痘病毒細(xì)胞傳代致弱毒Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44(CCTCC NO：V201504)，吸附10分鐘后加DMEM維持液，調(diào)pH至7.0，加青霉素、鏈霉素各100單位/ml，于37℃、5％CO2濃度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48h，細(xì)胞病變(CPE)達(dá)到80％時(shí)收獲，置-20℃冰箱反復(fù)凍融兩次，然后進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)合格達(dá)到《中華人民共和國(guó)獸醫(yī)生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo)，Reed-Muench法測(cè)定Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44的病毒滴度(TCID₅₀/0.1ml)為10^4.5/0.1ml和Orf Virus HB-TS09F65的病毒滴度(TCID₅₀/0.1ml)為10^6.5/0.1ml。各制備綿羊痘、羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞傳代致弱毒病毒液3000ml作為制備疫苗的病毒抗原。

3.2疫苗的配制和凍干

先將3.1節(jié)制備的各項(xiàng)指標(biāo)都合格的綿羊痘、羊傳染性膿皰病毒細(xì)胞弱毒抗原，以體積比1︰1的比例混勻后，再與耐熱凍干保護(hù)劑(海藻糖50g/L，脫脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸1.5g/L，維生素C 2.5g/L，剩余成分為超純水，經(jīng)無(wú)菌處理得到的保護(hù)劑。)以1︰1的比例混和，攪拌均勻后，以2mL/瓶無(wú)菌條件下封裝于鏈瓶?jī)?nèi)，在低溫冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行凍干。即為成品弱毒疫苗，將其在2℃-8℃下溫度保存。共制備弱毒凍干疫苗三批每批1700瓶，批號(hào)為：20151001、20151002、20151003。

實(shí)施例4綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗成品檢驗(yàn)

4.1物理性狀

產(chǎn)品為微黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。

4.2無(wú)菌檢驗(yàn)

從制備保存的20151001、20151002、20151003三批綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗中每批苗隨機(jī)取三瓶，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》，2010版，附錄42頁(yè)進(jìn)行，疫苗成品無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

4.3支原體檢驗(yàn)

從制備保存的20151001、20151002、20151003三批綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗中每批苗隨機(jī)取三瓶，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》，2010版，附錄49頁(yè)進(jìn)行支原體檢驗(yàn)。各代次細(xì)胞毒無(wú)支原體生長(zhǎng)；

4.4外源病毒檢驗(yàn)

從制備保存的20151001、20151002、20151003三批綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗中每批苗隨機(jī)取三瓶，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》，2010版，附錄40頁(yè)進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)。各代次細(xì)胞毒無(wú)外源病毒污染；證明各代次致弱細(xì)胞毒純凈、無(wú)污染。

4.5凍干綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗剩余水分測(cè)定

從制備保存的20151001、20151002、20151003三批綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗中每批苗隨機(jī)取三瓶，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》，2010版，附錄38頁(yè)進(jìn)行測(cè)定，三批疫苗均符合規(guī)定。

4.6凍干綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗真空度測(cè)定

從制備保存的20151001、20151002、20151003三批綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗中每批苗隨機(jī)取三瓶，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》，2010版，附錄48頁(yè)進(jìn)行測(cè)定，三批疫苗均符合規(guī)定。

實(shí)施例5綿羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗安全試驗(yàn)

將實(shí)施例3制備的所有指標(biāo)都達(dá)到“獸用新生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”的三批綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗，隨即取樣，以綿羊痘、羊口瘡病毒不小于10000個(gè)TCID50免疫劑量，(羊口腔黏膜和尾根皮內(nèi)接種)接種1年齡左右健康綿羊和3月齡左右的綿羊羔羊(從未患過(guò)羊痘、也未注射過(guò)羊痘疫苗的符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)的健康綿羊)各4只；以10000個(gè)TCID50的接種劑量(羊口腔黏膜和尾根皮內(nèi)接種)分別接種1年齡左右健康山羊和3月齡左右的山羊羔羊(從未患過(guò)羊痘、也未注射過(guò)羊痘疫苗的符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)的健康山羊)各4只，共接種8組。隨機(jī)挑選綿羊、山羊各一只以1mL劑量接種生理鹽水(羊口腔黏膜和尾根皮內(nèi)接種)做對(duì)照?？谇徽衬澗€接種后每日測(cè)定接種羊和對(duì)照羊的體溫和口腔粘膜的病變情況，觀察15日，進(jìn)行致弱毒株安全性評(píng)價(jià)。

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各批次疫苗的羊只組在觀察期內(nèi)，各試驗(yàn)組羊只，在口腔粘膜均出現(xiàn)紅點(diǎn)，在接種后3天自行消失。對(duì)照羊正常。證明綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗對(duì)綿羊及羔羊、山羊及羔羊均安全、無(wú)致病性。證明綿羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗對(duì)羊只安全。

實(shí)施例6綿羊痘、羊口瘡病毒二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗效力試驗(yàn)

6.1從制備保存的20151001、20151002、20151003三批綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗中每批苗隨機(jī)取三瓶，按原量稀釋混合，用犢牛睪丸原代細(xì)胞測(cè)定半數(shù)感染量(TCID₅₀)，要求羊傳染性膿皰病毒TCID₅₀不低于10⁶/0.1mL，綿羊痘病毒TCID₅₀不低于10^3.5/0.1mL。

6.2每批疫苗免疫成年綿羊及羔羊，成年山羊及羔羊各5只，成年羊接種0.4ml(口腔粘膜劃線接種0.2ml/只和尾根皮內(nèi)接種0.2ml/只)，羔羊減半。隨機(jī)挑選綿羊、山羊各一只以0.4mL劑量接種生理鹽水(羊口腔黏膜和尾根皮內(nèi)接種)做對(duì)照。免疫集中21日后，連同條件相同的對(duì)照羊，隨機(jī)等量分為山羊痘組和羊口瘡組,綿羊痘組用綿羊痘細(xì)胞強(qiáng)毒第16代(Sheeppox Virus GS-WW 2010F16)，以100個(gè)ID50的劑量，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。羊口瘡組用羊口瘡細(xì)胞強(qiáng)毒第15代(Orf Virus HB-TS09F15)，以100個(gè)ID50的劑量，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。觀察10～15天，結(jié)果如表3和4所示。效力試驗(yàn)證明利用綿羊痘弱毒株(Sheeppox Virus GS-WW 2010 F44株)和羊口瘡細(xì)胞弱毒株(Orf Virus HB-TS09F65株)所制備的二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗對(duì)綿羊和山羊免疫保護(hù)力好，可用臨床免疫預(yù)防羊痘和羊口瘡病毒的感染。

表3綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗成年羊效力檢驗(yàn)

表4綿羊痘、羊口瘡二聯(lián)細(xì)胞弱毒疫苗羔羊效力檢驗(yàn)