本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及麻欠精油在制備預(yù)防和治療子宮腺肌病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

子宮內(nèi)膜的健康狀況關(guān)乎女性的生理、心理和生殖健康，越來越受到臨床醫(yī)務(wù)人員的重視，其中，子宮腺肌病是一種常見的子宮內(nèi)膜疾病。

子宮腺肌病，又稱子宮內(nèi)子宮內(nèi)膜異位癥，是指子宮內(nèi)膜腺體及/或間質(zhì)侵入子宮肌層，并在其中彌漫性生長。其特征是在子宮肌層中出現(xiàn)了異位的內(nèi)膜和腺體，伴有其周圍的肌層細(xì)胞肥大和增生。

子宮腺肌病致病機(jī)制不詳，廣為接受的理論是子宮內(nèi)膜從基底層直接向下生長進(jìn)入子宮肌層。病理組織學(xué)已證實(shí)腺肌病的內(nèi)膜島與子宮內(nèi)膜之間有直接延續(xù)關(guān)系。不管異位內(nèi)膜組織有多深，連續(xù)切片可證實(shí)其與宮腔內(nèi)膜的連接。

目前臨床上子宮腺肌病的治療主要包括手術(shù)治療和藥物治療以及兩者相結(jié)合的方法，鑒于子宮腺肌病手術(shù)難于治愈，術(shù)后又容易復(fù)發(fā)，因此，藥物治療仍占據(jù)重要地位。藥物治療的要點(diǎn)是減滅和消除病灶、緩解和解除疼痛、改善和促進(jìn)生育、減少或避免復(fù)發(fā)。目前的藥物治療以西藥為主，副反應(yīng)較多，治療效果并不可靠。

而中草藥和民族藥由于其多成分、多靶點(diǎn)、作用溫和且可調(diào)理患者的全身狀況的特點(diǎn)，在子宮腺肌病的藥物治療中可以發(fā)揮其優(yōu)勢。復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院臨床研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后采用中藥治療可預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)，提高妊娠率，取得很好的臨床療效。因此腹腔鏡手術(shù)結(jié)合中草藥或民族藥治療是目前認(rèn)為子宮腺肌病較好的治療模式。中草藥或民族藥用于子宮腺肌病的術(shù)后輔助治療具有如下特點(diǎn)：(1)在臨床療效上與西藥療效相當(dāng)；(2)中草藥或民族藥治療后患者無轉(zhuǎn)氨酶升高、體重增加、更年期綜合征表現(xiàn)、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)；(3)中草藥或民族藥服藥期間一般不會(huì)影響內(nèi)分泌生理功能，而且可調(diào)經(jīng)助孕。因此，如何發(fā)掘療效較好的中草藥或民族藥用于子宮腺肌病的治療，是目前子宮腺肌病研究的重要內(nèi)容。

云南西雙版納地區(qū)是藥用植物種類豐富多樣和民族傳統(tǒng)藥用植物知識(shí)豐厚的熱帶地區(qū)，傣族傳統(tǒng)藥用植物是我國民族文化中的瑰寶。麻欠(Maqian)是傣藥的一種，又稱毛大葉臭花椒(Zanthoxylum myriacanthum var.Pubescens)，為蕓香科花椒屬大葉臭花椒(Zanthoxylum myriacanthum)的一個(gè)變種，因其葉軸、小葉柄、小葉兩面及花序軸均被長柔毛而得名。傣族醫(yī)藥書籍記載麻欠可用于治療腫痛等疾病，西雙版納當(dāng)?shù)卮鲎迦罕姵Ｓ迷撍幱糜诳寡?、?zhèn)痛以及緩解腫脹等。目前，未見有關(guān)麻欠用于治療子宮腺肌病的文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供麻欠精油在制備預(yù)防和治療子宮腺肌病藥物中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

麻欠精油在制備預(yù)防和治療子宮腺肌病藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述子宮為人子宮。

