本發(fā)明屬于醫(yī)藥和生化與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

腫瘤尤其是惡性腫瘤是威脅人類健康的一大疾病，腫瘤治療是當(dāng)今人類面臨的一大醫(yī)學(xué)難題。腫瘤往往是由于癌基因發(fā)生獲得功能性突變、抑癌基因發(fā)生喪失功能性突變所引起。這些基因發(fā)生突變往往導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸凋亡、對正常的抗生長信號不敏感、獲得自給自足的生長信號及無限復(fù)制的潛能、以及組織浸潤與轉(zhuǎn)移的能力，進(jìn)而產(chǎn)生復(fù)發(fā)及藥物耐受。因此，腫瘤事實上是細(xì)胞信號傳導(dǎo)發(fā)生異常的疾病。針對這些異常，篩選及設(shè)計相應(yīng)的抑制或逆轉(zhuǎn)異常信號傳導(dǎo)的藥物，則能達(dá)到治療目的。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，受多種細(xì)胞因子調(diào)控，參與了多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、糖代謝、基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞遷移，Akt的組成性活化和腫瘤惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。同時，Akt信號通路是腫瘤多藥耐藥的一個關(guān)鍵節(jié)點。因此，靶向抑制Akt信號通路成為腫瘤分子靶向治療中的新技術(shù)并在基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮重要作用。蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(cancerous inhibitor ofprotein phosphatase 2A，CIP2A)是蛋白磷酸2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的內(nèi)源性癌性抑制因子，通過抑制PP2A對癌蛋白c-Myc絲氨酸62位的去磷酸化作用，穩(wěn)定c-Myc蛋白表達(dá)。隨后，CIP2A在包括肺癌，胃癌，乳腺癌在內(nèi)的各種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中的作用被不斷發(fā)現(xiàn)，除了穩(wěn)定癌蛋白c-Myc功能外，還可以活化Akt、E2F1、PLK1等因子，進(jìn)而參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、復(fù)發(fā)及藥物耐受。CIP2A下游底物蛋白PP2A是一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，在哺乳動物細(xì)胞中作為抑癌因子參與多種信號通路調(diào)節(jié)。作為Akt及ERK的上游因子，PP2A能夠直接去Akt及ERK的磷酸化進(jìn)而在發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用。據(jù)報道，在很多癌癥中，PP2A活性被抑制，與癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。在癌細(xì)胞中，通過抑制CIP2A，重激活PP2A的活性能夠顯著抑制腫瘤生長及惡性轉(zhuǎn)化。因此，篩選直接靶向CIP2A的化合物，對于改善腫瘤治療療效具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種CIP2A抑制劑及其制備方法。牛蒡苷元能夠抑制癌蛋白CIP2A的表達(dá)，并且增強(qiáng)其底物PP2A的磷酸酶活性性，使PP2A蛋白介導(dǎo)的Akt信號通路被抑制。牛蒡苷元通過抑制CIP2A介導(dǎo)的Akt信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：配制包含牛蒡苷元、二甲亞砜和胎牛血清L-15培養(yǎng)基的CIP2A抑制劑。

將牛蒡苷元置于二甲亞砜中，配置成為40mmol/L的儲液，儲液可于-20℃冷凍儲藏，每次使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

在L-15培養(yǎng)基中加入胎牛血清至胎牛血清的體積濃度為10％得到的培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中加入牛蒡苷元至牛蒡苷元的濃度為4×10^-7-12×10^-7mol/L。

CIP2A癌蛋白抑制劑用于激活其底物抑癌蛋白PP2A的蛋白磷酸酶活性，抑制Akt信號通路(所述信號通路包括Akt磷酸化受抑制)，最終牛蒡苷元作為癌蛋白CIP2A抑制劑抑制腫瘤生長。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明用牛蒡苷元制備抑制癌蛋白CIP2A的試劑，牛蒡苷元主要來源于中國傳統(tǒng)膳食植物牛蒡，易于制備，且對人體毒性較低，可應(yīng)用性強(qiáng)。

本發(fā)明用牛蒡苷元制備的PP2A激活劑靶向下調(diào)底物癌蛋白Akt的磷酸化，該制劑專一性強(qiáng)、見效快且易于操作，為靶向治療腫瘤提供了思路，并為實驗研究PP2A及其底物蛋白Akt的生物學(xué)功能提供了新的技術(shù)方法和手段。

附圖說明

圖1.實施例1中牛蒡苷元對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-468中CIP2A的抑制作用。

