本發(fā)明是關于一種用作美白皮膚與抗皮膚老化的蝴蝶蘭萃取物，尤其是關于一種能夠抑制酪氨酸酶活性及具抗氧化活性的蝴蝶蘭萃取物。
背景技術：
在現今社會物質生活愈來愈富足的情況下，現代人除了滿足實質生理上的溫飽外，對于個人外在的形象也愈來愈重視，從醫(yī)美診所如雨后春筍般地開設以及整形風潮的盛行下可窺見此潮流趨勢。然而，關于個人外在的顯現，除了身材的比例或尺寸、頭發(fā)的多寡或發(fā)色外，最被人用以判定年輕與否或保養(yǎng)適當與否的一大標準就是皮膚的健康狀況與色澤。具有美白透晰、彈性而帶有些許光澤的緊致皮膚，一直是醫(yī)美業(yè)者所標榜的美容目標，更是消費者期待自己達成的愿望。
皮膚組織實質上最重要的功能在于它是身體抵御外來物質最重要的屏障之一，可保護身體免于細菌、病毒等致病菌與有毒物質的入侵，亦可保持人體水分與體溫維持在一定的標準。然而當皮膚暴露在陽光或其他光源的紫外線下，或是其他游離輻射或揮發(fā)性物質中時，會促使皮膚生成活性氧與自由基。當活性氧與自由基累積的數目超出個體所能承受的抗氧化能力時，就會開始與細胞內的DNA、蛋白質或脂質等產生反應，并使皮膚產生不良的變化，例如促進黑色素生成(melanogenesis)、造成皮膚的老化等(請參見Kim YJ,Yokozawa T.,Modulation of oxidative stress and melanogenesis by proanthocyanidins.Biol Pharm Bull.2009Jul；32(7):1155-9,2009)。
關于黑色素(Melanin)，其是由黑色素細胞所制造，而這些細胞位于表皮層的基底細胞之間。黑色素細胞合成黑色素顆粒后，分泌釋放黑色素，使人體有不同的膚色。當皮膚被陽光/紫外線照射時(特別是受紫外線-B照射時)，角質細胞中所生成的活性氧與自由基會誘發(fā)腫瘤蛋白53(p53)表現，經過一連串的反應，促進了「酪氨酸酶」(tyrosinase)的大量表現，大量的酪氨酸酶則加速催化細胞內的酪氨酸(tyrosine)，使其氧化為二羥基苯基丙胺酸(dihydroxyphenylalanine，簡稱DOPA)，而二羥基苯基丙胺酸再經過酪氨酸酶催化反應成為多巴醌(dopachrome)，多巴醌最后經由氧化反應轉變?yōu)楹谏?。因此，人體皮膚除原有膚色外，透過紫外光等光源的照射后，將因為黑色素的生成而使皮膚變得較黑。
另一方面，同樣因為紫外線照射時所生成的活性氧與自由基，會促進轉錄因子活化蛋白(AP1)的形成，而誘發(fā)一系列基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases)的表現，進而促進膠原蛋白、彈性蛋白及蛋白多醣的降解，導致皮膚變薄、萎縮、彈性組織變性、彈性變差、干燥、粗糙、產生皺紋、雀斑、斑點等皮膚老化現象。
鑒于上述黑色素形成的作用機轉以及皮膚老化的因素，產學界莫不欲找出可控制或影響其代謝過程的化合物，以根本解決皮膚變黑與老化的問題。
目前雖然已有利用蝴蝶蘭萃取物制作美容用品的創(chuàng)作，但關于該些萃取物的效用仍然局限于某種效用，亦即，利用目前已知方法所萃取出的萃取物，其中的有效成分比例可能不高或不平均，因此，尚未出現能夠含有同時兼具美白抗老化，且具有極佳改善效果的萃取物成分的發(fā)明。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的的一在于提供一種能夠抑制與黑色素生成有關的酪氨酸酶活性的蝴蝶蘭萃取物，藉由該萃取物對酪氨酸酶的抑制效果，使酪氨酸無法進行黑色素生成的代謝途徑，因而能夠避免皮膚變黑而具有美白皮膚的效果。
