適用于異種移植的三重轉基因豬的制作方法
相關申請的交叉引用
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關于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明
不適用。
本發(fā)明一般地涉及用于開發(fā)適于移植到人中的轉基因豬、轉基因豬器官、組織或細胞(特別是具有降低的引起血小板減少癥傾向、超急性排斥(hyperacuterejection，har)反應或血小板攝取的轉基因豬)的異種移植和遺傳修飾的領域。
背景技術：
眾所周知，從一個動物到同一物種的另一個動物(例如人到人)的移植是許多嚴重病癥(包括腎、心、肺、肝和其他器官疾病和皮膚損傷(例如嚴重燒傷疾病))的常規(guī)治療選擇。然而，眾所周知，沒有足夠的合適器官可用于移植以滿足當前或預期的器官移植的臨床需求。腎移植名單上約有100,000名患者，他們接受移植或死亡之前在等待名單上平均保留將近5年。在腎衰竭的患者中，透析提高了患者可等待移植的時間長度。在unos肝移植的全國等待名單上有超過18,000名患者，然而在美國每年進行不超過7000次移植。對于患有肝病或肝衰竭的患者，沒有相當于透析的系統(tǒng)。
異種移植(將器官、組織或細胞從一種動物移植到不同物種的另一種動物中(例如將豬器官移植到人接受者中))具有減輕可用于移植之器官短缺的潛力，這潛在地幫助全球數(shù)千人。然而，使用標準的未修飾的豬組織到人或其他靈長類動物中的異種移植伴隨著嚴重的移植組織排斥。排斥可以是超急性排斥、急性排斥、慢性排斥，可涉及存活限制性的血小板減少性凝血病(survivallimitingthrombocytopeniacoagulopathy)或者可以是急性體液異種移植反應(acutehumoralxenograftreaction，ahxr)。對移植組織上存在的豬抗體的人超急性排斥反應如此強烈，使得移植組織通常在移植到人體中的數(shù)分鐘或數(shù)小時內(nèi)被人免疫系統(tǒng)損傷。此外，不同的排斥機制可以以器官偏好的方式占主導地位。參見demetris等，1998“antibody-mediatedrejectionofhumanorthotopicliverallografts.astudyoflivertransplantationacrossabobloodgroupbarriers”，amj.pathol132：489-502；nakamura等，1993“l(fā)iverallograftrejectioninsensitizedrecipients.observationsinaclinicallyrelevantsmallanimalmodel”amj.pathol.142：1383-91；furuya等1992.“preformedlymphocytotoxicantibodies：theeffetsofclass，titerandspecificityonlivervheartallografts”hepatology16：1415-22；tector等2001.“rejectionofpighiverxenograftsinpatientswithliverfailure：implicationsforxenotransplantation”，livertranspl第82-9頁；其通過引用整體并入本文。例如，血小板減少性凝血病的早期發(fā)生是豬肝異種移植后非人靈長類動物接受者死亡的主要因素。然而，如果抗體介導的異種移植排斥(antibodymediatedxenograftrejection，amxr，amr)被阻止，則豬腎的非人靈長類動物(non-humanprimate，nhp)接受者就不會發(fā)生顯著的血小板減少癥，也不會表現(xiàn)出凝血病的臨床表現(xiàn)。參見例如ekser等，2012“geneticallyengineeredpigtobaboonliverxenotransplantation：histopathologyofxenograftsandnativeorgans”plosone第e29720頁；knosalla等2009，“renalandcardiaendothelialheterogeneityimpactacutevascularrejectioninpigtobaboonxenotransplantation”，amjtransplant1006-16；shimizu等2012.“pathologiccharacteristicsoftransplantedkidneyxenografts”，j.am.soc.nephrology225-35；其通過引用整體并入本文。
除了需要用于移植的器官、組織和細胞之外，用于輸血的安全血液也短缺。每年在美國進行使用包裝的人紅細胞(rbc)的1100萬次輸血(nationalblooddatasource，1998)。美國的血液供應長期不足。在2001年，預計美國血庫將獲得比最佳期望少約250,000個單位。官員們例行地預測在當常規(guī)獻血者休假以及大學生也離開主要城市中心的夏季月份期間會有嚴重的國家短缺。由于國家擁有穩(wěn)健且有競爭力的血液收集和分配系統(tǒng)，因此周期性短缺通常不會導致死亡，但是選擇性手術(electivesurgery)可能需要推遲，并且非重要需求不能得到滿足。由于正常捐獻的血液只能儲存約42天并且少于5％的合格捐獻者獻血，惡劣的天氣條件(例如暴風雪或颶風)常常導致危險的低血液儲備。
人血液不僅是稀缺資源，而且其對于接受者也有潛在的風險。盡管有病毒篩選過程，但是捐獻的人血液不是100％安全的(fda，血液采集和輸血后向fda報告的死亡的年度總結(annualsummaryoffatalitiesreportedtothefdafollowingbloodcollectionandtransfusion)，fy2013)。普通人群中丙型肝炎和hiv的發(fā)病率使得獻血制品昂貴且難以檢測。由于確保人血液中沒有任何感染性微生物困難且費用高，因此非常希望開發(fā)數(shù)量不限且不含感染原的紅細胞和其他輸血產(chǎn)品的來源。
豬細胞表達未見于人細胞中的α(1，3)半乳糖基轉移酶(α(1，3)galactosyltransferase，αgal)和胞苷單磷酸-n-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(cytidinemonophosphate-n-acetylneuraminicacidhydroxylase，cmah)。豬細胞還表達豬β1，4n-乙酰半乳糖胺基轉移酶(β1，4n-acetylgalactosaminyltransferase，β4galnt2)；認為許多人表達β4galnt2的形式(morton等(1970)voxsang19：472-482)。αgal酶催化糖蛋白上半乳糖-α1，3-半乳糖(αgal)殘基的形成。cmah將唾液酸n-乙酰神經(jīng)氨酸(neu5ac)轉化為n-羥乙酰神經(jīng)氨酸(neu5gc)。豬β1，4n-乙酰半乳糖胺基轉移酶(β4galnt2)催化將n-乙酰半乳糖胺末端添加至唾液酸修飾的乳糖胺以產(chǎn)生sda樣抗原，包括但不限于sda和galnacβ1，4[neu5acα2，3]galβ1-4glcnacβ1-3gal，也稱為cad或ct血型抗原(blanchard等(1983)jbc258：7691-7695)。豬β4galnt2也可催化形成另外的聚糖。在組織移植之前，neu5gc、αgal和sda表位的抗體存在于人血液中，并且參與所植入組織的強烈且即時的抗體介導的排斥。針對另一些β4galnt2(sda樣)表位的抗體也可存在于患者的血液中，并且可有助于抗體介導的所植入組織的排斥。
已經(jīng)采用許多策略來解決排斥反應，包括除去編碼α(1，3)半乳糖基轉移酶和cmah的基因以阻止酶的表達，修飾編碼α(1，3)半乳糖基轉移酶和cmah的基因以降低或限制酶的表達，或者以其他方式限制排斥反應。phelps等的美國專利7,795,493描述了用于產(chǎn)生缺乏功能性αgal表達的豬的方法。例如，day等的美國專利7,547,816描述了與野生型豬相比具有降低的α(1，3)半乳糖基轉移酶表達的敲除豬。盡管day豬可能具有降低的α(1，3)半乳糖基轉移酶表達，但是neu5gc抗原表位仍然存在，而且來自day豬的糖脂具有αgal抗原表位。遺憾的是，盡管gtko豬可具有降低的作為異種移植之障礙的抗α-gal抗體，但是在狒狒中使用gtko心和腎異種移植物的研究表明，gtko器官仍然引發(fā)免疫原性應答，導致所移植器官的排斥或損傷。用gtko腎移植并用兩種不同免疫抑制方案治療的狒狒在手術的16天內(nèi)死亡。chen等得出結論：“gal抗原的遺傳缺失不提供異種移植物存活的主要益處”(chen等，(2005)naturemed11(12)：1295-1298)，koike等的美國專利7,560,538和zhu等的美國專利7,166,378和8,034,330分別描述了用于制備不太可能遭受延遲異種移植排斥和超急性排斥之用于移植的豬器官的方法。zhu的專利討論了豬細胞上cmah活性或表位的降低。然而，basnet等檢測了人血清對cmah-/-小鼠細胞的細胞毒性反應。basnet等得出結論：“抗neu5gcab介導的免疫應答可顯著參與異種細胞移植中的移植物失功(graftloss)，但在器官移植中則不參與”(basnetdiamond等，2010xenotransplantation17(6)：440-448)。diamond等的美國專利6,166,288描述了制備以降低的異種移植材料的排斥將用于異種移植到人中的器官、組織或細胞的方法。美國專利6,166,288描述了表達巖藻糖基轉移酶基因的轉基因豬，所述巖藻糖基轉移酶基因編碼據(jù)稱從豬器官、組織和細胞中除去某些異源反應性抗原的酶。美國專利6,166,288沒有提供具有三個豬基因改變的轉基因豬。
schwarz等的美國專利6,572,867提供了用于降低靈長類動物中抗(αgal(1，3)gal)抗體之血漿水平的免疫抑制組合物。免疫抑制治療在移植領域中是已知的。因為免疫抑制藥物方案抑制了患者的免疫應答，其提高了感染風險，需要昂貴的維護藥物，可包括與其他藥物相互作用的藥物，并可引起額外的副作用，例如體重增長。
該領域的進展在很大程度上取決于具有降低排斥反應之修飾的遺傳修飾豬的開發(fā)。遺憾的是，開發(fā)純合轉基因豬是緩慢的過程，需要長達三年時間，在胎兒成纖維細胞中使用傳統(tǒng)的同源重組方法，隨后進行體細胞核轉移(somaticcellnucleartransfer，scnt)，然后使雜合的轉基因動物繁殖以產(chǎn)生純合的轉基因豬。用于異種移植的新的轉基因豬的開發(fā)受到缺乏多能干細胞的阻礙，作為替代依賴胎兒成纖維細胞作為進行遺傳工程的細胞。
因此，本領域中需要改進的、簡單的、可重復的、高效的和標準化的方法，所述方法產(chǎn)生具有降低的αgal、sda樣和neu5gc表位的三重敲除(αgal、β4galnt2、cmah)豬作為用于人移植接受者的器官、組織、血液和細胞的移植材料來源。
發(fā)明概述
本公開內(nèi)容一般地涉及制備用于移植到人中的具有降低的α(1，3)半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2表達的豬器官、組織或細胞的方法。
提供了轉基因豬，其在所述豬的至少一個細胞的核基因組中包含破壞的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2基因。與野生型豬中的表達相比，轉基因豬中的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β1，4n-乙酰半乳糖胺基轉移酶的表達降低。提供了從三重轉基因豬獲得的豬器官、組織、輸血產(chǎn)品或細胞。豬器官、組織、輸血產(chǎn)品或細胞可選自皮膚、心、肝、腎、肺、胰、甲狀腺、小腸及其組分。在一方面，與將來自野生型豬的組織移植給人相比，將來自三重轉基因豬的組織移植給人時，排斥相關癥狀改善。在一方面，排斥相關癥狀選自包含以下的組：細胞排斥反應相關癥狀、體液排斥反應相關癥狀、超急性排斥相關癥狀、急性體液異種移植反應排斥相關癥狀和急性血管性排斥反應相關癥狀。在一方面，與將來自野生型豬的器官、組織、輸血產(chǎn)品或細胞移植給人相比，將來自三重轉基因豬的器官、組織、輸血產(chǎn)品或細胞移植給人時，血小板減少癥降低。在一方面，與將來自野生型豬的肝暴露于人血小板時相比，將來自三重轉基因豬的肝暴露于人血小板時，肝顯示出降低的人血小板吸收。在一方面，與將來自野生型豬的腎移植給人相比，將來自三重轉基因豬的腎移植給人時，排斥相關癥狀降低。
在一個實施方案中，提供了從三重轉基因豬獲得的皮膚相關產(chǎn)品，所述轉基因豬在所述豬的至少一個細胞的核基因組中包含破壞的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2基因，并且其中與野生型豬相比，α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β1，4n-乙酰半乳糖胺基轉移酶的表達降低。在本申請的一個方面，皮膚相關產(chǎn)品表現(xiàn)出減輕的與傷口(特別是與人皮膚傷口)過早分離(prematureseparation)。
提供了制備用于異種移植到人中的移植材料的方法。所述方法包括提供本申請的三重轉基因豬作為移植材料的來源，并且其中所述移植材料選自器官、組織、輸血產(chǎn)品和細胞，并且其中所述移植材料具有降低的αgal、sda樣抗原和neu5gc抗原水平。
