本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中艾滋病生物細(xì)胞免疫治療儀的制備及應(yīng)用，主要用于艾滋病患者血細(xì)胞內(nèi)、外艾滋病毒的清除，從而達(dá)到治療艾滋病的目的。

背景技術(shù)：

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的傳染病，在全球廣泛流行，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署的有關(guān)報(bào)告，自1981年美國(guó)發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來(lái)，至今全球有208個(gè)國(guó)家和地區(qū)受到了艾滋病的嚴(yán)重威脅，約有4000萬(wàn)人感染了艾滋病，死亡人數(shù)已超過(guò)2000萬(wàn)，每天約有6000人成為艾滋病感染者，同時(shí)每天約有300多人死于艾滋病。在中國(guó)HIV感染者正處于高速增長(zhǎng)期，目前已遠(yuǎn)超過(guò)100萬(wàn)。艾滋病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病、結(jié)核病、糖尿病后又一個(gè)人類面臨的重大感染性疾病，已成為全球關(guān)注的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題。

人類免疫缺陷病毒是一種感染人類免疫細(xì)胞的慢病毒(Lentivirus)，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種，直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類脂包膜(來(lái)自宿主細(xì)胞)，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41。gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過(guò)非共價(jià)作用結(jié)合。向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)(Matrix)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼(Capsid)，衣殼在電鏡下呈高電子密度，內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來(lái)自宿主細(xì)胞的成分。

HIV進(jìn)入人體后，首先被巨噬細(xì)胞吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)繁殖。因?yàn)镃D4是HIV的受體，所以經(jīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖的HIV通過(guò)其囊膜蛋白gp120并在gp41的輔助下(gp41起著橋的作用，利用自身的疏水作用介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜融合)進(jìn)入CD4+細(xì)胞(細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等)，在細(xì)胞內(nèi)迅速增殖，每天產(chǎn)生10⁹～10¹⁰病毒顆粒，并不斷進(jìn)入其他正常的和再生的CD4+細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，制造更多的病毒感染細(xì)胞，使外周血CD4+T細(xì)胞持續(xù)破壞、減少。HIV的gp120與CD4受體結(jié)合可直接激活受感染的細(xì)胞凋亡，甚至感染HIV的T細(xì)胞表達(dá)的囊膜抗原也可啟動(dòng)正常T細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞表面CD4分子交聯(lián)間接地引起CD4+細(xì)胞的大量破壞，結(jié)果造成以CD4+T細(xì)胞缺損為中心的嚴(yán)重免疫缺陷，患者主要表現(xiàn)：外周淋巴細(xì)胞減少，T4/T8比例配置，對(duì)植物血凝素和某些抗原的反應(yīng)消失，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)下降，NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性減弱，IL2、γ干擾素等細(xì)胞因子合成減少。CD4+T細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞，感染者一旦失去了大量CD4+T細(xì)胞，整個(gè)免疫系統(tǒng)就會(huì)遭到致命的打擊，對(duì)各種疾病的感染都失去抵抗力。HIV進(jìn)入宿主CD4+細(xì)胞后也可以表現(xiàn)為長(zhǎng)期潛伏而不表現(xiàn)出臨床癥狀，其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，與病毒整合酶進(jìn)入宿主細(xì)胞核內(nèi)，在整合酶的作用下，雙鏈DNA整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，被整合的病毒DNA稱為前病毒，可潛伏數(shù)月甚至多年不復(fù)制，造成AIDS數(shù)月至多年的潛伏期。在AIDS的潛伏期，HIV主要在淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)繁殖，這些細(xì)胞是體內(nèi)的HIV貯存庫(kù)，可釋放至外周血或轉(zhuǎn)染外周血中的CD4+T細(xì)胞，有絲分裂原、抗原、TNF、IL-2和淋巴素(LT)都能激發(fā)HIV前病毒基因在感染的CD4+T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制。經(jīng)大量增殖后，HIV病毒顆粒不斷從被破壞的感染細(xì)胞釋放并游離于血液，然后再進(jìn)入其他細(xì)胞繼續(xù)感染過(guò)程。

HIV感染后可刺激機(jī)體生產(chǎn)囊膜蛋白(Gp120，Gp41)抗體和核心蛋白(P24)抗體。在HIV攜帶者、艾滋病病人血清中測(cè)出低水平的抗病毒中和抗體，其中艾滋病病人水平最低，HIV攜帶者最高，說(shuō)明該抗體在體內(nèi)有保護(hù)作用。但抗體不能與單核巨噬細(xì)胞內(nèi)存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細(xì)胞基因組中，因此HIV不會(huì)被免疫系統(tǒng)所識(shí)別，所以僅依靠自身免疫功能無(wú)法將其清除。另外一個(gè)很重要的原因應(yīng)該是，根據(jù)抗體殺滅、清除抗原的機(jī)理推測(cè)，免疫性抗體與抗原結(jié)合后，如果要產(chǎn)生免疫效應(yīng)，要么通過(guò)激活補(bǔ)體，介導(dǎo)ADCC效應(yīng)溶解細(xì)胞性抗原，但HIV不是細(xì)胞性抗原；要么通過(guò)趨化作用吸引吞噬細(xì)胞吞噬清除抗原，但HIV反而在吞噬細(xì)胞內(nèi)被保護(hù)、增殖；要么抗體與抗原結(jié)合起中和作用，使之失去感染力，但HIV抗原結(jié)構(gòu)多變，往往使抗體難以識(shí)別。

從目前已用于臨床的艾滋病治療方法看，效果不那么理想：(1)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：僅能防止尚未感染HIV的易感細(xì)胞感染，對(duì)已感染的細(xì)胞沒(méi)有治療作用，且毒副作用較多，包括腺粒體毒性、骨髓抑制、紅細(xì)胞性貧血、粒細(xì)胞和血小板減少、胰腺炎，加之交叉耐藥性的產(chǎn)生，這類藥已不單獨(dú)使用，主要做聯(lián)合用藥，且易產(chǎn)生耐藥變株，導(dǎo)致臨床療效下降或失效。(2)HIV蛋白酶抑制劑：易產(chǎn)生藥物性肝損傷、脂質(zhì)代謝紊亂等毒副作用及耐藥性。(3)HIV整合酶抑制劑：通過(guò)抑制HIV病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA整合而發(fā)揮作用，與HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑聯(lián)合同時(shí)使用對(duì)抗病毒有協(xié)同作用。(4)抑制HIV病毒進(jìn)入抑制劑：包括阻斷gp120與CD4結(jié)合、阻斷HIV與輔助受體結(jié)合、作用于gp41膜亞單位及作用于T淋巴細(xì)胞表面CC趨化因子受體5(CCR5)來(lái)阻斷HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞，但對(duì)肝和心臟有副作用。(5)細(xì)胞因子治療：主要用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡。(6)HIV疫苗治療：由于HIV的特殊性，如固有免疫不足以抵御HIV及其靶向破壞免疫系統(tǒng)，病毒突變迅速，導(dǎo)致至今尚未開(kāi)發(fā)出真正安全有效的疫苗。(7)基因治療：HIV基因治療的研究從未間斷，包括反義技術(shù)、RNA誘餌、RNA干擾、細(xì)胞內(nèi)抗體、顯性陰性突變體、自殺基因等，但進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)階段的基因療法幾乎沒(méi)有。(8)單克隆抗體被動(dòng)免疫療法：通過(guò)下調(diào)CD4+T細(xì)胞表面CCR5來(lái)降低HIV的易感性、延緩艾滋病的進(jìn)展和減少HIV的擴(kuò)散，中和單克隆抗體2G12、2F5和4E10應(yīng)用于HIV感染者具有良好的耐受性和安全性，能延緩但不能阻止病毒的反彈(9)過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療：體外大量培養(yǎng)HIV自體的CD4+T細(xì)胞時(shí)會(huì)導(dǎo)致病毒大量擴(kuò)增，增加病毒感染的CD4+T細(xì)胞數(shù)量，而回輸CD4+T細(xì)胞可能會(huì)增加體內(nèi)病毒復(fù)制的場(chǎng)所，導(dǎo)致病毒載量反彈，總體上看，過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療無(wú)明顯的毒副作用，也未取得滿意的治療效果。