為了達成前述的目的，本發(fā)明實施例提供一種蝴蝶蘭萃取物，其由包括以下步驟的方法所制備：(a)提供蝴蝶蘭(Phalaenopsis Sogo Yukidian‘V3’)的花瓣、花梗或花瓣與花梗相混合的待萃取物；(b)將該待萃取物與95％(v/v)乙醇以1:20～1:5重量比混合形成混合物后，靜置20～30小時以進行萃?。灰约?c)過濾該混合物，以獲得醇溶性蝴蝶蘭萃取物。
在一實施例中，所述的蝴蝶蘭萃取物，其中該步驟(b)中該待萃取物與95％(v/v)乙醇的重量比較佳可為1:10。
在另一實施例中，本發(fā)明提供一種用于美白皮膚的組成物，其包括前述的蝴蝶蘭萃取物，以及載劑。
為進一步提供具有抗氧化活性的蝴蝶蘭萃取物，達到抗皮膚老化的目的，在本發(fā)明的一實施例中，提供一種能夠用作美白皮膚與抗皮膚老化的蝴蝶蘭萃取物，其由包括以下步驟的方法所制備：(a)提供蝴蝶蘭(Phalaenopsis Sogo Yukidian‘V3’)的花瓣作為待萃取物；(b)將該待萃取物與95％(v/v)乙醇以1:20～1:5重量比混合形成混合物后；(c)將該混合物于55～65℃下加熱10～20分鐘后，靜置20～30小時以進行萃取；以及(d)過濾該步驟(c)中經加熱并靜置的該混合物，以獲得醇溶性蝴蝶蘭萃取物。
在一實施例中，前述的蝴蝶蘭萃取物，其中該步驟(b)中該待萃取物與95％(v/v)乙醇的重量比較佳可為1:10。
在一實施例中，前述的蝴蝶蘭萃取物，其中該步驟(c)中該加熱時間較佳可為15分鐘。
在另一實施例中，本發(fā)明提供一種用于美白皮膚的組成物，其包括前述的蝴蝶蘭萃取物，以及載劑。其中，該組成物可具有抑制酪氨酸酶的活性。
在另一實施例中，本發(fā)明提供一種用于抗皮膚老化的組成物，其包括前述的蝴蝶蘭萃取物，以及載劑。其中，該組成物可具有抗氧化的活性。
藉由本發(fā)明實施例中蝴蝶蘭萃取物抑制酪氨酸酶的特性以及抗氧化功能，可大幅阻斷皮膚黑色素的生成，同時具有減緩皮膚老化的效果，可普遍應用于保養(yǎng)品或化妝品中。無論是作為美白皮膚的組成物或抗皮膚老化的組成物，除包括所述的蝴蝶蘭萃取物外，可進一步包括制造該些保養(yǎng)品或化妝品所需的載劑或佐劑，例如：活性劑、防腐劑、螯合劑、增稠劑、界面活性劑、染色劑，并根據其產品類型，可制備成水性溶液、水-醇溶液、油性溶液、凝膠、乳霜、乳液、軟膏、粉末，或是附著于一介質上例如面膜、貼片或貼布。
以下將配合圖式進一步說明本發(fā)明的實施方式，下述所列舉的實施例是用以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發(fā)明的保護范圍當視后附的申請專利范圍所界定者為準。
具體實施方式
實施例1 蝴蝶蘭萃取物的制備
首先，自市面購置商品名為V3的蝴蝶蘭，其中文學名為大白花蝴蝶蘭，英文學名則為Phalaenopsis Sogo Yukidian‘V3’。摘取其花瓣，并同時將花梗切斷以適當長度后，以無菌水清洗數次，再置入設定為45～60℃的烘箱進行干燥后備用。
本實施例以下將同時進行多種萃取方式，比較并找出具有較佳效果萃取物的萃取條件。
(1)水萃取
取前述干燥后蝴蝶蘭花瓣或花梗部作為待萃取物，以1:10的重量比加入純水，攪拌混合后形成混合物，將該混合物加熱至100℃反應90分鐘以進行萃取。之后將該進行萃取后的混合物以孔徑6μm的濾紙進行過濾，取得水溶性蝴蝶蘭萃取物溶液。
(2)水萃取后進行醇萃取
