本發(fā)明涉及梓醇有效地防止非酶糖基化終末產(chǎn)物AGE(advanced glycationend products AGE)生成或抑制AGE的活性,還可防止NO激活，可用于防治由于AGE失調(diào)引起的糖尿病并發(fā)癥，阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)疾病。
背景技術(shù)：
非酶糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products AGE)是過(guò)量的糖和蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物，在體內(nèi)有兩個(gè)來(lái)源，一是過(guò)量的糖和蛋白質(zhì)在體內(nèi)合成AGE，二是通過(guò)進(jìn)食將食物中存在的AGE攝入體內(nèi)。AGE對(duì)人體的害處:一是可以引起體內(nèi)蛋白質(zhì)的糖基化,使血管上的蛋白質(zhì)發(fā)生變化,使血管壁減低韌性,易于受損。二是可以與細(xì)胞上的受體結(jié)合,通過(guò)一系列的反應(yīng)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放,促進(jìn)炎癥形成和組織損傷。三是可以使血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的一氧化氮失去活性,而一氧化氮是舒張血管的重要分子,血管的緊張性增加,與高血壓或血管損傷有關(guān)。四是可促進(jìn)氧自由基的形成,氧自由基可使組織損傷。研究證明：AGE能夠加速人體的衰老，能夠引起各種慢性退化性疾病，比如糖尿病并發(fā)癥、阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。所以降低AGE可以起到抗衰老和預(yù)防各種慢性退化性疾病。
AGE與衰老：隨著世界人口老齡化問(wèn)題的日趨嚴(yán)重,防衰抗老成為人們所關(guān)注的問(wèn)題。非酶糖基化衰老理論是已被眾多學(xué)者公認(rèn)的衰老理論之一。非酶糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGE)是非酶糖基化反應(yīng)的終產(chǎn)物,它是一種蛋白質(zhì),隨著年齡的增長(zhǎng),它在血清、組織中的生成和積聚是不可避免的。人體內(nèi)AGE的蛋白修飾是老年性疾病的介導(dǎo)因素,可作為測(cè)試?yán)匣M(jìn)程的時(shí)鐘。糖基化會(huì)造成的蛋白質(zhì)的交聯(lián)損傷,能使正常的蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成老年蛋白的結(jié)構(gòu),AGE隨著年齡增長(zhǎng)在體內(nèi)積聚增多,會(huì)造成人體內(nèi)血管壁的硬度增加；會(huì)通過(guò)直接或間接的作用導(dǎo)致骨代謝的失衡,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松；AGE存在還會(huì)使大腦神經(jīng)中樞的星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生一系列形態(tài)與功能的變化。
AGE與阿爾茨海默病：糖化終末產(chǎn)物是蛋白質(zhì)非酶促糖化的最終產(chǎn)物,具有不可逆性,與糖尿病慢性并發(fā)癥、正常老化有關(guān)。糖化終末產(chǎn)物腦內(nèi)沉積通過(guò)受體和非受體途徑參與老年性癡呆的發(fā)病過(guò)程,與異常的腦內(nèi)蛋白交聯(lián)存積、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元喪失有關(guān)?？固腔K末產(chǎn)物治療可能成為治療阿爾茨海默病的新途徑。
AGE動(dòng)脈粥樣硬化：動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展跟體內(nèi)AGE的慢性蓄積有著密切的關(guān)系。Kanauchi M等研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者血中AGE濃度較非冠心病對(duì)照組明顯升高；而且非糖尿病冠心病患者血中AGE含量與冠心病患者冠狀動(dòng)脈血管病變數(shù)目呈正相關(guān)，即多支冠狀動(dòng)脈病變的患者血中AGE含量明顯高于單支冠狀動(dòng)脈病變和雙支冠狀動(dòng)脈病變患者。糖尿病患者合并冠心病時(shí)，動(dòng)脈管壁中巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)外存在廣泛的AGE沉積，并與動(dòng)脈粥樣硬化病變嚴(yán)重程度相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化尤其有頸動(dòng)脈斑塊的患者血清AGE顯著高于無(wú)頸動(dòng)脈粥樣硬化患者，進(jìn)一步說(shuō)明AGE在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展中起著重要作用。