人類的吞噬細(xì)胞有大、小兩種，小吞噬細(xì)胞是外周血中的中性粒細(xì)胞，大吞噬細(xì)胞是血中的單核細(xì)胞和多種器官、組織中的巨噬細(xì)胞，兩者構(gòu)成單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)。單核細(xì)胞由骨髓中的單核細(xì)胞前體發(fā)育分化而成，約占血液中白細(xì)胞總數(shù)的3％-8％，其體積較淋巴細(xì)胞略大，單核細(xì)胞在血液中僅停留12-24小時(shí)，然后進(jìn)入結(jié)締組織或器官，發(fā)育成熟為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中高度分化、成熟的細(xì)胞類型，具有較強(qiáng)的吞噬功能，游走巨噬細(xì)胞大于單核細(xì)胞數(shù)倍，壽命較長(zhǎng)，可在組織中存活幾個(gè)月，定居的巨噬細(xì)胞有不同的名稱，在肝中為枯否細(xì)胞、在腦中為小膠質(zhì)細(xì)胞、在骨中為破骨細(xì)胞等，其表達(dá)Fc受體、C3b受體和CDl4，在固有免疫中發(fā)揮防御功能，也是參與適應(yīng)性免疫的專職抗原提呈細(xì)胞。巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD4分子，是艾滋病毒(HIV)的受體，HIV進(jìn)入人體后，首先遭到巨噬細(xì)胞的吞噬，但HIV很快改變了巨噬細(xì)胞內(nèi)某些部位的酸性環(huán)境，創(chuàng)造了適合其生存的條件，不但不被殺滅反而在其內(nèi)大量繁殖聚集，轉(zhuǎn)而將HIV傳遞給CD4+T細(xì)胞。

有文獻(xiàn)報(bào)道，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40LT抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時(shí)也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型，可以用于人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立。也有文獻(xiàn)報(bào)道，導(dǎo)入外源性hTERT可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征，近年來(lái)已利用hTERT成功建立了某些細(xì)胞的永生化細(xì)胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無(wú)致瘤性等相對(duì)“正?！钡纳L(zhǎng)特征，在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，日本學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周細(xì)胞、牙髓細(xì)胞系和牙囊細(xì)胞系，細(xì)胞群體倍增數(shù)達(dá)150次以上，細(xì)胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性，誘導(dǎo)培養(yǎng)后都可以表達(dá)來(lái)源細(xì)胞的相關(guān)蛋白，Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細(xì)胞系，細(xì)胞倍增達(dá)200次以上，細(xì)胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達(dá)穩(wěn)定。近來(lái)的研究證明，猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化，可使細(xì)胞渡過(guò)M1期后繼續(xù)存活、傳代培養(yǎng)20-30代，然后細(xì)胞又會(huì)進(jìn)入危機(jī)期(M2期)，細(xì)胞死亡率增加并伴染色體異常，分裂的細(xì)胞逐漸減少，絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生死亡，而hTERT可以維持細(xì)胞染色體端粒的穩(wěn)定，從而使細(xì)胞渡過(guò)危機(jī)期(M2期)，可繼續(xù)存活、傳代達(dá)100-300代以上，所以用SV40和hTERT同時(shí)轉(zhuǎn)染人離體組織細(xì)胞建立永生化細(xì)胞系，SV40可以使細(xì)胞渡過(guò)M1期，hTERT可以使細(xì)胞渡過(guò)M2期，比單獨(dú)使用其中之一建立的細(xì)胞系更穩(wěn)定、壽命更長(zhǎng)。

但未見(jiàn)基于SV40LT和/或hTERT基因構(gòu)建巨噬細(xì)胞系進(jìn)而大量擴(kuò)增以用于艾滋病治療的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決久攻不克的艾滋病治療領(lǐng)域的世界性難題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。

本發(fā)明的目的是要提供艾滋病生物細(xì)胞免疫治療儀；另一目的是要提供艾滋病生物細(xì)胞免疫治療儀的制備及應(yīng)用方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：制備能濾除多細(xì)胞結(jié)合而成的含有HIV的大體積細(xì)胞的血液分離器及能分離單個(gè)血細(xì)胞和血漿的血漿分離器，制備以T4 DNA連接經(jīng)BamHI酶切質(zhì)粒SV40LTag DNA和載體pcDNA3.1(-)DNA的產(chǎn)物而構(gòu)建的SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組子以及以Ligation Mix連接經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產(chǎn)物而構(gòu)建的pLXSNneo-hTERT重組子，進(jìn)而以脂質(zhì)體聯(lián)合轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞致其永生化，經(jīng)擴(kuò)增后配制于細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞濃度達(dá)80％，然后灌注高生物相容性材料制成的能防止細(xì)胞及其碎片濾出并能為巨噬細(xì)胞吞噬HIV提供場(chǎng)所的凈化器，其中巨噬細(xì)胞株被固定在凈化器中起吞噬HIV之用，所制凈化器進(jìn)而與血液、血漿分離器組合并附加計(jì)算機(jī)調(diào)控程序而制備艾滋病生物細(xì)胞免疫治療儀，體外循環(huán)中的血液被治療儀中的血液分離器濾除大體積的多核巨細(xì)胞、被血漿分離器分成血漿和單個(gè)血細(xì)胞，血漿經(jīng)凈化器清除HIV后與單個(gè)血細(xì)胞匯合后回輸。

本發(fā)明由血液分離器、血漿分離器和凈化器構(gòu)成，其中血液分離器的孔徑為150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm，能濾除血液中HIV感染細(xì)胞形成的多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體，血漿分離器能分離中等體積的單個(gè)血細(xì)胞和血漿，血漿凈化器中的凈化劑為巨噬細(xì)胞株，配制于細(xì)胞凍存液后便于長(zhǎng)期低溫保存?zhèn)溆?，因巨噬?xì)胞表達(dá)的CD4分子是艾滋病毒的受體，具有天然吞噬HIV的特性，本發(fā)明模擬巨噬細(xì)胞在體內(nèi)非特異性吞噬的模式，當(dāng)含有HIV的血漿流經(jīng)凈化器時(shí)，HIV與巨噬細(xì)胞發(fā)生接觸而被吞噬，隨之被阻留于凈化器內(nèi)，所以在艾滋病血漿凈化治療的體外循環(huán)中，含有大量HIV的大體積細(xì)胞首先被血液分離器濾除，而血漿中游離的HIV被凈化器清除，凈化后的血漿與中等體積的單個(gè)血細(xì)胞匯合后回輸，從而清除結(jié)合在細(xì)胞表面和/或細(xì)胞內(nèi)的HIV以及游離于血漿的HIV。本發(fā)明以體外濾除HIV的方法替代長(zhǎng)期以來(lái)無(wú)法有效殺滅HIV的常規(guī)體內(nèi)抗逆轉(zhuǎn)錄藥物治療方法。

具體實(shí)施方式

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的艾滋病生物細(xì)胞免疫治療儀的應(yīng)用示意圖。

圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的血液分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明提出的血漿分離器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4是根據(jù)本發(fā)明提出的凈化器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1中，動(dòng)脈血路管(1)的一端與動(dòng)脈血管相連通，另一端經(jīng)肝素和血液泵(2)與含有廢液出口(5)的血液分離器(3)相連，血液分離器(3)經(jīng)血液出口(4)、血液泵(6)、循環(huán)管路(7)與血漿分離器(8)相連，血漿分離器(8)的血漿出口經(jīng)血漿泵(9)和血路管(10)與兩個(gè)并聯(lián)的凈化器(11)和凈化器(12)相連，兩個(gè)凈化器的出口管路(13)與血漿分離器(8)的血細(xì)胞出口管路(14)匯合后經(jīng)靜脈管路(15)匯流體循環(huán)。

圖2表示圖1中的血液分離器(3)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖2中，分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細(xì)胞(4)不能濾過(guò)微孔(3)而被阻留在內(nèi)腔(2)，從而可被清除，能通過(guò)微孔(3)的中、小體積的單個(gè)血細(xì)胞(5)進(jìn)入外腔(6)，然后經(jīng)出口(7)流出，進(jìn)而經(jīng)圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細(xì)胞和血漿。

圖3表示圖1中的血漿分離器(8)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。圖3中，1是血漿分離器，2是血漿分離器內(nèi)腔，3是血漿分離器內(nèi)腔管壁上的微孔，4是不能通過(guò)微孔(3)的單個(gè)血細(xì)胞，5是能通過(guò)微孔(3)的血漿化學(xué)成份，6是血漿分離器外腔，7是血漿流出口，8是具有可開(kāi)關(guān)閥門的血細(xì)胞出口。

圖4中，1為凈化器，2為凈化器中的巨噬細(xì)胞株；3為與血漿一起進(jìn)入凈化器的HIV，4為HIV被凈化器中的吞噬細(xì)胞吞噬后不再下移的吞噬體，5為巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞因子。