提供了三重轉基因豬，其在所述豬的至少一個細胞的核基因組中包含破壞的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β1，4galnt2基因。在一個實施方案中，α(1，3)-半乳糖基轉移酶基因的破壞選自包含但不限于以下破壞的組：與g至a替換相鄰的三堿基對缺失、單堿基對缺失、單堿基對插入、二堿基對插入、六堿基對缺失、十堿基對缺失、七堿基對缺失、五堿基對缺失的八堿基對插入、五堿基對插入、十一堿基對缺失和十八堿基對缺失；cmah基因的破壞選自包含但不限于以下破壞的組：四堿基對插入、一堿基對缺失、二堿基對缺失、三堿基對缺失、四堿基對插入、五堿基對缺失、八堿基對缺失、十一堿基對缺失、十二堿基對缺失、單堿基對插入、單堿基對缺失的二堿基對插入、六十六堿基對缺失的十二堿基對插入、三堿基對缺失的四堿基對插入；以及五堿基對缺失/一堿基對替換，并且β4galnt2基因的破壞選自包含但不限于以下破壞的組：一堿基對插入、十二堿基對缺失/一堿基對替換、十二堿基對缺失、十四堿基對缺失、五堿基對缺失和271堿基對缺失/1堿基對插入。在一個實施方案中，α(1，3)-半乳糖基轉移酶基因的破壞選自包含以下破壞的組：五堿基對缺失和七堿基對缺失，cmah基因的破壞選自包含以下破壞的組：十二堿基對缺失和三堿基對缺失/四堿基對插入，β4galnt2基因的破壞選自包含以下破壞的組：一堿基對插入、十二堿基對缺失和五堿基對缺失。在一個實施方案中，α(1，3)-半乳糖基轉移酶基因的破壞選自包含以下破壞的組：十一堿基對缺失和十八堿基對缺失，cmah基因的破壞選自包含以下破壞的組：六十六堿基對缺失/十二堿基對插入和五堿基對缺失/一堿基對替換，并且β4galnt2基因的破壞選自包含以下破壞的組：十四堿基對缺失、十二堿基對缺失/一堿基對替換和271堿基對缺失/1堿基對插入。與野生型豬相比，三重轉基因豬中功能性α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2的表達降低。與將來自野生型豬的組織移植給人相比，將來自三重轉基因豬的組織移植給人時，超急性排斥相關綜合征改善。
提供了使將人對象鑒定為需要人器官移植的對象與進行人器官移植之間的持續(xù)時間延長的方法。所述方法包括提供來自三重轉基因豬的器官，所述三重轉基因豬包含破壞的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2基因，其中與野生型豬相比，α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β1，4n-乙酰半乳糖胺基轉移酶的表達降低；以及以治療有效的方式將來自三重轉基因豬的器官與人對象通過手術連接。在一方面，將所述器官與人對象內(nèi)部通過手術連接。在一方面，將所述器官與人對象外部通過手術連接。所述器官可與對象直接或間接連接。
提供了使將對象鑒定為需要人肝移植的對象與進行人肝移植之間的持續(xù)時間延長的方法。所述方法包括提供來自三重轉基因豬的器官，所述三重轉基因豬包含破壞的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2基因，其中與野生型豬相比，α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β1，4n-乙酰半乳糖胺基轉移酶的表達降低；以及以治療有效的方式將來自三重轉基因豬的肝與人對象通過手術連接。在一方面，將肝與人對象內(nèi)部通過手術連接。在一方面，將肝與人對象外部通過手術連接。肝可與對象直接或間接連接。
提供了使將人對象鑒定為需要人腎移植的對象與進行人腎移植之間的持續(xù)時間延長的方法。所述方法包括提供來自三重轉基因豬的腎，所述三重轉基因豬包含破壞的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2基因，其中與野生型豬相比，α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β1，4n-乙酰半乳糖胺基轉移酶的表達降低；以及以治療有效的方式將來自三重轉基因豬的腎與人對象通過手術連接。在一個方面，將腎與人對象內(nèi)部通過手術連接。在一方面，將腎與人對象外部通過手術連接。腎可與對象直接或間接連接。
提供了減輕皮膚相關產(chǎn)品與人對象過早分離的方法。所述方法包括提供包含破壞的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2基因的三重轉基因豬以及從三重轉基因豬制備皮膚相關產(chǎn)品的步驟。與野生型豬相比，三重轉基因豬中α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2的表達降低。
提供了在患者中改善超急性排斥相關癥狀的方法。所述方法包括將具有降低的αgal抗原、sda樣抗原和neu5gc抗原水平的豬移植材料移植到對象中。與將來自野生型豬的豬移植材料移植到人中相比，超急性排斥相關癥狀改善。
提供了表現(xiàn)出改變的表位譜(epitopeprofile)的細胞培養(yǎng)試劑。從包含破壞的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2基因的三重轉基因豬分離細胞培養(yǎng)試劑。與野生型豬相比，三重轉基因豬中α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2的表達降低。細胞培養(yǎng)試劑選自包含以下的組：細胞培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)血清、細胞培養(yǎng)添加劑和能夠增殖的分離的細胞。在一方面，細胞培養(yǎng)試劑分離自三重轉基因豬，其中α(1，3)-半乳糖基轉移酶基因的破壞選自包含以下破壞的組：五堿基對缺失、七堿基對缺失或在指定位置的單堿基對插入，cmah基因的破壞選自包含以下破壞的組：十二堿基對缺失、三堿基對缺失/四堿基對插入、七堿基對缺失和十一堿基對缺失，并且β4galnt2基因的破壞選自在指定位置的單堿基對插入、十二堿基對缺失和五堿基對缺失。在一方面，細胞培養(yǎng)試劑分離自三重轉基因豬，其中α(1，3)-半乳糖基轉移酶基因的破壞選自包含以下破壞的組：十一堿基對缺失和十八堿基對缺失，cmah基因的破壞選自包含以下破壞的組：六十六堿基對缺失/十二堿基對插入和五堿基對缺失/一堿基對替換，并且β4galnt2基因的破壞選自包含以下破壞的組：十四堿基對缺失、十二堿基對缺失/1堿基對替換和271堿基對缺失/1堿基對插入。
提供了產(chǎn)生具有改變的表位譜的目的化合物的方法。所述方法包括以下步驟：提供顯示改變的表位譜的細胞培養(yǎng)試劑，以及用表現(xiàn)出改變的表位譜的細胞培養(yǎng)試劑孵育能夠表達目的化合物的分離的細胞。從包含破壞的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2基因的三重轉基因豬分離具有改變的表位譜的細胞培養(yǎng)試劑。與野生型豬相比，三重轉基因豬中α(1，3)-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2的表達降低。目的化合物上neu5gc、αgal和sda樣表位的水平低于當所述目的化合物是由用來自野生型豬的細胞培養(yǎng)試劑孵育的分離的細胞產(chǎn)生的時所述目的化合物上neu5gc、αgal和sda樣表位的水平。在一個實施方案中，目的化合物選自包含糖脂和糖蛋白的組。在多個方面，目的化合物是糖蛋白，其選自包含以下糖蛋白的組：抗體、生長因子、細胞因子、激素和凝血因子(clottingfactor)。在一個實施方案中，α(1，3)-半乳糖基轉移酶基因的破壞選自以下破壞：五堿基對缺失、七堿基對缺失或指定位置的單堿基對插入，cmah基因的破壞選自以下破壞：十二堿基對缺失、三堿基對缺失/四堿基對插入、七堿基對缺失和十一堿基對缺失，并且β4galnt2基因的破壞選自：指定位置的單堿基對插入、十二堿基對缺失和五堿基對缺失。在一個實施方案中，α(1，3)-半乳糖基轉移酶基因的破壞選自包含以下破壞的組：十一堿基對缺失和十八堿基對缺失，cmah基因的破壞選自包含以下破壞的組：六十六堿基對缺失/十二堿基對插入和五堿基對缺失/一堿基對替換，并且β4galnt2基因的破壞選自包含以下破壞的組：十四堿基對缺失、十二堿基對缺失/一堿基對替換和271堿基對缺失/1堿基對插入。
提供了用于移植到人中的豬移植材料。豬移植材料的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)具有降低的αgal表位水平，并且移植材料具有降低的neu5gc和sda樣表位水平。
提供了轉基因豬，其在所述豬的至少一種細胞的核基因組中包含破壞的α1，3-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2基因，其中與野生型豬相比，α1，3-半乳糖基轉移酶、cmah和β4galnt2的表達降低，并且其中vvl結合降低。
附圖簡述
圖1描述了示例性敲除豬(豬分離群(isolate)標識符(identifier)47-1)中的序列改變的示意圖。圖a示出了野生型(wild-type，wt)和破壞的α1，3半乳糖基轉移酶基因(ggta-1)核苷酸序列的一部分。野生型ggta-1核苷酸序列(wt)的一部分示于頂行。來自三重轉基因豬的改變的ggta-1核苷酸序列的同一區(qū)域示于兩個底行中，每個底行提供一個ggta-1等位基因的改變的序列。來自示例性三重轉基因豬的破壞的ggta-1核苷酸序列是五個堿基對和七堿基對缺失。短劃線(dash)表示其中在野生型序列中將出現(xiàn)缺失的核苷酸的核苷酸序列部分。
圖b示出了示例性三重轉基因豬的野生型和破壞的cmah基因的一部分。野生型(wt)cmah基因的一部分示于頂行。來自同一三重轉基因豬的相當區(qū)域的兩個等位基因的核苷酸序列示于野生型序列下方。三重轉基因豬的破壞的cmah序列包含十二堿基對缺失和三堿基對缺失/四堿基對插入。短劃線表示其中缺失發(fā)生的核苷酸序列的區(qū)域。
圖c示出了示例性三重轉基因豬的野生型和破壞的β4galnt2基因的一部分。野生型(wt)β4galnt2基因的一部分示于頂行。來自相同的示例性三重轉基因豬的相當區(qū)域的核苷酸序列示于野生型序列的下方。如所示，三重轉基因豬的破壞的β4galnt2序列包含單堿基對插入、十二堿基對缺失和五堿基對缺失。與ggta1和cmah序列不同，檢測到三個不同的等位基因。β4galnt2序列有可發(fā)生在豬基因組中多于一個不同的基因座。短劃線表示發(fā)生β4galnt2缺失的核苷酸序列的區(qū)域。
圖2描繪了從來自cmah/αgal雙重轉基因豬(cmah，上圖)或cmah/αgal/β4galnt2三重轉基因豬(b4，下圖)的外周血單核細胞(pbmc)獲得的流式細胞術數(shù)據(jù)的圖。細胞未經(jīng)染色(僅細胞，白色曲線)或用與fitc綴合的雙花扁豆(dolichusbiflorus)凝集素染色(dba-fitc，實心黑色曲線)。dba結合帶有由β4galnt2產(chǎn)生的聚糖或sda樣聚糖的α-n-乙酰半乳糖胺。在上圖中，來自在用dba孵育后具有野生型β4galnt2序列(cmah)的雙重敲除(cmah/αgal)豬之pbmc的譜(黑色曲線)明顯相對于由來自雙重轉基因cmah/αgal豬的未染色細胞的譜(白色曲線)偏移。在下圖中，來自用dba孵育后具有破壞的β4galnt2序列(b4)的三重轉基因豬之pmbc的譜顯著地覆蓋來自三重轉基因cmah/αgal/β4galnt2豬的未染色細胞的譜(疊加的白色和黑色曲線的區(qū)域表示為灰色)。dba-fitc處理的細胞的譜中的有限變化表明缺乏與來自三重轉基因豬的pbmc結合的dba，并且來自三重轉基因豬的細胞上sda樣抗原的出現(xiàn)降低。
圖3示出了來自多種豬的pbmc的表位分析結果。圖a示出了用來自野生型(wt)和三重轉基因(ggta1-/-、cmah-/-、b4galnt2-/-)豬的pbmc進行的實驗之流式細胞術結果。在y軸上示出細胞計數(shù)；在x軸上示出熒光。
最左側的圖描繪了來自陰性對照(白色)和用ib4凝集素孵育的細胞(深色)的數(shù)據(jù)。ib4與由ggta1的基因產(chǎn)物產(chǎn)生的α半乳糖連接的碳水化合物相互作用。對照(陰性)和實驗(陽性)結果之間重疊的曲線用灰色示出。用ib4孵育的野生型細胞示出與未染色的野生型細胞不同的單獨峰。用ib4孵育的三重轉基因豬的細胞沒有示出顯著的第二個峰，表明αgal連接的碳水化合物顯著降低。
中間圖描繪了來自陰性對照(白色)和用hd抗體孵育的細胞(深色)的數(shù)據(jù)。陰性對照是不相關的同種型對照抗體。hd抗體與由cmah基因的產(chǎn)物產(chǎn)生的neu5gc碳水化合物相互作用。對照(陰性)和實驗(陽性)結果之間重疊的曲線用灰色示出。用hd抗體孵育的野生型細胞示出與用不相關抗體處理的野生型細胞不同的單獨峰。用hd抗體孵育的三重轉基因豬的細胞沒有示出顯著的第二個峰，表明neu5gc表位水平顯著降低。
最左側的圖描繪了來自陰性對照(白色)和用dba凝集素孵育的細胞(深色)的數(shù)據(jù)。dba凝集素與β4galnt2的基因產(chǎn)物產(chǎn)生的碳水化合物結構相互作用。對照(陰性)和實驗(陽性)結果之間重疊的曲線用灰色示出。用dba孵育的野生型細胞示出與未染色的野生型細胞不同的單獨峰。用dba孵育的三重轉基因豬的細胞沒有示出顯著的第二個峰，表明由β4galnt2的基因產(chǎn)物產(chǎn)生的碳水化合物顯著降低。
圖b示出了從流式細胞術實驗獲得的用于評價來自44種獨特人的血清中的人igg(x軸)和igm(y軸)與來自多種豬類型的pbmc的相對結合之結果的散點圖。來自野生型(wt)豬的pbmc的結果用空心正方形示出，來自單個轉基因αgal破壞的(ggta1-/-)豬的結果用三角形示出，來自雙重轉基因cmah/αgal破壞的(ggta1-/-和cmah-/-)豬的結果用空心圓示出，來自三重轉基因cmah/αgal/b4galnt2破壞的(ggta1-/-和cmah-/-和β4galnt2-/-)豬的結果用實心圓示出。來自三重轉基因cmah/αgal/b4galnt2破壞的(ggta1-/-和cmah-/-和β4galnt2-/-)豬的結果以低水平的igm和igg結合聚集；幾個數(shù)據(jù)點表明與三重轉基因細胞的中等igg結合。
圖4示出了從流式細胞術實驗獲得的用于評價來自恒河猴(rhesusmacaque)、狒狒和人的血清中恒河猴igg(x-軸)和igm(y-軸)與來自多種豬類型的pbmc的相對結合之結果的散點圖。來自單個轉基因αgal破壞的(ggta1-/-)豬的pbmc的結果示于x軸上，來自雙重轉基因cmah/ggta1-/-破壞的(ggta1-/-和cmah-/-)豬的結果用空心圓示出，三重轉基因cmah/ggta1-/-/b4galnt2破壞的(ggta1-/-和cmah-/-和β4galnt2-/-)豬的結果用實心圓示出。cmah/ggta1-/-和cmah/ggta1-/-/β4galnt2在y軸上。在線下方的結合表示與x軸上豬細胞的結合比與y軸上的豬細胞更具抗原性。用豬細胞測試人(上)、狒狒(中)和恒河猴(底部)血清。igm結果示于左側；igg結果示于右側。
