本發(fā)明涉及一種藥物組合物及其在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用，屬于生物制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：程序性死亡受體1(ProgrammedDeath-1；PD-1)，是一種重要的免疫抑制分子，為CD28超家族成員,其最初是從凋亡的小鼠T細(xì)胞雜交瘤2B4.11克隆出來。PD-1主要是在激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞中表達，具有抑制細(xì)胞激活的功能，這是免疫系統(tǒng)中一種正常的自穩(wěn)機制，因為過度的T/B細(xì)胞激活會引起自身免疫疾病，所以PD-1相當(dāng)于人體內(nèi)的一道護欄。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞會高表達PD-1的配體PD-L1(細(xì)胞程式死亡-配體1或表面抗原分化簇274或B7同源體)。腫瘤細(xì)胞上表達的PD-L1和T細(xì)胞表面的PD-1相互作用，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中PD-1通路持續(xù)激活，T細(xì)胞功能被抑制，無法殺傷腫瘤細(xì)胞。PD-1單克隆抗體可以通過阻斷這一通路，部分恢復(fù)T細(xì)胞的功能，進而利用激活的T細(xì)胞和相應(yīng)的細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞，從而其成為癌癥免疫療法的重要治療手段。研究表明，雙歧桿菌在抗腫瘤方面也具有重要的作用。雙歧桿菌是從母乳營養(yǎng)兒的糞便中分離出的一種厭氧的革蘭氏陽性桿菌，其可以通過調(diào)整腸道正常菌群，抑制腸道許多腐生菌生長，從而減少一些致癌物質(zhì)產(chǎn)生，雙歧桿菌具有激活機體巨噬細(xì)胞或LAK細(xì)胞的吞噬活性，并產(chǎn)生一定量的細(xì)胞因子如TNF—aINF—V等可直接殺死腫瘤細(xì)胞。抑制腫瘤內(nèi)血管形成，破壞腫瘤組織微血管，最終導(dǎo)致出血、壞死。由于PD-1單克隆抗體和雙歧桿菌，一種屬于生物大分子物質(zhì)，一種屬于益生菌，現(xiàn)有技術(shù)中往往將兩者分開使用，一種直接作為藥物使用，另一種則作為益生元添加保健食品或發(fā)酵制備乳制品，現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有將二者混用的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種藥物組合物以及該藥物組合物在制備治療癌癥藥物中的用途，所采取的技術(shù)方案如下：本發(fā)明的目的在于提供一種藥物組合物，該藥物由PD-1單克隆抗體與雙歧桿菌菌液兩種成分組成。優(yōu)選地，所述PD-1單克隆抗體的質(zhì)量(mg)與雙歧桿菌的體積(ml)組合配比為1～2:1～2。更優(yōu)選地，所述PD-1單克隆抗體的質(zhì)量(mg)與雙歧桿菌的體積(ml)組合配比為1:1。更優(yōu)選地，所述PD-1單克隆抗體的使用含量為2mg/kg；所述雙歧桿菌的活菌數(shù)為1×107cfu/mL。以上任一所述的藥物組合物在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述癌癥為肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸直腸癌、黑色素瘤、腎瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大腸癌、鼻咽癌、腦腫瘤、宮頸癌、血癌、骨癌、淋巴癌、胰臟癌。優(yōu)選地，所述癌癥為黑色素瘤。本發(fā)明獲得的有益效果：PD-1單克隆抗體是人或動物中一種免疫抑制分子，而雙歧桿菌是一種用于奶制品加工中的益生菌。發(fā)明人創(chuàng)造性的將兩者結(jié)合使用，通過實驗驗證，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合使用能夠十分有效的抑制腫瘤的增長，二者的具有協(xié)同作用，能夠明顯地提高PD-1單克隆抗體治療癌癥的功效。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。以下實施例所用材料、試劑、方法和儀器，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)材料、試劑、方法和儀器，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可通過商業(yè)渠道獲得。