下面結(jié)合圖1、圖2、圖3和圖4，對(duì)本發(fā)明提出的艾滋病生物細(xì)胞免疫治療儀的實(shí)施方案作詳細(xì)的描述。

一、構(gòu)建巨噬細(xì)胞株

(一)分選巨噬細(xì)胞

1、采集原代細(xì)胞

(1)采集單個(gè)核血液細(xì)胞：指以密度梯度離心法從血液中分離的淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。具體方法是：購(gòu)買血液中心的濃縮白細(xì)胞或?yàn)榭蒲卸４娴哪殠а?，?mL標(biāo)本，PBS液將血液稀釋2～3倍，充分混勻后將6mL抗凝血用滴管沿管壁緩慢疊加于已加入4mL淋巴細(xì)胞分離液的10mL離心管中水平離心機(jī)中水平離心(400r/min，20℃)35min；離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和PBS液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶為PBMC，用毛細(xì)吸管插到云霧層，吸取PBMC置入另一50mL離心管中，加入5倍以上體積PBS離心(300r/min，20℃)10min，棄上清50mLPBS重懸細(xì)胞，離心(350r/min，20℃)15min，棄上清，加入Buffer(PBS+0.5％新生牛血清+2mmol/LEDTA，pH7.2)2mL重懸細(xì)胞，取15uL細(xì)胞懸液加入血球計(jì)數(shù)板上顯微鏡下計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞(PBMC)總數(shù)。(2)采集單個(gè)核組織細(xì)胞：由浙江大學(xué)組織工程研究平臺(tái)提供。實(shí)質(zhì)上屬于來(lái)自脾臟的巨噬細(xì)胞，其制備方法是：①脾臟組織的獲取和轉(zhuǎn)運(yùn)：在論理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意下，取手術(shù)切除的脾臟標(biāo)本組織，立即剪碎成體積約1mm³的小組織塊，移入裝有預(yù)冷4℃的無(wú)菌密封瓶?jī)?nèi)，迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞培養(yǎng)室。②脾臟組織細(xì)胞混懸液的制備：將脾臟組織塊移至無(wú)菌操作臺(tái)，PBS洗滌3次，RPMI-1640洗滌2次，以清除組織內(nèi)的血液并保證組織的無(wú)菌。機(jī)械研磨脾臟組織，這時(shí)便有大量的組織細(xì)胞懸混于RPMI-1640液中。用200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾懸混有組織細(xì)胞的RPMI-1640液，濾液為脾臟組織細(xì)胞混懸液(主要含紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)。③脾臟組織細(xì)胞混懸液中紅細(xì)胞的裂解：然后用RPMI-1640液洗滌離心(1000r/min，3min)，以去除細(xì)胞碎屑，加入Tris-NH4Cl作用5min，裂解紅細(xì)胞，迅速離心(1000r/min，3min)，去除上清液內(nèi)的裂解紅細(xì)胞碎片，PBS洗滌離心3次，RPMI-1640洗滌離心1次，以清除混懸液中殘存的Tris-NH4Cl，避免其影響細(xì)胞的存活，此時(shí)，混懸液中主要含脾臟組織巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。④脾臟組織巨噬細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)：將前述混懸液作為培養(yǎng)細(xì)胞原液，臺(tái)盼藍(lán)染色判定活力并計(jì)數(shù)，用RPMI-1640液調(diào)整細(xì)胞濃度為(3～5)×10⁶/L，將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液接種于玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)條件為37℃，50mL/LCO₂，100％濕度，分別培養(yǎng)2～3h，相差顯微鏡下觀察形態(tài)。貼壁脾臟組織巨噬細(xì)胞的消化：貼壁脾臟組織巨噬細(xì)胞的消化：吸去培養(yǎng)上清液，巨噬細(xì)胞貼壁，PBS反復(fù)吹打、消化，所得細(xì)胞懸液洗滌離心(1000r/min，3min)，得到分離純化的巨噬細(xì)胞。此外，還可以取治療或手術(shù)后廢棄的標(biāo)本提取制備，如腹膜腔液、肺泡、肝臟、脾臟、腹膜組織、小腸黏膜等。(3)采集羊水、絨毛細(xì)胞：浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖遺傳實(shí)驗(yàn)室備用。在論理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意下，取實(shí)驗(yàn)診斷報(bào)告后的剩余羊水、絨毛細(xì)胞，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞留用。

2、分選貼壁細(xì)胞(巨噬細(xì)胞初步貼壁分選)

按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，但根據(jù)細(xì)胞性質(zhì)的不同，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)條件等，一般貼壁法將單個(gè)核血液細(xì)胞(PBMC)或單個(gè)核組織細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國(guó))中孵育2h，待單個(gè)核細(xì)胞貼壁后，吸棄上層懸浮細(xì)胞(巨噬細(xì)胞以外的細(xì)胞不易貼壁而隨上層液除去)，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI-1640培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞(主要為巨噬細(xì)胞，但還有少量其他貼壁細(xì)胞)。1 000r/min離心5min，棄上清。羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞培養(yǎng)1～7天，出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)克隆、細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)到60～80％的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以胰酶消化，PBS清洗，獲取細(xì)胞懸液，配成合適細(xì)胞濃度。

3、分選CD4細(xì)胞

采用免疫磁珠法分選CD4細(xì)胞：①主要試劑和儀器：CD4免疫磁珠(德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司)；0.2％臺(tái)盼藍(lán)染色液(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司)；新生牛血清(Hyclone公司)；MiniMACS磁力分離系統(tǒng)(德國(guó)美天旎生物技術(shù)有限公司)。②CD4細(xì)胞免疫磁珠分選方法：細(xì)胞懸液均分至兩個(gè)1.5mLEppendorf管，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清，重懸細(xì)胞每80uLBuffer含細(xì)胞數(shù)10⁷個(gè)，每10⁷個(gè)細(xì)胞加20uLCD4MicroBeads或CD8MicroBeads，充分混勻，在4～8℃孵化15min，用1mLBuffer洗滌細(xì)胞，離心(300r/min，20℃)10min，棄去上清500uLBuffer重懸細(xì)胞，將MS分離柱放置在MACS分離器的磁場(chǎng)中，以500uLBuffer漂洗，將500uL細(xì)胞懸液通過(guò)分離柱，用500uLBuffer沖洗分離柱重復(fù)操作3次，收集流出液，流出液中含非CD4細(xì)胞，自分離器中取出分離柱，用1000uLBuffer加壓沖洗分離柱，收集流出液，此為CD4細(xì)胞(細(xì)胞活力檢測(cè)：細(xì)胞純化前后分別取15uL細(xì)胞懸液與等體積臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，顯微鏡下觀察不著色發(fā)亮者為活細(xì)胞，著色脹大者為死細(xì)胞，計(jì)算200個(gè)細(xì)胞中活細(xì)胞的百分比)。此時(shí)分選的細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞。

4、分選CDl4細(xì)胞(分選巨噬細(xì)胞)

CDl4為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特有的表面標(biāo)志，理論上如果從單個(gè)核組織細(xì)胞、羊水細(xì)胞及絨毛細(xì)胞中分選，則所得細(xì)胞為巨噬細(xì)胞；如果從單個(gè)核血液細(xì)胞中分選，則所得細(xì)胞包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；但因單核細(xì)胞壽命短、僅在外周血中存活1天且遠(yuǎn)不如巨噬細(xì)胞易于貼壁生長(zhǎng)，所以在本發(fā)明的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)中已基本除去，分選出來(lái)的細(xì)胞基本為巨噬細(xì)胞。

基本方法類同于CD4細(xì)胞，采用免疫磁珠法。①試劑：人CDl4免疫磁珠試劑盒(Miltenyi Biotec，德國(guó))，RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))；②免疫磁珠法：(A)磁珠與特異性靶細(xì)胞一單核細(xì)胞結(jié)合：每1×10⁸個(gè)PBMC加入200uL偶聯(lián)CDl4抗體的磁珠和800uL緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/L EDTA0.5mL，4℃冰箱預(yù)冷)，在15mL離心管中充分混勻，4℃孵育15min，中間可輕微振搖1次。15min后取出離心管，每1×10⁷個(gè)細(xì)胞加入1～2mL預(yù)冷緩沖液，1 000r/min，離心8min，棄上清，加入0.5mL緩沖液并吹打成單細(xì)胞懸液。(B)收集磁珠標(biāo)記的單核細(xì)胞：將細(xì)胞分離柱置于MACS磁力架上，加入1mL緩沖液平衡細(xì)胞分離柱，待無(wú)液體滴下，立即將上述細(xì)胞懸液加人細(xì)胞分離柱中，用0.5mL緩沖液沖洗細(xì)胞分離柱3次。待沖洗完畢后，加入1mL緩沖液，從磁力架中移出細(xì)胞分離柱，用針柱快速推動(dòng)，沖出在分離柱中與CDl4抗體一磁珠相結(jié)合的細(xì)胞，即為CDl4+的巨噬細(xì)胞。

