本申請多個方面涉及用于增強(qiáng)激發(fā)能(例如準(zhǔn)直照明)所指向的樣本或組織的類型或性質(zhì)的識別精度的拉曼光譜系統(tǒng)和方法，例如異?；蛎黠@異常生長(例如癌癥)。具體但不排他地，本申請多個方面可在體內(nèi)和體外實時增強(qiáng)諸如胃腸道生長的異常組織的診斷精度。

背景技術(shù)：

通過如內(nèi)窺鏡的微創(chuàng)技術(shù)來準(zhǔn)確并快速地表征和識別組織的性質(zhì)，如腫瘤性胃腸生長是非常理想的。例如，結(jié)腸直腸癌(CRC)是一種到晚期才發(fā)現(xiàn)時則具有高死亡率的常見疾病。識別和根除腫瘤性息肉是降低結(jié)腸直腸死亡率和發(fā)病率的最重要的措施之一。利用常規(guī)結(jié)腸鏡技術(shù)區(qū)分具有很低或沒有惡性轉(zhuǎn)化風(fēng)險的增生性息肉和具有顯著惡性潛伏期的腺瘤仍然屬于臨床挑戰(zhàn)。

每年估計有超過120萬個新的癌癥病例和608,700例死亡，CRC是當(dāng)今世界中的重要問題。對可治愈階段的早期癌癥息肉(即腺瘤)的早期識別結(jié)合適當(dāng)?shù)闹委煾深A(yù)，如息肉切除術(shù)或內(nèi)窺鏡粘膜切除(EMR)仍然是減少結(jié)腸直腸死亡率和發(fā)病率的最重要的措施。現(xiàn)有的結(jié)腸鏡方法受到許多基本的臨床限制。這是因為常規(guī)結(jié)腸鏡檢查完全依賴于息肉的總體粘膜特征的可視性，如腺管開口，血管模式等，并且很少或沒有提供關(guān)于組織的生物分子信息。因此，目前的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)建議切除所有可疑的息肉樣病變或在結(jié)腸直腸檢查中發(fā)現(xiàn)的異常生長。這種方法工作強(qiáng)度很大，導(dǎo)致了高成本組織病理評估，并且給患者帶來不必要的風(fēng)險，因為所有息肉樣病變中的三分之一到二分之一都會變成增生。雖然息肉切除的絕對風(fēng)險被認(rèn)為相對較小，但它仍然是并發(fā)癥最常見的誘因，如結(jié)腸鏡檢查期間的出血，穿孔等?？紤]到現(xiàn)有的臨床挑戰(zhàn)和最近引入的廣泛傳播的基于結(jié)腸直腸群體的篩查計劃，對先進(jìn)的內(nèi)窺鏡檢查方法的需求變得前所未有的迫切。因此，最近的研究已經(jīng)開始針對更精密的分子成像和光譜技術(shù)的開發(fā)，以改進(jìn)體內(nèi)診斷和分析。

證據(jù)表明，將離體拉曼光譜應(yīng)用到結(jié)腸組織標(biāo)本可為區(qū)分不同病理類型(即正常，增生性息肉，腺瘤和腺癌)提供令人鼓舞的準(zhǔn)確率，準(zhǔn)確范圍為89％至99％。這仍需要去除息肉以便拉曼光譜識別該病理類型的性質(zhì)，并因此具有與上述常規(guī)內(nèi)窺鏡技術(shù)同樣的問題。此外，將拉曼光譜應(yīng)用到體內(nèi)臨床診斷存在許多障礙。這包括技術(shù)上的限制，例如固有的弱組織拉曼散射、較長的采集時間(>5s)和開發(fā)具有低熔融石英干擾、高收集效率和深度分辨力的長的(>1.9μm)小型化光纖探針設(shè)計的基本需求。該探針需要用低熔融石英制造，因為熔融石英具有較強(qiáng)的拉曼信號和熒光本底，這將干擾弱組織拉曼信號。迄今為止，這些技術(shù)限制仍然沒有被解決。

最近的技術(shù)進(jìn)步，包括快速拉曼光譜技術(shù)的發(fā)展和具有共焦能力的小型化光纖拉曼探針使得可在進(jìn)行中的內(nèi)窺鏡檢查期間，實現(xiàn)體內(nèi)實時組織病理評估(即光學(xué)活檢)。結(jié)腸直腸息肉的拉曼光譜研究易于受所謂的指紋(FP)光譜范圍(例如，800-1800cm^-1)的局限。使用高波數(shù)(HW)區(qū)域(例如，2800-3600cm^-1)已經(jīng)引起了一些注意，這是因為該光譜范圍表現(xiàn)出更強(qiáng)的組織拉曼信號以及來自光纖拉曼探針的石英本底的更少的干擾。然而，目前能夠識別體內(nèi)癌細(xì)胞的技術(shù)還不具有足夠的精確性以使這種類型的技術(shù)成為可行選擇。需要一種能夠在體內(nèi)和離體以更高的精度識別癌細(xì)胞的拉曼光譜技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)本申請的實施例的目的在于克服與用于表征、識別和/或診斷如異常生長的組織的類型和/或性質(zhì)的現(xiàn)有技術(shù)和當(dāng)前內(nèi)窺鏡技術(shù)相關(guān)聯(lián)的至少一些問題，異常組織如原發(fā)在身體的任何部分中的癌癥等。另一個目的是提供基于拉曼光譜的加強(qiáng)精確度的系統(tǒng)和方法，用于快速表征、識別和/或診斷異常組織的類型或性質(zhì)，例如在內(nèi)窺鏡檢查(例如胃腸內(nèi)窺鏡檢查，如結(jié)腸鏡檢查)期間的體內(nèi)息肉和癌前期。

根據(jù)本申請的各種實施例描述了光纖拉曼光譜系統(tǒng)和方法，提供了可在生物分子水平上在體內(nèi)實現(xiàn)增強(qiáng)準(zhǔn)確度的光學(xué)活組織檢查的無標(biāo)記的振動光譜技術(shù)。多個實施例能夠在正在進(jìn)行的內(nèi)窺鏡檢查期間實現(xiàn)來自FP和HW光譜范圍的同步測量的組合。對于體內(nèi)和體外拉曼測量，組合FP和HW光譜范圍的理論基礎(chǔ)有多個：

(i)對于可以表現(xiàn)出強(qiáng)烈自體熒光(例如胃、肺、結(jié)腸和肝)的組織，HW范圍仍然可以包含具有診斷信息的強(qiáng)組織拉曼峰，該強(qiáng)烈的自體熒光在FP范圍內(nèi)會覆蓋組織拉曼信號。

(ii)FP和HW范圍含有互補(bǔ)的生物分子信息(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和水的生物分子信息)并且因此可以改善組織表征和診斷。

(iii)不同的鍵在不同的光譜范圍內(nèi)振動，因此使用兩個不同的光譜范圍(FP和HW)增加了單次掃描中獲得的生物分子信息。

根據(jù)本申請的實施例，F(xiàn)P和HW組合光纖共焦拉曼光譜技術(shù)(例如涉及FP和HW光譜的同步采集)可以在身體檢查期間改善癌癥、癌前期和/或體內(nèi)的其他異常生長的實時診斷。該FP和HW組合技術(shù)也可以用于離體組織樣本，以更準(zhǔn)確地識別來自身體任何部位的樣本中存在的異常生長的類型。

根據(jù)本申請一個方面，拉曼光譜裝置包括：第一照射源，其被配置為將照明引導(dǎo)到組織中；拉曼光譜儀，其被配置為通過所述組織散射的照明同步檢測FP和HW拉曼光譜；以及計算機(jī)化控制和分析模塊，其包括至少一個處理單元和存儲器；該存儲器存儲由所述至少一個處理單元執(zhí)行的程序指令，用于分析在FP和HW波長范圍內(nèi)檢測到的拉曼光譜的離散光譜子區(qū)間(例如約3-15或約5-10個離散光譜子區(qū)間，其中給定的或每個光譜子區(qū)間可以具有約10-30cm^-1或約20cm^-1的光譜寬度)，以在一個或兩個波長范圍內(nèi)識別與一個或多個參考標(biāo)記的匹配。

在多個實施例中，拉曼光譜儀具有單個寬帶衍射光柵。第一照射源包括用于產(chǎn)生施加到組織的激發(fā)能的準(zhǔn)直照射源，并且該裝置還包括用于將準(zhǔn)直照明傳輸?shù)浇M織并將檢測到的拉曼光譜從該組織返回到該拉曼光譜儀的探針。

該一個或多個參考標(biāo)記可以包括或者是檢測到的拉曼光譜中特異性峰。計算機(jī)化控制和分析模塊可以包括由至少一個處理單元執(zhí)行的程序指令，用于基于該匹配來診斷異常生長。

該探針可以包括或者是共焦光纖探針。所述裝置還可包括具有細(xì)長軸的內(nèi)窺鏡，所述細(xì)長軸具有在其內(nèi)可傳送探針的器械通道。

計算機(jī)化控制和分析模塊可以包括可由至少一個處理單元執(zhí)行的程序指令，用于動態(tài)地調(diào)整準(zhǔn)直照明的功率，和/或動態(tài)地調(diào)整該組織暴露于準(zhǔn)直照明的時間。

該裝置可以包括校準(zhǔn)裝置，用于相對至少一個校準(zhǔn)基準(zhǔn)來標(biāo)準(zhǔn)化探針或整個拉曼裝置。

該裝置可以包括另一照射源，用于將額外的照明輸出到組織中；以及熱鏡濾光器，用于補(bǔ)償由所述第一照射源輸出的照明和由所述另一照射源輸出的額外的照明之間的照明干擾。

根據(jù)本申請的一個方面，由拉曼光譜裝置執(zhí)行的方法包括：將第一照射源輸出的照明引導(dǎo)到組織中；通過探針同步檢測來自該組織散射的照明的FP和HW拉曼光譜；以及分析在FP和HW波長范圍內(nèi)檢測到的拉曼光譜中的離散光譜子區(qū)間(例如約3-15或約5-10個離散光譜子區(qū)間，其中給定或每個光譜子區(qū)間可具有約10-30cm^-1或約20cm^-1的光譜寬度)，以識別與一個或兩個波長范圍中的一個或多個參考標(biāo)記的匹配。

同步檢測FP和HW拉曼光譜可以包括使用單個寬帶衍射光柵在FP和HW波長范圍內(nèi)衍射照明。

該方法可包括基于該匹配診斷異常生長的性質(zhì)。該一個或多個參考標(biāo)記可以包括或者是檢測到的拉曼光譜中特異性峰。

該方法還可包括動態(tài)地調(diào)整照明的功率，和/或動態(tài)地調(diào)整該組織暴露于該照明的時間。

該方法包括在照明該組織之前，相對至少一個校準(zhǔn)基準(zhǔn)執(zhí)行校準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)化程序，以標(biāo)準(zhǔn)化該探針或整個拉曼裝置。

該方法還包括利用另一照射源將額外的照明指向到組織中；同時利用熱鏡濾光器補(bǔ)償由所述第一照射源輸出的照明和由所述另一照射源輸出的額外的照明之間的照明干擾。

附圖說明

現(xiàn)通過示例參考附圖，以更好地根據(jù)本申請的實施例。該附圖不應(yīng)該被理解為限制性的，并且附圖尺寸不可依比例確定。

圖1為根據(jù)本申請一實施例的用于體內(nèi)組織診斷和表征的共焦拉曼光譜系統(tǒng)的示意圖；

圖2是根據(jù)本申請一實施例的在內(nèi)窺鏡檢查期間為改善或增強(qiáng)組織診斷和表征準(zhǔn)確度而開發(fā)的寬帶光纖共焦拉曼光譜系統(tǒng)的框圖；

圖3是根據(jù)本申請一實施例的從胃腸道(GI)粘膜實時獲得的寬帶FP和HW體內(nèi)拉曼和伴隨自體熒光光譜的曲線圖；

圖4為顯示根據(jù)本申請一實施例的應(yīng)用到包括指紋(FP)和高波數(shù)(HW)區(qū)域的寬帶體內(nèi)拉曼和伴隨自體熒光光譜的區(qū)間選擇的示例的曲線圖；

圖5為顯示根據(jù)本申請一實施例的分別在(a)800-1800cm^-1和(b)2800-3100cm^-1區(qū)域中減除自體熒光本底后應(yīng)用到寬帶體內(nèi)拉曼光譜的區(qū)間選擇的示例的曲線圖；