將前述(1)經水萃取后的蝴蝶蘭花瓣或花梗部再次作為待萃取物，進一步進行醇萃取。將此待萃取物以1:10的重量比加入95％(v/v)的乙醇，攪拌混合后形成混合物，于室溫下靜置24小時進行萃取。之后將該進行萃取后的混合物以孔徑6μm的濾紙進行過濾，取得經水萃取后的醇溶性蝴蝶蘭萃取物溶液。
(3)醇萃取
取前述干燥后蝴蝶蘭花瓣或花梗部作為待萃取物，以1:10的重量比加入95％(v/v)的乙醇，攪拌混合后形成一混合物，于室溫下靜置24小時進行萃取。之后將該進行萃取后的混合物以孔徑6μm的濾紙進行過濾，取得醇溶性蝴蝶蘭萃取物溶液。
(4)醇配合加熱萃取
取前述干燥后蝴蝶蘭花瓣或花梗部作為待萃取物，以1:10的重量比加入95％(v/v)的乙醇，攪拌混合后形成混合物，于60℃下加熱15分鐘后，再于室溫下靜置24小時進行萃取。之后將該進行萃取后的混合物以孔徑6μm的濾紙進行過濾，取得醇溶性蝴蝶蘭萃取物溶液。
前述(1)～(4)萃取后的水溶性或醇溶性蝴蝶蘭萃取物溶液，以冷凍干燥機/減壓濃縮機或其他相類的干燥方式進行干燥，以獲得粉末狀的蝴蝶蘭萃取物。
實施例2 體外酪氨酸酶活性試驗
將前述粉末狀的蝴蝶蘭萃取物加入ddH2O，配置成濃度為10％(w/v)的待測樣品溶液備用。取200μl配制好的待測樣品溶液與800μl 0.1M的磷酸緩沖溶液(pH 6.8)，注入微量管中?？刂平M則以等體積0.1M磷酸緩沖溶液取代待測樣品溶液。之后，分別取100μl 70unit/ml的蘑菇酪氨酸酶加入所有待測樣品溶液與控制組的微量管中，最后再加入900μl 25mM的L-DOPA，將溶液充分混合均勻后，于37℃下反應30分鐘。反應完成后以分光光度計測定405nm波長下的吸光值，其結果如表一所示。
若待測樣品中具有抑制酪氨酸酶的成分，則原本借助酪氨酸酶催化L-DOPA以產生多巴醌的反應將不易進行，也就是說，多巴醌的產物會減少。因此，通過吸光值的判定，當405nm波長下的吸光值愈低者，表示待測樣品的抑制酪氨酸酶的能力愈強。于此，關于其抑制能力將以抑制率表示，亦即，抑制百分比愈高表示待測樣品的抑制酪氨酸酶能力愈佳。其中，抑制率(％)＝[1-(待測樣品于405nm的吸光值/控制組于405nm的吸光值)]x 100。
表一
由表一的結果可以發(fā)現，經由水萃取的蝴蝶蘭花瓣萃取物，并不具有抑制酪氨酸酶的能力，而將該待測樣品于水萃取后再進行醇萃取所獲得的萃取物則具有高達65.00％的抑制率，對照抑制率最高的醇萃取方式(抑制率為65.38％)，可推論蝴蝶蘭萃取物中具抑制酪氨酸酶物質應是醇溶性。此外，于醇萃取過程中加入加熱步驟后，其抑制率有稍微下降至58.65％，因此，以單純經醇萃取步驟所獲得的萃取物有最高的酪氨酸酶抑制率，而于醇萃取過程中加入加熱步驟所獲得的萃取物則具有次高的酪氨酸酶抑制率。
無論是以醇萃取方式所獲得高酪氨酸酶抑制率的蝴蝶蘭萃取物(抑制率高達65.38％)，或于醇萃取過程中加入加熱步驟所獲得的蝴蝶蘭萃取物(抑制率為58.65％)，相較于目前已知其他花種花瓣的抑制率普遍低于50％的情況下，藉由本發(fā)明萃取方法所萃取出的蝴蝶蘭萃取物確實具有顯然高于預期抑制率的功效。
于醇萃取的實施例方法中，待萃取物與95％(v/v)乙醇的混合比例可為1:20～1:5之間，較佳為1:10，而其萃取時間則可在20～30小時的范圍內，以24小時為較佳。此外，在醇萃取過程中加入加熱步驟的實施例方法中，其加熱溫度可于55～65℃范圍內，較佳為60℃，加熱時間則可為10～20分鐘，較佳為15分鐘，萃取時間可為20～30小時，較佳24為小時。