此外，還可采用以下2種方法分選，包括①貼壁法：將PBMC置于含有RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于37℃，含5％CO：的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Themo electro corporation CLASS 100，美國(guó))中孵育2h。待單核細(xì)胞貼壁后，吸棄上層懸浮細(xì)胞，PBs緩沖液輕輕洗滌3遍，加入少量RPMI-1640培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞。1 000r/min離心5min，棄上清。②流式細(xì)胞術(shù)法：CDl4標(biāo)記：取PBMC，用緩沖液(含有10％的牛血清白蛋白2.5mL和2mol/LEDTA 0.5mL)調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁸/mL，在每毫升細(xì)胞懸液中加入CDl4+-FITC抗體100uL，4℃避光標(biāo)記18min，再向離心管中加入1mL流式緩沖液以終止染色，PBs洗滌3次，用含2％青鏈霉素的PBS調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/mL。流式細(xì)胞儀分選：將制備的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀(BD FAcsAria II，美國(guó))上分選，根據(jù)CDl4抗體的熒光強(qiáng)度、細(xì)胞的相對(duì)大小以及細(xì)胞的相對(duì)顆粒性和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，收集CDl4+細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)備用。

(二)構(gòu)建SV40LT/pcDNA3.1和hTERT/pLXSNneo重組子

1、提取SV40LT和hTERT基因

(1)SV40LT和hTERT的提取：(I)酶切SV40LT和hTERT：①酶切SV40LT：從市售購(gòu)買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質(zhì)粒，溶解于適量的H₂O或TE緩沖液中，加2uL10×酶切緩沖液、18uL H₂O和限制性內(nèi)切酶BamH I(1-5U/ugDNA)，37℃溫育1h，75℃加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過(guò)加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)以備電泳。②酶切hTERT：hTERT位于質(zhì)粒pClneo-hTERT的EcoRI與SalI位點(diǎn)之間，pLXSNneo載體多克隆位點(diǎn)(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點(diǎn)。從市售購(gòu)買pCIneo-hTERT質(zhì)粒，溶解于適量的超凈H₂O或TE緩沖液中，加2uL10×酶切緩沖液和18uL H₂O，加入限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37℃溫育1h，75℃加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過(guò)加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)，按常規(guī)PCR法擴(kuò)增hTERT后，收取擴(kuò)增物以備電泳。(II)SV40LT和hTERT電泳：①SV40LT(SV40DNA)電泳：取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10％瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的10×加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí)做合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物，接通電極，使DNA向陽(yáng)極移動(dòng)，在1-10V/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時(shí)，關(guān)閉電源。②hTERT電泳：取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10％瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的10×加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí)做合適的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物，接通電極，使hTERT向陽(yáng)極移動(dòng)，在1-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(shí)(30min)，關(guān)閉電源。(III)SV40LT和hTERT純化與回收：①SV40LT純化與回收：從瓊脂糖中分離出約2600bp SV40大T抗原DNA：在300-360nm長(zhǎng)波紫外光源下(使用長(zhǎng)波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標(biāo)DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒(méi)凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長(zhǎng)度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(méi)(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，在下層DNA的溶液中加入等體積酚氯仿(2個(gè))抽提2次，上清液轉(zhuǎn)入到另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，于20℃過(guò)夜，12000g，4℃下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入70％乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μl TE溶解DNA。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來(lái)。②hTERT純化與回收：從瓊脂糖中分離hTERT條帶：在長(zhǎng)波紫外光源下將含目標(biāo)hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒(méi)凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長(zhǎng)度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(méi)(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酚氯仿(2個(gè))抽提2次，上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，于20℃過(guò)夜，12000g，4℃下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70％乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50μl TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來(lái)。

2、構(gòu)建SV40LT/pcDNA3.1重組子

取9μl上述DNA成份(0.1-5μg)、10μl 2×連接緩沖液、1μl 10mmol/L ATP、T4 DNA連接酶(20～500粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1空載體混合，15℃溫育24h，構(gòu)建成SV40LT/pcDNA3.1重組子。

3、構(gòu)建hTERT/pLXSNneo重組子

取9μl上述純化的hTERT成份(0.1-5μg)、1μl 10mmol/L ATP、10ul Ligation Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合，15℃溫育24h，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子。

4、純化、擴(kuò)增、鑒定SV40LT/pcDNA3.1和hTERT/pLXSNneo重組子

(I)SV40LT/pcDNA3.1重組子的擴(kuò)增、分離與鑒定：①大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl₂或多種2價(jià)陽(yáng)離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl₂制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下：從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或1ml新鮮的16～20h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h(旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min)，每隔20～30min測(cè)量OD600值≈0.4，在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min后，于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl₂重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆?，用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1～2min，每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。②重組子的篩選、擴(kuò)增與提取：用無(wú)菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無(wú)菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過(guò)夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD₆₀₀≈4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4℃，6000g離心10min，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積≥20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在-20℃或-70℃無(wú)限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g離心10min，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見(jiàn)的飄浮物可用數(shù)層紗布過(guò)濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5～10min，于室溫，1 500g離心10min，加入2mL70％乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4℃長(zhǎng)期保存)。③重組子的鑒定：上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的DNA(含SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性內(nèi)切酶BamH I進(jìn)行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。(II)hTERT/pLXSNneo重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定：①大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl₂或多種2價(jià)陽(yáng)離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl₂制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下：從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或1ml新鮮的16～20h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h(旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min)，每隔20～30min測(cè)量OD600值≈0.4，在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用Sorvall6S2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl₂重懸每份沉定，迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩＂谝愿惺軕B(tài)大腸桿菌純化和擴(kuò)增hTERT/pLXSNneo重組子：用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中分別取200μl轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，在每管中加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl，DNA≤50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1～2min，每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgS04和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。③篩選、擴(kuò)增重組子：用無(wú)菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無(wú)菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過(guò)夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37℃培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD₆₀₀≈4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4℃，6000g離心10min，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積≥20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在-20℃或-70℃無(wú)限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g離心10min，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見(jiàn)的飄浮物可用數(shù)層紗布過(guò)濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5～10min，于室溫，1 500g離心10min，加入2mL70％乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4℃長(zhǎng)期保存)。④重組質(zhì)粒的鑒定與擴(kuò)增：挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃，250r/min搖床中培養(yǎng)，14h后收集培養(yǎng)物，4℃、10000r/min離心5min，按試劑盒說(shuō)明書小量提取并純化重組質(zhì)粒；以EcoRI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒反應(yīng)體系：限制性內(nèi)切酶各0.5ul、10×buffer 2ul、重組質(zhì)粒10ul、加水補(bǔ)足至20ul，37℃酶切1h。酶切產(chǎn)物于80V電壓條件下進(jìn)行0.8％瓊脂糖電泳，時(shí)間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測(cè)定重組質(zhì)粒的序列；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定準(zhǔn)確后，將含有該質(zhì)粒的細(xì)菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴(kuò)增培養(yǎng)，按大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行大劑量質(zhì)粒抽提純化，紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度及純度后備用。

