本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物及其制備方法。
背景技術(shù)：
周圍神經(jīng)損傷是臨床常見的創(chuàng)傷疾病。隨著社會(huì)的發(fā)展以及近些年自然災(zāi)害的頻發(fā)，事故、腫瘤、戰(zhàn)爭(zhēng)、地震等導(dǎo)致的神經(jīng)損傷人數(shù)逐年增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約超過一百萬人會(huì)遭遇周圍神經(jīng)損傷，并造成不同程度的功能損害、喪失、畸形甚至殘疾，給患者帶來了極大痛苦。由于周圍神經(jīng)損傷后病理過程復(fù)雜、成熟的神經(jīng)元不能分裂和復(fù)制、神經(jīng)修復(fù)和再生緩慢等因素，如何對(duì)周圍神經(jīng)損傷進(jìn)行有效治療一直是醫(yī)學(xué)界的難題。
目前，周圍神經(jīng)損傷的治療主要是藥物保守治療和外科手術(shù)治療。藥物保守治療是針對(duì)小段神經(jīng)缺損，可依賴內(nèi)在神經(jīng)再生能力自動(dòng)修復(fù)神經(jīng)損傷，為損傷部位提供藥理作用和為神經(jīng)修復(fù)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；同時(shí)也為外科手術(shù)提供輔助治療的作用。外科手術(shù)治療針對(duì)的是長(zhǎng)段的周圍神經(jīng)損傷，包括直接手術(shù)縫合和神經(jīng)移植技術(shù)等，其中神經(jīng)移植技術(shù)包括自體移植及神經(jīng)修復(fù)材料等，前者因其能提供神經(jīng)生長(zhǎng)因子、免疫排異小，被視為周圍神經(jīng)修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在來源有限、造成新創(chuàng)和引發(fā)供區(qū)麻木、瘢痕、神經(jīng)瘤等并發(fā)癥的弊端。目前臨床中采用的神經(jīng)修復(fù)材料如同種異體神經(jīng)多取材自殘肢，通過脫細(xì)胞以保證安全、無免疫排斥、不帶病毒，但存在取材困難和價(jià)格昂貴等問題。
基于自體神經(jīng)移植和同種異體神經(jīng)移植物所存在的缺陷，臨床上急需一種取材方便、制備過程簡(jiǎn)單、能最大程度上保留天然神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)微結(jié)構(gòu)同時(shí)價(jià)格低廉的周圍神經(jīng)再生修復(fù)材料。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明采用堿法與表面活性劑相結(jié)合的工藝，在溫和的條件下去除細(xì)胞，能最大限度保留神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)的完整性及其生物學(xué)活性。
本發(fā)明的目的是提供一種脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物及其制備方法。該神經(jīng)移植物完整保留了天然周圍神經(jīng)的細(xì)胞外基質(zhì)微結(jié)構(gòu)，同時(shí)無免疫原性，促缺損神經(jīng)再生修復(fù)效果良好。
本發(fā)明還提供了一種制備脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物的方法。該方法包括如下步驟：
將離體的哺乳動(dòng)物的周圍神經(jīng)依次用堿溶液、表面活性劑溶液、脫脂劑、PBS緩沖液進(jìn)行浸泡處理后，凍干，滅菌，得到所述脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物。
上述方法中，所述哺乳動(dòng)物為豬、牛、羊、馬、犬或獼猴等。
所述周圍神經(jīng)可為坐骨神經(jīng)、尺神經(jīng)、橈神經(jīng)或腓叢神經(jīng)等。
所述離體的哺乳動(dòng)物的周圍神經(jīng)可按照如下步驟獲得：將屠宰后的哺乳動(dòng)物在無菌操作下切取周圍神經(jīng)，取下后立即進(jìn)行余下操作。
所述堿溶液為堿性化合物的水溶液；
所述堿性化合物具體選自NH3·H2O、NaOH、Ca(OH)2、KOH、Na2CO3和NaHCO3中的至少一種；
所述堿溶液的濃度為0.2-2M，具體可為0.5M或1.5M；
用堿溶液進(jìn)行浸泡處理步驟中，溫度為0-25℃，具體可為4℃或10℃或15℃或20℃，時(shí)間為1-2小時(shí)，具體可為40分鐘或1小時(shí)或90分鐘或100分鐘。
所述表面活性劑溶液為表面活性劑的水溶液；
所述表面活性劑具體為硫代甜菜堿10(SB-10)或曲拉通X-200(TritonX-200)；
用表面活性劑溶液進(jìn)行浸泡處理具體包括如下步驟：先用SB-10的水溶液進(jìn)行一次浸泡處理，再用由TritonX-200與SB-10的混合水溶液進(jìn)行二次浸泡處理；
所述一次浸泡處理中，SB-10的水溶液的濃度具體為125mmol/L；
