本發(fā)明涉及一種腫瘤治療領(lǐng)域，尤其涉及五谷蟲制品用于制備治療胰腺癌的藥品、保健品或食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：五谷蟲為麗蠅科(Calliphoridae)昆蟲大頭金蠅(ChrysomyiamegacephalaFab.)或其他近緣昆蟲的干燥幼蟲體，在古代醫(yī)書中就有記載，用于治療小兒疳積、膿包瘡。目前記載五谷蟲具有以下藥理作用：1.平喘作用，五谷蟲所含的總氨基酸是平喘的有效成分；2.對(duì)腸平滑的作用，五谷蟲乙醇提取物和五谷蟲總氨基酸粗提取物對(duì)組胺所致離體家兔和豚鼠的回腸平滑肌痙攣均有明顯的爭痙作用；3.毒性，五谷蟲的毒性很小。中國發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朇N200510060277.4申請(qǐng)日2005.08.04)一種具有抗腫瘤生物活性蠅蛆的養(yǎng)殖方法。養(yǎng)殖的蠅蛆經(jīng)過國家新藥篩選中心幾年來多次檢測有對(duì)肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、胃癌、等腫瘤細(xì)胞生長有很強(qiáng)的抑制率，其抗腫瘤生物活性都在75％～97％。中國發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朇N200710067951.0申請(qǐng)日2007.04.10)公開了一類抗腫瘤化合物，該組份從外源物質(zhì)誘導(dǎo)的蠅蛆中提取、分離獲得，具有抑制人原髓細(xì)胞白血病HL－60和人肺腺癌A549細(xì)胞增殖生長的作用。中國發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朇N201310223817.0申請(qǐng)日2013.06.06)公開了一種五谷蟲抗腫瘤新用途，通過五谷蟲抑制小鼠腫瘤重量的作用來表現(xiàn)，五谷蟲能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，能夠在制備抗腫瘤藥物或保健品中應(yīng)用，具體公開了小鼠肉瘤S180的生長抑制。胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90％為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。其發(fā)病率和死亡率近年來明顯上升。5年生存率<1％，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌早期的確診率不高，手術(shù)死亡率較高，而治愈率很低。本病發(fā)病率男性高于女性，男女之比為1.5～2:1，男性患者遠(yuǎn)較絕經(jīng)前的婦女多見，絕經(jīng)后婦女的發(fā)病率與男性相仿。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供五谷蟲制品用于制備治療胰腺癌的藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供五谷蟲制品用于制備抑制胰腺癌的保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供五谷蟲制品用于制備抑制胰腺癌的食品中的應(yīng)用。作為優(yōu)選，上述的五谷蟲制品為五谷蟲干粉和\或五谷蟲提取物以及五谷蟲干粉和\或五谷蟲提取物制備的制劑。作為再優(yōu)選，所述的制劑為膠囊劑、片劑、丸劑、散劑、復(fù)方顆粒劑、保健酒、蛋白粉、口服液或凍干粉。作為優(yōu)選，上述的五谷蟲提取物包括五谷蟲全蟲或五谷蟲干粉的水提取物和有機(jī)溶劑提取物中的一種或多種。作為再優(yōu)選，所述的有機(jī)溶劑提取物中的有機(jī)溶劑包括乙醇、石油醚或己烷中的一種或多種。本發(fā)明的五谷蟲制品為一種天然的產(chǎn)品，五谷蟲制品有效成分是五谷蟲全蟲，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明：五谷蟲中含蛋白質(zhì)、脂肪、幾丁聚糖、含抗菌肽以及18種氨基酸。本發(fā)明的五谷蟲干粉中包括了五谷蟲全蟲的所有有效成分，五谷蟲提取物主要是以脂肪酸和/或蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，五谷蟲制品可以有效抑制胰腺癌生長，且五谷蟲制品不具有臨床上常用的化療藥的耐藥及其毒副作用。具體實(shí)施方式實(shí)施例11、種蠅選擇動(dòng)物學(xué)鑒定：麗蠅科Calliphoridae昆蟲大頭金蠅Chrysomyiamegacephala(Fab.)。成蠅體長8～11毫米，綠藍(lán)色、頭部寬，頂部黑色；復(fù)眼大，深紅色，額中條褐紅色，顏和頰部橙黃色，觸角及小顎須褐色。胸、腹部綠藍(lán)色，帶有紫色光澤。第1腹節(jié)及第2，3腹節(jié)后緣黑色。雌蠅的額部及中條在中部處向外側(cè)略為凸出。雄蠅復(fù)眼上部2/3有大形的小眼面，下方1/3則為小形的小眼面，二者界面清晰。前胸氣門黑色，中胸氣門淺褐色；有氣門。腋瓣帶棕色，上有小毛。幼蟲成熟時(shí)黃白色，前端尖細(xì)，后端截平。體節(jié)14，頭部1節(jié)，胸部3節(jié)，腹部10節(jié)，但通常只見8節(jié)。體表由小棘形成的環(huán)。