(三)構(gòu)建巨噬細(xì)胞株

1、聯(lián)合轉(zhuǎn)染SV40LT和hTERT致巨噬細(xì)胞永生化

將重組子SV40LT/pcDNA3.1和hTERT/pLXSNneo導(dǎo)入巨噬細(xì)胞，構(gòu)建巨噬細(xì)胞株，并行擴(kuò)大培養(yǎng)，具體方法為：在1.5ml微量離心管中制備下列溶液：取A管，將SV40LT/pcDNA3.1溶于50μl無(wú)血清培養(yǎng)液中；取B管，將hTERT/pLXSNneo溶于50μl無(wú)血清培養(yǎng)液中；然后取C管，將20μl脂質(zhì)體Lipofectamine溶解于80μl無(wú)血清培養(yǎng)液中，將A管、B管和C管混勻，在室溫的條件下靜置45min。用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌上述T淋巴細(xì)胞2次。然后分別在Lipofectamine-SV40LT/pcDNA3.1和Lipofectamine-hTERT/pLXSNneo混合物中加入1ml無(wú)血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至上述T淋巴細(xì)胞中，然后加入1ml無(wú)血清培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20ml/L)，在CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液(胎牛血清濃度為20％)，繼續(xù)培養(yǎng)20h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg·L^-1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8天后選擇活細(xì)胞作擴(kuò)大培養(yǎng)后，再加大G418濃度到800mg·L^-1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)9天左右鏡下觀察，可見(jiàn)巨噬細(xì)胞明顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。如果細(xì)胞增長(zhǎng)慢，或細(xì)胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進(jìn)行等量換液。當(dāng)總量達(dá)到14ml時(shí)轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)至第15-20周(約第135代)，仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即細(xì)胞增加數(shù)量與培養(yǎng)時(shí)間呈倍增關(guān)系，死亡細(xì)胞少于10％(通過(guò)讀取培養(yǎng)容器的刻度判斷細(xì)胞數(shù)量的增加情況；通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。因?yàn)檎５幕罴?xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺(tái)盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，可判斷為細(xì)胞已經(jīng)死亡。方法是每周吸取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)懸液，與臺(tái)盼藍(lán)染色劑混合后置室溫5～10分鐘，然后制成細(xì)胞薄片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算著色的死細(xì)胞和不著色的活細(xì)胞的百分比)。此后隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量的增加變慢、死亡細(xì)胞越來(lái)越多，直至細(xì)胞不再增加，甚至溶解、減少、全部死亡。當(dāng)總量達(dá)到45ml時(shí)，置50ml離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘，棄上清，加入3ml凍存培養(yǎng)基(5％二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95％FBS)混勻，成細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞濃度約為10⁵/ml)。凍存管分裝，1ml/管，置-20℃2h，再置-70℃2h，然后凍存在-196℃液氮中(或立即置零下80度，1-2小時(shí)后移入液氮罐中)。以此構(gòu)建永生化巨噬細(xì)胞株(系)。

2、鑒定巨噬細(xì)胞株的生物學(xué)特性

①觀察細(xì)胞鏡下形態(tài)：可見(jiàn)巨噬細(xì)胞漿豐富，不規(guī)則，在液體下能伸縮；②觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：取生長(zhǎng)較好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)，分別取1.4×10⁴細(xì)胞接種于30個(gè)含15 FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶，每天取2瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，連續(xù)觀察直至細(xì)胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在hepato ZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸(對(duì)數(shù))，描繪在半對(duì)數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，永生化細(xì)胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體：通過(guò)分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，或與原代細(xì)胞的核型相同，則說(shuō)明該細(xì)胞系沒(méi)有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時(shí)可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如果沒(méi)有，也說(shuō)明細(xì)胞系未出現(xiàn)瘤性特征)；④裸鼠致瘤試驗(yàn)：將hTERT和SV40LT永生化的細(xì)胞以3×10⁷接種裸鼠背部皮下，2個(gè)月后，4只裸鼠均未見(jiàn)腫瘤形成，證明此細(xì)胞為非惡化細(xì)胞；⑤轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA中hTERT和SV40大T基因檢測(cè)：如以免疫組織化學(xué)檢測(cè)，hTERT和SV40轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見(jiàn)大量棕色顆粒，表明hTERT或SV40LT抗原已整合入細(xì)胞內(nèi)；也可用RT-PCR法檢測(cè)T抗原在細(xì)胞中的表達(dá)，其中T抗原的引物：上游引物(A4239)5’-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496)5’-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為268bp，擴(kuò)增條件為94℃，5min，即：(94℃，1min；55℃，1min，-0.5℃/循環(huán)；72℃，1min)×30、(94℃，30S；40℃，30S，72℃，30S)×15，擴(kuò)增體系為50μl：[Mg²⁺]2mmol/L、dNTPs200μmol/L、引物濃度0.4μmol/L、Taq 1U、模板5μl；實(shí)驗(yàn)組以第19代細(xì)胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，產(chǎn)物-20℃保存)；陰性對(duì)照設(shè)兩個(gè)，分別以無(wú)菌水、原代細(xì)胞的cDNA做模板，陽(yáng)性對(duì)照以SV40 DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40 DNA，因?yàn)镾V40病毒無(wú)包膜，不使用SDS破膜，取5μl進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余-20℃保存?zhèn)溆?；⑥mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定：T抗原mRNA RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序：取100μl體系的擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產(chǎn)物，取2μl DNA溶液稀釋100倍，測(cè)濃度，余下的DNA及上、下游引物各10μl進(jìn)行測(cè)序。⑦流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：檢測(cè)第19代細(xì)胞系中合成、分裂的細(xì)胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細(xì)胞增強(qiáng)，說(shuō)明是hTERT和SV40大T抗原整合、表達(dá)的結(jié)果。⑧DNA序列測(cè)定：按常規(guī)測(cè)序儀檢測(cè)，顯示hTERT和SV40大T抗原基因序列?？傊郎奘杉?xì)胞株具有的特性為：①巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染了SV40LT和hTERT基因從而可長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)；②巨噬細(xì)胞的染色體核型為二倍體，即“46，XX”或“46，XY”；③巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線如以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在hepato ZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；④細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)(形成克隆)；⑤細(xì)胞為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗(yàn)陰性；⑥細(xì)胞的DNA中同時(shí)整合了SV40LT和hTERT基因，表達(dá)SV40LT和hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；⑦體外連續(xù)培養(yǎng)15-20周(約第135代)仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；⑧能反復(fù)凍存、長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。

3、檢測(cè)巨噬細(xì)胞株的功能

將巨噬細(xì)胞株接種于96孔培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，7-10天后，細(xì)胞克隆生長(zhǎng)面積達(dá)到1/10個(gè)細(xì)胞孔時(shí)，去培養(yǎng)上清，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的培養(yǎng)孔，顯微鏡下標(biāo)記細(xì)胞株生長(zhǎng)的位置、大小，使用無(wú)菌槍頭在標(biāo)注的位置吸取細(xì)胞克隆到新的有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，然后依次倍比稀釋到后面數(shù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一周左右，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞克隆長(zhǎng)滿至孔底面積1/10以上時(shí)，取細(xì)胞或培養(yǎng)上清檢測(cè)巨噬細(xì)胞株的功能。包括：①巨噬細(xì)胞株吞噬細(xì)菌功能檢測(cè)：將巨噬細(xì)胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性亞甲蘭液染色，在油鏡下觀察吞噬情況，計(jì)數(shù)吞噬細(xì)菌和未吞噬細(xì)菌的巨噬細(xì)胞數(shù)比例，以吞噬細(xì)菌功能強(qiáng)的巨噬細(xì)胞作為備選陽(yáng)性克隆株。②巨噬細(xì)胞株吞噬HIV功能檢測(cè)：取疾控中心保存的艾滋病(AIDS)患者的血漿與巨噬細(xì)胞株混合培養(yǎng)后，分離細(xì)胞株，PBS清洗3次，測(cè)定經(jīng)裂解的吞噬細(xì)胞株吞噬HIV的功能，具體根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性。具體按試劑盒說(shuō)明書操作。③巨噬細(xì)胞株產(chǎn)生巨噬細(xì)胞因子檢測(cè)：以人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)按說(shuō)明書操作，檢測(cè)范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性，具體按試劑盒說(shuō)明書操作。MIF是集細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，挑選具有較強(qiáng)吞噬功能的培養(yǎng)孔中的細(xì)胞克隆重復(fù)進(jìn)行下一輪稀釋培養(yǎng)，重復(fù)2-3輪，檢測(cè)功能穩(wěn)定后取出，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶擴(kuò)增培養(yǎng)。

4、巨噬細(xì)胞株的凍存與復(fù)蘇

保存前12小時(shí)調(diào)整細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，取一瓶生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)良好的細(xì)胞，適當(dāng)消化后制成細(xì)胞懸液，1000r/min離心5min，去上清液，輕彈管底使細(xì)胞松散，加入4℃保存的9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO，分裝細(xì)胞凍存管，1mL/管，-70℃冰箱過(guò)夜，取出后將凍存管放入液氮容器中保存?zhèn)溆?。?fù)蘇前準(zhǔn)備好40℃左右的熱水，將凍存管從液氮中小心取出，迅速置于熱水中均勻搖動(dòng)使細(xì)胞解凍，解凍后在1000r/min離心5min，超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下打開(kāi)凍存管，將解凍后的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌一次，然后在1000r/min離心5min，棄去上清，以備作擴(kuò)增培養(yǎng)。