圖5提供了一系列流式細胞術結果，表明與紅細胞(rbc)結合的igg抗體水平。針對三種人血清評價了多種類型的rbc。來自人a血清的結果在左欄，人o血清1在中間欄，并且人o血清2在右欄中。b4gal/cmah/gal三重敲除(b4g三重ko)rbc結果在頂行中。人o1rbc結果在第二行中。人o2rbc結果在第三行中。人arbc結果在第四行中。豬野生型rbc在底行中。當用人a和人o血清1評價野生型豬rbc時，存在多個顯著峰(significantpeak)；當用人o血清2評價野生型豬rbc時，存在多個小峰(minorpeak)。在追蹤人arbc和兩種人o血清中，存在顯著峰。然而，人arbc和人a血清僅顯示一個重疊的峰。正如所預期的，兩種人orbc在針對所有三種血清進行測試時僅顯示單個重疊峰。當針對所有三種血清測試時，b4gal/cmah/gal三重敲除rbc僅顯示單個重疊峰，這與人orbc類似。
圖6提供從與多種豬和人rbc結合的人抗體之流式細胞術比較獲得的數(shù)據(jù)的總結。將來自74個人的血清用豬和人rbc孵育。示出了來自野生型豬rbc(w)、缺乏ggta1和cmah(cmahrbc)或ggta1/cmah/β4galnt2(b4grbc)的動物和人同種異體rbc(h)的數(shù)據(jù)。圖a示出了與多種rbc結合igg的總結。數(shù)據(jù)表示igg的歸一化中位熒光強度(medianfluorescenceintensity，mfi)和標準差。使用人a、b、o和ab血清。使用重復測量單因素方差分析(anova)和tukey的多重比較檢驗進行抗體結合的組間比較。與多種rbc結合的人抗體在野生型細胞上最高，并且隨著每個聚糖產(chǎn)生基因被失活而降低。三重敲除rbc(b4g)最接近人allo-rbc(h)上觀察到的抗體結合水平。圖b示出了與多種rbc結合的igm的總結。數(shù)據(jù)表示igm的歸一化中位熒光強度(mfi)和標準差。對于igg和igm二者都觀察到野生型>雙重敲除＞三重敲除≈人的趨勢。在圖c中，流式細胞術用于揭示ggta1、cmah和β4galnt2基因失活對α-gal、neu5gc和dba反應性聚糖的表達的作用。在圖中示出了來自豬野生型(w)紅細胞、cmah/αgal雙重敲除(d)紅細胞、cmah/αgal/βgalnt2三重轉基因紅細胞(t)和人血型o紅細胞的結果。流式細胞術結果表明具有每種基因破壞的抗原性結構的喪失。在圖d中，對數(shù)據(jù)作圖以顯示當在x軸上檢查與人orbc結合的抗體時，每個人血清樣品的單個mfi以及當在y軸上檢查與三重敲除豬rbc(b4g)結合的抗體時每個人血清樣品的單個mfi。圖上對角線下方的數(shù)據(jù)點表示對豬三重敲除細胞的結合低于人血型o細胞。o型血的人被認為是萬能供血者；輸血人群orbc經(jīng)受有限的體液破壞。
圖7提供了使用定量質(zhì)譜法來測量單個抗體同種型豐度的免疫球蛋白分析的結果。圖7a是描述用于評價igg和igm與rbc的結合的生物化學方法的圖式。評價了來自野生型豬(w)、ggta1/cmah缺陷豬(d)、ggta/cmah/β4galnt2豬(t)和自體人rbc(h)的rbc。該過程的細節(jié)在本文中其他地方描述。圖b中示出了從rbc洗脫的物質(zhì)的代表性凝膠。將分子量標志物(mw)、粗制起始血清(s)和純化的人igg上樣以用于比較。其他對照包括未處理的rbc(泳道1所有樣品)和經(jīng)酸洗滌但未用血清孵育的rbc(泳道2所有樣品)。通過低ph孵育2或3分鐘從經(jīng)血清處理的rbc中去除材料(分別為泳道3和4，所有樣品)。單箭頭標記與白蛋白大小類似的蛋白質(zhì)的遷移。盡管自體人rbc比豬細胞釋放出更少的該蛋白質(zhì)，但是在另一些實驗中沒有重現(xiàn)這一結果。雙箭頭突出顯示與igg大小類似的蛋白質(zhì)的遷移(泳道3和4)。igg重鏈大小的帶的強度在不同的rbc之間不同。在低ph下孵育細胞2或3分鐘釋放相似的蛋白質(zhì)水平。為了定量從細胞釋放的抗體的量，收集在兩分鐘洗脫樣品中包含免疫球蛋白重鏈大致大小的凝膠切片，用胰蛋白酶孵育并通過質(zhì)譜法(參見下文)進行評估。三個箭頭指明與血紅蛋白大小相同的一起遷移的蛋白質(zhì)。無血清樣品的上清液中血紅蛋白的存在表明在操作期間發(fā)生rbc裂解。所有rbc類型的泳道1與2之間的變化表明酸洗滌加速裂解并從細胞釋放提高量的血紅蛋白。作為略高于免疫球蛋白輕鏈的雙重遷移的未知多肽(由＊標記)甚至在不存在血清的情況下也從rbc釋放。
圖c示出了用與通過質(zhì)譜法確定的相同血清的單獨等分試樣孵育后，從每種類型的rbc洗脫的igm和igg的相對水平。針對每種血清，來自質(zhì)譜分析的auc均相對于從與自體人紅細胞結合的總igg或igm獲得的值進行歸一化。通過對每個同種型的auc求和來計算igg的總抗體。示出了野生型豬紅細胞(w)、三重敲除豬紅細胞(b)和自體人紅細胞(a)的結果。自體人紅血細胞來自與獲得所測試血清相同的對象。
圖8提供免疫球蛋白衍生肽的代表性質(zhì)譜色譜圖。在y軸上示出相對豐度。在x軸上示出以分鐘(min)計的時間。使用這樣的色譜圖來計算auc。
圖9示出了流式細胞術分析設門(gating)和命運(fate)。將三種人血清用來自野生型豬(w)的rbc、自體人rbc(a)和來自ggta1/cmah/β4galnt2缺陷豬(t)的rbc孵育。在用熒光二抗孵育以報告結合的人免疫球蛋白后，通過流式細胞術分析細胞。使用前向散射(fsc，x軸)和側向散射(ssc，y軸)來識別rbc。黑色橢圓形表示用于選擇rbc進行分析的門。每個門旁邊示出的百分比表示駐留在門內(nèi)的總事件的分數(shù)。人血清的破壞的野生型豬rbc如通過落入在設門區(qū)域內(nèi)的碎片增多和rbc降低所見。野生型rbc高抗原性和隨后的細胞破壞可有助于在一些實驗中野生型(w)樣品的直方圖質(zhì)量。
圖10描繪了通過質(zhì)譜法確定的針對每個igg同種型獲得的曲線下面積(auc)值。在y軸上示出auc；在x軸上示出igg同種型和rbc類型。示出了來自三重敲除豬紅細胞(tko)、人自體紅細胞(humanauto)和野生型豬紅細胞(wt)的結果。
圖11描述了從野生型(wt)或gal/cmah/β4galnt2三重敲除豬(b4g)獲得的外周血單核細胞(pbmc)獲得的流式細胞術結果。示出了來自兩個豬分離群(58-1和59-2)的pbmc。ib4被αgal結合；在存在降低的αgal表達情況下，ib4結合降低。neu5gc是由cmah基因產(chǎn)物產(chǎn)生的表位。dba是由β4galnt2產(chǎn)物結合的凝集素?；疑狈綀D示出了陰性對照結果。對于各自具有ib4、dba和neu5gc的野生型細胞，顯然存在兩個峰。對于三重敲除豬分離群，第二峰消除或偏移到與陰性對照重疊，表明結合降低。
圖12提供了在凝集素染色后從主動脈內(nèi)皮細胞(aorticendothelialcell，aec)或永生化腎內(nèi)皮細胞(immortalizedrenalendothelialcell，irec)獲得的流式細胞術結果。將指定的細胞類型用ib4、neu5gc、dba、pna、木菠蘿凝集素(jacalin)或vvl孵育。左欄示出了從野生型aec(wt/aec)獲得的結果，第二欄示出了從αgal破壞的豬(gal/aec)獲得的結果，中間欄示出了從雙重敲除cmah/αgal豬(cmah/aec)獲得的結果，第四欄示出了從三重敲除cmah/αgal/β4galnt2豬(b4g/aec)獲得的結果，第五欄示出了從野生型永生化腎內(nèi)皮細胞獲得的結果，第六欄示出了從ggta1/cmah/β4galnt2和sla抗原破壞的永生化腎內(nèi)皮細胞獲得的結果?；疑狈綀D不合凝集素陰性對照。黑色實線代表凝集素結合。注意，在gal破壞的細胞中不存在第二ib4峰，在cmah破壞的細胞中沒有第二neu5gc峰，并且在β4galnt2破壞的細胞中不存在第二dba峰。第二pna和木菠蘿凝集素峰出現(xiàn)在來自單個、雙重和三重敲除豬的細胞中。在三重敲除aec和β4galnt2/sla三重敲除中，sla抗原破壞irmec，第二個vvl峰顯著偏移。雖然不受機制束縛，三重敲除細胞上抗原的vvl凝集素識別降低可有助于從三重敲除cmah/αgal/β4galnt2細胞和豬獲得的出人意料的結果。
圖13示出了示例性三重轉基因豬中野生型和破壞的β4galnt2、ggta1和cmah基因的一部分。每個野生型序列的下劃線部分表示crispr靶區(qū)域。該圖示出了來自多個三重轉基因豬(豬分離群標識符54-2、58-1和59-2)的序列破壞。示出了三種β4galnt2變異：14核苷酸缺失、12核苷酸缺失/1核苷酸替換和271核苷酸缺失/1核苷酸插入。描述的第三β4galnt2突變是271核苷酸缺失/1核苷酸插入，其中雙斜線(//)劃分缺失。示出了兩種αgal(ggta1)變異：11核苷酸(nt)缺失和18核苷酸(nt)缺失。示出了兩種cmah變異：66核苷酸缺失/12核苷酸插入和5核苷酸缺失/1核苷酸替換。
圖14示出了在人臨床交叉配型(crossmatch)試驗中用多種人血清評價的三重轉基因豬(αgal/b4galnt2/cmah缺陷)豬的三重轉基因細胞獲得的數(shù)據(jù)。上圖示出了來自31個pra＝0的人血清的結果；下圖示出了來自19個pra＞80的人血清的結果。用實心條表示不存在dtt的情況下的igm和igg結果；用空白條表示用dtt處理后的igg結果。在y軸上示出細胞毒性評分。細胞毒性評分為1是同種異體移植非常好的候選者。
發(fā)明詳述
本申請?zhí)峁┝瞬槐磉_所指定的豬基因組編碼的產(chǎn)物的用于移植到人中的轉基因豬和豬器官、組織和細胞，及其制備和使用方法。在一個實施方案中，本申請?zhí)峁┝税茐牡摩?1，3)-半乳糖基轉移酶、β4galnt2和胞苷單磷酸-n-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶基因的三重轉基因豬，其中與野生型豬相比，在敲除豬中，功能性α(1，3)-半乳糖基轉移酶、β4galnt2和胞苷單磷酸-n-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的表達降低。
i.概述
在說明書和權利要求中，術語“包括”和“包含”是開放式術語，并且應被解釋為意指“包括但不限于...”。這些術語包括限制性更強的術語“基本上由......組成”和“由......組成”。
除非上下文中另有明確規(guī)定，否則如本文和所附權利要求中使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞表示一個/種或更多個/種。同樣，術語“一”(或“一個”)、“一個或更多個”和“至少一個”在本文中可互換使用。還應注意，術語“包含”、“包括”和“具有”可互換使用。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。本文中明確提及的所有出版物和專利出于所有目的(包括描述和公開可能與本發(fā)明聯(lián)合使用的出版物中報道的化學品、儀器、統(tǒng)計分析和方法)通過引用整體并入本文。本說明書中引用的所有參考文獻都將被視為指示本領域的技術水平。本文中的任何內(nèi)容都不應被解釋為承認本發(fā)明沒有由于先前的發(fā)明而先于這樣的公開內(nèi)容的資格。
ii.組合物和方法
提供了適用于異種移植的轉基因動物和產(chǎn)生適用于異種移植的哺乳動物的方法。具體地，本申請描述了α1，3半乳糖基轉移酶(αgal)、β1，4n-乙酰半乳糖胺基轉移酶(β4galnt2)和胞苷單磷酸-n-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(cmah)表達降低的三重轉基因豬的產(chǎn)生。
在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了豬和從其來源的豬器官、組織和細胞，其中αgal、β4galnt2和cmah基因活性較低，使得所得的αgal、β4galnt2和cmah產(chǎn)物不再在細胞表面、糖蛋白或糖脂上產(chǎn)生野生型水平的α1，3-半乳糖基表位、sda樣表位或neu5gc。在一個替代實施方案中，αgal、β4galnt2和cmah基因以不發(fā)生基因轉錄的方式失活。在多個實施方案中，制備三重αgal/b4galnt2/cmah敲除豬。制備轉基因豬的方法及對其的挑戰(zhàn)將在galli等2010xenotransplantation17(6)p.397-410中討論。本發(fā)明的方法和細胞培養(yǎng)物在下文中進一步詳細描述。
術語“轉基因哺乳動物”是指其中給定基因已被改變、去除或破壞的轉基因哺乳動物。要強調(diào)的是，該術語旨在包括所有后代。因此，包括建立者動物(founderanimal)及其所有f1、f2、f3等后代，不論后代是否由建立者動物或后代動物通過體細胞核轉移(scnt)產(chǎn)生或通過傳統(tǒng)繁殖方法產(chǎn)生?！皢无D基因”意指其中一種基因已被改變、去除或破壞的轉基因哺乳動物?！半p重轉基因”意指其中兩種基因已被改變、去除或破壞的轉基因哺乳動物。“三重轉基因”意指其中三種基因已被改變、去除或破壞的轉基因哺乳動物。“四重轉基因”意指其中四種基因已被改變、去除或被破壞的轉基因哺乳動物。
原則上，轉基因動物可具有所破壞的目的基因序列的一個或兩個拷貝。在目的核酸序列的僅一個拷貝或等位基因被破壞的情況下，敲除動物被稱為“雜合轉基因動物”。術語“無效(null)”突變包括其中目的核苷酸序列的兩個拷貝被不同地破壞，但是破壞重疊使得一些遺傳物質(zhì)已經(jīng)從兩個等位基因中去除，以及其中目的核苷酸序列的兩個等位基因共享相同破壞的情況二者。在多個實施方案中，三種目的基因的破壞可發(fā)生在轉基因動物的至少一個細胞、至少多個動物細胞、至少一半的動物細胞、至少大部分的動物細胞、至少絕大多數(shù)的動物細胞中，至少70％、75”、80％、85％、90％、95％、98％或99％的動物細胞中。
術語“嵌合體”、“鑲嵌”或“嵌合哺乳動物”是指在其一些含有基因組的細胞中具有敲除的轉基因哺乳動物。嵌合體具有未改變的基因序列的至少一個細胞、具有未改變的基因序列的至少幾個細胞或具有未改變序列的多個細胞。
術語“雜合子”或“雜合哺乳動物”是指在所有其含有基因組的細胞中的一個染色體對上具有破壞的轉基因哺乳動物。
術語“純合子”或“純合哺乳動物”是指在所有其含有基因組的細胞中一個染色體對上的兩個成員都具有破壞的轉基因哺乳動物?！凹兒细淖儭笔侵溉旧w對的兩個成員的改變。
本申請的“非人哺乳動物”包括哺乳動物，例如嚙齒動物、綿羊、狗、綿羊類(例如綿羊)、牛類(例如肉牛和奶牛)、以及豬類(例如家豬和肉豬)。盡管本申請?zhí)峁┝说湫偷姆侨藙游?豬)，但是其他動物也可類似地進行遺傳修飾。
“突變”是動物中傳遞給動物后代的遺傳物質(zhì)的可檢測變化。突變通常是一個或更多個脫氧核糖核苷酸的變化，例如添加、插入、缺失、顛倒或替換核苷酸。
