本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物中有效成分提取及分離技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種蜂膠黃酮的精制方法及蜂膠黃酮和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蜂膠是蜜蜂從植物幼芽、樹皮與樹干裂縫上采集的樹脂，并混入其上顎腺分泌物和蜂蠟加工而成的具芳香氣味的膠狀固體物。蜂膠具有預(yù)防創(chuàng)傷感染、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血脂、降血糖以及抗病原微生物等多種生物學(xué)作用，蜂膠已成為近三十年來市場上最熱門的保健品之一。
蜂膠化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括以下幾類：樹脂類，在蜂膠中占50％～55％，是構(gòu)成蜂膠的主要部分；芳香油和蜂蠟，占蜂膠的30％～40％；花粉，占蜂膠中的一少部分5％～10％。蜂膠的功能性成分有很多，其中主要功能性成分為黃酮類化合物，主要包括以下三大類：黃酮類、黃酮醇類和雙氧黃酮類，如柯因、芹菜素、槲皮素、山萘酚、高良姜素、短葉松素和松屬素等。
目前市場上所有的蜂膠大多是經(jīng)乙醇提取所得，所得產(chǎn)物中總黃酮含量在20％～30％，而且提取物中膠質(zhì)物質(zhì)含量仍較高，粘性強，活性成分組成不明，使得蜂膠制劑所用劑量較大，在一定程度上限制了蜂膠在醫(yī)藥和日化等領(lǐng)域的應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有蜂膠乙醇提取物總黃酮含量相對較低、粘性強、活性成分不明等缺點而提供一種蜂膠黃酮的精制方法。
本發(fā)明目的之二是提供利用上述方法制備的蜂膠黃酮。
本發(fā)明目的之三是提供上述蜂膠黃酮的應(yīng)用。
作為本發(fā)明的一種蜂膠黃酮的精制方法，具有如下步驟：
1)將蜂膠冷凍、粉碎，過篩得到蜂膠粉末；
2)在步驟1)制備的蜂膠粉末中加入水，充分振蕩混合，然后加入NaHCO3水溶液，調(diào)節(jié)pH值9～11，在75～100℃條件下充分振蕩混合20～60分鐘，然后冷卻靜置，分液漏斗萃取、靜置，將萃取液分液獲得第一水相和第一固相；
3)在步驟2)的第一固相中加入水，充分振蕩混合，加入NaOH水溶液，調(diào)節(jié)pH值9～11，在75～100℃條件下充分振蕩混合20～60分鐘，然后冷卻靜置，分液漏斗萃取、靜置，將萃取液分液獲得第二水相和第二固相，第二固相棄用；
4)分別用酸從步驟2)制備的第一水相和步驟3)制備的第二水相中沉淀出第一黃酮類化合物和第二黃酮類化合物；
5)步驟4)所得第一黃酮類化合物和第二黃酮類化合物分別蒸干然后合并得到蜂膠黃酮。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟3)中加入的NaHCO3水溶液的質(zhì)量百分比濃度為3％～8％。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟4)中加入的NaOH水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.1％～0.4％。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟4)中加入的酸為質(zhì)量百分比濃度為3％～6％的HCl。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟4)中酸沉淀終點的pH值為2.5～4。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟5)中蒸干采用真空干燥。
作為本發(fā)明第二方面的蜂膠黃酮，其是有上述方法而得的。
作為本發(fā)明第三方面的蜂膠黃酮在制備保健品、藥品或日用品中的應(yīng)用。
本發(fā)明克服蜂膠常規(guī)乙醇提取物總黃酮含量相對較低、粘性強、產(chǎn)品活性成分組成不穩(wěn)定等技術(shù)缺陷，提供一種性能穩(wěn)定、安全可靠的蜂膠黃酮提取分離方法。
本發(fā)明制備的蜂膠黃酮的性能進行了如下項目測試：
(1)總黃酮含量
總黃酮含量測定：準(zhǔn)確吸取0.2mL稀釋后的待測樣品溶液于10mL容量瓶中，加95％乙醇至總體積3mL，依次加入硝酸鋁溶液(100g/L)0.2ml，醋酸鉀溶液(9.8g/L)0.2mL，搖勻，加水至刻度，混合均勻后，室溫避光反應(yīng)30min，于415nm處測定其吸光值，重復(fù)測定3次。以槲皮素(4～24μg/mL)建立標(biāo)曲，空白對照可用無水乙醇按上述操作處理。
在室溫下乙醇冷浸法對蜂膠總黃酮進行提取,得到蜂膠浸膏,總黃酮含量為20％～31％；采用本專利方法最終得到含量達75％以上的蜂膠總黃酮。
(2)抗氧化實驗