圖6為顯示根據(jù)本申請一實施例的拉曼光譜加上或減去三個病變的一個標(biāo)準(zhǔn)差的曲線圖，以及該三個病變的相關(guān)照片；

圖7A為根據(jù)本申請一實施例的分辨光譜特征的差光譜的曲線圖；

圖7B為根據(jù)本申請一實施例的在整個光譜范圍上的三個組織類別的方差分析(ANOVA)；

圖7C為根據(jù)本申請一實施例的顯著性拉曼峰值的直方圖；

圖8A-圖8D為根據(jù)已知實踐的對應(yīng)于不同結(jié)腸直腸組織類型的染色組織病理切片；

圖9A為根據(jù)本申請一實施例的后驗概率表示；

圖9B為根據(jù)本申請一實施例的用于診斷腺瘤和腺癌的受試者工作特征(ROC)的曲線圖；

圖10為根據(jù)本申請一實施例的用于區(qū)分腺瘤與良性息肉的受試者工作特征的曲線圖；

圖11A示出了根據(jù)本申請一實施例的用于食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)的診斷算法開發(fā)的平均體內(nèi)FP/HW拉曼光譜加減一個訓(xùn)練數(shù)據(jù)集(總數(shù)據(jù)集的80％)的標(biāo)準(zhǔn)差；

圖11B示出根據(jù)本申請一實施例的分辨EECC唯一光譜特征的差光譜(ESCC-正常)加減一個標(biāo)準(zhǔn)差，以及正常食道和ESCC的WLR引導(dǎo)的FP/HW拉曼程序的對應(yīng)的圖像；

圖12A顯示了根據(jù)本申請一實施例的在整個光譜范圍(即800-1800cm^-1和2800-3600cm^-1)上的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集(總數(shù)據(jù)集的80％)(正常(n＝736)；ESCC(n＝202))的拉曼峰強(qiáng)度的非配對雙側(cè)學(xué)生t-檢驗，其中包含最相關(guān)診斷信息的多個(如七個)拉曼光譜子區(qū)域被識別；

圖12B顯示了根據(jù)本申請一實施例的在診斷中相當(dāng)重要的拉曼峰(*p<1E-10)的直方圖±1SD；

圖13A顯示了與正常淺表角化鱗狀上皮和基底層對應(yīng)的代表性蘇木精和曙紅染色的組織病理切片；

圖13B顯示了與侵襲性食管鱗狀細(xì)胞癌對應(yīng)的代表性蘇木精和伊紅染色的組織病理切片，表現(xiàn)出突出的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞異型；

圖14A-14C顯示了根據(jù)本申請一實施例，分別基于FP、HW和集成或同步FP/HW拉曼技術(shù)利用最小二乘判別分析和留一患者的交叉驗證的屬于訓(xùn)練數(shù)據(jù)集(總數(shù)據(jù)集的80％)的(i)正常食道(n＝736)和(ii)ESCC(n＝202)的體內(nèi)拉曼光譜的后驗概率((○)正常，(▲)ESCC)；

圖15顯示了根據(jù)本申請一實施例，利用FP、HW和集成或同步FP/HW拉曼技術(shù)為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集(總數(shù)據(jù)集的80％)從正常食管組織中分離ESCC的受試者工作特征(ROC)曲線，其中ROC曲線下面積(AUC)分別為0.972,0.928和0.995；

圖16A為顯示了根據(jù)本申請一實施例的從子宮頸患者處測量的NIR-AF和拉曼復(fù)合光譜的曲線圖；

圖16B為顯示了根據(jù)本申請一實施例的在區(qū)間PLS-DA之后提取的選擇光譜區(qū)域的曲線圖；

圖17為顯示了根據(jù)本申請一實施例，作為在整個光譜上的PLS-DA和區(qū)間PLS-DA的模型復(fù)雜度函數(shù)而繪制的分類誤差的曲線圖，其中區(qū)間PLS-DA僅利用整個光譜的10％；

圖18為根據(jù)本申請一實施例的使用(a)整個光譜上PLS-DA建模；以及(b)使用區(qū)間PLS-DA建模得到的屬于癌前期群體的后驗概率(正常(n＝1001)以及癌前期(n＝232))的散點圖，；

圖19為根據(jù)本申請一實施例，在對90位胃癌患者(良性(n＝1950)；癌癥(n＝108))測量得到的連續(xù)拉曼光譜和區(qū)間PLS-DA之后的選擇光譜區(qū)域的曲線圖；

圖20為顯示根據(jù)本申請一實施例中，作為在整個光譜上的PLS-DA和區(qū)間PLS的模型復(fù)雜度函數(shù)而繪制的分類誤差的曲線圖；

圖21為根據(jù)本申請一實施例，使用(a)整個FP和HW光譜上的PLS以及(b)區(qū)間PLS-DA建模得到的屬于癌前期群體的后驗概率(正常(n＝1950)以及癌(n＝108))的散點圖；

圖22A顯示了根據(jù)本申請一實施例，在臨床內(nèi)窺鏡檢查期間從63名患者處獲得的胃IM(n＝329)和正常粘膜(n＝1083)的平均FP和HW體內(nèi)拉曼光譜加減一個標(biāo)準(zhǔn)差；

圖22B顯示了根據(jù)本申請一實施例的用于分辨正常和IM胃組織之間的獨(dú)特光譜特征的差光譜(即IM-正常加減一個標(biāo)準(zhǔn)差(SD))；

圖23A和23B顯示了胃組織的蘇木精和曙紅(H&E)-染色的切片的顯微照片：A、正常胃粘膜(200倍放大)；B、大量的腸上皮化生(100倍放大)；

圖24顯示了根據(jù)本申請一實施例，從胃組織的FP和HW集成拉曼光譜中計算得到的占據(jù)總方差的約88％的前五個主要成分(PC)(PC1＝45.6％；PC2＝33.6％；PC3＝4.2％；PC4＝3.1％；PC5＝1.2％)；

圖25A，25B和25C分別顯示了根據(jù)本申請一實施例，使用PCA-LDA結(jié)合留一組織交叉驗證法通過(A)FP，(B)HW和(C)FP和HW集成拉曼技術(shù)計算得到的正常和IM胃組織類別的后驗概率值的散點圖，其中，通過使用FP、HW和FP/HW集成拉曼技術(shù)分離IM與正常胃組織((○)正常；(▲)IM)，虛線(0.5)分別提供了96.3％(26/27)、77.8％(21/27)和92.6％(25/27)的診斷敏感性，以及87.5％(77/88)、78.4％(69/88)和90.9％(80/88)的特異度；

圖26示出了根據(jù)本申請一實施例，F(xiàn)P/HW集成、FP和HW拉曼分別結(jié)合PCA-LDA算法和留一組織交叉驗證技術(shù)的用于區(qū)分IM與正常胃組織的分類結(jié)果的受試者工作特性(ROC)曲線，其中對于FP/HW集成拉曼、FP拉曼和HW拉曼技術(shù)，ROC曲線下的積分面積分別為0.96,0.94和0.79；

圖27是根據(jù)本申請一實施例，應(yīng)用于從口腔測量的拉曼光譜的區(qū)間PLS-DA的示例，其中結(jié)構(gòu)間大變異性的區(qū)域(例如956cm^-1的羥基磷灰石，1302cm^-1和1445cm^-1的脂質(zhì))通過變量選擇技術(shù)被舍棄；

圖28是根據(jù)本申請一實施例，當(dāng)使用離散頻譜區(qū)間時處理拉曼光譜以用于預(yù)測的方法的流程圖；

圖29A和29B顯示了根據(jù)本申請一實施例，在氙光源的前面(a)不存在熱鏡；(b)與熱鏡整合以非接觸模式獲得的體內(nèi)拉曼光譜的曲線圖；

圖30A和30B顯示了根據(jù)本申請一實施例，在氙光源的前面(a)不存在熱鏡；(b)與熱鏡整合以接觸模式獲得的體內(nèi)拉曼光譜的曲線圖；

圖31是根據(jù)本申請一實施例的對生物醫(yī)學(xué)中的光纖拉曼光譜的任何應(yīng)用的照明光濾波的一般化系統(tǒng)的框圖；

圖32是根據(jù)本申請一實施例的校準(zhǔn)方法的流程圖；

圖33是根據(jù)本申請一實施例的用于在患者使用之前測試和校準(zhǔn)光纖拉曼內(nèi)窺鏡技術(shù)的校準(zhǔn)裝置的框圖；

圖34是根據(jù)本申請一實施例的在患者使用之前的拉曼內(nèi)窺鏡的測試程序圖；

圖35是根據(jù)本申請一實施例的使用兩個不同的光纖探針獲取的本底光譜的示例曲線圖；

圖36為示出了根據(jù)本申請一實施例的使用標(biāo)準(zhǔn)鎢燈在校準(zhǔn)裝置中校準(zhǔn)熒光標(biāo)準(zhǔn)玻璃容器的技術(shù)或方法的框圖；

圖37為示出了根據(jù)本申請一實施例的兩個不同光纖探針的校準(zhǔn)函數(shù)的示例的曲線圖；

圖38為示出了根據(jù)本申請一實施例的測量具有明確定義的拉曼峰值(例如聚苯乙烯)的材料的示例的曲線圖；

圖39為示出了根據(jù)本申請一實施例的測量波數(shù)-像素數(shù)的多項式映射的示例的曲線圖；

圖40A是顯示根據(jù)本申請一實施例，使用兩種不同的拉曼探針從兩層組織模型(即聚苯乙烯和聚乙烯)獲得的拉曼光譜的比較曲線圖；

圖40B是顯示根據(jù)本申請一實施例，組織模型中的頂層和底層的代表性拉曼光譜的曲線圖；

圖41是根據(jù)本申請一實施例的通過自動調(diào)整激光激發(fā)功率和累積來改善S/N比并防止CCD飽和的技術(shù)或方法的框圖；

圖42是根據(jù)本申請一實施例的通過自動調(diào)整曝光時間和累積來改善S/N比并防止CCD飽和的技術(shù)或方法的框圖；以及

圖43是示出根據(jù)本申請一實施例的存儲用于不同探針和不同器官的診斷模型的代表性數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)的框圖。

具體實施方式

拉曼光譜表示基于非彈性光散射基本原理的獨(dú)特的光學(xué)振動技術(shù)。當(dāng)入射激光誘導(dǎo)分子中的偏振變化時，小比例的入射光子(10⁸中占1個)被非彈性散射并具有頻率偏移，該頻率偏移對應(yīng)于樣品中分子的特異性拉曼活性振動模式。不同的分子和不同的鍵以不同的頻率振動。因此，拉曼光譜能夠從大量的細(xì)胞間和/或細(xì)胞內(nèi)組分中收獲豐富的特異性生物分子信息，組分如組織中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和脫氧核糖核酸(DNA)、水等。

圖1示出了根據(jù)本申請一實施例的光纖共焦拉曼光譜系統(tǒng)或裝置，或光纖共焦拉曼光譜儀100。系統(tǒng)100能夠同時在指紋(FP)光譜范圍和高波數(shù)(HW)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行拉曼光譜測量。根據(jù)本申請實施例，獲取和分析FP和HW組合光譜范圍測量能夠增強(qiáng)生物分子信息的體內(nèi)和離體分析的準(zhǔn)確性，例如用于表征、識別和/或診斷胃腸道組織。

該光纖共焦拉曼光譜儀100包括如近紅外(NIR)二極管激光器102的準(zhǔn)直照射源、高通量反射成像光譜儀104、NIR優(yōu)化的電荷耦合器件(CCD)照相機(jī)106以及可通過光纖110光學(xué)連接到激光器102和光譜儀104的探針108。該探針108可以由內(nèi)窺鏡的細(xì)長軸105傳送(例如在由細(xì)長軸105的器械通道內(nèi))。該光纖拉曼光譜儀100還可以包括用于對激光照明進(jìn)行本底抑制的帶通濾波器112，以及用于使組織拉曼信號通過同時消除散射激光和光纖本底干擾的長通濾波器114。計算機(jī)或微控制器系統(tǒng)124可以提供用于控制拉曼光譜儀操作和執(zhí)行拉曼光譜分析方面的自動化/計算機(jī)化控制和分析模塊。