“豬”是指本領域中已知的任何豬，包括但不限于：野生豬、家養(yǎng)豬、迷你豬、野豬(susscrofapig)、家豬(susscrofadomesticuspig)以及近親交配豬。不受限制，所述豬可選自包含以下的組：蘭德瑞斯豬(landrace)、約克郡豬(yorkshire)、漢普郡豬(hampshire)、杜洛克豬(duroc)、中國眉山豬(chinesemeishan)、切斯特白豬(chesterwhite)、伯克希爾戈廷根豬(berkshiregoettingen)、蘭德瑞斯/約克郡/切斯特白豬、尤卡坦豬(yucatan)、巴馬香豬(bamaxiangzhu)、五指山豬(wuzhishan)、西雙版納豬(xishuangbanna)和皮特蘭豬(pietrain)。豬器官、組織、細胞或輸血產(chǎn)品是來自豬的器官、組織、失活的動物組織、細胞或輸血產(chǎn)品。
α1，3半乳糖基轉移酶(αgal、ggta、ggt1、gt、αgt、ggta1、ggta-1)基因編碼酶(gt、αgal、α1，3半乳糖基轉移酶)。ensemble轉錄物enssscg00000005518包括豬ggta1核苷酸序列。功能性α1，3半乳糖基轉移酶催化在糖蛋白上形成半乳糖α1，3-半乳糖(αgal、gal、gal、gal1，3gal、gal1-3gal)殘基。半乳糖α1，3-半乳糖(αgal)殘基是人免疫系統(tǒng)識別的抗原表位或抗原。從轉基因器官材料中去除αgal無法消除對外源材料移植的人免疫應答，表明另一些抗體參與對異種移植物的迅速免疫應答。(mohiudden等(2014)，amj.transplantation14：488-489和mohiudden等2014xenotransplantation21：35-45)。導致功能性αgal表達降低的αgal基因的破壞可包含但不限于：與g至a替換相鄰的3堿基對缺失、單堿基對缺失、單堿基對插入、二堿基對插入、六堿基對缺失、十堿基對缺失、七堿基對缺失、五堿基對缺失的八堿基對插入、五堿基對插入、十一堿基對缺失和十八堿基對缺失(參見表1)。crispr靶序列位于基因的外顯子3中，接近起始密碼子。
胞苷單磷酸-n-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(cmp-neu5ac羥化酶基因，cmah)基因編碼酶(cmah)。功能性cmah催化唾液酸n-乙酰神經(jīng)氨酸(neu5ac)轉化為n-羥乙酰神經(jīng)氨酸(neu5gc)。neu5gc殘基是被人免疫系統(tǒng)識別的抗原表位或抗原。ensembl數(shù)據(jù)庫id基因：enssscg00000001099包括豬cmah核苷酸序列，并且crispr靶區(qū)域在外顯子6附近。導致功能性cmah表達降低的cmah基因的破壞可包含但不限于：四堿基對插入、一堿基對缺失、二堿基對缺失、三堿基對缺失、二十堿基對缺失、五堿基對缺失、八堿基對缺失、十一堿基對缺失、十二堿基對缺失、單堿基對插入、單堿基對缺失的二堿基對插入、四堿基對插入的三堿基對缺失、六十六堿基對缺失/十二堿基對插入和五堿基對缺失/1堿基對替換(參見表1)。
β1，4n-乙酰半乳糖胺基轉移酶(b4galnt2、β4galnt2、b1，4galnt2、β1，4galnt2)基因編碼β1，4n-乙酰半乳糖胺基轉移酶2糖基轉移酶(b4galnt2)。功能性b4galnt2產(chǎn)生sda樣聚糖(dall′olio等(2014)biochemicabiophysicaacta1840：443-453和blanchard等(1983)jbc258：7691-7685)。認為b4galnt2在大多數(shù)人中表達；先前的工作表明，僅5％的人缺乏功能性b4galnt2的表達。豬細胞中β4galnt2的破壞顯著降低了在超過5％的所測試人樣品中的交叉配型；該結果是意料之外的。sda樣聚糖可包括與血型或血型測定和胃腸癌抑制相關的sda和類似聚糖。ensembl數(shù)據(jù)庫enssscg00000030269條目包括β4galnt2cdna和氨基酸序列?；蚪M豬β4galnt2跨越跨過約40,000個堿基對的多個外顯子，并且可能在多個基因座發(fā)生。在這些實驗中使用的crispr靶區(qū)域見于外顯子2中，并且是ctgtatcgaggaacacgctt。導致功能性β4galnt2表達降低的β4galnt2基因的破壞可包括但不限于：一堿基對插入、十二堿基對缺失、五堿基對缺失、十四堿基對缺失、十二堿基對缺失/一堿基對替換、271堿基對缺失/一堿基對插入。
表1.功能性基因產(chǎn)物降低的活豬中目的基因破壞的實例
術語“破壞的基因”旨在包括目的核苷酸序列的插入、中斷或缺失，其中所述破壞的基因編碼具有不同于內(nèi)源性序列的氨基酸序列之改變的氨基酸序列的多肽，編碼具有比內(nèi)源性氨基酸序列少的氨基酸殘基的多肽或者不編碼多肽，但是目的野生型核苷酸序列編碼多肽。
本說明書提供了具有降低的功能性αgal、β4galnt2和cmah基因表達的轉基因動物。所述動物可以是適用于異種移植的任何哺乳動物。在一個具體實施方案中，所述動物是豬?！癱mah/αgal雙敲除”、“cmah/αgaldko”、“cmah/αgal”、“cmah/αgaldko”、“cmah-/-/gal-/-”、“αgal/cmahdkos”、“αgal/cmah雙重敲除”、“ggta1/cmahdko”、“gt1/cmahdko”、“ggta1-/-/cmah-/-”、“ggt1-/-/cmah-/-”、“cmah/ggtadko”、“gt/cmah-ko”、“ggta1/cmahko”、“dko(αgal/cmah)”、“dko(αgal&cmah)”、“cmah-/αgal-”、“αgal-/cmah-”、“cmah-/αgal-”及其變體是指缺乏功能性α1，3半乳糖基轉移酶和胞苷單磷酸-n-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶表達的轉基因動物、細胞或組織。可在野生型背景或cmah/αgal雙敲除背景中產(chǎn)生三重敲除產(chǎn)物或豬?！癱mah/αgal/b4galnt2三重敲除”、“cmah/αgal/β4galnt2三重敲除”、“cmah/αgal/b4galnt2tko”、“cmah/αgal/β4galnt2”、“cmah/αgal/b4galnt2tko”、“cmah-/-/gal-/-/b4galnt2-/-”、“αgal/cmah/β4galnt2tkos”，“αgal/cmah/β4gal三重敲除”、“ggta1/cmah/b4galnt2tko”、“gt1/cmah/β4galnt2tko”、“ggta1-/-/cmah-/-/β4galnt2-/-”、“ggt1-/-/cmah-/-/β4galnt2-/-”、“cmah/ggta/β4galnt2tko”、“gt/cmah/β4galnt2-ko”、“ggta1/cmah/β4galnt2ko”、“tko(αgal/cmah/β4galnt2)”、“tko(αgal、cmah、β4galnt2)”、“cmah-/αgal-/β4galnt2-”、“αgal-/cmah-/β4galnt2-”、“cmah-/αgal-β4galnt2-”及其變體是指缺乏功能性α1，3半乳糖基轉移酶、胞苷單磷酸-n-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶和β4galnt2表達的轉基因動物、細胞或組織。
轉基因移植材料。移植材料包括來自用作異種移植物的動物的器官、組織、輸血產(chǎn)品和/或細胞。用作異種移植物的移植材料可以從具有降低的αgal、β4galnt2和cmah表達的轉基因動物中分離出來。來自轉基因或敲除豬的轉基因植物材料可以從產(chǎn)前、新生、未成熟或完全成熟的轉基因動物中分離出來。移植材料可用作需要器官移植的人對象的臨時或永久性器官替代物?？墒褂萌魏呜i器官，包括但不限于：腦、心、肺、眼、胃、胰、腎、肝、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛發(fā)、指甲、耳、腺體、鼻、口、唇、脾、牙齦、牙齒、舌、唾液腺、扁桃體、咽、食管、大腸、小腸、小腸、直腸、肛門、甲狀腺、胸腺、骨、軟骨、腱、韌帶、腎上腺囊(suprarenalcapsule)、骨骼肌、平滑肌、血管、血液、脊髓、氣管、輸尿管、尿道、下丘腦、垂體、幽門、腎上腺、卵巢、輸卵管、子宮、陰道、乳腺、睪丸、精囊、陰莖、淋巴、淋巴結和淋巴管。
在另一個實施方案中，本申請?zhí)峁┛捎糜诋惙N移植的非人組織。在多個實施方案中，非人組織是來自三重αgal/cmah/β4galnt2轉基因豬的豬組織?？墒褂萌魏呜i組織，包括但不限于：上皮、結締組織、血液、骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)、腺樣體(adenoid)、脂肪、乳暈組織、棕色脂肪、松質(zhì)骨肌(cancellousmuscle)、軟骨組織、海綿狀組織、軟骨樣組織、嗜鉻組織、肉膜狀組織(dartoic)、彈性組織、上皮組織、脂肪組織、透明纖維(fibrohyaline)、纖維組織、gamgee、凝膠狀組織、肉芽組織、腸相關淋巴樣組織、骨骼肌、haller血管組織、中性組織、間質(zhì)組織、包埋組織(investing)、胰島、淋巴組織、淋巴樣組織、間質(zhì)組織、中腎組織、多泡脂肪(multilocularadipose)、胸腺組織、黏液結締組織、骨髓組織、鼻額點組織、腎原性組織、結組織、骨樣組織、骨狀組織、成骨組織、骨髓、網(wǎng)狀組織、根尖周組織、網(wǎng)狀組織、平滑肌、硬造血組織和皮下組織、失活的動物組織(包括心臟瓣膜、皮膚和腱，以及活體豬皮膚)。
另一個實施方案提供了來自具有減低或減小的αgal、b4galnt2和cmah表達的豬三重轉基因動物的細胞和細胞系。在一個實施方案中，這些細胞或細胞系可用于異種移植。可使用來自任何豬組織或器官的細胞，包括但不限于：上皮細胞、成纖維細胞、神經(jīng)細胞、角質(zhì)形成細胞、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞(b和t)、巨噬細胞、單核細胞、單個核細胞、心肌細胞、其他肌細胞、顆粒細胞、卵丘細胞、表皮細胞、內(nèi)皮細胞、朗格爾漢斯細胞島(isletoflangerhanscell)、胰腺胰島素分泌細胞、骨細胞、骨前體細胞、神經(jīng)元干細胞、原始干細胞、肝細胞、主動脈內(nèi)皮細胞、微血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、肝星形細胞、主動脈平滑肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)元、庫普弗細胞(kupferrcell)、平滑肌細胞、施萬細胞、紅細胞、血小板、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、胰島細胞、甲狀腺細胞、胸腺細胞、甲狀旁腺細胞、腮腺細胞、膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、紅細胞、白細胞、巨噬細胞、體細胞、垂體細胞、腎上腺細胞、毛細胞、膀胱細胞、腎細胞、視網(wǎng)膜細胞、視桿細胞、視錐細胞、心臟細胞、起搏細胞、脾細胞、抗原呈遞細胞、記憶細胞、t細胞、b細胞、漿細胞、肌細胞、卵巢細胞、子宮細胞、前列腺細胞、陰道上皮細胞、精細胞、睪丸細胞、生殖細胞、卵細胞、睪丸間質(zhì)細胞(leydigcell)、管周細胞、睪丸支持細胞(sertolicell)、黃體細胞、子宮頸細胞、子宮內(nèi)膜細胞、乳腺細胞、卵泡細胞、黏液細胞、纖毛細胞、非角質(zhì)化上皮細胞、角質(zhì)化上皮細胞、肺細胞、杯狀細胞、柱狀上皮細胞、多巴胺能細胞、鱗狀上皮細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、骨髓、胚胎干細胞、成纖維細胞和胎兒成纖維細胞。
非活體衍生物(nonviablederivative)包括通過酶促或化學處理這些組織衍生物從活細胞中剝離的組織，這些組織衍生物可在用于移植之前通過交聯(lián)或其他化學處理進一步加工。在一個優(yōu)選的實施方案中，衍生物包括來自于多種組織的細胞外基質(zhì)，包括皮膚、骨、尿、膀胱或器官黏膜下組織。此外，提供活組織剝離的腱、關節(jié)和骨，包括但不限于：心臟瓣膜和其他非活體組織作為醫(yī)療裝置。在一個實施方案中，提供了適用于細胞培養(yǎng)以及分離自本發(fā)明的轉基因豬的血清或培養(yǎng)基。還提供了豬轉基因器官、組織或細胞的組分。組分也可通過本領域中已知的任何方式進行修飾，包括但不限于交聯(lián)和醛交聯(lián)。組分可根據(jù)來自獲得所述組分的較大器官或組織而變化。皮膚組分可包括但不限于剝離的皮膚、膠原、上皮細胞、成纖維細胞和真皮。骨組分可包括但不限于膠原和細胞外基質(zhì)。心臟組分可包括但不限于瓣膜和瓣膜組織。
“異種移植”包括涉及將細胞、組織或器官移植、植入或輸注到來自不同物種的接受者對象的任何過程。特別地考慮其中接受者是人的異種移植。因此，異種移植包括但不限于血管化異種移植、部分血管化異種移植、非血管化異種移植、異種敷料、異種繃帶、異種結構和異種輸注。
在一些實施方案中，提供分離自包含破壞的α(1，3)-半乳糖基轉移酶、β4galnt2和cmah基因的轉基因豬的細胞培養(yǎng)試劑。細胞培養(yǎng)試劑是用于組織培養(yǎng)、體外組織培養(yǎng)、微流體組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)或使分離的細胞或細胞系生長的其他手段的試劑。細胞培養(yǎng)試劑可包括但不限于：細胞培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)血清、細胞培養(yǎng)添加劑、飼養(yǎng)細胞和能夠增殖的分離細胞?！澳軌蛟鲋车姆蛛x細胞”是指從其他細胞類型或其他細胞分離或部分分離的細胞，其中細胞能夠增殖、分裂或增殖成至少一種另外的克隆細胞。
在培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細胞可合成抗原表位或將其代謝地并入由所培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生的目的化合物中?？乖砦豢蓪е峦ㄟ^人抗體的結合提高和目的化合物的效力降低。參見ghaderi等，2010，naturebiotechnology28(8)：863-867，其通過引用整體并入本文。在具有改變的表位譜(例如降低的αgal、b4galnt2或neu5gc水平)的細胞培養(yǎng)試劑中培養(yǎng)產(chǎn)生細胞可降低目的化合物上的αgal抗原、neu5gc抗原和/或sda樣抗原的水平。目的化合物可包括但不限于糖蛋白和糖脂。目的糖蛋白可包括但不限于抗體、生長因子、細胞因子、激素或凝血因子。目的糖脂可包括但不限于治療劑、抗原和生物表面活性劑。