AGE與糖尿病并發(fā)癥：糖尿病慢性并發(fā)癥幾乎累及全身各器官組織，起病隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)，呈漸進(jìn)性發(fā)展，當(dāng)發(fā)展到一定階段后治療效果不佳，是造成患者致殘致死的重要原因。大量研究證據(jù)表明，持續(xù)高血糖引起體內(nèi)多種蛋白質(zhì)非酶糖基化及由此形成的非酶糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation endproducts，AGE)在糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。血清和組織中的糖基化終產(chǎn)物濃度與糖尿病慢性并發(fā)癥的嚴(yán)重程度有一致關(guān)系,而阻止糖基化反應(yīng),減少其形成的機(jī)會(huì),會(huì)減少或減輕并發(fā)癥。AGE對(duì)血管和腎臟的損傷最為嚴(yán)重,這正是糖尿病患者的常見(jiàn)并發(fā)癥。目前臨床使用治療糖尿病并發(fā)癥AGE抑制劑主要有：
氨基胍：是一種AGE抑制劑，它在高糖條件下也可有效地防止AGE生成或抑制AGE的活性。氨基胍通過(guò)與葡萄糖競(jìng)爭(zhēng)和大分子蛋白質(zhì)的結(jié)合，選擇性抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化早期產(chǎn)物的形成。據(jù)研究，氨基胍還可防止NO激活，調(diào)整糖尿病早期的血管功能失調(diào)。
醛糖還原酶抑制(spirohydantoin)：臨床觀察結(jié)果對(duì)防止糖尿病視網(wǎng)膜病變、外周神經(jīng)病變和腎病療效輕微，且起效緩慢。因使用時(shí)間尚短，使用也不廣泛，有待做出客觀評(píng)價(jià)。
中醫(yī)應(yīng)用地黃抗衰老、治療消渴癥、心血管疾病歷史悠久，如《本經(jīng)》中記載：地黃“久服輕身不老，生者尤良”?！秳e錄》中記載：地黃“主男子五勞七傷，女子傷中胞漏下血，破惡血，溺血，利大小腸，去胃中宿食，飽力斷絕，補(bǔ)五臟內(nèi)傷不足，通血脈，益氣力，利耳目”。載于《圣濟(jì)總錄》的方劑“地黃煎”治療消渴?。?/p>
梓醇為一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類(lèi)化合物，主要存在于地黃等植物中，結(jié)構(gòu)如下：
梓醇可降低高血糖小鼠血糖；還具有抗癌、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、利尿、降血糖及抗肝炎病毒等作用。
由于梓醇極性較大，而且化學(xué)穩(wěn)定性較差，因而大量制備純度在90％以上的單體成分難度較大。
本方發(fā)明在于解決了梓醇生產(chǎn)制備工藝的問(wèn)題，同時(shí)意外的發(fā)現(xiàn)，梓醇可促進(jìn)AGE裂解并能夠逆轉(zhuǎn)由AGE造成的組織與器官的損傷。實(shí)驗(yàn)表明梓醇可通過(guò)促進(jìn)AGE裂解并能夠逆轉(zhuǎn)由AGE造成的腎臟等器官的損傷，治療糖尿病腎病作用明顯且有一定的降糖、降脂作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，梓醇能夠有效地防止AGE生成或抑制AGE的活性,還可防止NO激活，可用于防治由于AGE失調(diào)引起的糖尿病并發(fā)癥，阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)疾病。
本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)下式I的梓醇能有效地防止AGE生成或抑制AGE的活性,還可防止NO激活，可用于防治由于AGE失調(diào)引起的糖尿病并發(fā)癥，阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)疾病。
本發(fā)明第一方面涉及式I的梓醇具有防止AGE生成或抑制AGE的活性。
為此本發(fā)明的第一個(gè)目的是梓醇在制備防止AGE生成或抑制AGE的活性的食品、保健品、藥品方面的應(yīng)用。