在一代表性實施例中，該近紅外二極管激光器102可具有300mW的最大輸出功率和785nm的波長，其可與例如由B&W泰克公司生產(chǎn)的器件一致。NIR激光器102在探針108的尖端116處產(chǎn)生激發(fā)能，該尖端116可以在由探針108“照明”的任何標(biāo)本中引起振動，從而產(chǎn)生拉曼光譜?？梢允褂闷渌愋偷臏?zhǔn)直照明來替代該二極管激光器102。光譜儀104可以配備有熱電冷卻，例如可冷卻到約-70℃。光譜儀104可以與例如由普林斯頓儀器公司生產(chǎn)的型號為Acton LS785 f/2的設(shè)備一致。照相機(jī)106可以與由普林斯頓儀器公司生產(chǎn)的Pixies 400BR eXcelon一致。在該代表性實施例中，該光譜儀100可以在400-3600cm^-1的光譜范圍內(nèi)獲得分辨率約為11cm^-1的體內(nèi)拉曼光譜。所示器件作為代表性示例，并且不作為限制性目的。

汞-氬光譜校準(zhǔn)燈的原子發(fā)射線可用于波長校準(zhǔn)。該燈可以與由位于弗羅里達(dá)頓尼丁的海洋光學(xué)生產(chǎn)的HG-1和AR-1相同。由于系統(tǒng)的波長依賴性，通過使用鎢校準(zhǔn)燈，例如由位于加利福尼亞圣地亞哥的EG&G咖瑪科技生產(chǎn)的RS-10，所有波長校準(zhǔn)光譜均被校正。

在一些實施例中，為了測量FP和HW光譜，可以通過連續(xù)切換不同的激光激發(fā)頻率，或者通過使用雙透射光柵來覆蓋整個光譜范圍，即以高分辨率(即，-150～1950cm^-1；1750～3600cm^-1)來測量組織拉曼信號，如國際專利申請PCT/SG2014/000063中所公開的。

圖2示出了在本文詳細(xì)描述的另一實施例，即利用單個反射光柵同步測量FP和HW光譜的寬帶光纖共焦拉曼系統(tǒng)或裝置(例如400-3600cm^-1)200，該系統(tǒng)和裝置在一定程度上提高了組織表征和診斷的準(zhǔn)確性，例如在內(nèi)窺鏡可及的器官和身體部位中。

該系統(tǒng)200包括近紅外(NIR)二極管激光器202(λex＝785nm)、配置有熱電冷卻的高通量反射光譜儀204、NIR優(yōu)化電荷耦合器件(CCD)照相機(jī)206和特別設(shè)計的1.8mm(外徑)光纖共焦拉曼探針208。該系統(tǒng)200還包括用于提供自動化/計算機(jī)化控制和分析模塊的計算機(jī)/微控制器系統(tǒng)124，以控制拉曼光譜儀操作并且執(zhí)行拉曼光譜分析的各方面。更具體地，根據(jù)本申請一實施例，該計算機(jī)/微控制器系統(tǒng)124可包括一個或多個處理單元，用于執(zhí)行存儲器駐留程序指令，以執(zhí)行特定拉曼光譜獲取和分析操作、程序或流程。

將定制的鍍金寬帶反射光柵(如830g/mm，在約800nm處具有>90％的衍射率)結(jié)合或集成到該光纖共焦拉曼系統(tǒng)200中，以覆蓋整個光譜范圍(即400-3600cm^-1)，光譜分辨率約為11cm^-1。該光纖共焦拉曼內(nèi)窺鏡探針208用于激光輸送和體內(nèi)組織拉曼信號收集。該共焦拉曼內(nèi)窺鏡探針208先前已經(jīng)在國際專利申請PCT/SG2014/000063有所描述，并且包括圍繞中心光傳輸光纖(直徑為200μm，NA＝0.22)的多個200μm的濾光器涂覆的斜切光纖集合(NA＝0.22)。將微型1.0mm藍(lán)寶石球透鏡(NA＝1.78)耦合到該共焦探針208的光纖尖端，以將激發(fā)光緊緊地聚焦到組織上，使得能夠從上皮層(組織深度<200μm)收集有效的拉曼光譜。根據(jù)本申請一實施例，該光纖共焦拉曼探針208可以插入到醫(yī)療內(nèi)窺鏡的器械通道中并且與上皮輕輕接觸，以使用寬帶共焦拉曼內(nèi)窺鏡技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)組織表征和診斷。

圖3顯示了從胃腸粘膜測量的寬帶FP和HW拉曼和伴隨自體熒光光譜的示例，其覆蓋了FP和HW區(qū)域。在FP范圍內(nèi)的伴隨自體熒光的頂部觀察到高分辨率的組織拉曼峰，以及FP范圍內(nèi)的試驗性分子分配如下：

·853cm^-1，其涉及v(C-C)蛋白質(zhì)，

·1004cm^-1，其涉及苯丙氨酸的v_s(C-C)環(huán)呼吸，

·1078cm^-1，其涉及脂質(zhì)的v(C-C)，

·1265cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺III v(C-N)和δ(N-H)，

·1302cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的CH₃CH₂扭曲和擺動，

·1445cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的δ(CH₂)變形，

·1655cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺I v(C＝O)，以及

·1745cm^-1，其涉及脂質(zhì)的v(C＝O)。

在HW區(qū)域中也可以看到強(qiáng)烈的拉曼峰，例如：

·2850和2885cm^-1，其涉及脂質(zhì)的對稱和非對稱CH₂拉伸，

·2940cm^-1涉及蛋白質(zhì)的CH₃拉伸，

·在3100至3600cm^-1區(qū)域中的3400cm^-1，其涉及水OH拉伸振動的寬拉曼帶。

根據(jù)本申請一實施例的寬帶技術(shù)允許FP或HW范圍，或FP和HW光譜區(qū)域同時用于組織分析、識別、表征和/或診斷，并且對于內(nèi)窺鏡可檢測到的表現(xiàn)出強(qiáng)烈的自體熒光的器官特別有用，可迅速飽和CCD。該計算機(jī)/微控制器系統(tǒng)124可以用于選擇性地將FP光譜區(qū)域、HW光譜區(qū)域，或者FP和HW區(qū)域均用于組織分析、識別、表征和/或診斷，例如該選擇響應(yīng)于用戶在圖形用戶界面上的直接輸入。

一實施例包括如果FP區(qū)域超過CCD的動態(tài)范圍，則使用HW光譜區(qū)域進(jìn)行診斷。在另一個實施例中，F(xiàn)P和HW光譜區(qū)域均用于組織表征、識別和/或診斷。寬帶光纖共焦拉曼內(nèi)窺鏡平臺允許根據(jù)測量的CCD飽和水平和/或組織類型，在不同光譜區(qū)域(如HW、FP、或同時FP和HW)之間切換。

根據(jù)本申請一實施例的組織表征、識別或診斷技術(shù)或方法利用來自寬帶FP和HW光譜的互補(bǔ)診斷信息。一般來說，組織生物醫(yī)學(xué)光譜極其復(fù)雜。將不同組織類型之間的拉曼光譜的細(xì)微分子差異轉(zhuǎn)換成有價值的診斷信息需要復(fù)雜的多變量統(tǒng)計分析技術(shù)，例如主成分分析法(PCA)。這已經(jīng)通過利用整個(即連續(xù)的)拉曼光譜分別在FP或HW區(qū)域上進(jìn)行組織診斷和表征而得到廣泛實踐。

PCA通過將拉曼光譜分解成正交分量，例如主分量(PC)的線性組合來減小拉曼光譜的維數(shù)，使得數(shù)據(jù)集中的光譜變化最大化。因此，PCA通常與有效的聚類算法集成，例如支持向量機(jī)(SVM)、邏輯回歸(LR)和線性判別分析(LDA)，用于生物醫(yī)學(xué)拉曼光譜的分類。PCA對于數(shù)據(jù)簡化和分析非常有效。

替換性地，偏最小二乘(PLS)-差分分析(DA)已經(jīng)開始應(yīng)用于通過對0和1的類成員關(guān)系進(jìn)行編碼，并以適當(dāng)?shù)腨指示符矩陣表示群體的親和性來對問題分類。PLS-DA采用PCA的基本原理，但還通過最大化光譜變化和群體的親和性之間的協(xié)方差來旋轉(zhuǎn)諸如潛變量(LVs)的分量，使得LV解釋了與診斷相關(guān)的變化而非在光譜數(shù)據(jù)集中的最顯著變量。在大多數(shù)情況下，這確保了診斷上顯著的光譜變化被保留在前幾個LVs中。

大多數(shù)多變量算法(例如PCA或PLS-DA)最初設(shè)計目的并非為了處理大量的不相關(guān)光譜變量。換句話說，拉曼光譜中的一些光譜區(qū)域可能對診斷模型具有弱化效應(yīng)，例如歸因于大方差、干擾、結(jié)構(gòu)間變異性等。

在一個實施例中，提供了一種利用來自FP和HW頻譜范圍的互補(bǔ)信息的新的診斷技術(shù)或程序，該互補(bǔ)信息例如通過使用寬帶光纖共焦拉曼光譜系統(tǒng)200對FP和HW光譜進(jìn)行測量而獲得。本實施例利用寬帶FP和HW拉曼光譜中的離散光譜子區(qū)間(例如大約3-15或大約5-10個離散光譜子區(qū)間，其中給定的或每個光譜子區(qū)間可具有大約10-30cm^-1或大約20cm^-1的光譜寬度)用于診斷，而非連續(xù)光譜范圍。圖4示出了胃腸道的寬帶拉曼測量的示例，其中互補(bǔ)信息已經(jīng)從FP，即800-1800cm^-1和HW，即2800-3600cm^-1光譜范圍中提取。圖5A-5B顯示了分別在FP和HW范圍中的5階多項式減法之后的相同的拉曼光譜，更清楚地顯示了特異性拉曼峰。根據(jù)本公開的實施例，使用來自FP和HW區(qū)的光譜子區(qū)間被發(fā)現(xiàn)可顯著改善或提高體內(nèi)拉曼內(nèi)窺鏡診斷異常生長的準(zhǔn)確度，如癌前期和癌癥，這將在下文作進(jìn)一步描述。

根據(jù)本申請的一個實施例涉及胃腸道異常生長，例如結(jié)腸直腸異常生長的診斷。從體內(nèi)結(jié)腸直腸組織測得的原始FP和HW拉曼光譜體現(xiàn)了弱組織拉曼信號、強(qiáng)自體熒光本底和噪聲的組合。為了觀察和分析拉曼信號，必須處理或去除本底和噪聲。因此，通過一階平滑濾波器預(yù)處理原始光譜，以減少光譜噪聲，例如具有3像素窗口寬度的S-G濾波器(Savitzky-Golay filter)。在FP區(qū)域(800-1800cm^-1)中，發(fā)現(xiàn)第五階多項式對于擬合經(jīng)過噪聲平滑的光譜中的自體熒光本底是最佳的，然后從校正的FP光譜中減去該多項式以生成單獨(dú)的組織拉曼光譜。在HW范圍(2800-3600cm^-1)中，發(fā)現(xiàn)一階線性擬合對于去除弱自體熒光基線是最佳的。每個接收到的信號的這種預(yù)處理在大約30ms內(nèi)完成，因此被處理的拉曼光譜和診斷結(jié)果可以實時顯示在諸如計算機(jī)屏幕的顯示設(shè)備上。

在預(yù)處理之后，分析拉曼光譜以確定峰和/或標(biāo)記。然后使用這些峰或標(biāo)記來估計、表征或確定導(dǎo)出光譜的組織的性質(zhì)(病變的性質(zhì)或異常生長)。這可以通過計算機(jī)系統(tǒng)使用與已知控制光譜、參考標(biāo)記等的比較的適當(dāng)手段來完成。本文使用的術(shù)語“參考標(biāo)記”旨在包括拉曼光譜中的一個或多個單獨(dú)的峰，或?qū)嶋H上整個拉曼光譜。如果一個或多個拉曼參考標(biāo)記指示異常細(xì)胞生長的某性質(zhì)，則可以使用查找表等對獲得的光譜和參考標(biāo)記作比較。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用許多不同類型的比較技術(shù)或方法。一旦已經(jīng)進(jìn)行比較并且已經(jīng)確定了最佳匹配，則可以通過任何適當(dāng)?shù)氖侄蜗蛳到y(tǒng)200的用戶指示存在的異常細(xì)胞生長的類型。這可以包括計算機(jī)屏幕上的視覺表示和/或可聽消息。