詞語“提供”旨在包括準備、獲取、預備、制備、供應或供給。認識到提供細胞的方法可與提供對象的方法不同，提供器官的方法可與提供豬的方法不同，提供腎的方法可與提供肝的方法不同，并且提供肝的方法器官可與提供適合于輸血之材料的方法不同。
當移植的組織、器官、細胞或材料不被接受者的身體接受時，則發(fā)生移植排斥。在移植排斥中，接受者的免疫系統(tǒng)攻擊移植的材料。存在多種類型的移植排斥并且其可以單獨或一起發(fā)生。排斥過程包括但不限于超急性排斥(har)、急性體液異種移植排斥反應(ahxr)、血小板減少癥、急性體液排斥、超急性血管排斥、抗體介導的排斥反應和移植物抗宿主病?！俺毙耘懦夥磻蔽覀円庵敢浦膊牧匣蚪M織在移植后前24小時內(nèi)發(fā)生或開始的排斥，涉及一種或更多種排斥機制。排斥包括但不限于“超急性排斥”、“體液排斥”、“急性體液排斥”、“細胞排斥”和“抗體介導的排斥”。急性體液異種移植反應(ahxr)的特征在于一系列病理特征，包括但不限于在移植的幾天內(nèi)發(fā)生的急性抗體介導的排斥、血栓性微血管病(thromboticmicroangiopathy，tma)的發(fā)生、微血管病、預形成的非galigm和igg結合、補體激活、微血管血栓形成和移植后前幾周內(nèi)的消耗性血小板減少癥。血小板減少是低于正常范圍140,000至440,000/μl的血小板量。血小板減少癥相關癥狀包括但不限于：內(nèi)出血、顱內(nèi)出血、血尿、嘔血、牙齦出血、腹脹、黑糞(melena)、經(jīng)期延長、鼻出血、瘀斑、瘀點或紫癜。通過豬肝攝取人血小板導致異種移植接受者血小板減少癥的發(fā)生。血小板減少癥可在異種移植器官的再灌注后或緊隨其后的再灌注期間發(fā)生。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了改善患者中排斥相關癥狀的方法，所述方法包括將在豬器官、組織或細胞上具有降低的αgal、β4galnt2和neu5gc表達的豬器官、組織或細胞移植到人中，其中與將來自野生型豬的組織移植給人相比，一種或更多種排斥相關癥狀改善。“改善”、“變好”、“改良”、“增強”和“幫助”旨在在所期望的方向推進或取得進展。還考慮改善排斥相關癥狀可包括不期望癥狀的降低、減輕或減小。進一步認識到，排斥相關癥狀可在另一種排斥相關癥狀改變的同時改善。改變的第二排斥相關癥狀可能改善或增強。第二改變的排斥相關癥狀可以以較不期望的方式改變。排斥相關癥狀包括但不限于超急性排斥相關癥狀和急性體液異種移植反應相關癥狀。排斥相關癥狀可包括但不限于：血栓性微血管病(tma)、微血管病、預先形成的非galigm和igg結合、補體活化、凝集、纖維化、微血管血栓形成、消耗性血小板減少癥、消耗性凝血病、深度血小板減少癥、難治性凝血病、移植物間質(zhì)性出血、斑駁(mottling)、發(fā)紺、水腫、血栓形成、壞死、纖維蛋白血栓形成(fibrinthrombiformation)、全身彌漫性血管內(nèi)凝血、腎小球毛細血管中igm沉積、腎小球毛細血管中igg沉積、肌酸酐水平升高、bun水平升高、t細胞浸潤、浸潤性嗜酸性粒細胞、浸潤性漿細胞、浸潤性嗜中性粒細胞、動脈炎、與內(nèi)皮結合的抗體，icos、ctla-4、btla、pd-1、lag-3或tim-3的表達改變以及全身性炎癥。
“超急性排斥相關癥狀”旨在包括與超急性排斥相關或由超急性排斥引起的本領域中已知的任何癥狀。認識到超急性排斥相關癥狀可以根據(jù)所移植的器官、組織或細胞的類型而變化。超急性排斥相關癥狀可包括但不限于血栓性閉塞、移植物脈管系統(tǒng)出血、嗜中性粒細胞流入(neutrophilinflux)、缺血、斑駁、發(fā)紺、水腫、器官衰竭、器官功能下降、壞死、腎小球毛細血管血栓形成、缺乏功能、溶血、發(fā)熱、凝血、膽汁產(chǎn)生降低、虛弱、低血壓、少尿、凝血病、血清轉氨酶水平升高、堿性磷酸酶水平升高、黃疸、嗜睡、酸中毒和高膽紅素血癥和血小板減少癥。
血小板減少是低于正常范圍140,000至440,000/μl的血小板量。血小板減少癥相關癥狀包括但不限于：內(nèi)出血、顱內(nèi)出血、血尿、嘔血、牙齦出血、腹脹、黑糞、經(jīng)期延長、鼻出血、瘀斑、瘀點或紫癜。通過豬肝攝取人血小板導致異種移植接受者血小板減少癥的發(fā)生。
血小板(也稱為凝血細胞)是參與血液凝固、止血和血栓形成的巨核細胞的去核碎片。人血小板通過多種方法常規(guī)分離，包括但不限于血小板采集術(plateletapheresis)、單采血小板術(plateletpheresis)和超速離心。
短語“血小板攝取”旨在包括將血小板并入肝或肝細胞中。雖然不受機制限制，但是這種攝取可通過吞噬過程發(fā)生?？赏ㄟ^本領域中已知的任何血小板攝取監(jiān)測測定法來監(jiān)測血小板攝取。血小板攝取監(jiān)測測定法包括但不限于免疫學方法、蛋白質(zhì)印跡法、免疫印跡法、顯微術、共聚焦顯微術、透射電子顯微術和吞噬體分離。認識到適當?shù)难“鍞z取監(jiān)測測定法可取決于所用標記的類型。血小板攝取可以測量為所吸收的總血小板百分比、未吸收的總血小板百分比、吸收的與未吸收血小板的比例、吸收至少一個血小板的細胞百分比、不吸收血小板的細胞百分比或每個細胞吸收的血小板數(shù)。認識到通過多于一種細胞類型的血小板攝取可有助于肝的總血小板攝取。動物肝攝取的總血小板可包括肝竇內(nèi)皮細胞攝取的血小板、庫普弗細胞(kupffer)攝取的血小板、lsec和庫普弗細胞攝取的血小板以及其他細胞類型攝取的血小板。認識到通過不同細胞類型攝取的血小板可能有助于相似或不同分數(shù)的肝攝取的總血小板。因此，肝攝取的血小板的改變、抑制、降低、減小或下降包含一種或更多種肝細胞類型的血小板攝取的改變、抑制、降低、減小或下降。
雖然不受機制的限制，血小板攝取可通過lsec和庫普弗細胞的吞噬發(fā)生。吞噬的特征在于形成內(nèi)含體，其通過含有降解酶的溶酶體的融合變成吞噬體(phagosome)。
評價、評估、分析、測量、量化或確定本領域中已知的排斥相關癥狀的任何方法可與要求保護的組合物和方法一起使用。分析排斥相關癥狀的方法可包括但不限于：包括具有血小板計數(shù)的cbc的實驗室評估、凝血研究、肝功能測試、流式細胞術、免疫組織化學、標準診斷標準、免疫學方法、蛋白質(zhì)印跡法、免疫印跡法、顯微術、共聚焦顯微術、透射電子顯微術、igg結合測定、igm結合測定、表達測定、肌酐測定和吞噬體分離。
當基因產(chǎn)物的總表達降低時，產(chǎn)生改變大小的基因產(chǎn)物或者當基因產(chǎn)物表現(xiàn)出改變的功能時，基因產(chǎn)物的表達降低。因此，如果基因表達野生型量的產(chǎn)物，但產(chǎn)物具有改變的酶活性、改變的大小、改變的細胞定位模式、改變的受體-配體結合或其他改變的活性，則認為該基因產(chǎn)物的表達降低。可通過本領域中已知的任何手段分析表達，包括但不限于：rt-pcr、蛋白質(zhì)印跡法、rna印跡法、微陣列分析、免疫沉淀、放射性測定、多肽純化、分光光度分析、丙烯酰胺凝膠的考馬斯染色、elisa、2-d凝膠電泳、原位雜交、化學發(fā)光、銀染、酶測定、麗春紅s染色、多重rt-pcr、免疫組織化學測定、放射免疫測定、比色測定、免疫放射測定、正電子發(fā)射斷層成像、熒光測定、透化細胞的熒光激活細胞分選染色、放射免疫吸附測定、實時pcr、雜交測定、夾心免疫測定、流式細胞術、sage、差異擴增或電子分析。表達可以直接或間接分析。間接表達分析可包括但不限于分析由酶催化的產(chǎn)物的水平以評價酶的表達。參見例如，ausubel等，編輯(2013)currentprotocolsinmolecularbiology，wiley-interscience，newyork，n.y和coligan等(2013)currentprotocolsinproteinscience，wiley-intersciencenewyork，ny。豬asgr1的基因表達測定是可商購的(appliedbiosystemstm，carlsbadca)。
“與......相比”旨在包括將某些事物與相似但不同的事物進行比較，例如將從轉基因豬實驗獲得的數(shù)據(jù)點與從野生型豬的相似實驗獲得的數(shù)據(jù)點相比較。詞語“比較”旨在包括檢查特征、質(zhì)量、值、數(shù)量或比例，以便發(fā)現(xiàn)正被比較的事物之間相似性或差異。比較可揭示了正在被比較的事物之間的顯著性差異?！帮@著性差異”是指針對多組獲得的結果(例如來自轉基因豬的材料和來自野生型豬的材料的結果)的統(tǒng)計學顯著性差異。通常來說，通過統(tǒng)計學顯著性檢驗來評價統(tǒng)計學顯著性，例如但不限于t檢驗、卡方檢驗、單尾t檢驗、雙尾t檢驗、方差分析(anova)、dunnett事后檢驗、fisher檢驗和z檢驗。兩個結果之間的顯著性差異可以是具有p＜0.1、p＜0.05、p＜0.04、p＜0.03、p＜0.02、p＜0.01或更大的結果。
詞語“分離的”旨在包括與另一實體或組物理分離的實體。分離的細胞與另一組細胞物理分離。一組細胞的實例包括但不限于：發(fā)育的細胞團、細胞培養(yǎng)物、細胞系、組織和動物。詞語“分離”旨在包括將實體與另一個實體或組物理分離。實例包括將細胞與其他細胞物理分離，將細胞組分與細胞的其余部分物理分離以及將動物的組織或器官物理分離。分離的細胞或細胞組分與來自其他天然存在的細胞或細胞成分以10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、高至100％分離。從另一組細胞中分離一種或更多種細胞的方法是本領域中已知的。參見例如，freshney(ed)cultureofanimalcells：amanualofbasictechniques(第3版)1994，wiley-liss；spector等(編輯)(1998)cells：alaboratorymanual(第1卷)coldspringharborlaboratorypress以及darling等(1994)animalcells：cultureandmediajohnwiley&sons。從動物中分離組織或器官的方法是本領域中已知的，并且根據(jù)待分離的組織或器官以及所期望的移植組織或器官的方法而變化。從動物或樣品分離輸血產(chǎn)品的方法是本領域中已知的，并且根據(jù)期望的輸血產(chǎn)品而變化。這些方法包括但不限于離心、透析、洗脫、單采血液成分術(apheresis)和低溫沉淀。
“皮膚相關產(chǎn)品”包括從皮膚分離的產(chǎn)品和旨在與皮膚一起使用的產(chǎn)品。與皮膚或其他組織分離的皮膚相關產(chǎn)品可在與皮膚一起使用前進行修飾。皮膚相關產(chǎn)品包括但不限于：替代敷料、燒傷覆蓋物、真皮產(chǎn)品、替代真皮、真皮成纖維細胞、膠原蛋白、軟骨素、結締組織、角質(zhì)形成細胞、脫細胞異種真皮(cell-freexenodermis)、脫細胞豬真皮、復合皮膚替代物和表皮及臨時傷口覆蓋物。參見例如matou-kovd等(1994)annmedburnclub7：143，其通過引用整體并入本文。
皮膚相關產(chǎn)品的連接時間段是向人對象施用皮膚相關產(chǎn)品與皮膚相關產(chǎn)品從人對象自然分離之間的時間。當人對象的皮膚傷口被密封時，皮膚相關產(chǎn)品可通過自然分離或機械分離來去除。然而，皮膚相關產(chǎn)品與人對象的自然分離可過早地發(fā)生。過早的自然分離在醫(yī)師期望的分離之前發(fā)生。例如而非限制，過早的自然分離可在傷口已經(jīng)被密封之前發(fā)生。過早的自然分離也可稱為“蛻皮(sloughing)”、“脫落”或“剝落”。過早的自然分離的臨床管理可包括皮膚相關產(chǎn)品的再應用、敷料應用、繃帶應用、施用抗生素和施用流體?？赏ㄟ^本領域中已知的任何手段密封皮膚傷口，包括但不限于對象皮膚的生長和皮膚移植。減輕的過早分離包括在醫(yī)師期望的分離之前降低、下降、較低頻率、減小、較少的量的皮膚相關產(chǎn)品的天然分離。減輕的過早分離可涉及較少數(shù)量的完全、較少數(shù)量的部分過早分離事件，并且與從野生型豬獲得的皮膚相關產(chǎn)品相比，在部分過早分離事件中涉及較少部分的皮膚相關產(chǎn)品。本申請的皮膚相關產(chǎn)品也可表現(xiàn)出提高的、加長的、改進的、延長的或擴展的連接時間。使用本申請的皮膚相關產(chǎn)品可延長連接持續(xù)時間。
皮膚傷口包括對體被(integument)的任何損傷，包括但不限于：開放性傷口、燒傷、撕裂、潰瘍、腿部潰瘍、足部潰瘍、黑素瘤摘除、癌癥摘除、整形手術和咬傷。
“手術連接”是指通過本領域中已知的任何手術方法來接合、組合、聯(lián)合、附接、緊固、連接、接合或締合。
在一個實施方案中，本申請?zhí)峁┝藖碜跃哂薪档偷摩羐al、cmah和β4galnt2基因表達的多個敲除豬動物之適用于輸血的非人材料。適用于輸血的這些材料可包括但不限于：血液、全血、血漿、血清、紅細胞、血小板和白細胞。這樣的材料可被分離、富集或純化。分離、富集或純化適合于輸血的材料的方法是本領域中已知的。血清學豬血紅細胞(rbc)與人rbc共享許多共同特征(pondwg，houptka，thebiologyofthepigithaca：comstockpub.associates，1978和jandl，jhblood：textbookofhematology，boston：little，brown，1996)。與在其他哺乳動物中一樣，豬中紅細胞生成的主要部位是骨髓。prbc是直徑為約4-8微米的雙凹盤(biconcavedisk)。豬血液的血細胞比容為35-47％，血紅蛋白濃度為6-17g/100ml。prbc的半衰期約為40天，而人rbc的半衰期為60天。
到目前為止，已經(jīng)鑒定了15種豬血型系統(tǒng)。最重要且充分研究的是與人abo系統(tǒng)密切相關的a-o(h)。prbc上的a和o抗原以與人lewis抗原類似的機制(marcus，d.m.&cass，l.e(1969)science164：553-555))從循環(huán)的血漿鞘糖脂被動地被吸附。prbc表型不完全可靠。豬的表型分型(phenotyping)可通過用抗a單克隆抗體(mab)(如血庫中使用的)和抗h凝集素抗體(ulexeuropaeus)對頰上皮細胞免疫組織化學染色(villarroyah等1990，autoimmunity6：47-60)實現(xiàn)。攜帶血型a的糖脂已經(jīng)從豬胃黏膜、上皮細胞和紅細胞中分離出來。在一些來自prbc的良好表征的蛋白質(zhì)中，豬血紅蛋白與其人對應物共享85％的序列同一性，并以