本發(fā)明第二方面涉及式I的梓醇在制備用于治療或預(yù)防由于AGE失調(diào)引起的糖尿病并發(fā)癥，阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)疾病的藥物中用途。
本發(fā)明第三方面涉及式I的梓醇用于治療或預(yù)防由于AGE失調(diào)引起的糖尿病并發(fā)癥，阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)疾病的組合物，其包括式I的梓醇及藥用載體或賦形劑。
本發(fā)明第四方面涉及治療或預(yù)防由于AGE失調(diào)引起的糖尿病并發(fā)癥，阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)疾病的方法，其包括將治療或預(yù)防有效劑量的式I的梓醇給予需治療或預(yù)防的患者。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的式I的梓醇可來(lái)自于天然植物或通過(guò)合成得到，例如可從天然植物如地黃中提取分離得到。優(yōu)選的，本發(fā)明的式I的梓醇可以通過(guò)以下方法制備：鮮地黃，用水超聲提取三次，每次加6倍量水，超聲1小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮。濃縮至密度1.10(60℃)左右，用D101大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行層析分離，以水-乙醇梯度洗脫，棄去水洗脫液，收集20％乙醇洗脫液，減壓濃縮，得粗品，乙醇重結(jié)晶即得。
根據(jù)本發(fā)明，“梓醇作為非酶糖基化終末產(chǎn)物抑制劑的用途”是指式I的梓醇用于治療由于AGE失調(diào)引起的糖尿病并發(fā)癥，阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)疾病。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所用術(shù)語(yǔ)患者意指哺乳動(dòng)物如人類(lèi)。
根據(jù)本發(fā)明，梓醇可按已知方法配成腸道或非腸道給藥的制劑，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑等。
以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。
1梓醇對(duì)AGE作用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
1.1裂解體外形成AGE交聯(lián)結(jié)構(gòu)的酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)
(1)AGE-BSA的制備：AGE交聯(lián)模擬物AGE-BSA，牛血清白蛋白BSA(Ⅴ)50mg/ml及0.5M葡萄糖在0.2MPBS(PH7.4)中，37℃無(wú)菌條件下，避光孵育3-4個(gè)月,使其形成糖基化BSA即BSA-AGE。同時(shí)，以無(wú)葡萄糖的BSA制備無(wú)糖基化BSA。然后在0.01MPBS(pH7.4)透析液中透析，除去未反應(yīng)的葡萄糖，熒光掃描(Exi/Em(395/460nm))，及SDS-PAGE鑒定BSA-AGE形成，同時(shí)采用Lowery方法進(jìn)行蛋白定量。
(2)ELISA分析步驟：用尾膠原包被96孔板，用pH7.4PBS滿孔中和酸性膠原1小時(shí)；SuperBlock(PIERCE)37℃，封閉1小時(shí)；PBST(PBS-Tween)洗板3次，每次振蕩1分鐘；用PBS稀釋AGE-BSA，以獲得最大交聯(lián)度濃度的AGE-BSA 100μl加入96孔板的A、B、C、D行的孔中，相同濃度的BSA加入E、F、G、H行的孔中，1列前3孔中PBS，作為系統(tǒng)和試劑空白，37℃，4h使之與膠原交聯(lián)；PBST洗板4次，間隔振蕩1分鐘。
受試藥采用pH7.4PBS稀釋?zhuān)?00μl/孔分別加于AGE-BSA交聯(lián)和BSA孔各4孔，同樣方式加入PBS 100μl/孔作為非裂解對(duì)照，37℃孵育16h；PBST洗板4次，間隔振蕩1min；加80μl/孔兔抗BSA抗體(1﹕500)37℃，50min；PBST洗板4次，間隔振蕩1min；加入80μl/孔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1﹕1000)37℃，50min；PBST洗板3次，間隔振蕩1min；加底物液TMB(3、3’、5、5’-四甲基聯(lián)苯胺)100μl/孔室溫，閉光20min；用2mol/L H2SO4終止反應(yīng)；10分鐘內(nèi)，BOBRAD Model550讀板機(jī)450nm下，板空白孔調(diào)零讀取OD值。裂解率以O(shè)D值降低的百分率表示：