在系統(tǒng)200一實施例的試驗中，對共計50位連續(xù)癥狀患者進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查。已經(jīng)對患者進(jìn)行檢查用于監(jiān)控或篩查如貧血，出血等的各種結(jié)腸直腸適應(yīng)癥。在結(jié)腸鏡檢查之前，對患者施用聚乙二醇(PEG)電解質(zhì)腸道制備物。使用靜脈內(nèi)施用異丙酚進(jìn)行鎮(zhèn)靜。內(nèi)窺鏡醫(yī)師在檢查期間和共聚焦拉曼掃描之前清潔結(jié)腸，用生理鹽水溶液進(jìn)一步?jīng)_洗多息肉和扁平結(jié)腸直腸病變，以進(jìn)一步減少混雜因素(即殘留的糞便和流體等)。在一般檢查期間，將內(nèi)窺鏡導(dǎo)向結(jié)腸遠(yuǎn)端，并在從體內(nèi)撤回探針期間對可疑病變進(jìn)行拉曼掃描(n～15光譜)。在約0.1至0.5秒的時間段內(nèi)獲取每個組織拉曼測量。這允許對結(jié)腸直腸息肉作快速調(diào)查。使用與霍特林(Hotelling)的T²和Q-殘留統(tǒng)計相關(guān)聯(lián)的主成分分析法(PCA)，在線臨床軟件自動舍棄在與結(jié)腸息肉(約10％)非接觸獲得的任何拉曼光譜。該P(yáng)CA方法為在先的國際專利申請PCT/SG2014/000063的主題，其工作如下：

·基于主成分(PCA)以及霍特林的T²和Q-殘留統(tǒng)計引入一種新的異常值檢測方案，作為在線框架中的高級特異性模型反饋工具?；籼亓值腡²和Q-殘留統(tǒng)計是提供模型擬合內(nèi)外信息的兩個獨(dú)立參數(shù)。

·使用霍特林的T²和Q-殘留參數(shù)作為控制所獲取的光譜質(zhì)量(即探針-組織接觸模式、探針處理變化、白光干擾、藍(lán)光干擾、混雜因素等)的指標(biāo)，聽覺反饋已被集成到在線拉曼診斷系統(tǒng)，便于實時光譜篩選并為臨床醫(yī)生提供探針處理建議。

·如果驗證光譜以作進(jìn)一步分析，則該光譜被饋送到概率模型，用于體內(nèi)癌癥診斷。軟件可基于大量患者的光譜數(shù)據(jù)庫，在不同的預(yù)渲染的多變量統(tǒng)計模型之間即時切換，包括偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、PCA線性判別分析(LDA)、蟻群優(yōu)化(ACO)-LDA、分類和回歸樹(CART)、支持向量機(jī)(SVM)、自適應(yīng)增強(qiáng)(AdaBoost)等。

拉曼掃描完成并保存結(jié)果后，取出每個組織樣本；將該樣本置于福爾馬林中、切開、用蘇木精和曙紅(H&E)染色，并用于組織病理學(xué)檢查。結(jié)腸直腸組織臨床上可分為以下三個重要的類別：

(i)良性(正常和增生性息肉)

(ii)低級別和高級別的腺瘤(管狀、管狀絨毛狀、絨毛狀)

(iii)腺癌。

將根據(jù)本申請的實施例的FP和HW同步光纖共焦拉曼技術(shù)與組織病理學(xué)評估進(jìn)行比較，以確定在體內(nèi)區(qū)分腫瘤性和非腫瘤性結(jié)腸直腸病變的能力。

該比較包括使用該結(jié)果的統(tǒng)計分析，以驗證FP和HW同步光纖共焦拉曼光譜技術(shù)是否足夠精確以替代當(dāng)前使用的技術(shù)。計算科恩統(tǒng)計以評估組織病理學(xué)表征的一致性。使用費(fèi)舍爾事后(post hoc)最小顯著差異(LSD)測試的方差分析(ANOVA)來測試群體之間平均值的差異。多變量統(tǒng)計分析用于為臨床診斷提取顯著拉曼光譜特征。概率偏最小二乘法(PLS)判別分析(DA)應(yīng)用于組織診斷。使用“留一患者”交叉驗證來評估和優(yōu)化PLS-DA模型復(fù)雜性，以降低過擬合的風(fēng)險。生成受試者工作特征(ROC)曲線并計算曲線下面積(AUC)，以評價FP和HW光纖共焦拉曼光譜技術(shù)在體內(nèi)區(qū)分腫瘤性和非腫瘤性息肉的能力。

在一僅作為示例呈現(xiàn)的實驗中，為了顯示將本申請一實施例應(yīng)用于一具體群體的測試對象或患者的結(jié)果，平均年齡為52歲(23-83)的50名患者(27名男性和23名女性)接受了光纖共焦拉曼檢查。十三名患者表現(xiàn)有腺瘤(11位管狀腺瘤和兩位絨毛管狀腺瘤)伴有低度異型增生。三位患者患有晚期結(jié)直腸腺癌?？贫鞯腒appa值為0.89表示該三個組織群體的病理發(fā)現(xiàn)之間具有高水平的一致性。從126個病變或異常生長中成功地獲取到共計1731個體內(nèi)結(jié)腸直腸拉曼光譜。在這些病變中，1397位是良性的，235位是腺瘤，99位是腺癌。這在組織病理組織學(xué)檢查中得到證實。表1總結(jié)了患者和病變的詳細(xì)分布，病變包括病理亞型和解剖學(xué)方位，如升、橫、降乙狀結(jié)腸、直腸。

圖6顯示了測量良性，腺瘤和腺癌異常生長得到的體內(nèi)拉曼光譜平均值±一個標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)(陰影淺灰色)。具有試驗性分布的顯著組織拉曼峰可以在FP范圍內(nèi)下列位置周圍觀察到：

·853cm^-1，其涉及v(C-C)蛋白質(zhì)，

·1004cm^-1，其涉及苯丙氨酸的v_s(C-C)環(huán)呼吸，

·1078cm^-1，其涉及脂質(zhì)的v(C-C)，

·1265cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺III v(C-N)和δ(N-H)，

·1302cm^-1，其涉及脂質(zhì)的CH₂扭曲和擺動，

·1445cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的δ(CH₂)變形，

·1618cm^-1，其涉及卟啉的v(C＝C)，

·1655cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺I v(C＝O)，以及

·1745cm^-1，其涉及脂質(zhì)的v(C＝O)。

在HW區(qū)域中也可以看到強(qiáng)烈的拉曼峰，例如：

·2850和2885cm^-1，其分別涉及脂質(zhì)的對稱和非對稱CH₂拉伸，

·2940cm^-1涉及蛋白質(zhì)的CH₃拉伸，

·3009cm^-1涉及蛋白質(zhì)的對稱＝CH₃拉伸，

·約3300cm^-1涉及酰胺A(蛋白質(zhì)的NH拉伸)，以及

·在約3200至約3400cm^-1，涉及OH拉伸振動的水的寬拉曼帶，該振動直接涉及組織的細(xì)胞和細(xì)胞外空間中的局部構(gòu)型和交互。

圖7A顯示了良性腺瘤、良性腺癌和腺瘤-腺癌的差光譜±1SD(陰影淺灰色)，該光譜分辨了不同的結(jié)腸直腸病變中的特征性光譜特征，例如峰強(qiáng)度、位移和譜帶增寬等。

圖7B示出了在整個光譜范圍(每個拉曼光譜范圍為800-1800cm^-1至2800-3600cm^-1，具有779個強(qiáng)度)中的每個拉曼強(qiáng)度的計算得到的p-值(ANOVA)的對數(shù)圖。

圖7C顯示了來自FP和HW范圍內(nèi)(i)1078cm^-1(ii)1265cm^-1(iii)1335cm^-1(iv)1431cm^-1(v)1618cm^-1(vi)2885cm^-1和(vii)3200cm^-1附近的最具診斷意義的拉曼峰強(qiáng)度(平均±1SD)的直方圖。

體內(nèi)拉曼光譜與不同病理類別的代表性組織病理切片相關(guān)聯(lián)。圖8A顯示了在具有輕度淋巴漿細(xì)胞浸潤的正常腸型粘膜中廣泛存在的杯狀細(xì)胞。圖8B顯示了在杯狀型增生性息肉中具有星形腺體的息肉狀特征。圖8C顯示了具有低度異型增長的管狀腺瘤，表現(xiàn)出具有高色度核的擁擠細(xì)胞。圖8D顯示了具有顯著細(xì)胞和結(jié)構(gòu)異常的侵襲性腺癌。圖8A-D中的組織病理學(xué)特征揭示了不同病變類型的細(xì)胞和形態(tài)特征，而FP和HW光纖共焦拉曼光譜技術(shù)揭示了與圖7A-C所示的結(jié)腸直腸癌相關(guān)的上皮中的發(fā)生的生物分子變化。

通過使用來自FP和HW光譜范圍的互補(bǔ)生物分子信息，使用于體內(nèi)診斷的光纖拉曼光譜得到應(yīng)用。圖9A顯示了使用根據(jù)本申請一實施例的FP和HW光纖共焦拉曼光譜技術(shù)，并使用來自分別屬于(i)良性(n＝1397)、(ii)腺瘤(n＝235)和(iii)腺癌(n＝99)的50位結(jié)腸直腸癌患者的三分概率PLS-DA生成的后驗概率。通過形成如圖9B所示的ROC曲線確定靈敏度和特異性之間的關(guān)系。曲線下面積(AUC)分別為0.930和0.978，用于分別區(qū)別腺瘤和良性息肉，以及腺癌和腺瘤與良性息肉。ROC分析顯示，腺瘤可以與良性息肉樣病變和平坦型病變區(qū)分，靈敏度為88.5％(208/235)；特異性為80.0％(1118/1397)?；诠庾V檢測腺癌靈敏度為92.9％(92/99)，特異性為96.51％(1575/1632)。如圖10所示，執(zhí)行另一ROC分析，以檢查來自FP和HW區(qū)域的生物分子信息用于診斷時是否互補(bǔ)。基于FP范圍(即800-1800cm^-1)和基于HW范圍(即2800-3600cm^-1)的AUC分別為0.895和0.908。另一方面，通過使用來自FP和HW范圍的互補(bǔ)信息，魯棒性顯著改善，得到的AUC為0.930。根據(jù)這些令人鼓舞的體內(nèi)結(jié)果，獨(dú)特的FP和HW光纖共焦拉曼光譜技術(shù)呈現(xiàn)出高度有效的光學(xué)形態(tài)，從而可以實時實現(xiàn)體內(nèi)結(jié)直腸腫瘤的客觀診斷。

已知很多人患有小結(jié)腸直腸增生性息肉或扁平息肉樣病變，這大大增加了組織病理學(xué)評估的成本。開發(fā)和采用高級內(nèi)窺鏡模型用于結(jié)腸直腸檢查的最重要的動機(jī)是實現(xiàn)從腺瘤中區(qū)分良性增生性息肉的能力。根據(jù)本申請一實施例首次證明，可以從結(jié)腸直腸息肉測量(例如同步)覆蓋FP和HW光譜范圍的高質(zhì)量體內(nèi)共焦拉曼光譜，并且實時分析該光譜，并且這可以用于提供識別瘤變的改進(jìn)方式，如圖6所示。根據(jù)本申請一實施例的光纖共焦拉曼光譜技術(shù)揭示了伴隨如圖7A-C所示的腫瘤轉(zhuǎn)化的上皮發(fā)生的多個生物化學(xué)和生物分子變化。例如，腫瘤性息肉與顯著降低的拉曼峰強(qiáng)度相關(guān)聯(lián)；1078cm^-1與v(C-C)相關(guān)；1431cm^-1與δ(CH 2)相關(guān)；2850和2885cm^-1分別與對稱和不對稱CH₂拉伸(p<0.001)相關(guān)，其指示脂質(zhì)含量的相對降低。結(jié)果還顯示了顯著上調(diào)蛋白質(zhì)，在1004cm^-1處由靈敏度生物標(biāo)記指示，與苯丙氨酸的νs(C-C)環(huán)呼吸相關(guān)；在1655cm^-1處用譜帶增寬指示，與蛋白質(zhì)的酰胺I v(C＝O)相關(guān)，表明腫瘤上皮中細(xì)胞增殖增加。腫瘤息肉中在1618cm^-1(p<0.001)處顯著的拉曼峰強(qiáng)度也和與抗原發(fā)作和所導(dǎo)致的新血管形成相關(guān)的血紅蛋白質(zhì)含量密切相關(guān)。