以下實施例僅用于舉例說明目的，并不意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實際上，除了本文中所示和描述的那些之外，根據(jù)前述說明和以下實施例，多種修改對于本領域技術人員來說將變得明顯并落入所附權利要求書的范圍內(nèi)。
實施例
實施例1.靶定的cmah、ggta1和β4galnt2區(qū)域的dna測序分析
使用genelute哺乳動物基因組dna微量制備試劑盒(sigma-aldrich，st.louis，mo)提取來自克隆豬的基因組dna。進行cmah、ggta1和β4galnt2crispr/cas9靶區(qū)域的pcr擴增。使用引物對靶定的cmah、ggta1和β4galnt2區(qū)域進行測序。
使用pwomaster(roche，indianapolisin)，使用pwosuperyielddna聚合酶、dntpack(rocheappliedscience，indianapolis，in)。ggta1的pcr條件如下：94℃，2分鐘；94℃，15秒，54℃，30秒，和72℃，45秒，持續(xù)15個循環(huán)；94℃，15秒，54℃，30秒，72℃，45秒，每個循環(huán)外加5秒，持續(xù)25個循環(huán)；且最后延伸步驟為72℃，持續(xù)5分鐘。對于cmah，94℃，2分鐘；94℃，15秒，56℃，30秒和72℃，45秒，持續(xù)15個循環(huán)；94℃，15秒，56℃，30秒，72℃，45秒，每個循環(huán)外加5秒，持續(xù)25個循環(huán)；且最后延伸步驟為72℃，持續(xù)5分鐘。對于β4galnt2，94℃，2分鐘；94℃，15秒，62℃，30秒，72℃，40秒，持續(xù)15個循環(huán)，94℃，15秒，62℃，30秒，72℃，40秒，每個循環(huán)外加5秒，持續(xù)25個循環(huán)；且最后延伸步驟為72℃，持續(xù)5分鐘。pcr產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上分離，并通過genelute凝膠提取試劑盒(sigma-aldrich，st.louis，mo)純化。pcr產(chǎn)物通過sanger方法(dna測序核心設施，印第安納大學醫(yī)學院(indianauniversityschoolofmedicine))進行測序，用以下特異性測序引物，對于ggta1為5’ccttagtatccttcccaacccagac3’(seqidno：5)；對于cmah為5’cattttcttcggagttgagggc3’(seqidno：6)；對于β4galnt2為5’aaagccacaggaggagccag3’(seqidno：7)。一旦檢測到突變，將pcr產(chǎn)物插入pcr4blunt-topo載體中并轉化到大腸桿菌(e.coli.)中。再次對單個克隆進行測序以進一步研究單個基因的每個等位基因中的突變。
來自示例性dna序列分析的結果總結在圖1的圖a-c中。dna序列分析證實至少一只豬中兩個等位基因中ggta1和cmah基因的改變。序列分析示出ggta1靶區(qū)域中重疊的5和7堿基對缺失(圖a)。在同一的豬中，序列分析證實在一個等位基因上由12堿基對缺失組成的cmah基因的破壞，以及另一個等位基因上重疊的3堿基對缺失的5堿基對替換(圖b)。dna序列分析證實了同一豬中β4galnt2基因序列的改變。β4galnt2基因序列數(shù)據(jù)示出三種變異；三個突變的存在可表明β4galnt2基因在至少兩個基因座出現(xiàn)。在β4galnt2基因的重疊區(qū)域，一個等位基因示出單堿基對插入，一個等位基因示出五堿基對缺失并且一個等位基因示出十二堿基對缺失/一堿基對替換。沒有發(fā)現(xiàn)野生型β4galnt2序列的證據(jù)(圖c)。圖13總結了另外的三重敲除豬分離群的dna序列分析。
實施例2.敲除豬(三重轉基因豬)的產(chǎn)生
使用addgene質(zhì)粒42230[http：//www.addgene.org/42230和20]進行寡核苷酸退火并克隆到px330質(zhì)粒中以驅動grna表達。靶定基因的寡核苷酸對是ggta1(ncb1登錄號：xm_005660398.1)，5’caccgagagaaaataatgaatgtcaa-3’正向)(seqidno：8)，5’aaattgacattcattattttctc-3’(反向)(seqidno：9)；cmah(ncbi登錄號：nm_001113015.1)5’-caccgag下aaggtacgtgatctgt-3’(正向)(seqidno：10)，5’-aaacacagatcacgtaccttactc-3’(反向)(seqidno：11；β4galnt2(ncbi登錄號nm_001244330.1)5’-caccgtgtatcgaggaacacgctt-3’(正向)(seqidno：12)，5’-aaacaagcgtgttcctcgatacac-3’(反向)(seqidno：13)。
用所有三種grna/cas9質(zhì)粒共轉染肝源細胞。48小時后，將經(jīng)處理的細胞通過ib4凝集素柱以分離α-gal無效細胞。在含有0.5％bsa的500μlhbss中，用2μg/ml熒光素標記的雙花扁豆(dolichosbiflorus)凝集素(dba)-fitc(vectorlaboratories，burlingame，ca，usa)進一步對兩百萬個α-gal陰性細胞進行染色，并使用bdfacsaria分選機(bdbioscience，sanjose，ca，usa)對dba陰性細胞進行流式分選。在體細胞核轉移之前沒有分析neu5gc(cmah基因功能的指示物)的存在。
使用體外成熟卵母細胞進行體細胞核轉移(scnt)(desotobiosciencesinc.，st.seymourtn和minitubeofamcrica(mounthorebwi))。通過在0.1％透明質(zhì)酸酶中用移液管進行吸取從卵母細胞中去除卵丘細胞。選擇具有正常形態(tài)和可見極體的卵母細胞，在操作介質(zhì)(具有含5μg/ml雙苯甲酰亞胺和7.5μg/ml細胞松弛素b之5％胎牛血清(fbs)的無鈣ncsu-23)中孵育15分鐘。在該孵育期后，通過除去第一極體和中期ii板來從卵母細胞去除細胞核。對于三重轉基因豬，將位點靶向的、ib4反向選擇(counter-selected)的、dba陰性肝源細胞(liverderivedcell，ldc)的單細胞注射到每個去核的卵母細胞中。一些三重轉基因豬是從胎兒成纖維細胞的scnt發(fā)育來的，所述胎兒成纖維細胞從由位點靶向的、ib4反向選擇的、dba陰性肝源細胞產(chǎn)生的流產(chǎn)的三重敲除豬胎兒獲得。用btx電穿孔儀(harvardapparatus，hollistonma)誘導電融合。在多種情況下，將注射有細胞(偶聯(lián))的去核卵母細胞在280mm甘露醇、0.001mmcacl2和0.05mmmgcl2中暴露于140v的50μs，或者在280mm甘露醇、0.1mmcacl2和0.05mmmgcl2中暴露于180v的50μs的兩個dc脈沖。激活后，將卵母細胞置于具有0.4％牛血清白蛋白(bsa)的ncsu-23培養(yǎng)基中，并在潮濕氣氛中于38.5℃、5％co2下孵育少于1小時。在激活后一小時內(nèi)，將卵母細胞轉移到接受者豬中。接受者豬在動情期的第一天與西方豬(occidentalpig)同步飼養(yǎng)(synchronize)。胚胎移植后第25天或第26天通過超聲驗證妊娠。
本研究中使用的所有動物均經(jīng)機構生物安全委員會(institutionalbiosafetycommittee，ibc)和機構動物護理和使用委員會(institutionalanimalcareandusecommittee，iacuc)批準。
實施例3.三重敲除的ib4反選擇
用三組靶向構建體(αgal、β4galnt2和cmah)轉染肝源細胞(ldc)。用ib4(一種結合αgal的物質(zhì))選擇細胞。獲得ib4反選擇中存活的大量細胞群體中的細胞dna，并評價靶基因序列。在ib4反選擇中存活的大量群體細胞直接用于scnt以制備妊娠豬。
實施例4.靶向載體的設計
靶向載體(例如crispr構建體、zn指構建體和talen構建體)被設計成在合適位點靶向豬cmah序列(ensemble轉錄物ensssct00000001195)。靶向載體構建體被設計成在合適位點靶向ggta1(ensemble轉錄物ensssct00000006069)。靶向載體構建體被設計成在ncbigeneid：100621328和ensemble：enssscg00000030269中的合適位點靶向β4galnt2。
創(chuàng)建具有作為ensemble轉錄物中列出的序列的一部分的反向互補物之引物序列的cmahcrispr構建體，并將其用于產(chǎn)生三重敲除豬。創(chuàng)建具有與適當ensemble轉錄物中的一部分相同的引物序列的galcrispr構建體并將其用于產(chǎn)生三重轉基因豬。創(chuàng)建具有與上述ncbi序列ncbigeneid：100621328的一部分相同的引物序列的β4galnt2crispr構建體并將其用于產(chǎn)生三重轉基因豬。
實施例5.具有轉基因pbmc的人血清的交叉配型
從靜脈穿刺在acd中收集來自轉基因(例如三重ggta-1/β4galnt2/cmah)豬和野生型豬的豬全血。將全血與pbs以1∶1混合并用ficoll分離。使用ficoll-paqueplus(gehealthcare)從全血制備豬外周血單核細胞(pbmc)。從ficoll層中取出pbmc，并用pbs洗滌數(shù)次，然后根據(jù)需要用裂解液洗滌以除去紅細胞。將pbmc以400萬個細胞/mi懸浮于ex-cell培養(yǎng)基中(用于雜交瘤細胞14610c的ex-cell610hsf-無血清培養(yǎng)基)。
從44名健康人志愿者獲得血清。制備了25％的熱滅活血清。將25μl熱滅活的血清、25μlex-cell培養(yǎng)基和50μl懸浮細胞添加到96孔v底板上的每個孔中。將細胞在4℃下孵育30分鐘，然后用ex-cell培養(yǎng)基洗滌3次。將細胞用如下二抗進行染色：在ex-cell培養(yǎng)基中以1∶250濃度的alexaflour488山羊抗人igg109-546-170，在ex-cell培養(yǎng)基中1∶250濃度的alexaflour488山羊抗人igm709-546-073，添加100μl的二抗。用移液管懸浮細胞。將細胞在4℃下孵育30分鐘。細胞用ex-cell培養(yǎng)基洗滌一次，并用移液管懸浮于ex-cell培養(yǎng)基或1∶1的ex-cell培養(yǎng)基和流式固定液(1％緩沖的多聚甲醛)中。對于alexaflour488，流式細胞術分析用通道fl-1設門完成。來自一個這樣的實驗的結果示于圖3的圖b中。
實施例6.dba凝集素流式細胞術染色
將來自三重轉基因豬和其他目的豬的全血收集在抗凝血檸檬酸鹽葡萄糖(anticoagulantcitratedextrose，acd)中。將全血與pbs1∶1混合，并用ficoll(ficoll-paqueplus，gehealthcare17-1440-03)分離。獲得含有鈣的流式洗滌和染色緩沖液。流式洗滌緩沖液是具有0.5％bsa無igg的0.1％疊氮化鈉的hbss(ph7.4)，進行0.45μm過濾以除去微粒。將pbmc以2×106個細胞/ml重新懸浮于流式洗滌緩沖液中并均勻懸浮。細胞在冰上封閉15分鐘。細胞再次重新懸浮。將100μl(2×105個細胞)添加到5ml流式管中。獲得dba-熒光素(2mg/ml儲液)。在流式緩沖液中將dba-熒光素凝集素儲液以1∶10稀釋至終濃度為0.2μg/ml。將dba-熒光素凝集素以1μgdba：1×106個細胞(0.2μg/2×105個細胞或1μl)的比例添加到細胞中。dba凝集素和細胞在室溫下孵育30分鐘。用4ml流式洗滌hbss徹底洗滌細胞。將細胞以400×g離心5分鐘，并除去洗滌的上清液。將細胞重新懸浮于200μl流式洗滌hbss中。如果進行額外的洗滌，則使用相同的參數(shù)。如果希望的話，最后一次洗滌后將細胞以約200μl流式固定劑/2×105個細胞固定，并在4℃下儲存直到分析。通過對前向散射和側向散射設門進行流式細胞術分析。在fl-1中收集細胞熒光事件；在散射門中收集了10,000個事件。對于每個細胞系，收集僅細胞和dba-熒光素數(shù)據(jù)。ib4凝集素與由αgal基因產(chǎn)物產(chǎn)生的αgal連接的碳水化合物相互作用。hd抗體與由cmah基因產(chǎn)物產(chǎn)生的neu5gc碳水化合物相互作用。dba凝集素與β4galnt2基因產(chǎn)物產(chǎn)生的碳水化合物結構相互作用。圖3的圖a中示出了一個這樣的實驗的結果。
實施例7.與rbc結合的igg抗體
獲得人a和兩個人o血清和rbc。獲得豬野生型和j/cmah/gal三重敲除rbc。使用ficoll-paqueplus(gehealth，uppsalasweden)從酸-檸檬酸鹽-葡萄糖管(bectondickinson&co.，franklinlakesnj)中收集的全血中分離紅細胞。通過在沒有抗凝血劑的情況下通過收集全血分離新鮮血清并離心以去除凝結的物質(zhì)。密度分離后，用pbs洗滌rbc三次，室溫下在pbs中以1∶10稀釋。為了確定與rbc結合的抗體(2×105細胞/孔)，將其與稀釋的、熱滅活的人血清在4℃下孵育30分鐘，最終血清濃度為25％。將細胞在含有疊氮化物的pbs中洗滌三次，并用山羊抗人iggalexafluor488或驢抗人igmalexafluor488(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.，westgrove，pa，usa)染色。使用accuric6流式細胞儀和cflow軟件(accuri，annarbor，miusa)進行流式細胞術分析。rbc設門是基于前向散射和側向散射。與rbc結合的示例性igg抗體流式細胞術描記圖(trace)示于圖5中。