5、巨噬細(xì)胞株的擴(kuò)增

將上述細(xì)胞沉淀使用完全培養(yǎng)液輕輕重懸后移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反復(fù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，直至所需的巨噬細(xì)胞株數(shù)量，每傳代培養(yǎng)10代，檢測(cè)巨噬細(xì)胞株的功能，觀察是否穩(wěn)定。繼續(xù)在數(shù)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

本申請(qǐng)的技術(shù)方案，所采用的原代細(xì)胞包括直接分離和干細(xì)胞誘導(dǎo)來(lái)源的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、單核細(xì)胞以及通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)、交聯(lián)、親和吸附制成的包被有CD4分子的顆粒，和/或與CD4+細(xì)胞功能相似的顆粒。永生化細(xì)胞株的構(gòu)建方法包括常規(guī)的細(xì)胞溶合雜交瘤技術(shù)。質(zhì)粒載體包括選用SV40LT/pLXSN、hTERT/pLPCX、SV40LT/pcDNA3.1(-)和hTERT/pLXSNneo。致永生化的成份包括逆轉(zhuǎn)錄病毒基因、SV40LT、hTERT、EB病毒、腫瘤基因、細(xì)胞生長(zhǎng)刺激劑和誘導(dǎo)劑以及包括抗CD3單克隆抗體、抗CD3/CD28雙抗體在內(nèi)的CD4+細(xì)胞表面抗體。

二、凈化器的制備

1、凈化劑的充填

將本發(fā)明制備的巨噬細(xì)胞株，以無(wú)菌生理鹽水清洗后，再以1000r/min離心5min(低速短時(shí)離心)，取細(xì)胞沉淀裝配丙烯酸酯之類高生物相容性材料(與血漿分離器材料相同)制成的圓柱形凈化器，至4/5，然后加細(xì)胞凍存液(含30％胎牛血清、12％二甲亞砜的1640培養(yǎng)液)，使細(xì)胞濃度達(dá)80％，輕輕搖勻，封口，經(jīng)4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，過(guò)夜，入-196℃液氮凍存?zhèn)溆谩＝鈨鍪褂脮r(shí)，需迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的37℃水浴中，并不斷搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化，然后以無(wú)菌生理鹽水清洗后使用。在制備凈化劑時(shí)，保存細(xì)胞的介質(zhì)包括選用生理鹽水、常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞凍存液。以吞噬HIV的巨噬細(xì)胞株配制凈化劑時(shí)，其濃度為80％，以吸附HIV的免疫細(xì)胞和免疫顆粒配制凈化劑時(shí)，其濃度為95％以上?？梢詫⒍喾N細(xì)胞混合配制成凈化劑。

2、凈化器的規(guī)格

凈化器可為底徑小、頂徑大的圓柱形，或方形、漏斗形，容積為200～300ml，進(jìn)出口均設(shè)有細(xì)胞篩網(wǎng)，進(jìn)口處頂徑篩網(wǎng)目數(shù)為800目；出口處底徑篩網(wǎng)目數(shù)為2.0～5.0目(2.5～5.0目相當(dāng)于0.1～0.2微米或100～200納米)，具體可制成2.0目、2.5目、3.0目、3.5目、4.0目、4.5目和5.0目的7種不同規(guī)格，用以阻擋120納米的HIV病毒或更大的細(xì)菌；液體出口處設(shè)置目數(shù)為100目(相當(dāng)于4微米)的細(xì)胞濾網(wǎng)，用以阻擋可能濾出的細(xì)胞；液體進(jìn)出口與網(wǎng)篩之間設(shè)有緩沖區(qū)，有利于系統(tǒng)循環(huán)的穩(wěn)定性。

3、凈化器的材料

血液凈化器選用丙烯酸酯之類的高分子材料，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變。可通過(guò)共價(jià)、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的不均勻性、親水性、減少對(duì)凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。在吸附器內(nèi)表面加親水凝膠，將2甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿-丁基異丁烯酸固化在醋酸纖維素膜上，通過(guò)控制濕紡過(guò)程，可生成CA/PMB30、CA/PMB80和CA/PMB30-80，具有較高的血液和細(xì)胞相容性。將某些具有抗凝作用的物質(zhì)固化在載體或吸附器內(nèi)表面的材料上，可抑制血液凝固，提高生物相容性，還可降低肝素用量，并有可能實(shí)現(xiàn)無(wú)肝素化。將肝素共價(jià)結(jié)合到聚醚砜表面，既保持了聚醚砜的力學(xué)性能，又能提高吸附器內(nèi)表面的抗凝血性能。在醋酸纖維膜上共價(jià)固化亞油酸膜，或?qū)⒐矁r(jià)結(jié)合到聚丙烯酸的亞油酸嫁接到聚砜膜表面，都可以有更好的組織相容性和抗凝血效果。隨著高分子材料和納米技術(shù)的不斷發(fā)展，與人類血管內(nèi)皮接近的材料在不久的將來(lái)將會(huì)出現(xiàn)。

三、分離器的制備

(一)血液分離器的制備

1、制備原理：①血細(xì)胞、細(xì)菌、病毒的分子大?。喝梭w血液中有形成份(細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。細(xì)菌的大小為：球菌的直徑約在0.75-1.25μm之間，桿菌長(zhǎng)度約在2-5μm，螺旋菌長(zhǎng)約100-200μm。病毒的大小以納米(nm)為單位[1cm＝10mm，1mm＝1000μm，1μm＝1000nm]，不同病毒間大小差異很大，最小的如植物的聯(lián)體病毒(Geminiviruses)直徑僅18-20nm，最大的動(dòng)物痘病毒(Poxviruses)大小達(dá)300-450nm×170-260nm，最長(zhǎng)的如絲狀病毒科(Filoviridae)病毒粒子大小為80nm×790-14000nm，多數(shù)單個(gè)病毒粒子的直徑在100nm左右，艾滋病毒為100-120nm(0.1-0.12μm)。②艾滋病患者血液中存在的相關(guān)成份：多核巨細(xì)胞(HIV感染細(xì)胞表面的gp120與CD4+細(xì)胞結(jié)合而成的大體積的HIV感染細(xì)胞)、gp120細(xì)胞(表面有g(shù)p120但以單個(gè)細(xì)胞存在的HIV感染細(xì)胞)、基因整合細(xì)胞(艾滋病感染初期或潛伏期，整合有HIV雙鏈DNA，但細(xì)胞表面沒(méi)有g(shù)p120的HIV感染細(xì)胞)、正常白細(xì)胞(未感染HIV的單個(gè)細(xì)胞存在的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)、紅細(xì)胞、血小板、化學(xué)成份(蛋白質(zhì)、糖類、脂類、電解質(zhì)等)、游離的HIV、細(xì)菌及其他微生物。③多核巨細(xì)胞為天然的大體積細(xì)胞；gp120細(xì)胞和基因整合細(xì)胞可通過(guò)抗原和抗體的免疫反應(yīng)使細(xì)胞凝集為大體積多細(xì)胞聚合體；游離的HIV可通過(guò)載體顆粒/免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇篌w積成份。④根據(jù)上述3點(diǎn)，可以制備能通過(guò)單個(gè)細(xì)胞但不能通過(guò)大體積細(xì)胞或顆粒的血液分離器。⑤選用具有選擇性吸附功能的材料，經(jīng)本發(fā)明的體外血液循環(huán)支路篩除血液中的HIV感染細(xì)胞。

2、血液分離器的材料與要求：同本發(fā)明的凈化器，選用聚醋無(wú)紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)和白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、C3a、C5a的改變。

3、血液分離器的型號(hào)：血液分離器的外形制備成柱形結(jié)構(gòu)(以醋酸纖維或脫脂棉為材料制作濾芯)、扁平結(jié)構(gòu)(以聚醋無(wú)紡布為材料制作濾芯)；孔徑制備成150～250μm、50～150μm、15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm、1～2μm的型號(hào)。

4、血液分離器的應(yīng)用原則：根據(jù)艾滋病患者的病情選用不同型號(hào)的分離器，原則上先選用大孔徑型號(hào)做預(yù)篩濾，然后選用較小孔徑的型號(hào)。重度艾滋病患者常發(fā)生嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染，血液中含有不同大小的成份。如含有特大體積的真菌、螺旋菌、腫瘤細(xì)胞及其他異物，則選用孔徑為150～250μm或50～150μm的分離器；如為篩濾HIV感染的單核巨噬細(xì)胞、多核巨細(xì)胞、多細(xì)胞聚合體及吸附有HIV的顆粒性物質(zhì)，以及為了置換易受HIV感染的CD4+細(xì)胞，則選用15～40μm、8～15μm、5～8μm、3～5μm之類的型號(hào)。這幾種型號(hào)近似或小于血液中單個(gè)紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小淋巴細(xì)胞的體積，但紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞具有變形運(yùn)動(dòng)的特性，能通過(guò)比自身體積更小的微孔。