上述峰強(qiáng)度涉及分子內(nèi)特定鍵的振動。每種類型的鍵具有不同的峰強(qiáng)度，并且可以與特定鍵相關(guān)聯(lián)的峰強(qiáng)度的識別可以揭示生物分子信息。病變或異常生長包括特定的一個或多個鍵并產(chǎn)生特定的相關(guān)峰強(qiáng)度這一事實可用于區(qū)分不同類型的異常生長。例如，如果良性的異常生長表現(xiàn)出特定的峰強(qiáng)度，則隨后對該峰強(qiáng)度的檢測就可以確定在之后的情況，病變或異常生長也可能是良性的。

根據(jù)本申請的實施例，可以利用峰強(qiáng)度和生物標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)來識別存在的異常生長的類型。這在體內(nèi)和離體均可實現(xiàn)。

在一些結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)腺瘤中的水含量明顯不同。寬反對稱OH拉伸振動在3200cm^-1(p<0.001)的強(qiáng)度的增加表明腫瘤上皮具有增多的結(jié)合水含量，該結(jié)合水含量可部分解釋為水通道蛋白質(zhì)改變了水滲透性，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞水合。結(jié)合水的增加可能與疏水性脂質(zhì)的同時減少相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)的意義可通過計算與脂質(zhì)和結(jié)合水相關(guān)的峰強(qiáng)度比(即I₂₈₈₅/I₃₂₀₀)分析。該峰值比可以獨(dú)自區(qū)分腺瘤和良性息肉，靈敏度為81.3％(191/235)；特異性為80.4％(1132/1397)。因此，息肉中的脂質(zhì)含量和水灌注是原位結(jié)直腸瘤形成的非常有用的生物標(biāo)記。上皮拉曼光譜特征與細(xì)胞和組織生物化學(xué)的直接相關(guān)性因此可以加深對生物分子水平上在體結(jié)腸直腸癌發(fā)生的理解?？梢允褂梅寤驑?biāo)記來診斷存在的異常生長類型。

如圖9A-B所示，通過利用大范圍的互補(bǔ)光學(xué)生物標(biāo)記，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合和未結(jié)合水的構(gòu)象，首次證明了可以在體內(nèi)實現(xiàn)腺瘤的準(zhǔn)確診斷?？梢曰诠庾V將腺瘤與良性息肉樣和平坦型病變區(qū)分開，靈敏度為88.5％(208/235)；特異性為80.0％(1118/1397)。雖然光纖共焦型拉曼探針選擇性地詢問淺上皮層，但它仍然能夠有效區(qū)分腺癌與腺瘤，這表明侵襲性癌細(xì)胞與顯著的生物分子異常相關(guān)。

通過結(jié)果可以清楚地看到FP和HW光纖共焦拉曼結(jié)腸鏡技術(shù)在體內(nèi)檢測和診斷結(jié)直腸瘤形成的有效性。還已經(jīng)證明，通過利用FP和HW光譜范圍可以產(chǎn)生優(yōu)于單獨(dú)使用FP或HW范圍的AUC。這些實質(zhì)性結(jié)果確認(rèn)了FP和HW拉曼光譜技術(shù)可以大大降低誤分類率，并且證實了增加來自FP和HW范圍的互補(bǔ)生物分子信息，以提高體內(nèi)結(jié)腸直腸診斷。例如，HW光譜范圍包含與水的局部構(gòu)象以及CH₂和CH₃拉伸部分相關(guān)的信息，這些都不包含在FP范圍內(nèi)的。FP和HW范圍的組合也可以用于離體診斷目的。

應(yīng)當(dāng)注意，F(xiàn)P和HW組合拉曼光譜技術(shù)通常是優(yōu)選的操作方法，例如通過FP和HW同步光譜測量。然而，使用體內(nèi)FP或HW可產(chǎn)生能夠鑒定不同類型的異常生長的結(jié)果。因此，根據(jù)本申請的實施例可以單獨(dú)使用FP、單獨(dú)使用HW或者使用FP和HW的組合(例如同時地)。

還應(yīng)當(dāng)注意，使用寬帶FP和HW光譜中的離散光譜子區(qū)間(其也可以被稱為預(yù)定值和/或參考標(biāo)記)提供了改進(jìn)的診斷技術(shù)或方法。

在用于增強(qiáng)目標(biāo)組織表征和診斷的精度的設(shè)備中應(yīng)用單個鍍金的寬帶反射光柵(例如用于同時獲得FP和HW光譜)為一個重要發(fā)展，例如在內(nèi)窺鏡手術(shù)期間用于在體內(nèi)以更強(qiáng)的精度實時表征/診斷潛在的異常或異常生長。該單個鍍金的寬帶反射光柵意味著在體內(nèi)測量期間不需要像現(xiàn)有技術(shù)那樣切換衍射光柵。這顯然有很多優(yōu)點。因此，根據(jù)本申請實施例的系統(tǒng)或設(shè)備能夠進(jìn)行所有必要的測量，而不需要任何切換過程。該裝置更緊湊且成本有效，因為其僅具有一個光柵而不是多個光柵。雖然與雙光柵設(shè)計相比，單光柵設(shè)計在光譜分辨率上有點下降，但是這一緊湊系統(tǒng)不會影響或明顯影響診斷目的或結(jié)果，這是因為該緊湊系統(tǒng)的光譜分辨率與組織拉曼光譜帶寬匹配，通常在約10cm^-1的范圍內(nèi)。

光纖共焦拉曼光譜提供了客觀連續(xù)的實時計算機(jī)化診斷，該診斷可直接操作而不需要額外的內(nèi)窺鏡訓(xùn)練或配給造影劑。通過在體內(nèi)實現(xiàn)腸上皮的功能性和生物分子/生物化學(xué)評估，F(xiàn)P和HW纖維光學(xué)共焦拉曼光譜的引入將對胃腸內(nèi)窺鏡實踐，例如結(jié)腸鏡實踐帶來重要影響。這種新的生物分子內(nèi)窺鏡方法使得臨床結(jié)直腸檢查時可客觀和直接地做決策。在結(jié)腸直腸檢查中，光纖共焦拉曼光譜可以有兩個關(guān)鍵作用，如下：

(i)預(yù)防和介入方法，包括鑒定小的高危腺瘤用于立即執(zhí)行息肉切除術(shù)或EMR。事實上顯然具有低風(fēng)險的增生性息肉或扁平可疑病變可以原位留置，從而有效地降低醫(yī)療成本；

(ii)光纖共焦拉曼光譜法也可以用于高度精確地有效確認(rèn)或排除結(jié)腸直腸腺癌的存在。

根據(jù)本申請的實施例揭露了對CRC應(yīng)用內(nèi)窺鏡和腹腔鏡手術(shù)的可能性，從而為胃腸病學(xué)家提供了用于實時評估和定義切緣的客觀工具以及在分子水平上的治療后功效或復(fù)發(fā)的后續(xù)評估。這可以協(xié)助完全腫瘤切除和隨后的邊緣評估，以減少復(fù)發(fā)的風(fēng)險。因此，根據(jù)本申請的實施例的FP和HW光纖共焦拉曼光譜可以用于胃腸內(nèi)窺鏡領(lǐng)域，也可以用于其他身體部位，并通過實現(xiàn)實時體內(nèi)客觀組織評估用于篩選設(shè)置和治療結(jié)腸直腸應(yīng)用中。

另一個臨床實例利用根據(jù)本申請一實施例，在內(nèi)窺鏡檢查期間通過同時獲取來自體內(nèi)食管組織的指紋(FP)(即800-1800cm^-1)和高波數(shù)(HW)(即2800-3600cm^-1)拉曼光譜，實時體內(nèi)診斷食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)。在該組實驗中，從48位接收常規(guī)內(nèi)窺鏡檢查的食管患者處獲得總計1172個高質(zhì)量的體內(nèi)FP/HW組織拉曼光譜(正常(n＝860)；ESCC(n＝312))。體內(nèi)拉曼數(shù)據(jù)集總共分成兩個部分：即總數(shù)據(jù)集的80％用于訓(xùn)練(來自34位食管患者的938個體內(nèi)FP/HW拉曼光譜[正常(n＝736)；ESCC(n＝202)]))；而總數(shù)據(jù)集的其余20％用于預(yù)測測試(來自14名食管患者的234個體內(nèi)FP/HW拉曼光譜[正常(n＝124)；ESCC(n＝110)])。

圖11A顯示了訓(xùn)練數(shù)據(jù)集(總數(shù)據(jù)集的80％)的體內(nèi)拉曼光譜平均值±一個標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)(陰影淺灰色)，用于組織診斷算法開發(fā)。還顯示了WLR引導(dǎo)的FP/HW拉曼程序的對應(yīng)圖像。具有試驗性分布^7-18的顯著食道組織拉曼峰可以在FP范圍內(nèi)被觀察到，即：

·853cm^-1，其涉及v(C-C)蛋白質(zhì)，

·1004cm^-1，其涉及苯丙氨酸的環(huán)呼吸，

·1078cm^-1，其涉及脂質(zhì)的v(C-C)，

·1265cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺III v(C-N)和δ(N-H)，

·1302cm^-1，其涉及脂質(zhì)的CH₂扭曲和擺動，

·1335cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)和核酸的CH₃CH₂扭曲，

·1445cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的δ(CH₂)變形，

·1618cm^-1，其涉及卟啉的v(C＝C)，

·1655cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺I v(C＝O)，以及

·1745cm^-1，其涉及磷脂質(zhì)的v(C＝O)。

在HW區(qū)域^18-24中也可以看到強(qiáng)烈的拉曼峰，例如：

·2850和2885cm^-1，其分別涉及脂質(zhì)的對稱和非對稱CH₂拉伸，

·2940cm^-1涉及蛋白質(zhì)的CH₃拉伸，

·～3300cm^-1涉及酰胺A(蛋白質(zhì)的NH拉伸)，以及

·水的寬拉曼帶(OH拉伸振動峰在約3250cm^-1和約3400cm^-1)，其涉及食管組織的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外空間中的OH鍵的局部構(gòu)象和交互。

圖11B顯示了ESCC和正常食管組織之間的差異拉曼光譜±1SD(陰影面積)，反映了與食道中癌癥進(jìn)展相關(guān)的拉曼活性組分變化。識別到的ESCC和正常組織的拉曼光譜中顯著性差異(p＝1.3E-8，不成對的雙側(cè)學(xué)生的t檢驗)顯示了FP/HW同步拉曼內(nèi)窺鏡檢查用于體內(nèi)診斷食管癌的潛力。

為了闡明具有診斷重要意義的拉曼活性組分，圖12A顯示了在整個光譜范圍(即800-1800cm^-1和2800-3600cm^-1)內(nèi)計算每個拉曼強(qiáng)度得到的p值(不成對的雙側(cè)學(xué)生的t檢驗)的對數(shù)圖。特別地，在ESCC和正常食管之間發(fā)現(xiàn)了下述具有靜態(tài)顯著性差異(p<1E-10)的光譜子區(qū)域：840-940cm^-1、1025-1100cm^-1、1310-1355cm^-1、1585-1690cm^-1和2830-2975cm^-1涉及蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和核酸。在3160-3260cm^-1和3370-3420cm^-1范圍內(nèi)的結(jié)合水中也觀察到顯著的光譜差異。

圖12B顯示FP和HW范圍的統(tǒng)計學(xué)上最不同的拉曼峰強(qiáng)度(平均值±1SD)的直方圖，即(i)853cm^-1，(ii)1078cm^-1，(iii)1335cm^-1，(iv)1618cm^-1，(v)1655cm^-1，(vi)2850cm^-1，(vii)2885cm^-1，(viii)3250cm^-1和(ix)3400cm^-1。如圖13所示，組織病理學(xué)識別ESCC中顯著的細(xì)胞和結(jié)構(gòu)異常，代表不同拉曼活性組分的相對較高或較低FP/HW組織拉曼帶揭露了伴隨著ESCC的轉(zhuǎn)化，食管組織的特異性生物化學(xué)/生物分子的改變。FP/HW拉曼光譜的變化與組織中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA和水含量相關(guān)，再次確認(rèn)了FP/HW同步拉曼光譜在分子水平上檢測ESCC的能力。