對于αgal，使用抗體/凝集素同工凝集素斑豆(griffoniasimplicifolia)gs-ib4alexafluor647(invitrogen，grandislandny，usa)；對于neu5gc，使用雞抗neu5gc抗體試劑盒(biolegend，sandiegoca)；并且對于β4galnt2來源的碳水化合物，使用熒光雙花扁豆凝集素(fluoresceindolichosbiflorusagglutinin)(dba)(vectorlaboratories，inc.barlingame，causa)進行豬rbc細胞表面聚糖的細胞表面分析。來自一個這樣一系列實驗的描記圖示于圖6中。[matt.-請確認實驗細節(jié)。]
實施例8.rbc剝離和相關流式細胞術
在密度分離后，將rbc在pbs中洗滌3次并懸浮于50％阿氏液(alsever’ssolution)中。將rbc以21,300×g沉淀2分鐘。以1∶1的細胞沉淀物體積與血清體積將血清添加到沉淀細胞中。將血清rbc混合物混合并在4℃下孵育20分鐘。將細胞以21,300×g沉淀2分鐘，并用阿氏液洗滌一次。將細胞與酸剝離緩沖液(ph2.75檸檬酸/磷酸鹽，300mos/kg)混合以除去結合的抗體，并用1mtris-堿(ph9.0)(calbiochem，lajollaca)中和。在低ph處理期間洗脫的物質(zhì)通過sds-page和質(zhì)譜進行分析(見下文)。使用2×106個rbc完成抗體洗脫樣品的匹配流式細胞術分析。將細胞懸浮于含有0.1％疊氮化鈉的ex-cell610-hsf無血清培養(yǎng)基(sigma，st.louis，mousa)中，在4℃下用25％熱滅活血清的混合物孵育30分鐘。將rbc洗滌三次并用山羊抗人iggalexafluor488或驢抗人igmalexafluor488(jacksonimmunoresearchlaboratoriesinc.，westgrovepa，usa)抗體染色。二抗與rbc在4℃下孵育30分鐘并洗滌。在bdaccuric6流式細胞儀(accuri，annarbor，mi，usa)上完成流式細胞術分析并使用flowjo7.6.5(flowjollc，ashlandor，usa)生成直方圖。代表性描記圖示于圖8中。rbc設門基于前向散射和側向散射。代表性設門示于圖10中。
實施例9.從rbc洗脫的蛋白質(zhì)的sds-page凝膠分析
將單個人血清用多種rbc(野生型豬(w)、cmah/galdko(d)、cmah/gal/β4galnt2(t)和自體人(a))孵育。在上述剝離之后，通過將100μl洗脫液稀釋至900μl丙酮中沉淀中和的洗脫液，然后在-20℃下孵育30分鐘。沉淀物在4℃下以20,000×g離心15分鐘。棄去上清液，并用水中的70％v/v乙醇洗滌沉淀。沉淀物在4℃下以20,000×g再次離心15分鐘。再次棄去上清液，并將沉淀在vacufugeplus(eppendorf，hauppauge，ny，usa)中在37℃下干燥30分鐘。然后根據(jù)制造商的說明書，并將樣品溶于100微升含有2-巰基乙醇(sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)的2×laemmeli緩沖液(bio-rad，hercules，ca，usa)中。然后將樣品在95℃下加熱5分鐘，并隨后使其冷卻至室溫。然后將15微升的各樣品上樣到26孔，4-20％無染色劑tgx凝膠(bio-rad)上，并使用bio-rad標準系統(tǒng)在變性和還原條件下在200v下電泳42分鐘。電泳后，取出凝膠，并用100毫升g-250bio-safe考馬斯染色劑(bio-rad)染色30分鐘。然后將凝膠在水中脫色并使用700nm激光在li-cor經(jīng)典成像儀(licorbiosciences，lincoln，neusa)上成像。然后將各樣品在干冰上裝運用于質(zhì)譜制備和分析。圖7的圖a中示出了工藝示意圖；從rbc洗脫的材料的代表性凝膠示于圖7的圖b中。
實施例10.從rbc洗脫的免疫球蛋白的質(zhì)譜定量
由msbioworks，llc進行質(zhì)譜分析。根據(jù)制造商的說明書，用pngasef(newenglandbiolabs)處理50μl等分試樣的每個樣品。每個樣品用丙酮沉淀30分鐘，然后每個客戶方案(clientprotocol)在4℃下用70％乙醇洗滌。將所得沉淀物干燥并重懸浮于40μl具有dtt的1.4×lds上樣緩沖液中。在mops緩沖液系統(tǒng)中，20μl在4-12％的雙trissdspage凝膠上運行。
切下含有重鏈(50kda)的區(qū)域，并按照以下方案使用機器人(progest，digilab)進行胰蛋白酶消化：1)用25mm碳酸氫銨然后用乙腈洗滌。2)用10mm二硫蘇糖醇在60℃下還原，然后在室溫(rt)下用50mm碘乙酰胺烷基化。3)用胰蛋白酶(promega)在37℃下消化4小時。4)用甲酸淬滅，并直接分析上清液，無需進一步處理。
使用與thermofisherqexactive接口的watersnanoacquityhplc系統(tǒng)，通過納米lc/ms/ms分析凝膠消化物。將肽上樣到捕集柱(trappingcolumn)上并以350nl/分鐘在75μm分析柱上洗脫；兩個柱都裝有jupiterproteo樹脂(jupiterproteoresin)(phenomenex)。質(zhì)譜儀以數(shù)據(jù)依賴模式運行，ms和ms/ms分別在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中進行。選擇十五個最豐富的離子用于ms/ms。對于每種同種型特異性肽，確定并計算曲線下面積(auc)。比較auc使得可以對樣品中每種抗體的水平進行定量評價。代表性描記圖示于圖9中。用于通過質(zhì)譜鑒定和定量每種抗體的肽的序列示于表2中。
●igm肽中的小寫字母n表示作為pngasef處理結果推定出現(xiàn)的脫酰胺化天冬酰胺殘基。
實施例11.數(shù)據(jù)處理
使用具有以下參數(shù)的mascot的本地拷貝搜索數(shù)據(jù)：酶：胰蛋白酶，數(shù)據(jù)庫：swissprothuman(正向和反向附加有常見雜質(zhì))，固定修飾：脲甲基(carbidomethyl)(c)，可變修飾：氧化(m)、乙酰(蛋白質(zhì)n端)、脫酰胺(nq)，pyro-glu(n端q)。質(zhì)量值：單一同位素肽質(zhì)量公差：10ppm，片段質(zhì)量公差：0.02damax，錯過酶切位點：2。mascotdat文件被解析到腳手架軟件(scaffoldsoftware)中進行驗證、過濾，并為每個樣品創(chuàng)建一個非冗余列表。以1％蛋白質(zhì)和肽水平假發(fā)現(xiàn)率(falsediscoverrate，fdr)過濾數(shù)據(jù)，并且每個蛋白質(zhì)需要至少兩種獨特的肽。檢查原始lc/ms數(shù)據(jù)，在qualbrowser(thermo)中提取所選離子色譜圖的靶標肽的準確m/z值；計算每種情況下的峰面積。
實施例12.用于定量與rbc結合的抗體之質(zhì)譜和流式細胞術技術的比較
熒光二抗(可能人工掩蔽且不能容易地報告不同的igg同種型)的使用可影響流式細胞術結果。定量質(zhì)譜法可允許直接的肽分析，無需第二試劑，并可提供有關個體同種型水平的信息。質(zhì)譜和流式細胞術提供可反映方法中不同固有偏倚的抗體結合的測量結果。個體同種型水平可對多種免疫效應子功能有不同的貢獻。從三個人收集血清和rbc。每份血清與其自體rbc(a)和豬rbc(野生型(w)或三重敲除(t))孵育。使用流式細胞術和質(zhì)譜法評價免疫球蛋白結合。圖8的圖a和圖b提供了來自一個這樣的實驗的流式細胞術描記圖。質(zhì)譜定量表明，對于三份血清中的兩份，與自體人rbc(a)相比，三重敲除豬細胞(t)結合較少的igg，對于所有三種血清，結合較少的igm。流式細胞術和定量質(zhì)譜均表明，與來自三敲除豬的rbc結合的人免疫球蛋白水平較低。與人血型orbc進行比較，因為人血型orbc的抗原性足夠低以避免即使在不存在免疫抑制情況下的體液損傷。
實施例13.與rbc結合的抗體的同種型分析
使用質(zhì)譜auc來定量每種同種型與不同rbc的結合。使用ggta1/cmah敲除rbc(d)、ggta1/cmah/β4galnt2敲除rbc(t)和自體人rbc(a)進行評價。血清1中的零值表示沒有特定同種型與靶細胞結合。與血清2、3和4中的自體人細胞結合的igg4以10倍至16倍提高。與多重血清中的豬(t)rbc相比，igg2是唯一的顯示與人細胞(a)的提高結合的其他同種型，但是提高小于對于igg4所見的(范圍3至6倍，參見血清2、3和4)。圖10顯示了一系列實驗的結果。
樣品14.不同豬的凝集素染色
將來自ggta1/cmahdko豬的豬腎用來自溶組織梭菌(clostridiumhistolyticum)(sigma，st.louis，mo，usa)的0.025％的iv型膠原酶沖洗。分離初級rmec，并用補充有10％的dko豬血清、100μg/ml內(nèi)皮細胞特異性生長因子、青霉素、鏈霉素和兩性霉素b的rpmi培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，用含有慢病毒載體(其中c-dna表達sv40的大t抗原和小t抗原)(appliedbiologicalmaterialsinc，richmond，bc，canada)的慢病毒上清液感染豬rmec24小時。分離單細胞克隆并擴增至10代。將irmec用補充有10％的dko豬血清、100μg/ml內(nèi)皮細胞特異性生長因子、青霉素、鏈霉素的rpmi培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用于在第15-40代之間表征。獲得αgal/cmah/β4galnt2/sla抗原破壞的irec。
用來自溶組織梭菌(sigma，st.louis，mo，usa)2的0.025％的iv型膠原酶分離來自ggta1/cmah/b4galnt2ko豬的主動脈胸部和腹部分支的原代主動脈內(nèi)皮細胞。將aec用補充有ggta1/cmah/b4galnt2ko豬血清、100μg/ml內(nèi)皮細胞特異性生長因子、青霉素、鏈霉素和兩性霉素b的rpmi1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，以及對于wt/ggta1koaec，用10％fbs或對于ggta1/cmahdko和ggta1/cmah/b4galnt2aec，用5％的ggta1/cmahdko豬血清。這些細胞在5代以內(nèi)使用。使cmah缺陷豬細胞在ggta1/cmahdko豬血清中生長以防止攝取來自牛血清的neu5gc。
使用熒光素標記的雙花扁豆凝集素凝集素(在hbss中以1∶1000稀釋)(dba，vectorlaboratories，burlingame，ca，usa)、熒光素標記的木菠蘿(artocarpusintegrifolia)凝集素(在hbss中以1∶1000稀釋)(ail，vectorlaboratories)、熒光素標記的長柔毛野豌豆(viciavillosa)凝集素(在hbss中以1∶1000稀釋)(vvl，vectorlaboratories)、熒光素標記的花生(arachishypogaea)凝集素(在hbss中以1∶1000稀釋)(pna，vectorlaboratories)和來自斑豆(griffoniasimplicifolia)(invitrogen，grandisland，ny，usa)的alexafluor488標記的同工凝集素ib4(在hbss中以1∶1000稀釋)染色原代aec細胞(2×105個細胞)。對于neu5gc，用具有alexafluor標記的抗neu5gc或正常雞igy(biolegend)的0.5mg/ml儲液以1∶5000的最終稀釋比對細胞進行染色。細胞在4℃下染色30分鐘。然后洗滌細胞并使用c6流式細胞儀(bdbiosciences)進行分析。然后在neu5gc的情況下，在凝集素或同種型對照的情況下與未染色的細胞相比計算熒光強度。代表性描記圖示于圖12中。
實施例15.pbmc的表型分析
通過ficoll-paque(gehealthcare，uppsala，sweden)分離外周血單個核細胞(pbmc)并計數(shù)。然后按照制造商的說明書，將在hank′s平衡鹽溶液(hbss)中稀釋的neu5gc封閉緩沖液(biolegend，sandiego，ca，usa)中以2×106個細胞/毫升的密度重懸浮細胞。將細胞在冰上孵育15分鐘，然后染色。將100微升(2×105個細胞)添加到12×75mm聚苯乙烯流式染色管(bdbiosciences，bedford，ma，usa)中。將細胞以每1×106個細胞1微克的以下物質(zhì)進行染色：熒光素標記的雙花扁豆凝集素凝集素(dba，vectorlaboratories，burlingame，ca，usa)、熒光素標記的木菠蘿凝集素(ail，vectorlaboratories)、熒光素標記的長柔毛野豌豆凝集素(vvl，vectorlaboratories)、熒光素標記的花生凝集素(pna，vectorlaboratories)和來自斑豆的alexafluor488標記的同工凝集素ib4(invitrogen，grandisland，ny，usa)。對于neu5gc，用來自具有alexafluor標記的抗neu5gc或正常雞igy(biolegend)的0.5mg/ml儲液以1∶5000的最終稀釋比例染色細胞。細胞在冰上孵育的同時染色30分鐘。然后用4毫升的neu5gc封閉緩沖液洗滌細胞，并以400×g沉淀5分鐘。棄去上清液，并將細胞重懸于200微升的封閉緩沖液中并立即分析。使用c6流式細胞儀(bdbiosciences)通過使用正向散射和側向散射設門方法收集10,000個事件來分析細胞。然后在neu5gc的情況下，在凝集素或同種型對照的情況下與未染色的細胞相比計算熒光強度。
實施例16.臨床交叉配型測試
將來自三重轉基因豬的pbmc進行用于同種異體移植的人臨床交叉配型測試。從具有反應性抗體圖(pra)為0(頂圖)的31名人對象和具有pra圖評分超過80(下圖)的19名人對象獲得血清。臨床醫(yī)生通常移植細胞毒性評分為1的人器官。將經(jīng)ficoll處理的來自三重轉基因豬的pbmc調(diào)節(jié)至2×106個細胞/ml的細胞濃度。一些血清等分試樣用dtt處理。準備兩套交叉配型托盤。將血清和對照裝載到交叉配型托盤中。將細胞制備物充分混合并在hamilton重復分配器中緩慢地抽取。在照明視窗框內(nèi)，將一微升的細胞添加到含有血清的每個孔中。最后將受試細胞添加到陽性對照孔。將相等數(shù)量的托盤放入sorvall離心機的相對的桶中。啟動離心機并使其達到1000rpm，然后關閉離心機。在照明視窗框內(nèi)檢查托盤以確保細胞微滴與血清混合。將托盤在室溫下孵育30分鐘。使用jet移液管將所有托盤用15μlpbs洗滌四次至各孔中。使用溫和洗滌技術使細胞沉降2-3分鐘。除去pbs、油和血清。