后氣門略高出表面，較扁于上方，氣門環(huán)不完全；后氣門間距不大于后氣門的橫徑；第1氣門裂垂直形；前氣門具有10—13個(gè)指狀突。2、種蠅采集(1)種蠅箱的制作：可以選用木質(zhì)、玻璃、陶瓷制作，圓形或長方形均可，頂部留一個(gè)直徑25厘米的口，并制作一個(gè)用透氣的網(wǎng)狀蓋，以防種蠅逃逸。(2)種蠅飼料配置：奶粉+紅糖，1:1混合，加15％的水調(diào)和，放置于種蠅箱內(nèi)。(3)打開種蠅箱網(wǎng)狀蓋，置于28--38攝氏度，濕度小于65％的環(huán)境內(nèi)。讓外界的大頭金蠅進(jìn)入箱內(nèi)覓食，對(duì)不符合要求的蠅種進(jìn)行分揀丟棄，并蓋上網(wǎng)狀蓋，使其滯留于種蠅箱內(nèi)覓食、產(chǎn)卵。3、養(yǎng)殖硬件與養(yǎng)殖飼料(1)蠅房建造：按養(yǎng)殖規(guī)模，可以選用磚石，玻璃、塑料、鋼架結(jié)構(gòu)材料，離地面2米左右的墻體上間隔1.5--2米設(shè)置通風(fēng)窗，為防止其他蒼蠅或昆蟲進(jìn)入，宜設(shè)有紗窗與外界隔離，在養(yǎng)殖箱上方一米制成可活動(dòng)的通風(fēng)管道，便于廢氣收集，防止異味散發(fā)污染環(huán)境，廢氣統(tǒng)一通過臭氧除臭裝置處理后排出。為防止蠅種進(jìn)入廢氣收集管道，宜在各進(jìn)氣口設(shè)置紗窗隔斷。(2)養(yǎng)殖箱制作：可以選用木質(zhì)、陶瓷、水泥材料，制成長方形箱體，底部設(shè)置止水密封裝置，箱體上方留一個(gè)直徑30--40厘米的圓孔，即可。各養(yǎng)殖箱下方設(shè)有污水收集通道，統(tǒng)一進(jìn)入污水池處理后排放。(3)保溫：為符合養(yǎng)殖產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化要求，可以附設(shè)加溫、降溫設(shè)施。在炎熱時(shí)季可在蠅房頂面設(shè)置防嗮遮陽設(shè)施。(4)養(yǎng)殖飼料：豬內(nèi)臟、淡水魚、牛蛙、奶粉、蜂蜜。4、養(yǎng)殖工藝步驟(1)蠅種：采集的蠅種移植到提前一天放有淡水魚的種蠅箱內(nèi)，培養(yǎng)2天，待其在箱內(nèi)產(chǎn)卵。(2)收集蠅卵：待種蠅在蠅種箱內(nèi)產(chǎn)卵，即可將蠅卵收集，轉(zhuǎn)移到加有飼料的蠅房養(yǎng)殖箱內(nèi)進(jìn)行孵化、養(yǎng)殖，飼料和蠅卵的比例為每5克蠅卵，加入15公斤的飼料。(3)孵化養(yǎng)殖：蠅卵孵化后，即可在養(yǎng)殖箱內(nèi)獲得所需的飼料，一般需要72小時(shí)，蟲體長到長度1--1.2厘米，直徑2.5--3毫米時(shí)。(4)活性催化：在養(yǎng)殖箱內(nèi)加入用200毫升預(yù)配的5％蔗糖(w/w)水溶液和1％的超氧化物歧化酶(LA-SOD)(酶系活力大于300萬單位/克)500毫升，2小時(shí)后取出活體五谷蟲，用清水反復(fù)沖洗干凈，即刻放入—38攝氏度以下的冰柜內(nèi)速凍。(5)清洗干燥：低溫速凍兩天后，取出，在清水中融化，再仔細(xì)清洗，瀝干水分，使用真空低溫干燥設(shè)備干燥到水分含量低于10％。試驗(yàn)例1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑u(píng)價(jià)五谷蟲整體物對(duì)PC-3人胰腺癌細(xì)胞的體外抑制作用。二、主要實(shí)驗(yàn)儀器與材料1.主要儀器可調(diào)波長式微孔板酶標(biāo)儀。2.主要試劑五谷蟲經(jīng)加工處理過的整體化合物，本公司培養(yǎng)；1640液體培養(yǎng)基，購自南京凱基生物公司；FBS，GIBCO(澳大利亞)；MTT.三、實(shí)驗(yàn)方法和步驟實(shí)驗(yàn)方法:MTT原理:MTT，一種黃顏色的染料?；罴?xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下，生成藍(lán)色(或藍(lán)紫色)不溶于水的甲臜(Formazan)，甲臜的多少可以用酶標(biāo)儀在490nm處進(jìn)行測定。在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測出活細(xì)胞的數(shù)目。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入MTT不會(huì)有反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)步驟：1:收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入150ul,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度1*105/孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。2:5％CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入3個(gè)濃度梯度的藥物(0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml),每孔50ul,設(shè)3個(gè)復(fù)孔.