利用在FP和HW光譜范圍中識別的互補(bǔ)生物化學(xué)/生物分子信息，對訓(xùn)練數(shù)據(jù)集(總數(shù)據(jù)集的80％)實施PLS-DA和LOPCV，以開發(fā)用于增強(qiáng)體內(nèi)ESCC診斷的穩(wěn)健性診斷模型?？贫鱇appa為0.91證實了食管組織群的高度一致性。圖14分別示出了針對(a)FP，(b)HW和(c)綜合FP/HW的每個拉曼預(yù)測的交叉驗證的PLS-DA后驗概率的散點圖。綜合FP/HW拉曼光譜的診斷準(zhǔn)確率為97.3％[靈敏度97.0％(196/202)；特異性97.4％(717/736)]，優(yōu)于僅使用FP(精度-90.9％；靈敏度-93.6％(189/202)和特異性-90.2％(664/736))或HW(準(zhǔn)確度-85.5％；靈敏度-78.2％(158/202)和特異性-87.5％(644/736))拉曼技術(shù)。如圖15所示，還生成了受試者工作特征(ROC)曲線，ROC曲線下FP、HW和綜合FP/HW技術(shù)的積分面積分別為0.972,0.928和0.995。上述結(jié)果證實與單獨(dú)的FP或HW拉曼技術(shù)相比，F(xiàn)P/HW綜合或同步拉曼技術(shù)為體內(nèi)ESCC檢測提供了最佳診斷性能。

根據(jù)這些理想的診斷結(jié)果，F(xiàn)P/HW同步拉曼光譜和開發(fā)的診斷算法被應(yīng)用于獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集(總數(shù)據(jù)集的20％)的預(yù)測診斷。使用FP/HW集成拉曼光譜可以實現(xiàn)93.2％的預(yù)測準(zhǔn)確度(即靈敏度-92.7％(102/110)和特異性-93.6％(116/124)]，證實了FP/HW集成拉曼光譜相對于FP(預(yù)測精度-91.0％；靈敏度-90.9％(100/110)和特異性-91.9％(113/124))或HW(預(yù)測精度-80.3％；靈敏度-76.4％(84/110)和特異性-83.9％(104/124))拉曼技術(shù)單獨(dú)用于體內(nèi)EECC的優(yōu)點。

在另一個實施例中，考慮識別其他類型的癌癥，例如，使用圖2中的系統(tǒng)200來識別宮頸癌或其他類型的異常生長。

為了從FP和HW光譜區(qū)域中選擇互補(bǔ)光譜區(qū)間，將變量/特征選擇技術(shù)并入寬帶拉曼內(nèi)窺鏡技術(shù)中。該變量/特征選擇的好處包括：

1.提高預(yù)測性能；

2.降低模型復(fù)雜度；和

3.理解底層光譜處理，例如變量/特征的重要性。

在一個實施例中使用區(qū)間PLS-DA算法，但是原則上可以應(yīng)用多個或所有其它特征/變量選擇技術(shù)或方法來選擇用于任何聚類算法的互補(bǔ)光譜區(qū)域，諸如PCA-LDA、SVM、LR等。該特征/變量選擇技術(shù)可以是遺傳算法(GA)、群體智能、選擇性比率等。簡而言之，本文使用的區(qū)間PLS-DA對拉曼光譜中的區(qū)間的最佳組合執(zhí)行連續(xù)窮舉搜索。因此，區(qū)間PLS-DA創(chuàng)建各個PLS模型，每個PLS模型僅使用變量的子集或窗口。如果對于給定光譜數(shù)據(jù)集存在200個區(qū)間，則計算200個PLS-DA模型(即每個區(qū)間一個模型)。

對每個模型執(zhí)行留一患者交叉驗證，并且選擇可提供最高診斷準(zhǔn)確度的區(qū)間。這是最佳單區(qū)間模型。如果只需要一個區(qū)間，則算法在該點停止。然而，如果期望多于一個區(qū)間(以增加信息內(nèi)容并提高預(yù)測性能)，則可以執(zhí)行附加的周期。在第二周期中，在創(chuàng)建新的一組新PLS模型時，在所有模型中使用第一被選區(qū)間，但是與每個其他剩余區(qū)間(每次一個)組合。以這種方式，提取來自FP和HW范圍的互補(bǔ)診斷值的區(qū)域，同時從模型中排除冗余或不相關(guān)的光譜范圍，例如預(yù)測能力弱的區(qū)域。

FP和HW范圍之外的其它光譜范圍(例如，2000cm^-1至2800cm^-1之間的所謂的拉曼靜默區(qū))可用于某些應(yīng)用中。為了演示本實施例的應(yīng)用，獲取了來自一系列子宮頸患者的寬帶光譜。招募了總共44名由于子宮頸抹片檢查異常而接受陰道鏡檢查程序的非孕期女性患者(18至70歲)。在體內(nèi)組織拉曼光譜測量之前，將5％乙酸溶液局部施用于子宮頸2分鐘以評估組織中的顏色白化(子宮頸中白色變色的程度與癌前期級別相關(guān))。

通過使光纖共焦探針輕觸組織，測量共焦寬帶拉曼和伴隨的自體熒光光譜。圖16A顯示了正常(n＝356)和癌前期(n＝120)宮頸組織的拉曼和自體熒光平均原始復(fù)合光譜。該正常和癌前期宮頸組織光譜顯示在位于自體熒光之上的弱拉曼振動帶，臨近：

·～854cm^-1，其涉及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和膠原的糖原(CCH)變形芳香和(C-C)拉伸，

·～937cm^-1，其涉及脯氨酸、纈氨酸和糖原的ν(C-C)拉伸，

·～1001cm^-1，其涉及苯丙氨酸的(C-C)環(huán)呼吸，

·～1095cm^-1，其涉及磷脂和核酸，

·～1253cm^-1，其涉及酰胺III，

·～1313cm^-1，其涉及脂質(zhì)/蛋白質(zhì)(膠原)的CH₃CH₂扭轉(zhuǎn)模式，

·1445cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的CH₂彎曲模式，

·～1654cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺I帶-(C＝O)拉伸模式，

·～2946cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)-CH₃拉伸，以及

·～3400cm^-1，其涉及水-(OH)拉伸。

為了證明與區(qū)間選擇集成的寬帶拉曼技術(shù)可以改善子宮頸癌前期的診斷，將常規(guī)PLS-DA應(yīng)用于連續(xù)光譜(圖16A)，并將區(qū)間PLS-DA應(yīng)用于提取如上所述的互補(bǔ)區(qū)域。圖16B示出了在區(qū)間PLS-DA之后選擇的光譜子區(qū)域(即1000-1020cm^-1、1640-1660cm^-1、2890-2910cm^-1和3290-3310cm^-1)。

圖17示出了分類誤差，該分類誤差為PLS-DA和區(qū)間PLS-DA模型的算法復(fù)雜度(即LV的數(shù)量)的函數(shù)。最小值分別位于9和5LVs。顯然，通過使用來自FP和HW區(qū)域的互補(bǔ)光譜區(qū)域而非整個光譜，精度顯著增加(分類誤差從25％降低到15％)。該示例顯示通過去除含有弱信息的區(qū)域并從FP和HW光譜中選擇互補(bǔ)子區(qū)間，癌前期體內(nèi)檢測的準(zhǔn)確率可以顯著提高約10％。這確實證明FP和HW區(qū)含有用于組織表征的互補(bǔ)信息。圖18A和18B中的散點圖示出了概率分類結(jié)果。因此，來自寬帶共焦拉曼內(nèi)窺鏡技術(shù)的離散區(qū)間現(xiàn)在使得臨床醫(yī)生能夠獲得與可疑病變相關(guān)的風(fēng)險的更準(zhǔn)確的概率測量，從而顯著地改善物理活檢引導(dǎo)。

應(yīng)當(dāng)注意，可以通過結(jié)合諸如家族疾病史的先驗信息施加閾值到概率分類(圖18A和18B)。例如，如果患者屬于高危群體，則裝置可以為癌前期或癌癥自動選擇更高靈敏度的閾值。產(chǎn)生先驗概率的其他類型的數(shù)據(jù)可以是遺傳、蛋白質(zhì)組、流行?。焕缒挲g、種族、性別、飲酒習(xí)慣等、成像結(jié)果(例如CT、MRI等)、癥狀等?？烧{(diào)節(jié)閾值的選擇已被集成到用于控制光譜測量的臨床拉曼內(nèi)窺鏡軟件中。

在另一個使用寬帶共焦拉曼內(nèi)窺鏡的臨床實例中，從一系列胃癌患者處獲取光纖共焦拉曼光譜用于胃惡性腫瘤的早期診斷。圖19A顯示了從90位患者測得的平均體內(nèi)共焦FP和HW拉曼光譜，呈現(xiàn)出不同組織類型：良性(n＝1950光譜)和癌癥(n＝108光譜)，這已通過組織病理學(xué)特征得到證實。蛋白質(zhì)，DNA和脂質(zhì)的顯著性組織拉曼峰可以在下列范圍附近觀察到：

·936cm^-1，其涉及v(C-C)蛋白質(zhì)，

·1004cm^-1，其涉及苯丙氨酸的νs(C-C)環(huán)呼吸，

·1078cm^-1，其涉及脂質(zhì)的v(C-C)

·1265cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺III v(C-N)和δ(N-H)，

·1302cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的CH₂扭曲和搖擺，

·1445cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的δ(CH₂)變形，

·1618cm^-1，其涉及卟啉的v(C＝C)，

·1655cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺I v(C＝O)，

·1745cm^-1，其涉及脂質(zhì)的v(C＝O)，

·～2946cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)-CH3拉伸，以及

·～3400cm^-1，其涉及水-(OH)拉伸。

為了說明根據(jù)本申請實施例，將常規(guī)PLS-DA應(yīng)用于連續(xù)光譜以及區(qū)間PLS-DA中。圖19B顯示了在區(qū)間PLS-DA之后的選擇的互補(bǔ)光譜區(qū)(即，～1050-1120cm^-1，～1323-1490cm^-1和～2850-2870cm^-1)。

圖20示出了分類誤差，該分類誤差為PLS-DA和區(qū)間PLS-DA的算法復(fù)雜度(即LVs的數(shù)量)的函數(shù)。對于兩種模型，可使用5個LVs發(fā)現(xiàn)分類誤差中的最小值。顯然，通過選擇FP和HW范圍內(nèi)的互補(bǔ)診斷顯著性光譜區(qū)而非整個光譜，模型變得更精確(分類誤差從0.25％降低到0.18％)，如圖21A和21B中的散點圖所示。靈敏度從72.2％增加到75.9％，特異性從74.7％增加到87.9％，這說明了互補(bǔ)信息改善了胃癌的診斷。

另一個臨床實例利用根據(jù)本公開的一實施例；在該實施例中，在內(nèi)窺鏡檢查期間利用FP和HW同步光纖拉曼內(nèi)窺鏡技術(shù)用于胃腸化生(IM)-癌前病變的體內(nèi)檢測。在該實施例中，拉曼光譜系統(tǒng)200包括近紅外(NIR)二極管激光器(λex＝785nm)(最大輸出：300mW，B&W泰克公司)，高通量反射成像光譜儀(Acton LS-785f/2，普林斯頓儀器公司)，該光譜儀裝配有鍍金的830gr/mm光柵，以及熱電冷卻的NIR優(yōu)化的電荷耦合器件(CCD)照相機(jī)(PIXIS：400BR-eXcelon，普林斯頓儀器公司)。系統(tǒng)200在400-3600cm^-1的光譜范圍內(nèi)獲得分辨率為約9cm^-1的體內(nèi)組織拉曼。具有1.8mm外徑的1.9m長的光纖拉曼探針108用于激光輸送和體內(nèi)上皮組織拉曼信號收集。用于內(nèi)窺鏡檢查的拉曼內(nèi)窺鏡探針108包括18個圍繞中心光傳輸光纖(直徑200μm，NA＝0.22)的200μm的傾斜收集纖維(NA＝0.22)。將1.0mm藍(lán)寶石球透鏡(NA＝1.78)耦合到探針的纖維尖端，以將激發(fā)光緊密聚焦到胃組織表面上，使得能夠從上皮襯壁收集有效的拉曼光譜。光纖拉曼光譜系統(tǒng)200的深度選擇能力可以確保具有微觀探測容積(<0.02mm²)的較淺組織問詢(<200μm)，從而減少來自較深的龐大組織的干擾和信號稀釋，同時選擇性地或優(yōu)選地問詢與腫瘤發(fā)作和發(fā)展相關(guān)的上皮。使用汞-氬光譜校準(zhǔn)燈(HG-1和AR-1，海洋光學(xué)公司，弗羅里達(dá)頓尼丁)的原子發(fā)射線用于波長校準(zhǔn)。由于該系統(tǒng)的波長依賴性，使用鎢校準(zhǔn)燈(RS-10，EG&G咖瑪科技，加利福尼亞圣地亞哥)校正所有波長校準(zhǔn)光譜。整個FP/HW光纖拉曼內(nèi)窺鏡系統(tǒng)200可使用腳踏板和直觀的軟件框架來控制，該軟件框架被配置為實時地向胃腸病學(xué)家提供反饋(例如聽覺和/或視覺的概率反饋)。

