一種基于蝴蝶蘭種子萌發(fā)的原球莖為受體的育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于蝴蝶蘭種子萌發(fā)的原球莖 為受體的育種方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蝴蝶蘭a/7Ar〇￡/ite)屬于蘭科蝴蝶蘭屬植物，是一種重要的盆栽花 丼，具有很高的觀賞價值及經(jīng)濟價值，但是由于在自然界中蝴蝶蘭缺乏具有藍色或香味的 品種，傳統(tǒng)的雜交育種手段不能實現(xiàn)對蝴蝶蘭花色、花香的多樣化需求。因而新的轉(zhuǎn)基因 育種技術(shù)在培育蝴蝶蘭新品種方面得到了一定程度的應(yīng)用。現(xiàn)有的常用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)包 括：外源基因間接轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、外源基因直接轉(zhuǎn)化的基因槍法、顯微注射法和PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法等，以及適用于多胚珠植物的花粉管通道法；其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前研宄較 多、理論機理較清楚、技術(shù)方法也較為成熟的基因轉(zhuǎn)化方法。
[0003] 轉(zhuǎn)基因育種方法雖然具有育種目的明確、育種時間較短等優(yōu)點，但是在植物轉(zhuǎn)基 因過程中，受體材料的選擇則是育種成功與否的基礎(chǔ)與關(guān)鍵因素。適宜的受體材料有助于 加快與完善遺傳轉(zhuǎn)化的順利進行及轉(zhuǎn)基因植物的成功培育。針對蝴蝶蘭的轉(zhuǎn)基因育種，理 論而言，體細胞胚、類原球莖及原球莖都可以作為蝴蝶蘭理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料，但是當 前獲得體細胞胚、類原球莖的方式主要通過莖尖、莖段、葉片、根尖、根段、花梗腋芽等外植 體的誘導(dǎo)獲得，而在誘導(dǎo)過程中，常存在褐變，誘導(dǎo)率低等問題，因而蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因育種實 踐中，以體細胞胚或類原球莖作為受體材料常有一定的限制。另外，在以體細胞胚或類原球 莖作為受體材料進行轉(zhuǎn)基因育種時，采用基因槍或農(nóng)桿菌浸染進行轉(zhuǎn)基因操作時，也存在 轉(zhuǎn)染率低的缺陷，而且在農(nóng)桿菌浸染操作過程中，還存在對抗生素敏感性低等弊端，因而急 需進一步改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種基于蝴蝶蘭種子萌發(fā)的原球莖為受體的育種方法，該方 法以蝴蝶蘭種子萌發(fā)的原球莖為轉(zhuǎn)基因育種受體材料，可以較好的克服現(xiàn)有的以外植體誘 導(dǎo)獲得受體材料存在的褐化、轉(zhuǎn)化率低、品質(zhì)差異、誘導(dǎo)時間長、生長速度慢、繼代困難等弊 端；同時本發(fā)明以蝴蝶蘭"紅龍"和"光芒四射"品種為例，培育了新的蝴蝶蘭品種，該品種 培育過程中以農(nóng)桿菌浸染方式進行轉(zhuǎn)基因操作，分別導(dǎo)入花色、花香兩種基因成分，為培育 獲得新的蝴蝶蘭種質(zhì)資源提供了新的參考和借鑒。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案詳細介紹如下。
[0006] -種基于蝴蝶蘭種子萌發(fā)的原球莖為受體的育種方法，包括以下步驟： (1)無菌條件下，將蝴蝶蘭種子在種子誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)生長，獲得原球莖； 所述蝴蝶蘭品種優(yōu)選為"紅龍"或"光芒四射"； 所述種子誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基為：3g/L花寶1號+2g/L活性炭+2g/L水解酪蛋白+15g/L 蔗糖 +2mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+6. 5g/L 瓊脂，pH=5. 