圖2.實施例2中牛蒡苷元對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-468中CIP2A底物蛋白PP2A的激活作用。

圖3.實施例3中牛蒡苷元對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-468中PP2A底物蛋白Akt的磷酸化抑制作用。

圖4.實施例4移植人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的小鼠模型中，牛蒡苷元對腫瘤生長的抑制作用，其中圖4A、4B為牛蒡苷元處理對腫瘤體積的影響；圖4C為腫瘤組織內(nèi)CIP2A蛋白表達(dá)的結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明。實施例中用到的主要材料如下：

細(xì)胞系：實施例中所用細(xì)胞系均購自ATCC。

BALB/c裸鼠：購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。

抗體：CIP2A,Akt,磷酸化Akt(Ser473)抗體購自美國Santa Cruz公司，PP2A,GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。PP2A蛋白磷酸酶活性測定試劑盒購自美國Upstate公司。

實施例1牛蒡苷元抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-468的CIP2A蛋白表達(dá)。

具體實施方法如下：

牛蒡苷元儲液的制備；將牛蒡苷元置于二甲亞砜(DMSO)中，配置成牛蒡苷元濃度為40mmol/L的儲液，凍于-20度，使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

按照如下方法得到四種經(jīng)過不同濃度的牛蒡苷元(Atn)處理的MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞：將MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞分別分為四組，一組MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基(在L-15培養(yǎng)基(Gibco)中加入胎牛血清(Hyclone)至胎牛血清的體積濃度為10％得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到0M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞；一組MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞在4×10^-7M培養(yǎng)基(在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中加入牛蒡苷元至牛蒡苷元的濃度為4×10^-7M得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到4×10^-7M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞；一組細(xì)胞在8×10^-7M培養(yǎng)基(在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中加入牛蒡苷元至牛蒡苷元的濃度為8×10^-7M得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到8×10^-7M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞；一組MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞在1.2×10^-6M培養(yǎng)基(在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中加入牛蒡苷元至牛蒡苷元的濃度為1.2×10^-6M得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到1.2×10^-6M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞。

用RIPA裂解液(Sigma)裂解四種經(jīng)過不同濃度的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，蛋白溶液置于-20℃保存或直接Western blot(蛋白質(zhì)印跡法)上樣。根據(jù)檢測蛋白的分子量大小配置(8％-12％)聚丙烯酰胺凝膠，加樣后電泳，根據(jù)分子量分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后用5％的脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時，4℃過夜孵育(8-12小時)相應(yīng)的抗體(Anti-CIP2A，Anti-GAPDH)，第二天用洗膜緩沖液TBST每10分鐘洗膜1次，共5次，TBST稀釋相對應(yīng)的二抗，室溫25℃孵育1.5小時，TBST每10分鐘洗膜1次，共5次。ECL試劑盒，孵育PVDF膜2分鐘，暗室檢測曝光。

實驗結(jié)果：

如圖1所示可知，牛蒡苷元抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞中CIP2A的表達(dá)，實驗結(jié)果表明，隨著濃度的增加，CIP2A表達(dá)呈現(xiàn)明顯下降趨勢。

實施例2牛蒡苷元抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-468中CIP2A的底物蛋白PP2A的磷酸酶活性。

具體實施方法如下：

牛蒡苷元儲液的制備；將牛蒡苷元置于二甲亞砜(DMSO)中，配置成牛蒡苷元濃度為40mmol/L的儲液，凍于-20度，使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

按照如下方法得到四種經(jīng)過不同濃度的牛蒡苷元(Atn處理的MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞：將MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞分別分為四組，一組MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基(在L-15培養(yǎng)基中加入胎牛血清至胎牛血清的體積濃度為10％得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231細(xì)胞，得到0M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞；一組MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞在4×10^-7M培養(yǎng)基(在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中加入牛蒡苷元至牛蒡苷元的濃度為4×10^-7M得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到4×10^-7M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞；一組細(xì)胞在8×10^-7M培養(yǎng)基(在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中加入牛蒡苷元至牛蒡苷元的濃度為8×10^-7M得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到8×10^-7M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞；一組MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞在1.2×10^-6M培養(yǎng)基(在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中加入牛蒡苷元至牛蒡苷元的濃度為1.2×10^-6M得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到1.2×10^-6M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞。