[(PBS孔的OD平均值-受試藥孔OD平均值)/PBS孔的OD平均值]×100％。
1.2梓醇裂解體內(nèi)形成的紅細(xì)胞表面AGE-IgG交聯(lián)結(jié)構(gòu)的酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)
(1)AGE-IgG交聯(lián)的制備：3只Wister大鼠，雄性，體重180-200g，適應(yīng)性飼養(yǎng)2天后禁食8小時(shí)后腹腔注射鏈尿佐菌素(65mg/Kg)，72小時(shí)后尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖水平高于16.7mmol/L大鼠留用，常規(guī)飼養(yǎng)12周后，取血，肝素抗凝，PH 7.4PBS洗三次，1﹕250稀釋。
(2)ELISA分析步驟：96孔板(Millipore，MAIPS4510)用300μl Superblock(PIERCE)37℃封閉1h，用PBST滿孔洗板1次，再用PBS洗板2次；將用PBS稀釋且混勻的RBC 50μl加入孔中，每只大鼠RBC樣品加4個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)留4孔加入PBS作為抗體對(duì)照孔。PBS洗RBC 1次，加入50μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗大鼠IgG(1﹕2000)室溫間隔震蕩2小時(shí)。
加入受試藥放入37℃溫箱，1h；PBS洗4次，加底物液OPD(鄰苯二胺)100μl/孔，室溫，避光30min；用2mmol/L H2SO4 50μl/孔終止反應(yīng)；快速將每孔液體120μl轉(zhuǎn)入普通型96孔酶標(biāo)板，BOBRAD Model 550讀板機(jī)490nm下，板空白調(diào)零，讀取OD值。裂解率以RBC-IgG含量降低的百分率表示：
[(對(duì)照組動(dòng)物RBC-IgG–受試藥處理組RBC-IgG)/對(duì)照組動(dòng)物RBC-IgG]×100％
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法與實(shí)驗(yàn)結(jié)果
定量指標(biāo)均以的形式表示，對(duì)兩組定量資料的結(jié)果分析，采用Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間均數(shù)的差異顯著性檢驗(yàn)。對(duì)單因素k(k＞2)水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，如果各組均數(shù)之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則用雙側(cè)Dunnett t檢驗(yàn)將各處理組均數(shù)與對(duì)照組均數(shù)進(jìn)行多重比較。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析結(jié)果表明：
梓醇對(duì)AGE-BSA-膠原交聯(lián)結(jié)構(gòu)的裂解作用：正常狀態(tài)下，體內(nèi)也有AGE及其交聯(lián)結(jié)構(gòu)的形成，但形成速度特別緩慢且蓄積量很少，在高糖狀態(tài)下，體內(nèi)AGE的形成和累積會(huì)明顯加劇，血管基質(zhì)蛋白上形成的AGE能進(jìn)一步與血液循環(huán)系統(tǒng)中其它蛋白氨基交聯(lián)，加速蛋白分子沉積在血管壁上，使血管硬化，彈性喪失，對(duì)生理蛋白酶敏感性降低。如受試物能有效裂解交聯(lián)蛋白，使老化蛋白得以復(fù)性或代謝，以消除這些交聯(lián)蛋白所造成的病理影響，將有利于緩解和防治衰老和糖尿病并發(fā)癥。為此本實(shí)驗(yàn)觀察了梓醇對(duì)糖尿病大鼠尾腱膠原發(fā)生的交聯(lián)是否有逆轉(zhuǎn)作用。以AGE-BSA與包被在96孔酶標(biāo)板上大鼠尾腱蛋白交聯(lián)，體外制備AGE交聯(lián)結(jié)構(gòu)，采用ELISA方法評(píng)價(jià)梓醇對(duì)AGE交聯(lián)的裂解作用。