5~5. 6 ; 培養(yǎng)條件為：日溫25°C、夜溫17°C，光強3000 Lx，日光照16h，培養(yǎng)60~90d ; (2) 將步驟（1)中原球莖切塊后直接或者增殖培養(yǎng)后作為受體材料； 增殖培養(yǎng)基為：3g/L花寶1號+2g/L活性炭+15g/L蔗糖+3mg/L 6-BA+0. 6 mg/L 2, 4-D+ 6. 5g/L 瓊脂，pH=5. 5~5. 6 ; 培養(yǎng)條件為：日溫25°C、夜溫17°C，光強3000Lx，日光照16h，增殖培養(yǎng)60~90d，增殖培 養(yǎng)至直徑大小約為0. 5cm左右的原球莖可作為轉(zhuǎn)基因的受體材料； 步驟（1)中原球莖切塊直徑最小不應(yīng)小于0. 3cm ; (3) 將步驟（2)中增殖培養(yǎng)的受體材料預(yù)培養(yǎng)3d，進行農(nóng)桿菌浸染； 所述預(yù)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基及生長條件同步驟（2); 所述農(nóng)桿菌浸染液為重懸液，重懸液采用液體增殖培養(yǎng)基，配方為：3g/L花寶1號 +15g/L 蔗糖 +3mg/L 6-BA+0. 6 mg/L 2, 4-D，pH=5. 5~5. 6 ; 農(nóng)桿菌浸染時，重懸液0D_=0. 4~0. 6,浸染15min ; 所述農(nóng)桿菌浸染液中菌株為重組農(nóng)桿菌菌株GV3101，該菌株包含有質(zhì)粒表達載體 PCAMBIA1301 -Tfc如#7么 pCAMBIAlSOS-Kf^^r f 漢 所述質(zhì)粒表達載體pCAMBIA1301-7fc如#7么pCAMBIAlSOS-Kr/^Wf通過對 PCAMBIA1301、pCAMBIA1303載體進行改造獲得，具體步驟為：首先分別在pCAMBIA1301、 PCAMBIA1303載體的多克隆位點處加上CAMV35S啟動子（pCAMV35S)和CAMV35S終 止子（T-CAMV35S);然后在載體的基因組中分別重組整合月季花香基因Tfc如#7么三 色堇藍色基因漢最后將改造完成的質(zhì)粒表達載體pCAMBIA1301 -Tfc如#7么 pCAMBIAlSOS-Kf^W辟?；赁r(nóng)桿菌菌株GV3101即可； (4) 將步驟（3)浸染后受體材料置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C條件下暗培養(yǎng)3d ; 所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基組分同步驟（2)中增殖培養(yǎng)基； (5) 將步驟（4)中共培養(yǎng)后的受體材料進行農(nóng)桿菌洗脫，洗脫采用含有300mg/L Cef無 菌水浸泡20~30min進行； (6) 將步驟（5)中洗脫后的受體材料置于篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)過程中，每15d進行 一次轉(zhuǎn)篩，每次轉(zhuǎn)篩前均需要按照步驟（5)中方法進行農(nóng)桿菌的洗脫； 所述篩選培養(yǎng)基為：步驟（2)中增殖培養(yǎng)基+8 mg/L Hyg+50 mg/L Cef，pH=5. 5~5. 6 ; 培養(yǎng)條件為：日溫25°C、夜溫17°C，光強3000Lx，日光照16h ; 篩選培養(yǎng)四輪后，接入步驟（2)的增殖培養(yǎng)基+50 mg/L Cef的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)直 至分化成芽并長成小苗；篩選鑒定； 培養(yǎng)條件為：日溫25°C、夜溫17°C，光強3000Lx，日光照16h ; (7) 將步驟（6)中篩選鑒定正確的蝴蝶蘭植株進一步擴增或者接入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生 根； 所述生根培養(yǎng)基為：3g/L花寶1號+1. 5mg/L IBA+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+6. 5g/L 瓊脂，pH=5. 5~5. 6。