另一方面，當以蝴蝶蘭的花梗進行萃取時，有著與利用花瓣萃取相近的效果趨勢。同樣地，經水萃取的蝴蝶蘭花梗萃取物，僅具有極低的抑制酪氨酸酶的能力，但將該待測樣品以醇萃取后所獲得的萃取物則具有高達61.92％的抑制率。雖然于醇萃取過程中加入加熱步驟后，其抑制率有稍微下降，但仍高達60.19％，因此，以單純經醇萃取步驟所獲得的蝴蝶蘭花梗的萃取物有最高的酪氨酸酶抑制率，而于醇萃取過程中加入加熱步驟所獲得的萃取物則具有次高的酪氨酸酶抑制率。
由以上結果可知，為獲得高酪氨酸酶抑制率的蝴蝶蘭萃取物，除可利用花瓣外亦可從花梗獲得，因此萃取時可選用花瓣、花?；蚨叩幕旌线M行萃取。
實施例3抗氧化力試驗
關于抗氧化力的測試于本實施例中是以蝴蝶蘭萃取物清除α,α-二苯–β–味基胼基(α,α-diphenyl–β–picrylhydrazyl,DPPH)自由基的能力評估其抗氧化能力。
取0.2ml不同濃度的待測樣品溶液，加入1.8ml新鮮配制的0.1mM DPPH甲醇溶液，振蕩混合均勻后，于避光環(huán)境下置于室溫下反應30分鐘，之后以分光亮度計檢測517nm波長下的吸光值?？刂平M則以等體積0.1mM DPPH乙醇溶液取代待測樣品溶液后進行前述相同的反應試驗，其結果如表二所示。
由于具抗氧化力的物質會提供氫予DPPH自由基，使氧化鏈鎖反應受到抑制，因此，供氫能力越強，吸光值會因為DPPH被還原而愈低，亦即具有較佳的抗氧化能力。于此，關于抗氧化能力將以DPPH自由基清除率表示，即清除百分比愈高表示待測樣品的供氫能力愈佳，抗氧化力也愈強。其中，清除率(scavenging effect％)＝[1-(待測樣品于517nm的吸光值/控制組于517nm的吸光值)]x 100。
表二
由表二的結果可知，將蝴蝶蘭花瓣待測樣品于水萃取后再進行醇萃取所獲得的萃取物僅有25.73％的清除率，而以醇萃取方式者清除率提高為54.98％，但于醇萃取過程中加入加熱步驟的方法中，其清除率大幅提升至60.77％，因此，于醇萃取過程中加入加熱步驟所獲得的蝴蝶蘭花瓣萃取物有最高的自由基清除率，而以單純經醇萃取步驟所獲得的萃取物則具有次高的自由基清除率。
于醇萃取的實施例方法中，待萃取物與95％(v/v)乙醇的混合比例可為1:20～1:5之間，較佳為1:10，而其萃取時間則可在20～30小時的范圍內，以24小時為較佳。此外，在醇萃取過程中加入加熱步驟的實施例方法中，其加熱溫度可于55～65℃范圍內，較佳為60℃，加熱時間則可為10～20分鐘，較佳為15分鐘，萃取時間可為20～30小時，較佳24為小時。
對照表一與表二可知，若欲使蝴蝶蘭萃取物同時具有較佳的酪氨酸酶抑制率與自由基清除率，可以醇萃取方式獲得，若欲取得更高自由基清除率的萃取物，則可以醇萃取過程中加入加熱步驟的方法進行。
藉由本發(fā)明實施例經醇萃取或醇萃取過程中加入加熱步驟方法所萃取的蝴蝶蘭萃取物，因為具有極高的酪氨酸酶抑制活性，因而可抑制黑色素的形成，除可利用于美白皮膚外，也可避免皮膚進一步的變黑，而有維持皮膚膚色的功效。同時，其亦具有極佳的自由基清除率，因此具備優(yōu)異的抗氧化效果，除可避免黑色素形成路徑中酪氨酸的形成而同時有減緩皮膚變黑的效果外，亦因可去除自由基，降低了轉錄因子活化蛋白(AP1)的形成與基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases)的表現，因而可改善皮膚變薄、萎縮、彈性組織變性、彈性變差、干燥、粗糙、產生皺紋、雀斑、斑點等老化現象。
藉由本發(fā)明實施例所萃取的蝴蝶蘭萃取物，可普遍應用于保養(yǎng)品或化妝品中，作為美白皮膚的組成物或抗皮膚老化的組成物，或是將該組成物附著于一介質上例如面膜、貼片或貼布等，用于皮膚保養(yǎng)或美白。