以AGE-BSA與包被在96孔酶板上大鼠尾膠原蛋白交聯(lián)，體外制備模擬AGE交聯(lián)結(jié)構(gòu)，采用ElISA方法評(píng)價(jià)氨基胍和梓醇對(duì)AGE交聯(lián)的裂解作用，結(jié)果顯示，氨基胍和梓醇在一定的濃度下，對(duì)AGE交聯(lián)具有一定的裂解作用,并具有劑量依賴(lài)關(guān)系。與陽(yáng)性藥氨基胍相比，梓醇的裂解率雖然稍低一點(diǎn)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，也具有良好的裂解活性。初步表明梓醇的藥物作用靶點(diǎn)之一可能是AGE。
梓醇對(duì)體內(nèi)AGE交聯(lián)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)作用：在高糖狀態(tài)下，IgG被晚期糖化終物(AGE)修飾逐漸形成交聯(lián)物IgG-AGE，IgG-AGE易與紅細(xì)胞(RBC)表面結(jié)合，如受試物能打斷AGE-IgG之間的交聯(lián)，則能降低IgG與紅細(xì)胞表面的結(jié)合量，IgG和血紅細(xì)胞的功能得以逆轉(zhuǎn)。為進(jìn)一步證實(shí)梓醇具有有效裂解體內(nèi)形成的AGE交聯(lián)結(jié)構(gòu)的作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了梓醇對(duì)老齡糖尿病大鼠紅細(xì)胞表面AGE-IgG交聯(lián)的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。
AGE能與多種蛋白交聯(lián)，其中包括細(xì)胞表面蛋白。該試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)IgG與血紅細(xì)胞表面結(jié)合量的減少來(lái)評(píng)價(jià)藥物裂解體內(nèi)形成的AGE的能力。研究結(jié)果表明：梓醇和氨基胍能減少體內(nèi)已形成的AGE及其交聯(lián)結(jié)構(gòu)，與氨基胍相比，梓醇的裂解效果雖稍低一點(diǎn)，但也具有很好的裂解效果(見(jiàn)表3)，同時(shí)也進(jìn)一步證明AGE是梓醇的藥物作用靶點(diǎn)之一。
表3梓醇對(duì)體內(nèi)AGE交聯(lián)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)作用
上述試驗(yàn)研究表明，梓醇能阻止AGE的形成與累積并能裂解AGE交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其作用的分子機(jī)理是打斷AGE特有的二羰基鍵。梓醇通過(guò)選擇性地裂解過(guò)度沉積在血管壁上的AGE交聯(lián)結(jié)構(gòu)，改善糖尿病大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，提高動(dòng)脈血管順應(yīng)性，可以使血管及組織的彈性恢復(fù)，逆轉(zhuǎn)血管硬化。
傳統(tǒng)的降糖方法只能延緩并發(fā)癥的發(fā)生，對(duì)已形成的蛋白老化和血管硬化卻無(wú)能為力，而梓醇以AGE為藥物作用靶點(diǎn)，對(duì)已經(jīng)由于高糖和衰老造成的蛋白交聯(lián)有逆轉(zhuǎn)作用，從而使得老化蛋白得以復(fù)性或代謝，進(jìn)而消除了由于這些交聯(lián)老化蛋白所造成的病理影響，從而可防治或緩解糖尿病相關(guān)的腎臟等臟器損傷。
2梓醇改善2型糖尿病大鼠心血管并發(fā)癥的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
2.1大鼠模型的建立、分組及給藥
取170-210g雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分5組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、二甲雙胍陽(yáng)性藥組(100mg/kg)、梓醇低高組(100mg/kg、300mg/kg)。除正常對(duì)照組外，其他各組均尾靜脈注射STZ(60mg/kg)一周后以血糖儀測(cè)定血糖大于11.1mmol/L確定為糖尿病大鼠模型。1周后，連續(xù)給高脂飼料8周。從造模第4天開(kāi)始給藥，治療組小鼠分別灌胃給予格列本脲及梓醇，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組灌胃給予等體積蒸餾水，每只0.4ml，每天1次，連續(xù)3周。
2.2改善2型糖尿病大鼠心血管并發(fā)癥觀察指標(biāo)
血糖值測(cè)定：分別于開(kāi)始給藥前,及連續(xù)灌胃梓醇治療四周后尾部取血，滴在血糖試條的反應(yīng)端，通過(guò)血糖測(cè)試儀顯示出動(dòng)物的血糖值。