(二)血漿分離器的制備

(1)制備原理：根據(jù)血細(xì)胞和血漿成份的分子大小制備。如人體血液中有形成份(血細(xì)胞)的大小為：正常紅細(xì)胞大約為7微米(μm)，是雙凹圓盤狀的細(xì)胞；白細(xì)胞分為5種，中性粒細(xì)胞約12μm，嗜酸性粒細(xì)胞略大些，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞接近，小淋巴細(xì)胞6-8μm，與紅細(xì)胞近似，單核細(xì)胞最大，約15-20μm。血小板為圓盤形，直徑1～4微米到7～8微米不等，人的血小板平均直徑為2-4微米，厚0.5～1.5微米。

(2)材料：可選用聚醋無(wú)紡布、醋酸纖維、脫脂棉等，要求生物相容性好，幾乎不激活補(bǔ)體、不引起炎癥反應(yīng)、不引起白細(xì)胞、血小板、血氧分壓、補(bǔ)體C3a、C5a的改變?？赏ㄟ^(guò)共價(jià)、接枝、聚合等方法改進(jìn)材料的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)表面的微觀不均勻性、親水性、減少對(duì)凝血及氧化應(yīng)激的影響、從而提高篩濾充分性和生物相容性、減少并發(fā)癥的發(fā)生。

(3)型號(hào)與規(guī)格：就分離器的外形來(lái)說(shuō)，可以醋酸纖維或脫脂棉等材料作濾芯制備成柱形結(jié)構(gòu)、以聚醋無(wú)紡布等材料作濾芯制備成扁平結(jié)構(gòu)等形狀；按待分離的血細(xì)胞和血漿成份的分子大小確定孔徑。本發(fā)明所涉及的血漿分離器用性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、通透性高的高分子聚合物制成空心纖維型濾器，空心纖維膜直徑為270～370μm，膜厚度為50μm，孔徑為0.2～0.6μm，纖維長(zhǎng)度為13.5～26μm。該孔僅準(zhǔn)許血漿濾過(guò)，但能阻擋所有的細(xì)胞成分。

四、艾滋病生物細(xì)胞免疫治療儀的構(gòu)件

1、關(guān)鍵構(gòu)件：(1)血液分離器：用于按體積大小篩除以多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體狀態(tài)存在的HIV感染細(xì)胞，即用于清除血細(xì)胞內(nèi)的HIV；(2)血漿分離器：用于分離單個(gè)血細(xì)胞和血漿；(3)血漿凈化器：用于吸附血漿中的HIV。

2、附加構(gòu)件：包括血泵、肝素泵、動(dòng)靜脈壓和空氣監(jiān)測(cè)、溫度控制系統(tǒng)、除氣系統(tǒng)、電導(dǎo)率監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、超濾監(jiān)測(cè)和漏血監(jiān)測(cè)等部分組成。(1)血泵(Blood Pump)：用來(lái)推動(dòng)血液循環(huán)以維持血液凈化治療的順利進(jìn)行，通常血泵部分往往具有轉(zhuǎn)速檢測(cè)功能，以監(jiān)測(cè)病人的血流情況，因此血泵轉(zhuǎn)輪與凹槽間距設(shè)定要精確，并需要經(jīng)常調(diào)整，根據(jù)血路泵管的情況，一般將間距設(shè)定為3.2～3.3mm，不可太松，否則會(huì)造成血流檢測(cè)不準(zhǔn)；也不可太緊，否則會(huì)造成管路破裂。(2)肝素泵(Heparin Pump)：肝素泵相當(dāng)于臨床上應(yīng)用的微量注射泵，用以持續(xù)向篩濾管道(病人血液)中注射肝素，由于病人的血液在體外循環(huán)與空氣接觸，容易發(fā)生凝血現(xiàn)象，使用肝素泵可以防止凝血的發(fā)生。(3)動(dòng)靜脈壓監(jiān)測(cè)：動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)主要用以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血液分離器微孔的堵塞情況，另外用以監(jiān)測(cè)體外循環(huán)血栓、凝固和壓力的變化。當(dāng)血流不足時(shí)，動(dòng)脈壓就會(huì)降低；當(dāng)有凝血、血栓形成，特別是分離器微孔堵塞時(shí)，動(dòng)脈壓就會(huì)升高；靜脈壓監(jiān)測(cè)用來(lái)監(jiān)測(cè)管路血液回流的壓力，當(dāng)分離器微孔堵塞、凝血、血栓形成、血流不足以及靜脈血回流針頭脫落時(shí)，靜脈壓就會(huì)下降，如果血路回流管扭曲堵塞或回流針頭發(fā)生堵塞時(shí)，靜脈壓就會(huì)升高。(4)空氣監(jiān)測(cè)(Air Detector)：用來(lái)監(jiān)測(cè)血液流路的空氣氣泡，一般用超聲波探測(cè)的原理，為了避免病人發(fā)生空氣栓塞而設(shè)置。當(dāng)監(jiān)測(cè)到有空氣氣泡時(shí)，檢測(cè)系統(tǒng)會(huì)驅(qū)動(dòng)動(dòng)、靜脈血路夾來(lái)阻斷血流，防止危險(xiǎn)的發(fā)生。

總之，在本發(fā)明關(guān)鍵構(gòu)件和附加構(gòu)件的基礎(chǔ)上，引入計(jì)算機(jī)調(diào)控而制成操作的人性化、治療的個(gè)性化、設(shè)計(jì)的安全性，以及模塊化、自動(dòng)監(jiān)測(cè)及調(diào)控、液晶顯示、自行判斷警報(bào)原因及解除信號(hào)等微電腦處理的血液凈化治療儀。

五、艾滋病生物細(xì)胞免疫治療儀的連接通路與使用方法

1、安裝：如圖1，以無(wú)菌操作連接各部件，包括血液分離器、血漿分離器、血漿凈化器及各循環(huán)管路。

2、排氣：以無(wú)菌生理鹽水充液分離器、凈化器及各循環(huán)管路，排除分離器、凈化器及其循環(huán)管路內(nèi)的氣體、氣泡，仔細(xì)檢查，確認(rèn)無(wú)氣體、氣泡后使用。

3、通液：將動(dòng)脈血路管(1)接通艾滋病患者的動(dòng)脈血管，在操作中再次仔細(xì)檢查排氣是否完全，液流是否通暢，并避免管內(nèi)流液污染。

4、抗凝：從肝素泵(2)向液流中注射抗凝劑(肝素)，初次為2500∪或20～30∪/kg。

5、啟動(dòng)：將動(dòng)脈血路管(1)的一端與動(dòng)脈血管相連通，將靜脈管路(15)接通靜脈血管，然后打開(kāi)血液泵(2)，血流量為100～150ml/min，如圖1，當(dāng)動(dòng)脈血液經(jīng)動(dòng)脈血路管(1)、肝素和血液泵(2)進(jìn)入血液分離器(3)時(shí)，因HIV感染而形成的大體積多核巨細(xì)胞被阻留在血液分離器(3)內(nèi)，單個(gè)血細(xì)胞和血漿依次經(jīng)血液出口(4)、血液泵(6)和循環(huán)管路(7)流入血漿分離器(8)，分離的血漿依次經(jīng)血漿泵(9)和血路管(10)流入此時(shí)開(kāi)放的凈化器(11)，待充滿血漿、約10分鐘，開(kāi)始放出血漿，經(jīng)出口管路(13)流出，同步向凈化器(12)灌注血漿，在凈化器(11)內(nèi)的血漿將近流完時(shí)，再次開(kāi)始灌注血漿，此時(shí)凈化器(12)開(kāi)始放出血漿，兩個(gè)并聯(lián)的凈化器(11)和(12)交替進(jìn)行。如表示圖1中的血液分離器(3)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖2所示，血液分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，多核巨細(xì)胞(4)不能濾過(guò)微孔(3)而被阻留在內(nèi)腔(2)，從而可被清除，能通過(guò)微孔(3)的中、小體積的單個(gè)血細(xì)胞(5)及血漿進(jìn)入外腔(6)，然后經(jīng)出口(7)流出，進(jìn)而經(jīng)圖1所示的血漿分離器(8)分離出血細(xì)胞和血漿。如表示圖1中的血漿分離器(8)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖3所示，血漿分離器(1)的內(nèi)腔(2)的管壁上有很多微孔(3)，不能通過(guò)微孔(3)的單個(gè)血細(xì)胞(4)經(jīng)具有可開(kāi)關(guān)閥門的血細(xì)胞出口(8)流出，進(jìn)入圖1所示的血細(xì)胞出口管路(14)；能通過(guò)微孔(3)的血漿及其化學(xué)成分(5)進(jìn)入血漿分離器外腔(6)，然后經(jīng)血漿流出口(7)、圖1所示的血漿泵(9)和血路管(10)進(jìn)入凈化器。如表示圖1中凈化器(11)和(12)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的圖4所示，當(dāng)含有HIV(3)的血漿進(jìn)入凈化器(1)時(shí)，其中的HIV(3)被凈化器中的巨噬細(xì)胞(2)吞噬后形成不再下移的巨噬細(xì)胞吞噬體(4)，被清除HIV后的凈化血漿經(jīng)圖1所示的出口管路(13)與血漿分離器(8)分離的單個(gè)細(xì)胞在出口管路(14)處匯合后經(jīng)靜脈管路(15)匯流。如此清除HIV，凈化血液，直至事先設(shè)定的血漿循環(huán)量(通常為9L)，治療才宣告結(jié)束，整個(gè)治療過(guò)程均由電腦控制，并可隨時(shí)檢測(cè)工作狀態(tài)，使用方便、自動(dòng)化和安全。