原始光譜通過三階Savitzky-Golay平滑濾波器(窗口寬度為3個像素)進(jìn)行預(yù)處理，以去除光譜噪聲。在FP區(qū)域(800-1800cm^-1)中，發(fā)現(xiàn)第五階多項式對于在噪聲平滑光譜中擬合AF本底是最佳的，然后從測得的FP頻譜中減去該多項式以產(chǎn)生單獨(dú)的FP組織拉曼光譜。在HW范圍(2800-3600cm^-1)中，使用一階多項式擬合去除AF本底。在FP和HW范圍下的積分面積上對FP/HW拉曼光譜進(jìn)行歸一化，以允許更好地比較正常和IM胃組織之間的光譜形狀和相對拉曼帶強(qiáng)度。使用在Matlab環(huán)境(邁斯沃克有限公司，馬薩諸塞州納蒂克)中開發(fā)的軟件在線處理所有原始光譜數(shù)據(jù)。實施主成分分析(PCA)和線性判別分析(LDA)以開發(fā)用于區(qū)分正常和IM胃組織的穩(wěn)健性診斷算法。利用留一組織部位交叉驗證來以公正的方式評價開發(fā)的診斷模型。在1秒內(nèi)從每個組織部位獲取多個拉曼光譜(10-15)，并且應(yīng)用多數(shù)表決策略作最終分類。診斷結(jié)果可以實時顯示在顯示設(shè)備上，如計算機(jī)屏幕。還通過連續(xù)改變閾值來生成受試者工作特征(ROC)曲線，以確定所有組織中正確和不正確的分類。所有光譜預(yù)處理和多變量統(tǒng)計分析均使用Matlab編程環(huán)境中編寫的腳本在線執(zhí)行。

從115個部位(即正常(n＝88部位)和IM(n＝27部位))成功獲得總共1412個體內(nèi)拉曼光譜(即，正常(n＝1083光譜)和IM(n＝329光譜))，這已通過得到一致結(jié)果的組織病理學(xué)檢查得到證實。

圖22A顯示測得的平均體內(nèi)拉曼光譜±1標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)(陰影淺灰色)(即，正常和IM)。在FP范圍在下列位置處觀察到具有試驗性分配的顯著性組織拉曼峰：

·875cm^-1，其涉及v(C-C)蛋白，

·1004cm^-1，其涉及苯丙氨酸的v_s(C-C)環(huán)呼吸，

·1078cm^-1，其涉及脂質(zhì)的v(C-C),

·1302cm^-1，其涉及脂質(zhì)的CH₂扭曲和搖擺，

·1445cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的δ(CH₂)變形，

·1655cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺I v(C＝O)。

此外，在HW區(qū)域中還觀察到強(qiáng)烈的拉曼峰：

·2885cm^-1，其涉及脂質(zhì)的對稱和不對稱CH₂拉伸，

·2940cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的CH₃拉伸，

·3300cm^-1，其涉及酰胺A(蛋白質(zhì)的NH拉伸)，以及

·水(OH拉伸振動峰值在～3400cm^-1)的寬拉曼帶，其與組織的細(xì)胞和細(xì)胞外空間中的OH鍵的局部構(gòu)象和相互作用相關(guān)。

圖22B顯示了與IM轉(zhuǎn)化相關(guān)的分辨不同光譜特征(例如峰強(qiáng)度、位移和帶增寬)的差光譜(即IM-正常)±1SD(陰影淺灰色)，證實了FP/HW拉曼光譜用于內(nèi)鏡下IM早期診斷的潛力。

圖23A-B顯示使用拉曼內(nèi)窺鏡檢查的相應(yīng)組織部位的代表性蘇木精和曙紅(H&E)切片，其包括(a)正常胃粘膜(200倍放大率)；(b)廣泛的胃腸化生，其中胃上皮含有明顯的杯狀細(xì)胞(100倍放大率)。組織病理學(xué)特征顯示胃組織中正常和腸化生病變的細(xì)胞和形態(tài)特征，而FP/HW同步拉曼內(nèi)窺鏡揭示在分子水平上的上皮組織的特定生物化學(xué)成分(例如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和水)。

為了開發(fā)復(fù)雜的多變量診斷算法并且比較三種不同的拉曼技術(shù)(即FP、HW和FP/HW集成)的組織診斷性能，在獲得的體內(nèi)組織拉曼光譜上實施PCA-LDA與學(xué)生的t-檢驗以評估在不同組織類型的光譜中觀察到的難以察覺的差異?；谌鐖D24所示的診斷顯著性PCs(p<0.01)進(jìn)一步開發(fā)留一組織部位交叉驗證的PCA-LDA診斷算法，分別占拉曼光譜變量的45.6％(PC1)、33.6％(PC2)、4.2％(PC3)、3.1％(PC4)和1.2％(PC5)。不同顯著性PC的特征是不同的；特別地，一些PC特征，如圖24中的峰、谷和光譜形狀，類似于組織拉曼光譜模式的峰、谷和光譜形狀。第一顯著PCs導(dǎo)致光譜數(shù)據(jù)集內(nèi)的最大方差(即，45.6％)；而連續(xù)的PCs描述構(gòu)成逐漸變小的方差的特征。然后將所有五個診斷上有重要意義的PCs擬合到LDA模型以及用于胃組織診斷和分類的留一組織部位交叉驗證技術(shù)。

圖25分別示出了由(a)FP/(b)HW和(c)集成或同步FP/HW拉曼技術(shù)計算并通過PCA-LDA算法建模得到的正常和IM病變之間的交叉驗證分類結(jié)果(后驗概率)。針對FP、HW和FP/HW集成拉曼光譜技術(shù)，應(yīng)用于后驗概率散點圖的閾值線(0.5)分別產(chǎn)生89.6％(103/115)、78.3％(90/115)和91.3％(105/115)的診斷精確度(靈敏度為96.3％(26/27)、77.8％(21/27)、92.6％(25/27)；特異性為87.5％(77/88)、78.4％(69/88)、90.9％(80/88))。結(jié)果表明，與單獨(dú)的FP技術(shù)或單獨(dú)的HW技術(shù)相比，F(xiàn)P/HW集成拉曼光譜在胃IM診斷上表現(xiàn)最好。

圖26顯示了FP、HW和FP/HW集成拉曼技術(shù)產(chǎn)生的ROC曲線，揭示了胃IM識別的診斷靈敏度和特異性之間的關(guān)系。針對FP、HW和的FP/HW集成拉曼技術(shù)，曲線下的積分面積(AUCs)分別為0.94、0.79和0.96，進(jìn)一步證實了FP/HW集成拉曼技術(shù)在體內(nèi)胃IM檢測中提供最佳的診斷性能?？傮w上，上述結(jié)果表明開發(fā)FP/HW同步拉曼光譜技術(shù)用于在內(nèi)窺鏡檢查期間增強(qiáng)體內(nèi)胃癌前期病變的早期診斷的巨大潛力。

圖27顯示了另一個實施例中，單獨(dú)在FP范圍內(nèi)從口腔中測得的拉曼光譜。應(yīng)當(dāng)注意，在口腔中的不同組織部位(例如口腔和咀嚼粘膜)之間存在明顯的結(jié)構(gòu)間變異性。在該實施例中，使用區(qū)間選擇方法將具較大結(jié)構(gòu)間變異的區(qū)域排除，如956cm^-1的羥基磷灰石和1302cm^-1和1445cm^-1的脂質(zhì)。因此，可通過排除具有較大變異的光譜區(qū)域，利用變量/特征選擇技術(shù)減少結(jié)構(gòu)間變異性對診斷算法的影響。這是一個重要的點，并將應(yīng)用于其他器官，包括皮膚，口腔等。

圖28示出了如何在基于不同光譜子區(qū)域在實現(xiàn)概率診斷模型之后將該預(yù)測具前瞻性地實時地應(yīng)用于新光譜的示例。這包括幾個步驟，包括光纖本底減影校準(zhǔn)、光譜區(qū)間截斷預(yù)處理和用于疾病分類的預(yù)測器的預(yù)處理和最終應(yīng)用。

該實施例相對于現(xiàn)有技術(shù)具有幾個主要優(yōu)點：不必使用整個寬帶光譜用于診斷，該技術(shù)或方法僅使用互補(bǔ)信息的子集(例如5-20％)，大大簡化了診斷模型。其次，變量選擇為該疾病的生物化學(xué)和生物分子基礎(chǔ)提供了定性洞察。第三，與基于整個光譜范圍的光譜分析相比，精確度顯著增加。此外，如果某些光譜范圍具有干擾或混雜因素(例如血液)等，則可以有效地降低這些因素的影響。

在一個示例中，計劃對食管反流可疑癥狀進(jìn)行內(nèi)窺鏡篩查的患者接受如下：

·在食管末端執(zhí)行常規(guī)WLR/NBI/AFI內(nèi)鏡成像，顯示了為可疑癌前期(如結(jié)構(gòu)異常)的較大巴雷特(Barrett)部分的非確定性外觀。

·隨后將寬帶共焦拉曼內(nèi)窺鏡技術(shù)應(yīng)用于可疑組織部分中的客觀目標(biāo)活檢。

·共聚焦拉曼分類被定義為“正常”(無病理或胃炎)、“低風(fēng)險”(腸化生)和“高風(fēng)險”(發(fā)育不良/癌癥)。

·共焦拉曼探針放置在食管末端的組織，并根據(jù)從FP和HW區(qū)域中提取的互補(bǔ)信息實時地給出診斷。

·共焦拉曼內(nèi)窺鏡技術(shù)靶向隨后活檢的高危組織部位。

根據(jù)本申請實施例證明，在患者體內(nèi)篩查期間可以執(zhí)行實時同步的指紋(FP)和高波數(shù)(HW)光纖共焦拉曼光譜。光纖共焦拉曼光譜揭示了生物分子和生物化學(xué)的變化，如結(jié)腸直腸癌發(fā)生過程中發(fā)生在上皮細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)和水。與單獨(dú)使用FP或HW范圍相比，使用來自FP和HW范圍的互補(bǔ)生物分子信息改善了異常生長的檢測。FP和HW光纖共焦拉曼光譜技術(shù)在改善癌前期和癌癥檢測和表征方面具有的巨大潛力。使用整個光譜的子集在身體的許多不同部位的處理和異常生長的識別中具有顯著的優(yōu)點。FP和HW范圍已經(jīng)被特別地確定為本文討論的檢測類型產(chǎn)生良好的結(jié)果。應(yīng)當(dāng)理解，可以證明這對于其他類型的檢測、其它范圍更有用。

根據(jù)本申請的實施例不限于生物醫(yī)學(xué)拉曼光譜，還可以應(yīng)用于其它領(lǐng)域。這些領(lǐng)域包括如熒光光譜、彈性散射光譜、表面增強(qiáng)拉曼光譜、過程分析技術(shù)、水和環(huán)境監(jiān)測、藥物過程/藥物遞送控制、食品工業(yè)、質(zhì)量控制工業(yè)、法醫(yī)學(xué)等。在這樣的實施例中，由照射源提供的激發(fā)能被引導(dǎo)到不需要包括或是組織的目標(biāo)樣本(例如化學(xué)、水或環(huán)境材料/物質(zhì)樣本、制藥/藥物或食物樣本，或者其他類型的樣本)。此外，這些實施例不需要涉及內(nèi)窺鏡或內(nèi)窺鏡檢查。文中提及的術(shù)語“拉曼”旨在包括其它類型的光譜，包括上文提到的光譜類型。

根據(jù)本申請的實施例可以用作任何器官的診斷平臺，例如肺，上下GIs(例如食管、胃、結(jié)腸直腸)、肝、膀胱、頭和頸(例如鼻咽、喉、口腔)、子宮頸、皮膚、骨或者可以使用常規(guī)內(nèi)窺鏡、腹腔鏡或關(guān)節(jié)鏡的任何其它部位。

使用根據(jù)本申請某些實施例獲得的一些組織拉曼光譜可能會受到內(nèi)窺鏡照明的干擾。這會使異常生長的診斷難以實現(xiàn)。因此，另一實施例提供了一種消除這種干擾的解決方案。