葡萄糖耐量：大鼠禁食12h，口服2.5g/kg葡萄糖，尾靜脈取血分別測(cè)定灌胃葡萄糖前(0h)、注射后0.5h、1h、2h的血糖值，并用梯形面積法計(jì)算血糖曲線下面積(AUC)。
AUC＝0.25×0h血糖值+0.5×0.5h血糖值+0.75×1h血糖值+0.5×2h血糖值
血清生化指標(biāo)測(cè)定：OGTT 24h后大鼠眼眶取血，離心分離血清。用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和血尿素氮(BUN)的含量。
血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定：末次給藥后，ip.40mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)束大鼠眼眶取血后，腹腔注射40mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，右頸總動(dòng)脈插管至主動(dòng)脈，并連接壓力換能器記錄血壓及心率；行開(kāi)胸術(shù)暴露升主動(dòng)脈，并套以合適Doppler探頭測(cè)定血液流速。經(jīng)Biopac多道生理記錄儀記錄并計(jì)算的血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)。
梓醇對(duì)2型糖尿病大鼠的血糖值和血脂的影響：采用用小劑量STZ破壞胰島再持續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料導(dǎo)致2型糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?shí)驗(yàn)結(jié)果表明,誘導(dǎo)8周后,與正常飼養(yǎng)的大鼠相比,其余各組血糖值要明顯升高,但是血糖絕對(duì)值差值并不大,模型組和給藥組的血糖值并不是很高,都在正常范圍內(nèi),但是葡萄糖耐量則遠(yuǎn)遠(yuǎn)要高于正常組,葡萄糖耐量異常顯著。說(shuō)明造模成功，適合應(yīng)用于2型糖尿病的研究。
2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法與實(shí)驗(yàn)結(jié)果
定量指標(biāo)均以的形式表示，對(duì)兩組定量資料的結(jié)果分析，采用Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間均數(shù)的差異顯著性檢驗(yàn)。對(duì)單因素k(k＞2)水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，如果各組均數(shù)之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則用雙側(cè)Dunnett t檢驗(yàn)將各處理組均數(shù)與對(duì)照組均數(shù)進(jìn)行多重比較。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析結(jié)果表明：
梓醇對(duì)2型糖尿病大鼠的血糖有降低作用，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義，能抑制大鼠的血糖的上升，和模型組比較，給藥四周后大鼠血糖值沒(méi)有進(jìn)展而模型組大鼠血糖有所升高，見(jiàn)表4。
表4梓醇對(duì)2型糖尿病大鼠血糖的影響(n＝10)
#p<0.05，#與對(duì)照組比較
梓醇改善2型糖尿病大鼠的血脂水平：2型糖尿病的典型特征是血糖值并不高，血脂異常。從表2-2可以看出，造模8周后大鼠的總膽固醇要顯著高于正常組大鼠(P﹤0.01),血清高密度脂蛋白要明顯低于正常組大鼠(P﹤0.05),低密度脂蛋白顯著高于正常組大鼠.說(shuō)明長(zhǎng)期的葡萄糖耐量異常可以導(dǎo)致脂代謝的紊亂和異常。
梓醇治療四周后，高劑量組和中劑量組大鼠的血清總膽固醇值要明顯低與模型組大鼠,提示梓醇能有效的降低糖尿病大鼠的高脂狀態(tài)。HDL有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，結(jié)果顯示梓醇能顯著的提高糖尿病大鼠的血清高密度脂蛋白含量(P﹤0.01)，證明梓醇對(duì)高糖引起的心血管功能損害有一定的保護(hù)作用，見(jiàn)表5。
表5梓醇對(duì)2型糖尿病大鼠血脂的影響(n＝10)
#與對(duì)照組比較，#p<0.05，##p<0.01，*與模型組比較，*p<0.05。