所述麻欠精油為從麻欠植物中提取的揮發(fā)性物質(zhì)。

所述麻欠精油的提取方法，選自：水蒸氣蒸餾法、擠壓法、冷浸法或溶劑提取法。

優(yōu)選的，麻欠精油是由以下方法制得：

取麻欠植物加入水中，經(jīng)過浸泡和/或超聲后，加熱至沸騰，手機(jī)餾出液，有機(jī)溶劑萃取其有機(jī)相，揮干有機(jī)相即得麻欠精油。

所述的麻欠植物選自麻欠的果實(shí)、果皮、種子和莖中的一種或多種。

優(yōu)選的，所述麻欠植物為粗粉或碎片。

優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑為乙醚。

優(yōu)選的，麻欠精油是由以下方法制得：取新鮮麻欠植物，干燥，之后在45～65℃溫水中浸泡60～150分鐘，然后超聲波超聲處理30～60分鐘，加熱至沸騰，提取2～3小時(shí)，用乙醚萃取，揮干乙醚即得麻欠精油。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明以原代培養(yǎng)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)為模型，篩選發(fā)現(xiàn)麻欠精油具有很好的抑制子宮內(nèi)膜異位種植活性，麻欠精油在較低濃度(體積濃度不低于0.01‰)時(shí)可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的原代人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞IL-8分泌，較高濃度(體積濃度不低于0.08‰)時(shí)抑制人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡和壞死。故麻欠精油可用于制備預(yù)防或治療子宮腺肌病藥物。

麻欠精油作為一種傣藥成分，避免了西藥的諸多不良反應(yīng)，服藥期間不會(huì)影響內(nèi)分泌生理功能，也不會(huì)影響女性患者的正常生育要求，具有明顯的臨床優(yōu)勢。

附圖說明

圖1a和圖1b為人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞免疫組化鑒定，其中，圖1a為Vimentin陽性，圖1b為cytokeratin陰性；

圖2為麻欠精油對(duì)人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞活力的影響；

圖3為麻欠精油誘導(dǎo)人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡和壞死；

圖4為麻欠精油抑制TNF-α誘導(dǎo)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞IL-8(白細(xì)胞介素8)分泌。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。

實(shí)施例

1.材料與方法

1.1麻欠精油的制備：新鮮麻欠果實(shí)于11月采自西雙版納孟旺鄉(xiāng)，干燥后備用。將麻欠干燥果實(shí)浸泡在溫水(60℃，120分鐘)。然后超聲波超聲處理50分鐘，加熱至沸騰，提取2.5小時(shí)。用乙醚萃取，揮干乙醚，得麻欠精油。

2.試驗(yàn)方法

2.1人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定

從確診的子宮腺肌病患者的異位子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本中成功分離得到人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，具體分離純化方法參照文獻(xiàn)方法(唐雪蓮,謝梅青,張鳳麗.高純度分離子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞和體外培養(yǎng)技術(shù).中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版).2003,24(6):589-592.)，并參照文獻(xiàn)方法對(duì)所分離得到的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定(張婷婷,張瑞曉.膠原酶分離及低速離心結(jié)合篩網(wǎng)過濾法純化子宮內(nèi)膜細(xì)胞的研究[J].生殖與避孕.2014,34(1):12-16.)以原代培養(yǎng)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)作為子宮腺肌病的藥物篩選模型，圖1a和圖1b示出了人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞免疫組化鑒定結(jié)果。

2.2麻欠精油對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞存活率影響實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)方法以Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測定細(xì)胞存活率(Tominaga,H.；Ishiyama,M.；Ohseto,F.；Sasamoto,K.；Hamamoto,T.；Suzuki,K.；Watanabe,M.A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay.[J]Anal.Commun.,1999,36(2),47-50.)。CCK-8方法的原理是利用Dojindo開發(fā)的水溶性四唑鹽—-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臜染料。CCK-8溶液可以直接加入到細(xì)胞樣品中；不需要預(yù)配各種成分。

CCK-8法是用于測定細(xì)胞增殖或毒性實(shí)驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。-8被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原后生成的橙黃色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。