[0007] 本發(fā)明以蝴蝶蘭種子萌發(fā)的原球莖為受體材料構(gòu)建了一套蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因受體體 系，同時建立了一套基于農(nóng)桿菌浸染的遺傳轉(zhuǎn)化體系及相應(yīng)的檢測體系，相較于現(xiàn)有的蝴 蝶蘭轉(zhuǎn)化體系，較為明顯的技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在如下幾個方面：一是，利用種子萌發(fā)的原球莖所 構(gòu)建的受體體系，相較于其他通過外植體獲得受體材料方式更加快捷；同時本發(fā)明也提供 了原球莖的擴增體系，因而總體而言，本發(fā)明的受體材料相較于現(xiàn)有技術(shù)，受體材料性能穩(wěn) 定，來源廣泛；二是本發(fā)明所構(gòu)建的遺傳轉(zhuǎn)化體系對選擇性抗生素敏感性較好，可有效回避 蝴蝶蘭在誘導(dǎo)類原球莖過程中對抗生素不敏感的問題，利于抗性轉(zhuǎn)基因材料的篩選。總體 而言，本發(fā)明通過對現(xiàn)有蝴蝶蘭原球莖繁殖體系的篩選、優(yōu)化，對現(xiàn)有的蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因育種 體系的改良應(yīng)用，成功構(gòu)建了一套較為完整的和轉(zhuǎn)化、篩選效果較好的蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因育種 體系，技術(shù)手段較為成熟、育種效果具有較好的保障，對于促進蝴蝶蘭新品種開發(fā)具有較好 的推廣應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0008] 圖 1 為 pCAMBIA1301、pCAMBIA1303 載體改造示意圖； 圖2為pCAMBIA1301-7fc如#71么pCAMBIA1303-l^巧，質(zhì)粒表達載體構(gòu)建示意圖； 圖3為蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中種子萌發(fā)60d所形成的原球莖； 圖4為不同生長調(diào)節(jié)劑組合處理對原球莖增殖培養(yǎng)的影響； 圖5為不同濃度6-BA、2, 4-D組合處理對原球莖增殖培養(yǎng)的影響； 圖6為不同活性炭含量對原球莖生長的影響，其中A :0mg/L活性炭，B :lmg/L活性炭， C :2mg/L活性炭； 圖7為抗生素抗性篩選結(jié)果，其中A :對照（CK)，B :lmg/L Hyg，C :3mg/L Hyg，D :5mg/L Hyg，E :8mg/L Hyg，F(xiàn) :10mg/L Hyg，G :10mg/L Kan，H :50mg/L Kan，I :100mg/L Kan ; 圖8為蝴蝶蘭生根情況； 圖9為不同濃度Cef對農(nóng)桿菌生長的影響，從左至右依次為A- E，其中A :0mg/L Cef，B ：50mg/L Cef, C ：100mg/L Cef, D ：200mg/L Cef, E ：300mg/L Cef； 圖10為PCR檢測，其中A為轉(zhuǎn)化Tfc如#7么B為轉(zhuǎn)化廟勺PCR檢測，M為Marker， N為Negative，P為Positive 分別是隨機抽取的蝴蝶蘭轉(zhuǎn)化植株樣品； 圖11為⑶S組織染色檢測，其中A :對照，B :⑶S檢測陽性材料。
【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的解釋說明。
[0010] 在具體介紹實施例前，首先對下述實施例中所用到的部分試驗材料和儀器簡要介 紹如下。
[0011] 蝴蝶蘭材料:實施例中所用蝴蝶蘭品種包括"紅龍"、"光芒四射"兩個商業(yè)蝴蝶蘭 品種，所用蝴蝶蘭種子由蝴蝶蘭自交獲得。
[0012] 組培培養(yǎng)基部分原料：組培培養(yǎng)基中所用花寶1號、6-BA、2, 4-D、NAA、IBA、水解酪 蛋白、TDZ、活性炭、蔗糖、瓊脂等物料均購自通亞公司。
[0013] 轉(zhuǎn)基因操作中所用部分試劑：氨芐青霉素（Amp)、卡那霉素（Kan)、利福平（Rif)、 慶大霉素（Gen)、潮霉素（Hyg)、頭孢霉素（Cef)等抗生素購自寶賽公司。
[0014] 農(nóng)桿菌：農(nóng)桿菌菌株GV3101感受態(tài)購于邁其公司，重組后農(nóng)桿菌菌株GV3101中含 有質(zhì)粒表達