所述二次浸泡處理中，由TritonX-200與SB-10的混合水溶液中，TritonX-200的質(zhì)量百分濃度為0.14％；SB-10的濃度為0.6mmol/L；
所述一次浸泡處理和二次浸泡處理步驟中，溫度均為0-25℃，具體可為4℃或10℃或20℃，時(shí)間均為7-24小時(shí)，具體可為10小時(shí)或12小時(shí)或20小時(shí)。
所述脫脂劑選自異丙醇、丙酮、三氯甲烷和二氯甲烷中的一種或幾種的混合物；
用脫脂劑進(jìn)行浸泡處理步驟中，溫度為0-25℃，具體可為4℃或10℃或20℃；浸泡的方式為振蕩浸泡；時(shí)間為8-10小時(shí)，具體可為9小時(shí)或10小時(shí)。
所述PBS緩沖液的pH值為5.8-7.8，具體可為7.4；
用PBS緩沖液進(jìn)行浸泡處理的溫度為0-25℃，具體可為4℃或10℃或20℃；時(shí)間為8-18小時(shí)，具體可為10小時(shí)或12小時(shí)或18小時(shí)。
所述凍干步驟中，凍干的時(shí)間為8-12小時(shí)，具體可為10小時(shí)。
所述滅菌步驟中，滅菌的方式為環(huán)氧乙烷滅菌、鈷-60輻照或電子束滅菌。
所述環(huán)氧乙烷滅菌中，滅菌溫度為30-70℃，濕度為30-80RH，環(huán)氧乙烷的濃度為400-800mg/L，滅菌的時(shí)間為2-4小時(shí)，具體可為3小時(shí)；
所述鈷-60輻照滅菌或電子束滅菌工藝中，輻照劑量為13-25KGy。
該方法所得脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。
另外，按照上述方法制備得到的脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物及該脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物在神經(jīng)損傷修復(fù)或制備修復(fù)神經(jīng)損傷材料中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述神經(jīng)為周圍神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、尺神經(jīng)、橈神經(jīng)或腓叢神經(jīng)。
本發(fā)明提供的脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物，是用化學(xué)方法脫除動(dòng)物源性神經(jīng)中的細(xì)胞成分，得到脫細(xì)胞神經(jīng)外基質(zhì)。該方法去除了能引起免疫反應(yīng)的異種細(xì)胞，保留了除細(xì)胞外大部分的基質(zhì)、纖維，無免疫排異反應(yīng)、生物相容性好、使用安全，為神經(jīng)纖維再生、恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)功能提供天然的管道支架和營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。
附圖說明
圖1為脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑獲得。
實(shí)施例1、豬脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物的制備
1、前處理：將屠宰場(chǎng)已經(jīng)屠宰完畢的健康成年豬，無菌操作取坐骨神經(jīng)，用純化水充分洗滌。
2、堿處理：1.5M NH3·H2O水溶液，4℃浸泡處理60分鐘，用純化水充分洗滌。以去除細(xì)胞膜中的非膠原類蛋白。
3、表面活性劑處理：首先進(jìn)行SB-10處理，在125mmol/L SB-10中4℃浸泡處理12小時(shí)，PBS充分洗滌；然后用0.14％TritonX-200、0.6mmol/L SB-10混合溶液處理，4℃浸泡處理7小時(shí)。以破壞細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞破裂，釋放細(xì)胞質(zhì)和核物質(zhì)。
4、脫脂處理：將產(chǎn)物置于異丙醇中20℃振蕩浸泡8小時(shí)。脫去神經(jīng)中的脂肪。
5、PBS緩沖處理：pH 7.4的PBS緩沖液，4℃處理12小時(shí)。
6、凍干與滅菌處理：凍干機(jī)冷凍干燥10小時(shí)后，進(jìn)行鈷-60輻照滅菌，25KGy，無菌封裝。
實(shí)施例2：牛脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物的制備
1、前處理：將屠宰場(chǎng)已經(jīng)屠宰完畢的健康成年牛，無菌操作取尺神經(jīng)，用純化水充分洗滌。
2、堿處理：2M KOH水溶液，10℃浸泡處理100分鐘，用純化水充分洗滌。以去除細(xì)胞膜中的非膠原類蛋白。
3、表面活性劑處理：首先進(jìn)行SB-10處理，在125mmol/L SB-10中10℃浸泡處理12小時(shí)，PBS充分洗滌；然后用0.14％TritonX-200、0.6mmol/L SB-10混合溶液處理，10℃浸泡處理7小時(shí)。以破壞細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞破裂，釋放細(xì)胞質(zhì)和核物質(zhì)。