將對(duì)數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞以1×10⁵cells/孔接種于96孔板中，每孔200μL培養(yǎng)體系，加入不同劑量的麻欠精油(體積濃度分別為：0.01‰，0.02‰，0.04‰，0.08‰，0.16‰)，作用時(shí)間為24h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育2h后以酶標(biāo)儀450nm讀取吸光度。

細(xì)胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％

As：實(shí)驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、麻欠精油)

Ac：對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8)

Ab：空白孔(不含細(xì)胞和麻欠精油的培養(yǎng)基、CCK-8)

細(xì)胞存活率檢測結(jié)果見圖2，從圖2可以看出，當(dāng)麻欠精油濃度大于0.08‰時(shí)，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞存活率迅速降低。

2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞接種于六孔板中，加入不同劑量的麻欠精油(體積濃度分別為：0.01‰，0.02‰，0.04‰，0.08‰，0.16‰)，作用時(shí)間為24h后，收集細(xì)胞，預(yù)冷D-Hanks洗滌，重懸于binding buffer(10mmol/L HEPES，pH 7.4，140mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl₂)，細(xì)胞濃度1×10⁶cells/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加5μL AnnexinⅤ-FITC和5μL PI(50μg/mL)，于室溫黑暗中孵育15min，加入400μL binding buffer，輕輕混勻，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。凋亡細(xì)胞為Annexin V陽性細(xì)胞(AV+/PI-和AV+/PI+象限)，壞死細(xì)胞為PI陽性細(xì)胞(AV-/PI+)。

細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果見圖3，從圖3可以看出，當(dāng)麻欠精油濃度大于0.08‰時(shí)，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞凋亡率和壞死率顯著增加。

2.4麻欠精油抑制TNF-α誘導(dǎo)的原代人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞IL-8分泌

通過TNF-α(10ng/ml，sigma公司)刺激原代人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞模擬炎癥狀態(tài)環(huán)境，采用ELISA檢測麻欠精油對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的原代人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞IL-8分泌的影響，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞接種于六孔板中，加入不同劑量的麻欠精油(體積濃度分別為：0.01‰，0.02‰，0.04‰，0.08‰，0.16‰)，作用時(shí)間為24h后，離心，收集上清液按下述方法測定：

1)實(shí)驗(yàn)前2h從冰箱中取出試劑盒(RD公司)，平衡至室溫；

2)雙蒸水稀釋濃縮洗滌液。未用完4℃保存；

3)標(biāo)準(zhǔn)品配制：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液復(fù)溶，混勻，靜置15分鐘，然后倍比稀釋，未用完標(biāo)準(zhǔn)品-20℃保存；

4)生物素化抗體：臨用前將濃縮生物素化抗體用生物素化抗體稀釋液按說明書方法稀釋；

5)酶結(jié)合物：臨用前將濃縮酶結(jié)合物用酶結(jié)合物稀釋液按說明書方法稀釋；

6)取出所需板條，其它板條密封放回4℃；

7)除空白孔外，在其它各孔中分別加入細(xì)胞上清液(稀釋20倍)或已稀釋好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用封板膠紙封住反應(yīng)，37℃孵育90min；

8)洗板4次：甩盡板孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液300μL，靜止30S后甩盡液體，在后迭吸水紙上拍干，再加入洗液；

9)每孔加生物素化抗體工作液100μL，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵育60min；

10)洗板4次；

11)每孔加酶結(jié)合物工作液100μL，封住板孔，37℃孵育30min；

12)洗板4次；

13)每孔加顯色劑100μL，避光，37℃孵育15-25min(視顏色深淺掌握)；

14)每孔加終止液100μL，混勻，即刻在450nm處讀數(shù)(5分鐘內(nèi))；

15)結(jié)果計(jì)算：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值應(yīng)減去零孔的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過樣品OD值求出其濃度，再乘以稀釋倍數(shù)。

檢測結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示麻欠精油在不影響細(xì)胞活力的濃度下即可抑制TNF-α誘導(dǎo)的人子宮異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞IL-8分泌(圖4)

上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。