梓醇提高血管硬化大鼠血管順應(yīng)性：體內(nèi)AGE的過(guò)多形成與累積，會(huì)引起蛋白分子過(guò)度沉積在血管壁上，導(dǎo)致血管硬度增加，血管順應(yīng)性降低。血管順應(yīng)性是指血管壁的緩沖能力，是血管的內(nèi)在彈性特性。如藥物能阻止AGE的形成與累積，或能有效裂解AGE交聯(lián)結(jié)構(gòu)，則能使硬化血管得以逆轉(zhuǎn)，血管順應(yīng)性增加。
如表6和表7所示，模型組大鼠血壓、心率明顯高于正常對(duì)照組糖尿病大鼠，而糖尿病大鼠心輸出量、全身動(dòng)脈順應(yīng)性(SAC)等各項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)與正常組大鼠比較皆有顯著得下降，且總外周阻力(TPR)顯著升高；表明糖尿病大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)呈異常狀態(tài)。與模型對(duì)照組比較，二甲雙胍、梓醇高低兩個(gè)劑量能顯著提高大鼠心輸出量、降低總外周阻力(TPR)、并顯著改善全身動(dòng)脈順應(yīng)性(SAC)。
表6梓醇對(duì)糖尿病大鼠心率、血壓的影響
表7梓醇對(duì)糖尿病大鼠血管順應(yīng)性的影響
*模型與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；◆給藥組與模型組比較：◆P＜0.05，◆◆P＜0.01
3梓醇的安全性生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
本試驗(yàn)采用5g/kg劑量對(duì)其急性毒性進(jìn)行了初步觀察。取健康ICR小鼠80只，雌雄各半，各性別小鼠隨機(jī)分成2個(gè)對(duì)照組和2個(gè)梓醇給藥組，禁食6小時(shí)后，一次分別灌胃與腹腔注射給予梓醇5g/kg，對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水。
動(dòng)物給藥后連續(xù)觀察8小時(shí)，給藥后1-14天，每日觀察2次。記錄各組動(dòng)物的一般活動(dòng)狀態(tài)，有無(wú)死亡及死亡前表現(xiàn)和死亡動(dòng)物分布。死亡動(dòng)物及時(shí)做大體解剖觀察?；畲鎰?dòng)物于藥后14天稱(chēng)體重后處死，進(jìn)行大體解剖觀察，若有差異則進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。
采用Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間均數(shù)的差異顯著性檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果表明：小鼠一次灌胃給予梓醇后，部分小鼠活動(dòng)減少，但很快恢復(fù)正常，無(wú)其它反應(yīng)。在14天的觀察期內(nèi)無(wú)動(dòng)物死亡，小鼠一般活動(dòng)狀態(tài)良好，進(jìn)食、大便未見(jiàn)明顯異常。實(shí)驗(yàn)前后體重與對(duì)照組無(wú)明顯差異(表8)。大體解剖表明，心臟、肝臟、腎臟、肺臟等主要臟器無(wú)肉眼可見(jiàn)的變化。
梓醇5g/kg急性毒性試驗(yàn)小鼠未出現(xiàn)死亡，體重及行為與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，解剖學(xué)觀察也未發(fā)現(xiàn)異常，此劑量為臨床有效劑量的500倍，據(jù)此可以認(rèn)為梓醇用于治療糖尿病腎病劑量范圍甚寬。
表8小鼠灌胃梓醇后體重變化(g)
具體實(shí)施方式：
以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例1：梓醇的制備與結(jié)構(gòu)鑒定
1.1梓醇的制備：
取鮮地黃，用水超聲提取三次，每次加6倍量水，超聲1小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮。濃縮至密度1.10(60℃)左右，用D101大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行層析分離，以水-乙醇梯度洗脫，棄去水洗脫液，收集20％乙醇洗脫液，減壓濃縮，得粗品，乙醇重結(jié)晶即得。
1.2結(jié)構(gòu)鑒定：
本自制品為白色粉末(EtOH)，易溶于甲醇、乙醇、水等溶劑。熔點(diǎn)：207-209℃(分解點(diǎn))。與梓醇對(duì)照品的混合熔點(diǎn)不下降，可初步判斷該化合物為梓醇。
經(jīng)如下光譜進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定：ESI-MS譜，UV譜,IR譜,1H-NMR譜，13C-NMR譜，1H-1HCOSY譜，HMQC譜，HMBC譜，DEPT譜。.