實施例1PD-1單克隆抗體和雙歧桿菌聯(lián)合治療對小鼠黑色瘤的抑制作用(1)小鼠黑色素瘤模型的建立采用皮下抑制模型，便于觀察腫瘤生長情況。無菌操作下抽取腹腔積液型B16黑色素瘤鼠的腹腔積液，臺盼藍染色檢查癌細(xì)胞成活率，成活率大于95％的腹腔積液瘤細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基調(diào)至1×107/mL。取正常6周齡裸鼠25只，每只老鼠體重約為20g，在每只裸鼠右側(cè)鼠鼠鼷處皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，10d于接種出長出2～3mm瘤時，小鼠黑色素瘤模型制作成功。(2)分組及處理造模后小鼠隨機分成5組，每組5只，雙歧桿菌和PD-1抗體用PBS溶解，分別包括PBS對照組(腹腔注射滅菌PBS1mL/d)，PD-1單抗處理組(腹腔注射1mL2mg/kg/d)，PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合處理組(PD-1單抗腹腔注射1mL2mg/kg/d和雙歧桿菌1×107cfu/mL)，雙歧桿菌處理組(1mL雙歧桿菌1×107cfu/mL)，CTX(化療藥環(huán)磷酰胺)(腹腔注射CTX15mg/kg/d)，與接種瘤細(xì)胞后次日開始給藥，連續(xù)給藥12d。(3)對小鼠黑色素瘤抑制作用的研究停藥次日并稱重處死小鼠，解剖剝離腫瘤塊，稱瘤重，按平均瘤重計算抑瘤率。抑瘤率＝[(對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積]×100％。(4)實驗結(jié)果結(jié)果顯示，處理組與PBS對照組相比，前者明顯抑制了小鼠B16黑色素瘤的生長，PD-1單抗處理組、PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合處理組和雙歧桿菌處理組的抑瘤率分別為35.83％、31.33％、55.31％。其中，PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合處理組和其他兩組相比，有顯著差異(P<0.05).說明，PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合使用抑制黑色素瘤效果要高于其他各組(見表1)。表1各組對小鼠黑色素瘤的抑制效果實施例2PD-1單克隆抗體和雙歧桿菌聯(lián)合治療對腫瘤中血管生成的影響以及細(xì)胞周期和凋亡的變化。(1)小鼠黑色素瘤模型的建立采用皮下抑制模型，便于觀察腫瘤生長情況。無菌操作下抽取腹腔積液型B16黑色素瘤鼠的腹腔積液，臺盼藍染色檢查癌細(xì)胞成活率，成活率大于95％的腹腔積液瘤細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基調(diào)至1×107/mL。取正常6周齡裸鼠25只，每只老鼠體重約為20g，在每只裸鼠右側(cè)鼠鼠鼷處皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，10d于接種出長出2～3mm瘤時，小鼠黑色素瘤模型制作成功。(2)分組及處理造模后小鼠隨機分成5組，每組5只，雙歧桿菌和PD-1抗體用PBS溶解，PBS對照組(腹腔注射滅菌PBS1mL/d)，PD-1單抗處理組(腹腔注射1mL2mg/kg/d)，PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合處理組(PD-1單抗腹腔注射1mL2mg/kg/d和雙歧桿菌1×107cfu/mL)，雙歧桿菌處理組(1mL雙歧桿菌1×107cfu/mL)，CTX(化療藥環(huán)磷酰胺)(腹腔注射CTX15mg/kg/d)，與接種瘤細(xì)胞后次日開始給藥，連續(xù)給藥12d。(3)Ⅷ-RAg免疫組化和流式細(xì)胞儀檢測小鼠黑色素瘤血管形成、細(xì)胞周期及凋亡率按免疫組化試劑盒檢測小鼠黑色素瘤血管的形成:常規(guī)脫蠟至水；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的H2O2孵育以消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性；先后用枸櫞酸鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的胰蛋白酶修復(fù)抗原；標(biāo)本經(jīng)封閉液作用后,依次滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗(Ⅷ-RAg多克隆抗體)、生物素標(biāo)記的二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素；DAB顯色,蘇木素復(fù)染核；梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞染色情況。