DPPH自由基清除活性：將1mg/mL的樣品儲備液用無水乙醇稀釋一系列的濃度梯度。取上述稀釋液100μL加入100μL 0.1mg/mL DPPH工作液，同時以不加DPPH(以100μL無水乙醇代替DPPH)的供試品溶液各濃度作為對照以消除供試品本身顏色對測試結(jié)果的干擾，并設(shè)DPPH陰性對照(以100μL無水乙醇代替供試品)，每組平行設(shè)2個復(fù)孔。室溫避光反應(yīng)30min后，在517nm處測定吸光度，使其讀數(shù)在0.2-0.8之間。
與現(xiàn)有的蜂膠乙醇提取物相比，本發(fā)明的蜂膠黃酮具有下述特點：
1、總黃酮含量高。
2、去除了膠質(zhì)物質(zhì)，所得產(chǎn)物粘度低。
3、制成品所用劑量小。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明得到的蜂膠提取物中黃酮類化合物含量高，粘性低，擴大了蜂膠黃酮的使用范圍，制劑產(chǎn)品活性成分高，劑量低。
具體實施方式
通過下述實施例將能夠更好地理解本發(fā)明。
實施例1
蜂膠黃酮的精制方法，其步驟如下：
1)將蜂膠冷凍、粉碎，過篩得到蜂膠粉末；
2)蜂膠粉末中加入水，充分振蕩混合，加入質(zhì)量百分比濃度為3％的NaHCO3水溶液，調(diào)節(jié)pH值10，在75～100℃條件下充分振蕩混合40分鐘，然后冷卻靜置，分液漏斗萃取、靜置，將提取液分液獲得第一水相和第一固相；
3)在第一固相中加入水，充分振蕩混合，加入質(zhì)量百分比濃度為0.1％的NaOH水溶液，調(diào)節(jié)pH值11，在75～100℃條件下充分振蕩混合45分鐘，然后冷卻靜置，分液漏斗萃取、靜置，將提取液分液獲得第二水相和第二固相，第二固相棄用；
4)分別用質(zhì)量百分比濃度為3％的HCl從第一水相和第二水相中沉淀出第一黃酮類化合物和第二黃酮類化合物，酸沉淀終點的pH值為2.5；
5)所得第一黃酮類化合物和第二黃酮類化合物分別蒸干，然后合并得到蜂膠黃酮。
按照本說明書描述的方法對本實施例得到的蜂膠黃酮性能進行了測定，其結(jié)果如下：
A、總黃酮含量
在室溫下乙醇冷浸法對蜂膠總黃酮進行提取,得到蜂膠浸膏,總黃酮含量為24.56％；采用本專利方法最終得到含量達78.64％以上的蜂膠總黃酮。B、抗氧化實驗
結(jié)果表明，本申請蜂膠精制黃酮與乙醇提取物抗氧化實驗對比結(jié)果見下表。
結(jié)果顯示本申請產(chǎn)品抗氧化活性明顯高于蜂膠乙醇提取物。可以用于制備保健品、藥品或日用品。
實施例2：
蜂膠黃酮的精制方法，其步驟如下：
1)將蜂膠冷凍、粉碎，過篩得到蜂膠粉末；
2)蜂膠粉末中加入水，充分振蕩混合，加入質(zhì)量百分比濃度為5％的NaHCO3水溶液，調(diào)節(jié)pH值9，在75～100℃條件下充分振蕩混合60分鐘，然后冷卻靜置，分液漏斗萃取、靜置，將提取液分液獲得第一水相和第一固相；
3)在第一固相中加入水，充分振蕩混合，加入質(zhì)量百分比濃度為0.2％的NaOH水溶液，調(diào)節(jié)pH值10，在75～100℃條件下充分振蕩混合40分鐘，然后冷卻靜置，分液漏斗萃取、靜置，將提取液分液獲得第二水相和第二固相，第二固相棄用；
4)分別用質(zhì)量百分比濃度為4.5％的HCl從第一水相和第二水相中沉淀出第一黃酮類化合物和第二黃酮類化合物，酸沉淀終點的pH值為3；
5)所得第一黃酮類化合物和第二黃酮類化合物分別真空干燥，然后合并得到蜂膠黃酮。
按照本說明書描述的方法對本實施例得到的蜂膠黃酮性能進行了測定，其結(jié)果如下：
A、總黃酮含量
在室溫下乙醇冷浸法對蜂膠總黃酮進行提取,得到蜂膠浸膏,總黃酮含量為28.36％；采用本專利方法最終得到含量達82.31％以上的蜂膠總黃酮。B、抗氧化實驗
結(jié)果表明，本申請蜂膠精制黃酮與乙醇提取物抗氧化實驗對比結(jié)果(見下表)。
結(jié)果顯示本申請產(chǎn)品抗氧化活性明顯高于蜂膠乙醇提取物?？梢杂糜谥苽浔＝∑?、藥品或日用品。
實施例3：
蜂膠黃酮的精制方法，其步驟如下：
1)將蜂膠冷凍、粉碎，過篩得到蜂膠粉末；
2)蜂膠粉末中加入水，充分振蕩混合，加入質(zhì)量百分比濃度為8％的NaHCO3水溶液，調(diào)節(jié)pH值11，在75～100℃條件下充分振蕩混合30分鐘，然后冷卻靜置，分液漏斗萃取、靜置，將提取液分液獲得第一水相和第一固相；
3)在第一固相中加入水，充分振蕩混合，加入質(zhì)量百分比濃度為0.4％的NaOH水溶液，調(diào)節(jié)pH值9，在75～100℃條件下充分振蕩混合60分鐘，然后冷卻靜置，分液漏斗萃取、靜置，將提取液分液獲得第二水相和第二固相，第二固相棄用；
4)分別用質(zhì)量百分比濃度為6％的HCl從第一水相和第二水相中沉淀出第一黃酮類化合物和第二黃酮類化合物，酸沉淀終點的pH值為4；
5)所得第一黃酮類化合物和第二黃酮類化合物分別真空干燥，然后合并得到蜂膠黃酮。
按照本說明書描述的方法對本實施例得到的蜂膠黃酮性能進行了測定，其結(jié)果如下：
A、總黃酮含量
在室溫下乙醇冷浸法對蜂膠總黃酮進行提取,得到蜂膠浸膏,總黃酮含量為30.96％；采用本專利方法最終得到含量達83.65％以上的蜂膠總黃酮。
B、抗氧化實驗
結(jié)果表明，本申請蜂膠精制黃酮與乙醇提取物抗氧化實驗對比結(jié)果(見下表)。
結(jié)果顯示本申請產(chǎn)品抗氧化活性明顯高于蜂膠乙醇提取物。可以用于制備保健品、藥品或日用品。