同時(shí)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)；5％CO2，37℃孵育48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。3:每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h；終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液每孔加入200ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。4：按下列公式計(jì)算被測化合物對(duì)癌癥細(xì)胞生長的抑制率。抑制率＝(1-對(duì)照組OD值/給藥組OD值)×100％四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表：各被測化合物對(duì)PC-3細(xì)胞生長的抑制率編號(hào)0.25mg/ml0.5mg/ml1.0mg/ml166.37％95.13％92.04％295.28％95.28％85.84％388.50％88.50％71.39％492.63％93.81％70.50％590.27％94.69％59.59％本次MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明：樣品對(duì)抑制人胰腺癌細(xì)胞有明顯的作用。尤以低濃度時(shí)為佳。試驗(yàn)例2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑u(píng)價(jià)五谷蟲對(duì)人胰腺癌細(xì)胞的體外抗腫瘤作用。應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI-FCM定量分析五谷蟲誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞SW1990發(fā)生凋亡。二、主要實(shí)驗(yàn)儀器與材料1、材料1.1.1人胰腺癌細(xì)胞株及其培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株，購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞在含10％的滅活特級(jí)新生牛血清的F12K培養(yǎng)液中生長，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)箱中二氧化碳的濃度為5％，溫度37℃，飽和濕度。1.1.2藥物與試劑五谷蟲原蟲粉用水浸泡過濾后的溶液；AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒為南京凱基公司產(chǎn)品；RNA酶A，胰蛋白酶(GIBCO)。2、主要儀器BD流式細(xì)胞儀BDFACSCaliburTM三、實(shí)驗(yàn)方法和步驟1.藥物處理取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，加入五谷蟲水浸泡液，按相當(dāng)于濃度為0、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml與細(xì)胞共同孵育24、48、72小時(shí)后，用0.25％胰蛋白酶進(jìn)行消化，使之成為單細(xì)胞，然后用1×PBS漂洗2次，離心后備用。2.AnnexinV-FITC/PI-FCM檢測預(yù)先配制好染液及緩沖液，置于冰上，取備用細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每105～106細(xì)胞加入500ulBindingBuffer懸浮細(xì)胞，再加入5ulAnnexinV-FITC混勻后，加入5ulPI混勻；室溫、避光、反應(yīng)15分鐘，上機(jī)檢測。3、數(shù)據(jù)與圖像分析在二維的FCM分析圖上，細(xì)胞分為四個(gè)亞群：左下(LL)象限，AnnexinV-FITC-/PI-為活細(xì)胞群(V)；右下(LR)象限，AnnexinV-FITC+/PI-為凋亡細(xì)胞(AP)，此區(qū)細(xì)胞具有典型的凋亡細(xì)胞特征：包括細(xì)胞與核體積縮小，染色質(zhì)濃縮致密，有新月體狀核形成，細(xì)胞膜上的微絨毛消失；右上(UR)象限，AnnexinV-FITC+/PI+細(xì)胞已具有了壞死細(xì)胞的特征：細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞器腫脹，胞質(zhì)內(nèi)空泡化，為繼發(fā)性壞死細(xì)胞(N)；左上(UL)象限，AnnexinV-FITC-/PI+為培養(yǎng)操作過程中出現(xiàn)的機(jī)械損傷細(xì)胞(O)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果濃度和作用時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)SW1990胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響注：V：左下(LL)象限，活細(xì)胞群所占百分比；AP：右下(LR)象限，凋亡細(xì)胞所占百分比；N：右上(UR)象限，繼發(fā)性壞死細(xì)胞所占百分比；O：左上(UL)象限，機(jī)械損傷細(xì)胞所占百分比。