用RIPA裂解液裂解四種經(jīng)過不同濃度的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，蛋白溶液置于-20℃保存。各取100μg蛋白，分別與4μg PP2A抗體孵育，4℃孵育過夜(8-12小時)。在混合液中分別加入40μl的蛋白凝膠珠(proteinAagarose beads，Santa Cruz)，4℃孵育2小時。離心收集珠子，用預(yù)冷的700μl磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次，然后用500μl Ser/ThrAssay Buffer洗滌一次。下一步，加入750mM的磷肽(phosphopeptide)30℃孵育10分鐘，期間不斷攪拌。下一步，加入100μl的孔雀石綠磷酸檢測溶液(Malachite Green Phosphate Detection Solution)，混勻后在650nm波長下，多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek)檢測吸收值。

實驗結(jié)果：

如圖2所示可知，牛蒡苷元抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞中PP2A磷酸酶活性，實驗結(jié)果表明，隨著濃度的增加，PP2A酶活性呈現(xiàn)明顯上升趨勢。*表示與對照組相比有顯著差異(*，p＜0.05)。

實施例3牛蒡苷元抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-468中PP2A底物Akt磷酸化。

具體實施方法如下：

牛蒡苷元儲液的制備；將牛蒡苷元置于二甲亞砜(DMSO)中，配置成牛蒡苷元濃度為40mmol/L的儲液，凍于-20度，使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

按照如下方法得到四種經(jīng)過不同濃度的牛蒡苷元(Atn處理的MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞：將MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞分別分為四組，一組MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基(在L-15培養(yǎng)基中加入胎牛血清至胎牛血清的體積濃度為10％得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到0M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞；一組MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞在4×10^-7M培養(yǎng)基(在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中加入牛蒡苷元至牛蒡苷元的濃度為4×10^-7M得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到4×10^-7M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞；一組細(xì)胞在8×10^-7M培養(yǎng)基(在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中加入牛蒡苷元至牛蒡苷元的濃度為8×10^-7M得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到8×10^-7M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞；一組MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞在1.2×10^-6M培養(yǎng)基(在含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中加入牛蒡苷元至牛蒡苷元的濃度為1.2×10^-6M得到的培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)24小時，收集MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，得到1.2×10^-6M的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞。

用RIPA裂解液(Sigma)裂解四種經(jīng)過不同濃度的牛蒡苷元處理的MDA-MB-231(或MDA-MB-468)細(xì)胞，蛋白溶液置于-20℃保存或直接Western blot(蛋白質(zhì)印跡法)上樣。根據(jù)檢測蛋白的分子量大小配置(8％-12％)聚丙烯酰胺凝膠，加樣后電泳，根據(jù)分子量分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后用5％的脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時，4℃過夜(8-12小時)孵育相應(yīng)的抗體(Anti-Akt，Anti-pAkt(Ser473)，Anti-GAPDH)，第二天用洗膜緩沖液TBST每10分鐘洗膜1次，共5次，TBST稀釋相對應(yīng)的二抗，室溫25℃孵育1.5小時，TBST每10分鐘洗膜1次，共5次。ECL試劑盒，孵育PVDF膜2分鐘，暗室檢測曝光。

實驗結(jié)果：

如圖3所示可知，牛蒡苷元抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞中Akt的磷酸化，實驗結(jié)果表明，隨著濃度的增加，Akt磷酸化呈現(xiàn)明顯下降趨勢。

實施例4牛蒡苷元對MDA-MB-231移植瘤的生長抑制及對CIP2A蛋白的抑制

將5×10⁶個MDA-MB-231細(xì)胞注射入BALB/c裸鼠(雌性，6周齡，體重20克左右)構(gòu)建MDA-MB-231移植瘤小鼠模型，在平均瘤大小達(dá)到200～300mm³時，將小鼠分成兩組(對照組和藥物組)，每組6只。通過腹腔注射給藥(每周連續(xù)5次)，藥物組注射15μg/g的牛蒡苷元(將牛蒡苷元溶解于DMSO中，再補(bǔ)充生理鹽水，DMSO含量是2％)，對照組注射安慰劑(2％DMSO生理鹽水)注射量是5μl安慰劑/g(體重)。給藥期間用游標(biāo)卡尺測量瘤的長徑和短徑(每周2次)，按公式：體積(mm³)＝長徑×短徑²×4π/3，計算瘤體積。3周后處死小鼠，取瘤組織進(jìn)行Western blot檢測CIP2A蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明牛蒡苷元明顯抑制腫瘤的生長(圖4A、B)，并可在體內(nèi)降低CIP2A蛋白的水平(圖4C)，并且通過測量藥物組和對照組小鼠給藥前后的瘤體積大小也說明牛蒡苷元明顯抑制腫瘤的生長(表1)。

表1小鼠注射藥物前后腫瘤對比