4、脫脂處理：將產(chǎn)物置于丙酮中25℃振蕩浸泡10小時(shí)。脫去神經(jīng)中的脂肪。
5、PBS緩沖處理：pH 7.4的PBS緩沖液，10℃處理18小時(shí)。
6、凍干與滅菌處理：凍干機(jī)冷凍干燥10小時(shí)后，進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，無菌封裝。
滅菌參數(shù)：溫度在30-70℃之間、濕度在30-80RH之間，環(huán)氧乙烷的濃度在400-800mg/L之間，滅菌3小時(shí)。
實(shí)施例3：犬脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物的制備
1、前處理：將屠宰場(chǎng)已經(jīng)屠宰完畢的健康成年犬，無菌操作取橈神經(jīng)，用純化水充分洗滌。
2、堿處理：0.5M Ca(OH)2水溶液，20℃浸泡處理40分鐘，用純化水充分洗滌。以去除細(xì)胞膜中的非膠原類蛋白。
3、表面活性劑處理：首先進(jìn)行SB-10處理，在125mmol/L SB-10中20℃浸泡處理12小時(shí)，PBS充分洗滌；然后用0.14％TritonX-200、0.6mmol/L SB-10混合溶液處理，20℃浸泡處理7小時(shí)。以破壞細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞破裂，釋放細(xì)胞質(zhì)和核物質(zhì)。
4、脫脂處理：將產(chǎn)物置于三氯甲烷中10℃振蕩浸泡9小時(shí)。脫去神經(jīng)中的脂肪。脫去神經(jīng)中的脂肪。
5、PBS緩沖處理：pH 7.4的PBS緩沖液，20℃處理10小時(shí)。
6、凍干與滅菌處理：凍干機(jī)冷凍干燥10小時(shí)后，進(jìn)行電子束滅菌，無菌封裝。
實(shí)施例4：馬脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物的制備
1、前處理：將屠宰場(chǎng)已經(jīng)屠宰完畢的健康成年馬，無菌操作取腓叢神經(jīng)，用純化水充分洗滌。
2、堿處理：1.5M KOH水溶液，15℃浸泡處理90分鐘，用純化水充分洗滌。以去除細(xì)胞膜中的非膠原類蛋白。
3、表面活性劑處理：首先進(jìn)行SB-10處理，在125mmol/L SB-10中4℃浸泡處理20小時(shí)，PBS充分洗滌；然后用0.14％TritonX-200、0.6mmol/L SB-10混合溶液處理，10℃浸泡處理10小時(shí)。以破壞細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞破裂，釋放細(xì)胞質(zhì)和核物質(zhì)。
4、脫脂處理：將產(chǎn)物置于二氯甲烷中4℃振蕩浸泡10小時(shí)。脫去神經(jīng)中的脂肪。
5、PBS緩沖處理：pH 7.4的PBS緩沖液，10℃處理18小時(shí)。
6、凍干與滅菌處理：凍干機(jī)冷凍干燥10小時(shí)后，進(jìn)行鈷-60輻照滅菌，25KGy，無菌封裝。
實(shí)施例5：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
選用健康成年雌性獼猴為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以坐骨神經(jīng)為缺損模型，以實(shí)施例1制備得到的產(chǎn)品為實(shí)驗(yàn)品，分為脫細(xì)胞神經(jīng)修復(fù)組(A組)、原位逆行神經(jīng)對(duì)照組(B組)、神經(jīng)缺損對(duì)照組(C組)，分別進(jìn)行暴露術(shù)部、橋接神經(jīng)、縫合。
術(shù)后1、3、5月，分三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行大體觀察、外周血淋巴細(xì)胞分析(術(shù)前檢測(cè)一次)、神經(jīng)電生理檢測(cè)、組織學(xué)觀察、透射電鏡觀察的檢測(cè)，驗(yàn)證本發(fā)明脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植物的神經(jīng)修復(fù)功能。
術(shù)后三組獼猴均存活，進(jìn)食、飲水均正常，創(chuàng)口愈合良好，無感染，A、B組跛行步態(tài)逐漸轉(zhuǎn)好，C組跛行依然明顯；A、B組CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值術(shù)前、術(shù)后無差異；A、B組神經(jīng)傳導(dǎo)速度逐漸提高，A組略高于B組；A、B組術(shù)部神經(jīng)逐步增粗，無塌陷、變扁，均有輕度粘連；HE染色A、B組神經(jīng)纖維逐漸髓鞘化、纖維呈有規(guī)律的緊密排列，A組髓鞘化和規(guī)律性均略高于B組；透射電鏡觀察到術(shù)后5個(gè)月，A、B組橫切面均可見大量再生有髓神經(jīng)纖維和無髓纖維混合，施旺細(xì)胞包繞在軸突外側(cè)形成有髓纖維，大多數(shù)髓鞘結(jié)構(gòu)發(fā)育良好，呈同心圓板層樣結(jié)構(gòu)，B組有少數(shù)不成熟的髓鞘，A組髓鞘厚度顯著比B組厚。