試驗(yàn)例3一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑u(píng)價(jià)冷凍干燥與低溫烘干的特種五谷蟲對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PC-3的體外抑制作用。二、主要實(shí)驗(yàn)儀器與材料1.主要儀器可調(diào)波長式微孔板酶標(biāo)儀。2.主要試劑五谷蟲經(jīng)加工處理過的整體物，本公司自供；1640液體培養(yǎng)基，購自南京凱基生物公司；FBS，GIBCO(澳大利亞)；MTT.三、實(shí)驗(yàn)方法和步驟實(shí)驗(yàn)方法:MTT原理:MTT，一種黃顏色的染料。活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下，生成藍(lán)色(或藍(lán)紫色)不溶于水的甲臜(Formazan)，甲臜的多少可以用酶標(biāo)儀在490nm處進(jìn)行測定。在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測出活細(xì)胞的數(shù)目。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入MTT不會(huì)有反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)步驟：1:收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入150ul,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度1*105/孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。2:5％CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入3個(gè)濃度梯度的藥物(0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml),每孔50ul,設(shè)3個(gè)復(fù)孔.同時(shí)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)；5％CO2，37℃孵育48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。3:每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h；終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液每孔加入200ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。4：按下列公式計(jì)算被測化合物對(duì)癌癥細(xì)胞生長的抑制率。抑制率＝(1-對(duì)照組OD值/給藥組OD值)×100％四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表：被測化合物對(duì)PC-3細(xì)胞生長的抑制率編號(hào)0.25mg/ml0.5mg/ml1.0mg/mlA2295.28％95.28％85.84％本次MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明：對(duì)抑制人胰腺癌細(xì)胞有明顯的作用。尤其在小劑量0.25mg時(shí)比1mg時(shí)更強(qiáng)。試驗(yàn)例4范**,男,72歲，既往史：膽囊摘除。2010年2月，在上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行腹腔探查術(shù)，術(shù)中發(fā)現(xiàn)患者遠(yuǎn)端肝內(nèi)膽管擴(kuò)張，肝轉(zhuǎn)移，盆腔少量積液。病理確診為轉(zhuǎn)移性低分化胰腺癌，輸血，清創(chuàng)縫合，告知家屬無治療價(jià)值。病案簡介：患者于2010年4月開始口服五谷蟲治療，連續(xù)用藥十個(gè)月，2012年7月復(fù)查，胰腺大小正常，肝內(nèi)膽管未見擴(kuò)張，腹腔未見積液。肝腎脾未見異常，ca125從102.7降到9，,鐵蛋白563回復(fù)到287.其他各項(xiàng)腫瘤標(biāo)注均正常。且身體狀況恢復(fù)如常，可獨(dú)立料理日常生活起居及務(wù)農(nóng)?，F(xiàn)患者身體及精神狀況良好。試驗(yàn)例5方**，女，64歲，腹水、胰腺淋巴結(jié)腫大(胰腺癌或淋巴癌)2011年8-9月間因腹痛去醫(yī)院就診，查出胰臟胰頭上方有腫大淋巴結(jié)2.1*1.2cm；大量腹水8.2cm；血清糖鏈抗原CA125達(dá)648.5U/ml、763.8U/ml，CA15-337.9U/ml；腹水中鐵蛋白FER581.9μg/L，懷疑是胰腺癌或淋巴癌，但沒有最終結(jié)論；未在醫(yī)院接受任何治療，曾用營養(yǎng)補(bǔ)充品和果蔬湯食療8個(gè)月，腹水明顯減少，血清糖鏈抗原CA125明顯下降；但腫大淋巴結(jié)縮小不明顯。藥性五谷蟲口服治療記錄當(dāng)前第1頁1 2 3