(1)ESI-MS：分子離子峰385.2(M+Na)+，360.9(M-1)-，190(M-1-苷元)-，181(M-1-苷元-OH)-，表明該化合物分子量為362。元素分析測(cè)得元素C含量為49.74％，元素H含量為6.12％，推斷分子式為C15H22O10。
(2)UVλH2Omax:210nm。210nm的末端吸收峰表明本結(jié)構(gòu)無(wú)共軛雙鍵。
(3)IRυKBr cm-1:3405(br.–OH),1672(C＝C)。3405cm-1的吸收峰為O—H的伸縮振動(dòng)。3200～2800cm-1之間的吸收峰屬C—H的伸縮振動(dòng)。1672cm-1處的較強(qiáng)吸收屬于C＝C的伸縮振動(dòng)。
(4)1H-NMR結(jié)合1H-1HCOSY譜：δH 4.74(1H，d，J＝7.9Hz)為β-葡萄糖H-1’信號(hào)；δH 6.34(dd，J＝1.7,5.9Hz),δH 5.04(dd，J＝4.5，5.8Hz)分別為H-3、H-4的信號(hào)，為雙鍵相互偶合；δH 2.25(dddd，J＝2.0,3.4，5.3,7.8Hz)為5位H信號(hào)，2.51(dd，J＝7.6，9.8Hz)為9位H信號(hào)；10位CH2的H信號(hào)為(4.14d,3.77d)；6’位CH2的H信號(hào)為(3.9d，3.65dd)。
(5)13C-NMR結(jié)合DEPT譜：2個(gè)仲C(δc61.05C-10，δc 62.38C-6’)，10個(gè)叔C，其中C-5δC為38.53，C-9δC為43.37。6個(gè)與-OH相連C(C-2’，C-3’，C-4’，C-5’，C-6，C-10)。葡萄糖C-1’δC為99.11，C-1δC為95.06，表明與葡萄糖相連。1個(gè)季C為C-8，δC66.05。
1H和13C譜：自制梓醇1H和13C譜數(shù)據(jù)列表1總結(jié)如下：
表1自制梓醇1H和13C譜數(shù)據(jù)
文獻(xiàn)(陳德昌主編《中藥化學(xué)對(duì)照品工作手冊(cè)》)中δCC-6為77.4，δCC-3’為79.6，根據(jù)樣品的二維圖譜推斷應(yīng)是化學(xué)位移數(shù)據(jù)顛倒了：HMBC譜中，δH 3.875的H與C-4，C-5，C-7相關(guān)，且與-OH相連按，排除H-9，故判斷為H-6的化學(xué)位移值。結(jié)合HMQC譜，H-6與δC為79.11的C相關(guān)，故此C應(yīng)為C-6，即δCC-6為79.11。同樣，根據(jù)二維譜可推斷，δCC-3’為77.10。所以，文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)應(yīng)修正為δCC-6為79.6，δCC-3’為77.4。
文獻(xiàn)(陳德昌主編《中藥化學(xué)對(duì)照品工作手冊(cè)》)梓醇13C譜數(shù)據(jù)與本自制品13C譜數(shù)據(jù)列表2比較如下：
表2文獻(xiàn)報(bào)道梓醇與本品13C數(shù)據(jù)比較
由本表看出，本品與文獻(xiàn)報(bào)道梓醇的13C數(shù)據(jù)基本一致。
掃描電鏡、X-粉末衍射和TG/DSC檢測(cè)結(jié)果表明，不同析出條件得到的梓醇結(jié)晶均為一種晶型，研究中未發(fā)現(xiàn)梓醇存在同質(zhì)多晶現(xiàn)象，也未發(fā)現(xiàn)晶型會(huì)隨放置時(shí)間延長(zhǎng)而發(fā)生變化。
根據(jù)以上波譜數(shù)據(jù)，參考有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，可確證該化合物為梓醇。
實(shí)施例2梓醇滴丸劑的制備
取實(shí)施例1的梓醇0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6-8℃液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。
實(shí)施例3梓醇片劑的制備
取實(shí)施例1的梓醇0.5g、加入淀粉10g，蔗糖4.5g、混合均勻后，制粒壓片，即得。
實(shí)施例4梓醇膠囊劑的制備
取實(shí)施例1的梓醇0.5g、加入淀粉10g，蔗糖4.5g、混合均勻后，制粒裝膠囊，即得。