六、艾滋病生物細(xì)胞免疫治療儀功效的驗(yàn)證

1、血液分離器濾除HIV感染細(xì)胞功效的驗(yàn)證

表1 AIDS患者外周血大、中、小白細(xì)胞中HIV-p24檢測(cè)結(jié)果(p24：pg/ml)

本發(fā)明人按照本發(fā)明的基本方法，做了如下的簡(jiǎn)易驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：取疾控中心和傳染病實(shí)驗(yàn)室生物樣本庫(kù)保存的已確診的艾滋病(AIDS)患者的抗凝全血若干份，分別取數(shù)份相同ABO血型的抗凝全血混合成為5例，使血液量足夠大，然后委托中心血站按成份輸血的血液成份分離方法，經(jīng)血液成份分離系統(tǒng)分離出白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血漿，取白細(xì)胞成份按常規(guī)離心沉淀，吸棄上清液，以適量的生理鹽水懸浮白細(xì)胞沉淀，然后加入合適比例的gp120抗體(上海廣銳生物科技有限公司)，混勻后置37℃反應(yīng)5分鐘，然后以孔徑為20～30um的血液成份分離系統(tǒng)分離出大體積的白細(xì)胞(稱為大白細(xì)胞)，對(duì)濾過(guò)的白細(xì)胞濾液再進(jìn)一步以孔徑為15～25um的血液成份分離系統(tǒng)分離出中等體積的白細(xì)胞(稱為中白細(xì)胞)，濾液中的白細(xì)胞為小體積的白細(xì)胞(稱為小白細(xì)胞)，分別收集大、中、小白細(xì)胞分離懸液，常規(guī)離心沉淀，吸棄上清液，以定量移液器分別吸取等量的大、中、小白細(xì)胞沉淀，常規(guī)方法(機(jī)械或細(xì)胞裂解液)裂解細(xì)胞(如用同種裂解液，需加量相等)，離心沉淀后取上清液，然后根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果(表1)說(shuō)明，AIDS患者不同體積大小的白細(xì)胞中的HIV-p24含量不同，在大、中、小白細(xì)胞中HIV-p24的平均含量分別為275.0pg/ml、196.0pg/ml、126.4pg/ml，其中大、小白細(xì)胞中HIV-p24平均含量相差148.6pg/ml，減少了54.4％；在大、中、小白細(xì)胞中HIV-P24的總含量分別為1375.0pg/ml、979.9pg/ml、632.1pg/ml，其中大、小白細(xì)胞中HIV-p24總含量相差742.9pg/ml，減少了54.3％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，t＝2.43，p＜0.05。說(shuō)明AIDS患者體內(nèi)的大體積白細(xì)胞或經(jīng)gp120抗體作用后而形成的大體積白細(xì)胞中含有較高含量的HIV，能通過(guò)實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案被分離清除。

2、凈化器清除HIV功效的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證巨噬細(xì)胞株清除HIV的功效，本發(fā)明設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)易的測(cè)試方法：取滅菌的2.5×300mm魏氏血沉管5支，分別吸取經(jīng)離心(1000r/min，5min)沉淀的巨噬細(xì)胞株至200mm刻度，接著吸取經(jīng)100℃溶化后保溫在39～41℃?zhèn)溆玫?.9％瓊脂糖C1-4B，達(dá)到約10mm長(zhǎng)刻度，置血沉管冷卻后，瓊脂糖成為半固體，能阻止血沉管內(nèi)細(xì)胞流出但不會(huì)阻止小分子的水和化學(xué)成份之類的物質(zhì)通過(guò)。另取疾控中心及傳染病實(shí)驗(yàn)室樣本庫(kù)保存的艾滋病(AIDS)患者的5例血漿，各約10mL，各取9mLAIDS濾前血漿分批次注入血沉管(簡(jiǎn)易凈化裝置)上端空管，待流經(jīng)血沉管下層的巨噬細(xì)胞株層并從血沉管內(nèi)流出后，收集流出液，稱為AIDS濾后血漿。取AIDS濾前血漿和濾后血漿，以人巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司)配對(duì)檢測(cè)，按說(shuō)明書操作，檢測(cè)范圍為0～800pg/ml，敏感度為1.0pg/ml，可在白色背景下，直接用肉眼觀察：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。結(jié)果如表1，濾前血漿中MIF檢測(cè)結(jié)果均為陰性(或因含量低于檢測(cè)靈敏度、血漿長(zhǎng)期保存致降解等)，而濾后血漿中檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。說(shuō)明巨噬細(xì)胞株在此過(guò)程產(chǎn)生了MIF細(xì)胞因子。MIF是集細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，作為固有免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮中樞性的作用，在各種感染和急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮多種免疫功能。在作AIDS血漿濾過(guò)簡(jiǎn)易凈化器前后MIF配對(duì)檢測(cè)的同時(shí)，本發(fā)明還做了HIV-1p24的配對(duì)檢測(cè)，根據(jù)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法，上海啟發(fā)生物科技有限公司)操作，以已知濃度0pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、2.5pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的p24抗原作為對(duì)照，最低檢測(cè)限低于5pg/ml，測(cè)定范圍0～400pg/ml，線性范圍0.5pg/ml～80pg/ml，15min內(nèi)450nm測(cè)定吸光度(OD)，空白對(duì)照校準(zhǔn)品吸光度值不高于0.050，0pg吸光度值不高于0.100，1000pg/ml吸光度不低于1.000，當(dāng)吸光度＞0.12時(shí)被認(rèn)為是陽(yáng)性，結(jié)果(表2)說(shuō)明AIDS血漿濾過(guò)簡(jiǎn)易凈化裝置后，部分HIV已被巨噬細(xì)胞株吞噬吸附，濾過(guò)后的血漿HIV明顯減少，經(jīng)第1次濾過(guò)后，HIV清除率為20.55％，經(jīng)第2次濾過(guò)后，HIV清除率為42.83％，p＜0.01，具有明顯的效果，說(shuō)明隨著濾過(guò)次數(shù)的增加HIV會(huì)被不斷地清除，從而達(dá)到治療AIDS目的。

表1 AIDS血漿濾過(guò)含巨噬細(xì)胞的簡(jiǎn)易凈化裝置前后MIF檢測(cè)結(jié)果(定量：pg/ml)

表2 AIDS血漿濾過(guò)含巨噬細(xì)胞的簡(jiǎn)易凈化裝置前后p24檢測(cè)結(jié)果(p24：pg/ml)

總之，上述簡(jiǎn)易驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，已被HIV感染的外周血白細(xì)胞易融合成大體積的多核巨細(xì)胞或多細(xì)胞聚合體，能被血液分離器分離清除；而血漿中游離的HIV，能被血漿凈化劑(巨噬細(xì)胞株)清除，表明以分離器和凈化器(劑)為關(guān)鍵部件構(gòu)成的艾滋病生物細(xì)胞免疫治療儀具有顯著的清除血細(xì)胞內(nèi)、外HIV病毒的治療功效。