細(xì)胞周期及凋亡率檢測：將新鮮的腫瘤制成單細(xì)胞懸浮液1×107/L，離心棄上清，加入DNAPrepLRP210μl，DNA-PrepStain2.2ml，混勻，避光，染色，室溫30min。用流式細(xì)胞儀進行檢測(Cellquese軟件獲取)，獲得DNA直方圖，據(jù)所測得的DNA直方分布圖，用細(xì)胞周期分析軟件modfit進行細(xì)胞周期各時相分布及凋亡率的分析。(4)實驗結(jié)果結(jié)果顯示，處理組與PBS對照組相比，處理組明顯抑制了小鼠B16黑色素瘤的血管形成，PD-1單抗處理組、PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合處理組和雙歧桿菌處理組的平均每個視野的微血管數(shù)分別為61、42、77。利用SPSS10軟件分析，PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合用藥微血管數(shù)少于其他各組，并且達到差異顯著性P<0.05。對細(xì)胞周期和凋亡率分析的結(jié)果顯示，處理組與PBS對照組相比，可使細(xì)胞周期阻滯在S期，抑制腫瘤DNA合成，進而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合用藥組的阻滯作用高于其他各組，其中對照組、PD-1單抗處理組、雙歧桿菌處理組、PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合處理組和CTX處理組S期細(xì)胞比率分別為13.23％、17.81％、18.74％、21.66％、15.37％。腫瘤細(xì)胞凋亡率從大到小依次為PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合處理組>PD-1單抗處理組>雙歧桿菌處理組>CTX處理組>對照組。實驗結(jié)果見表2和表3。表2各組藥物對B12黑色素瘤細(xì)胞周期的影響表3各組藥物對B12黑色素瘤細(xì)胞凋亡率的影響使用藥品腫瘤細(xì)胞凋亡率PBS(對照)(0.77±0，031)％PD-1單抗(12.87±2.37)％雙歧桿菌(1.87±0.04)％PD-1單抗&雙歧桿菌(22.76±1.57)％CTX(1.53+0.38)％實施例3PD-1單克隆抗體和雙歧桿菌聯(lián)合治療小鼠黑色瘤的最佳比例。(1)小鼠黑色素瘤模型的建立采用皮下抑制模型，便于觀察腫瘤生長情況。無菌操作下抽取腹腔積液型B16黑色素瘤鼠的腹腔積液，臺盼藍染色檢查癌細(xì)胞成活率，成活率大于95％的腹腔積液瘤細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基調(diào)至1×107/mL。取正常6周齡裸鼠25只，每只老鼠體重約為20g，在每只裸鼠右側(cè)鼠鼠鼷處皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，10d于接種出長出2～3mm瘤時，小鼠黑色素瘤模型制作成功。(2)分組及處理造模后小鼠隨機分成9組，每組5只，分別命名為1～9組，每組PD-1抗體的使用質(zhì)量(mg)與雙歧桿菌的體積(ml)比分別為：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、5:1、4:1、3:1、2:1，其中PD-1單抗腹腔注射的劑量為2mg/kg/d，雙歧桿菌的使用濃度為1×107cfu/mL。與接種瘤細(xì)胞后次日開始給藥，連續(xù)給藥12d。(3)對小鼠黑色素瘤抑制作用的研究停藥次日并稱重處死小鼠，解剖剝離腫瘤塊，稱瘤重，按平均瘤重計算抑瘤率。抑瘤率＝[(對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積]×100％。(4)實驗結(jié)果結(jié)果顯示，實驗1～9組的抑瘤率分別為55.31％、53.27％、46.71％、45.33％、29.35％、38.11％、42.32％、44.06％、49.16％。其中，PD-1抗體的使用質(zhì)量(mg)與雙歧桿菌的體積(ml)比為1:1和1:2時，抑瘤效果最佳。說明，PD-1單抗和雙歧桿菌聯(lián)合使用最優(yōu)比例為1:1～2。2:1的比例次之。實驗結(jié)果件表4。表4各組對小鼠黑色素瘤的抑制效果雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3