制備ahg/c’1類混合物的工作稀釋液。一組托盤用5μl的ahg/c’處理；另一組托盤用5μl的未稀釋的兔補體(無ahg托盤)處理。托盤任選地以60rpm在轉子上放置4分鐘。將托盤在室溫下孵育60分鐘。細胞用5μl的fluoroquench染色，并使其靜置5分鐘。將托盤放置在反相熒光顯微鏡上；使用160x的總放大率評價每個孔。
評估各個孔中死亡細胞的百分比。ao穿過活細胞的完整細胞膜，插入dna并且當在490nm激發(fā)時發(fā)出綠色熒光(535nm)。當490nm激發(fā)時，死細胞用溴化乙錠染色時發(fā)出紅色熒光(605nm)。使用以下所述的系統(tǒng)對每個孔進行評分：
一個這樣的系列的實驗結果示于圖14中。注意細胞毒性評分為1的多種血清。
實施例17.通過轉基因肝的人血小板離體灌注
將三重轉基因ggta1/cmah/β4galnt2豬麻醉并插管。進行中線腹部切口(abdominalincision)。取出肝并在正常溫度條件下置于灌注裝置中。在灌注裝置中保持濕度、溫度和空氣流。灌注裝置通過改變流量來保持恒定的壓力。使用通過門靜脈的離心式流和通過肝動脈的脈沖式流。這兩種流量均在豬生理壓力下設定?；A灌注溶液是具有生理營養(yǎng)和胰島素的含氧的林格液。
人血小板從健康志愿對象獲得，或者在從分離少于6天時間內(nèi)商購并儲存在20-24℃。在含有抗凝血劑檸檬酸鹽葡萄糖的無菌磷酸緩沖鹽水(pbs)中洗滌大約1×1011個人血小板。血小板可根據(jù)制造商的方案用cfse標記。
在添加血小板前兩小時灌注豬肝。在添加到灌注系統(tǒng)之前和在預定時間點在添加血小板后，獲得血小板樣品。評價灌注前和灌注后血小板水平。進行豬肝的灌注前和灌注后評價。獲得野生型豬肝，并在類似條件下灌注肝。
實施例18.對轉基因異種移植物之反應的評價
從三重敲除豬(αgal、cmah、β4galnt2)獲得豬肝。使用背負法(piggybackmethod)將肝通過手術移植到最近死亡的人尸體中。手術后，從人尸體獲得生物樣本。監(jiān)測排斥相關反應的臨床指標。
實施例19.對轉基因異種移植之反應的評價
從三重轉基因豬(αgal、cmah、β4galnt2)獲得豬腎。向高度敏感的人對象施用化合物以管理預先存在的和從頭合成的供體特異性抗體。將豬腎通過手術移植到對象中。手術后，從人尸體獲得生物樣本。監(jiān)測移植排斥的臨床指標。
實施例20.共聚焦顯微術分析
將仔豬(三重ggta1、cmah、βgalnt2敲除，野生型或其他目的仔豬)安樂死。從豬獲得肝、心和腎組織。制備每種組織的冷凍切片。將固定的組織在hbss中的odyssey封閉緩沖液(li-corbiosciences，lincolnne)中封閉1小時。將載玻片固定在4％多聚甲醛中10分鐘。將組織用ib4凝集素alexafluor647(invitrogen，grandislandny)染色以可視化gal表位的存在。為了可視化neu5gc表位，將組織用雞抗neu5gc抗體或對照抗體(sialix，vistaca)染色1小時。將組織用dba染色以可視化sda樣表位的存在。將組織用hbss洗滌三次。將驢抗雞dylight649(jacksonimmunoresearchlaboratoriesinc，westgrovepa)二抗與組織孵育約1小時。將組織用0.1％hbss吐溫洗滌三次。為了對細胞核進行染色，將dapi染色劑(invitrogen，grandislandny)添加至所有載玻片中保持1分鐘，然后進行兩次0.1％hbss吐溫洗滌。將組織固定在prolonggold(invitrogen，grandislandny)中。使用olympusfv1000進行共聚焦顯微術。
實施例21.抗體介導的補體依賴性細胞毒性
抗體介導的補體依賴性細胞毒性測定法是本領域中已知的。進行diaz等的方法(diaz等，2004transplantimmunology13(4)：313-317)。從健康志愿者獲得人血清。制備25％熱滅活血清。將熱滅活的人血清連續(xù)稀釋，并將100μl的各濃度置于96孔v底測定板中。將血清與從目的豬(ggta1/cmah/β4galnt2三重轉基因等)獲得的100μl等分試樣的pbmc混合。pbmc終濃度為5×106/ml或者1×106/ml。血清濃度為50％、17％、2％、0.6％、0.2％和0.07％?；旌衔镌?℃下孵育30分鐘。30分鐘后，將板以400×g離心4分鐘。將板傾析并用hbss洗滌。向每個孔中添加兔補體(150μl1∶15稀釋)，并在37℃下孵育30分鐘。將pbmc用在hbss(1μg/ml)中從1mg/ml丙酮儲液中每天新鮮制備的熒光素二乙酸酯(fluoresceindiacetate，fda)儲液標記，以及用在磷酸緩沖鹽水(pbs)中以50μg/ml制備的碘化丙啶(pi)標記。在補體中孵育后，通過移液管將樣品轉移到含有250μl的hbss和10μl的fda/pi的管中以便使用accuric6流式細胞儀進行分析。
確定死細胞(pi+/fda-)、受損細胞(pi+/fda+)和活細胞的百分比。從計算中排除雙陰性事件(pi-/fda-)。認為未暴露于血清的細胞中的細胞毒性百分比是自發(fā)性殺傷。對于自發(fā)性殺傷校正細胞毒性值。
實施例22.豬肝獲取
將豬術前用藥、插管且用丙泊酚進行麻醉并置于仰臥位。進行腹部的中線切口。肝的韌帶附著物(ligamentousattachment)被取下。對門靜脈和肝動脈插管并用2升冷的組氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液(essentialpharmaceuticals，llc)沖洗。將肝從豬中取出，并在4℃下在冰上儲存在組氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液中，直到其被放到肝灌注回路中。冷缺血時間在45分鐘至3小時之間。在某些實驗中，豬肝可從屠宰場獲得。來自屠宰場的豬肝在放血兩分鐘內(nèi)用含有肝素(2000u/l)的組氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液沖洗。
實施例23.血小板攝取分析i
用羧基熒光素二乙酸酯琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoreceindiacetatesuccinimidylester，cfse)(一種熒光綠細胞質(zhì)標志物)標記血小板。使用常溫豬肝灌注系統(tǒng)。在添加血小板之前，將來自目的敲除豬或野生型豬的豬肝灌注2小時。向灌注系統(tǒng)中添加約3000億血小板(未標記的為70％，標記的為30％)。在多個預定時間點從豬肝中取出活檢物。通過共聚焦顯微鏡術檢驗活檢物。用對懷布爾-帕拉德體(wieble-paladebody)特異的染色劑處理活檢物。懷布爾-帕拉德體在血小板和內(nèi)皮細胞中出現(xiàn)。進行基于熒光elisa的測定。血小板來自人或狒狒?；蛘?，在共聚焦顯微術之前，用內(nèi)皮標志物和溶酶體標志物標記活檢物。
實施例24.血小板攝取分析ii
用羧基熒光素二乙酸酯琥珀酰亞胺酯(cfse)、熒光綠細胞質(zhì)標志物標記血小板。使用常溫豬肝灌注系統(tǒng)。在添加血小板之前，將來自目的敲除豬或野生型豬的豬肝灌注2小時。通過透射電子顯微術(tem)分析活檢物。
實施例25.體外血小板攝取
從豬肝或目的肝的血竇分離原代肝血竇內(nèi)皮細胞(liversinusoidalendothelialcell，lsec)。原代野生型豬lsec在培養(yǎng)5天后失去吞噬能力；這些實驗用第3天和第4天原代lsec進行。人或狒狒血小板用cfse標記，如本文中別處所述。分離的lsec與標記的血小板一起孵育。通過共聚焦顯微術分析樣品。
實施例26.nhp中的腎異種移植
用一個劑量的抗cd4/抗cd8(50mg/kg)、抗cd154/抗-cd28dab、mmf和類固醇處理接受者非人靈長類動物(non-humanprimate，nhp)。在某些研究中使用他克莫司(靶水平8-12)。使用恒河猴(macacamulatta)作為nhp。在一些實驗中，恒河猴可以是3-5歲且小于6kg。將敲除豬的腎(或野生型對照腎)移植到nhp接受者中。在規(guī)定的時間點收集樣品(血液、尿和腎活檢樣品)進行分析。隨后分析了腎功能、血清肌酐、異種抗體的存在和量(流式細胞術和多參數(shù)流式細胞術)、細胞因子分泌、來自外周血的轉錄譜、尿和移植物活檢、異種移植組織學和抗豬抗體的產(chǎn)生(基于流式的異種交叉匹配測定)。cmah缺失對nhp中的研究沒有幫助。對于nhp研究，使用具有野生型cmah基因的豬(gal-/β4galnt2)。在移植后2周、5周和10周進行超聲引導針穿刺活檢。
實施例27.nhp的獸醫(yī)護理
將nhp圈養(yǎng)在單獨的籠中并提供有干凈、適當大小的生活區(qū)；每天喂兩次；并由動物護理技術人員每天至少檢查兩次，且臨床獸醫(yī)人員每天檢查一次。每次麻醉的動物進行血液采集或其他手術時都進行身體檢查。
實施例28.nhp靜脈切開術和組織取樣
在氯胺酮(10mg/kg)或舒泰(telazol)(4mg/kg)麻醉下對禁食動物進行靜脈放血術(phlebotomy)和組織取樣(例如：血液收集、淋巴結活檢和骨髓吸出)。施用丁丙諾啡(buprenephrine)(每6小時0.01mg/kg)作為進行腎移植的動物的術后鎮(zhèn)痛，并且根據(jù)需要由主治獸醫(yī)確定。監(jiān)測動物“不可逆轉的危重病”，例如但不限于：體重由基線降低25％；完全厭食4天；主要器官衰竭或對治療無響應的醫(yī)學狀況(例如呼吸窘迫、黃疸、尿毒癥、難治性腹瀉、自殘或持續(xù)性嘔吐等)，以及對立即干預無響應的手術并發(fā)癥：出血、血管移植/循環(huán)衰竭、感染和傷口開裂。
實施例29.豬胚胎移植手術、靜脈放血術和收集程序
胚胎移植手術：在手術之前，用tkx(舒泰(500mg)+氯胺酮(250mg)和甲苯噻嗪(250mg)；每50磅1cc，im)將母豬麻醉以進行插管外加使用精密蒸發(fā)器的et管吸入異氟醚和廢氣清除。在恢復期期間，每15分鐘至少監(jiān)測動物一次，并評價和記錄生命體征(溫度、心率、呼吸速率和毛細血管再充盈時間)。受過培訓的動物護理技術人員或獸醫(yī)監(jiān)測動物，直到它們可自主地保持自己的胸骨無妨礙(sternalrecumbrance)。經(jīng)主管獸醫(yī)批準后，將動物返回常規(guī)圈養(yǎng)區(qū)。術后鎮(zhèn)痛劑包括每8-12小時一次丁丙諾啡0.01-0.05mg/kgim或每天一次卡洛芬2-4mg/kgsc。在胚胎移植后約26天，當母豬被食物轉移注意力時，進行超聲檢查以確認發(fā)生妊娠。約10天后進行第二次超聲。出生是通過自然分娩，除非臨床上出現(xiàn)困難。由獸醫(yī)工作人員推薦進行剖宮產(chǎn)術。將標準的剖宮產(chǎn)術方案與胚胎移植手術中使用的全身麻醉方案一起使用。將實驗仔豬清潔，將臍帶消毒。每只仔豬在出生后的第一個小時接受初乳。以24/7觀察仔豬，直到至其少7天大。使用產(chǎn)仔欄(farrowingcrate)保護仔豬與母親，同時保持能夠護理仔豬。
在氯胺酮(10mg/k)或舒泰(4mg/kg)麻醉下對禁食動物進行全部的靜脈放血術。器官收集(終末手術步驟)使用麻醉方案(舒泰(500mg)+氯胺酮(250mg)+甲苯噻嗪(250mg))；每50磅1cc；im)+/-戊巴比妥(10-20mg/kg)iv，如果需要進行插管和通過使用精密蒸發(fā)器的et管吸入異氟醚以實現(xiàn)廢氣清除。豬用鹽水灌注，然后除去心臟和其他組織/器官?；蛘撸梦氲穆樽韯┞樽碡i，并用巴比妥酸衍生物(100-150mg/kg)處理并進行兩側氣胸(bilateralpneumothorax)。
實施例30.免疫抑制劑對t細胞增殖應答的cfsemlr評估
來自恒河猴的pbmc與來自ggta-/β4galnt2-雙重敲除或對照豬的豬pbmc一起孵育。使用cfse的稀釋液來評價t細胞亞群中的t細胞增殖。
實施例31.腎異種移植中免疫抑制劑的評估
接受者恒河猴是免疫成熟的(cmv+、lcv+、sv40+、＞4kg)、mhc和家譜限定的。將免疫抑制候選物(抗cd154dab、克隆5c8抗cd154)施用于恒河猴。在移植前，用t細胞消耗(抗cd4/抗cd8，單劑量)、mmf、類固醇和免疫抑制候選物處理接受者恒河猴。使用血清肌酐評估腎功能。認為肌酐和/或bun分別提高＞5.0mg/dl或100mg/dl為陰性結果。在移植后第2、5和10周進行超聲引導針穿刺活檢。使用多參數(shù)流式細胞術(t、b和其他細胞子集)收集移植前和每周移植后外周血樣品進行免疫分型。功能測定(包括細胞因子分泌以及轉錄物譜的離體評價)為在確定的時間點的外周血、尿和移植物活檢?？梢栽u價外周血樣品中共刺激和共抑制受體(例如但不限于icos、ctla-4、btla、pd-1、lag-3、tim-3)的表達。
本發(fā)明不限于本文中列出的用于舉例說明的實施方案，而是包括在權利要求的范圍內(nèi)的一切。已經(jīng)參照一些示例性實施方案描述了本發(fā)明，應理解，本文中列出的描述一些示例性實施方案的任何限制或要素并不旨在被并入專利權利要求的含義中，除非這些限制或要素是在權利要求中明確列出。同樣地，應理解，由于本發(fā)明是由權利要求限定，并且由于即使在本文中未被明確討論，本發(fā)明的固有和/或不可預見的優(yōu)點也可存在，所以不必為了落入任何權利要求的范圍內(nèi)而滿足本文中所公開的本發(fā)明的任何或全部的指定優(yōu)點或目的。
此外，本文中引用的所有參考文獻通過引用整體并入本文并且用于所有目的，如同在本文中完全列出一樣。
序列表
<110>印第安納大學研究與技術公司
約瑟夫·a·泰克托爾
<120>適用于異種移植的三重轉基因豬
<130>iurtc2015-074
<150>62/067,129
<151>2014-10-22
<160>13
<170>fastseqforwindowsversion4.0
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<211>41
<212>dna
<213>野豬
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<223>ggta1區(qū)
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<400>12
caccgtgtatcgaggaacacgctt24
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