根據(jù)本申請一實施例的用于引導(dǎo)如上文所述的共焦拉曼光纖探針的三角內(nèi)窺鏡成像系統(tǒng)包括300W短弧氙光源、胃腸(GI)內(nèi)窺鏡和視頻信號處理器。該氙光源與不同組的濾光器耦合以為串聯(lián)的三端內(nèi)窺鏡成像(未示出)提供不同照明光。該濾波器可以包括如WLR(紅色濾波器，585-655nm；綠色濾波器，500-575nm)；藍(lán)色濾波器，390-495nm)、AFI(藍(lán)色濾波器，390-470nm；用于反射圖像歸一化的綠色濾波器，540-560nm)和NBI(綠色濾光片，530-550nm；藍(lán)色濾光片，390-445nm)。

使用安裝在GI內(nèi)窺鏡(未示出)的遠(yuǎn)側(cè)處的兩個不同的CCD來檢測從組織反射的光或發(fā)射的熒光；其中一個CCD是用于WLR/NBI的常規(guī)CCD；另一個是用于AFI觀察的高靈敏度CCD。該內(nèi)窺鏡短弧氙燈發(fā)射覆蓋UV/VIS/NIR的寬帶連續(xù)光，并在>700nm的NIR光譜范圍內(nèi)具有突出的離散峰。由于785nm激光激發(fā)斯托克斯拉曼光譜也落在NIR范圍內(nèi)，環(huán)境氙光會干擾該組織拉曼信號并完全模糊化體內(nèi)組織測量和診斷。由于這個原因，拉曼內(nèi)窺鏡診斷通常在氙燈照明燈“關(guān)閉”或調(diào)暗的情況下進(jìn)行，這在臨床設(shè)置中是非常不理想的。

為了消除環(huán)境氙氣照明干擾，提出了一種實施例，其中在內(nèi)窺鏡系統(tǒng)的氙氣光源前面整合有一熱鏡低通濾波器(在約700nm處截止；可見光范圍內(nèi)具有約95％的平均透射率)，可以消除環(huán)境干擾。

為了證明該實施例的應(yīng)用，在不同的內(nèi)窺鏡照射條件下測量體內(nèi)拉曼光譜。圖29A顯示了在沒有集成熱鏡的內(nèi)窺鏡檢查期間獲得的非接觸組織拉曼光譜?？梢宰R別到，來自氙燈的主要干擾完全覆蓋了組織拉曼信號。圖29B示出了在氙燈前面整合有熱鏡低通濾波器之后，非接觸模式下的組織拉曼光譜。可以看出，基本上消除了氙干擾。現(xiàn)在可以觀察到可高度分辨的組織拉曼峰，其中暫時分子分配如下：

·853cm^-1，其涉及v(C-C)蛋白質(zhì)，

·1004cm^-1，其涉及苯丙氨酸的v_s(C-C)環(huán)呼吸，

·1078cm^-1，其涉及脂質(zhì)的v(C-C),

·1265cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺IIIv(C-N)和δ(N-H)，

·1302cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的CH₃CH₂扭曲和搖擺，

·1445cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的δ(CH₂)變形，

·1655cm^-1，其涉及蛋白質(zhì)的酰胺I v(C＝O)，以及

·1745cm^-1，其涉及脂質(zhì)的v(C＝O)。

測量拉曼光譜時該探針接觸該組織。圖30A示出在沒有熱鏡的情況下以接觸模式測量的組織拉曼光譜。圖30B示出了在氙燈前面整合有熱鏡低通濾波器之后，接觸模式下的組織拉曼光譜?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明整合熱鏡可以完全消除來自共焦拉曼探針的非接觸模式以及接觸模式下的體內(nèi)組織拉曼光譜的環(huán)境氙干擾。此外，從圖中顯而易見的是，在具有組織的拉曼探針的非接觸模式下，氙干擾最為突出，這是因為更多的光耦合到探針頭內(nèi)。因此，該實施例在優(yōu)選為非接觸模式的諸如喉部/支氣管的器官中是特別有用的，這是由于刺激咳嗽反射；或在患有晚期腫瘤的患者是特別有用的，拉曼探針與組織的接觸可誘導(dǎo)流血以及癌細(xì)胞擴(kuò)散的風(fēng)險。

應(yīng)當(dāng)注意，使用熱鏡過濾照明光用于引導(dǎo)并不限于在內(nèi)窺鏡上應(yīng)用，而是更通用于過濾用于引導(dǎo)NIR組織光譜學(xué)(即表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)、NIR熒光或NIR反射率)的任何光或成像模態(tài)，用于內(nèi)部或外部器官(例如皮膚、子宮頸、膀胱、胃、食管、鼻咽、喉、口腔、結(jié)腸，直腸、肺等)。

因此，圖31示出了系統(tǒng)2100，概括了該概念。系統(tǒng)2100包括可以與組織2104接觸的探針2102。該系統(tǒng)還包括NIR激光器2106、光譜儀2108、CCD 2110。一邊緣長通濾波器2112位于該探針和該光譜儀之間；帶通濾波器2114位于該探針和該激光器之間。PC 2116和相關(guān)軟件用于控制系統(tǒng)。該組織還由照射源2118經(jīng)一熱鏡低通濾波器2120照射。應(yīng)當(dāng)理解，該系統(tǒng)可以在構(gòu)成系統(tǒng)的元件以及這些元件的方向和位置方面發(fā)生變化，這取決于本實施例的具體應(yīng)用。

眾所周知，儀器標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于臨床拉曼光譜的進(jìn)展速度。因為組織拉曼光譜是基于固有較弱且具高分辨率的峰，所以該技術(shù)對儀器變化非常敏感。因此，在對人類患者進(jìn)行臨床測量之前開展和使用用于測試/校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)窺鏡檢查儀器的技術(shù)是勢在必行的，以確保在不同拉曼系統(tǒng)中可得到可靠并一致的體內(nèi)診斷。

圖32示出了將拉曼內(nèi)窺鏡應(yīng)用于患者之前測試?yán)鼉?nèi)窺鏡的基本步驟，包括(i)啟動系統(tǒng)；(ii)測試?yán)鼉?nèi)窺鏡系統(tǒng)；(iii)將拉曼內(nèi)窺鏡應(yīng)用于患者。提出了一種新裝置和技術(shù)或方法，用于系統(tǒng)測試和校準(zhǔn)光纖拉曼內(nèi)窺鏡的校正。這包括光機(jī)裝置和在拉曼軟件中實現(xiàn)的一組程序指令程序，用于自動系統(tǒng)測試和在光纖拉曼診斷應(yīng)用中的校準(zhǔn)。該校準(zhǔn)裝置包括光譜校準(zhǔn)輻射源(如汞和氬燈、NIR光譜發(fā)射器、激光等)、光強(qiáng)度輻射源、激光功率計、組織模型，以及自動光機(jī)械部件(例如步進(jìn)電機(jī))和控制器，用于拉曼內(nèi)窺鏡系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化。該校準(zhǔn)裝置是臨床拉曼內(nèi)窺鏡平臺的主要部分，也可以用作為獨(dú)立裝置用于光纖的一般測試和校準(zhǔn)，包括封閉的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動的濾波器輪2302，例如來自美國新澤西州紐頓市的統(tǒng)雷有限公司的FW102C，其內(nèi)集成有不同的樣本2304。柔性光纖拉曼探針2306可以安裝在該校準(zhǔn)裝置中，如圖33中示意性描述地。

在臨床拉曼軟件中，濾波器輪旋轉(zhuǎn)與激光激發(fā)和采集同步。從該濾波器輪中的每個樣本獲取光譜并存儲該光譜。在校準(zhǔn)/測試程序中執(zhí)行的步驟包括CCD特征(即溫度、暗電流)、激光激發(fā)功率和熔融石英光纖本底的測量，用于系統(tǒng)響應(yīng)校準(zhǔn)/測試的熒光材料，用于波長校準(zhǔn)/測試的材料和最后的組織幻影。測得的信號可以用于重新校準(zhǔn)拉曼內(nèi)窺鏡系統(tǒng)的參數(shù)(如強(qiáng)度響應(yīng)、波長精度、本底噪聲等)。

現(xiàn)在結(jié)合獲得的信號的示例，描述已經(jīng)整合到校準(zhǔn)裝置的濾波器輪中的程序和標(biāo)準(zhǔn)樣本。圖34示出了在將校準(zhǔn)裝置用于患者之前測試該拉曼內(nèi)窺鏡的過程(2400)?？梢栽诿看螠y量之后或者在完成所有測量之后執(zhí)行信號分析(即故障檢測或校準(zhǔn))(如該具體示例所示)。

在第一實例中，測量CCD的檢測器信號并記錄溫度(2402)。這可以包括在不存在激光激發(fā)的情況下測量該信號強(qiáng)度的多個光譜(即，在0...1秒的曝光時間)。系統(tǒng)隨后驗證暗電流小于先前存儲在工廠配置文件中的最大值。該實施例還包括確保在一系列光譜中的暗電流變化系數(shù)小于同樣先前存儲在該配置文件中的最大值。

還使用集成激光功率計來測量在光纖拉曼探針的尖端處的激光激發(fā)功率(2402)，以確保其所在范圍小于美國國家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(ANSI)最大允許皮膚曝光極限(設(shè)定為785nm激光束)。該實施例包括確保激光功率小于先前存儲在配置文件中的最大值。

濾波器輪包含具有暗環(huán)境的空槽，從而可以測量熔融石英光纖探針本底信號(2404)。使用激光激發(fā)和不同的曝光時間(例如，0.1...1.0s)測量光纖探針本底的多個光譜。這些光譜包含關(guān)于光纖探針狀態(tài)的信息。例如，如果光纖損壞或探針尖端被污染，可以通過拉曼或熒光強(qiáng)度的增加來反映。

圖35示出了用于兩個不同光纖探針的寬帶拉曼內(nèi)窺鏡探針的本底信號的示例。該實施例還包括確保在一系列光譜上的變化系數(shù)小于先前存儲在配置文件中的最大值。測得的光纖探針本底也存儲在該存儲器中，用于在實時處理期間從體內(nèi)組織拉曼光譜中作進(jìn)一步處理(即減影)。

還測量并存儲了表現(xiàn)出寬且穩(wěn)定熒光光譜的熒光玻璃(例如，鍍鉻硼硅酸鹽玻璃、綠玻璃、kopp2412等)，用于測試和/或校準(zhǔn)拉曼內(nèi)窺鏡系統(tǒng)(2406)的響應(yīng)和收集效率。根據(jù)圖36中詳述步驟，使用國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(NIST)鎢絲燈對該標(biāo)準(zhǔn)熒光玻璃進(jìn)行預(yù)先工廠校準(zhǔn)。系統(tǒng)的響應(yīng)可以與早先存儲在配置文件中的響應(yīng)進(jìn)行比較。該實施例還包括確保在一系列光譜上的變化系數(shù)小于先前存儲在配置文件中的最大值。該響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣本的光譜可用于將系統(tǒng)重新校準(zhǔn)為出廠刻度。圖37顯示了使用兩種不同的光纖探針從熒光標(biāo)準(zhǔn)玻璃(即kopp2412)中導(dǎo)出的校準(zhǔn)函數(shù)的實例。

還測量具有明確限定的窄拉曼峰的材料(2408)。一示例如圖38中所示的聚苯乙烯。波長標(biāo)準(zhǔn)用于評估是否由于光學(xué)失調(diào)而在波長軸上存在偏移。將光譜與先前存儲在配置文件中的光譜進(jìn)行比較(例如使用相關(guān)系數(shù)或峰值識別等)。這包括分辨率(即半高寬(FWHM))的測試和峰值位置的驗證。具有明確限定的窄拉曼峰的材料的光譜也可以用于將系統(tǒng)重新校準(zhǔn)為存儲在配置文件中的先前工廠標(biāo)準(zhǔn)。重新校準(zhǔn)包括來自工廠校準(zhǔn)波長軸的預(yù)定義峰值與來自未校準(zhǔn)光譜的對應(yīng)峰值之間的多項式映射(例如3...5階)。圖39中示出了一示例，其示出了在重新校準(zhǔn)之后的峰的多項式映射。

濾波器輪還包含分層的組織模型。該組織模型包括具有漫射性質(zhì)的材料和/或顯示出公知拉曼峰值的分層的組織模型(2410)。該實施例還包括確保在一系列光譜上的變化系數(shù)小于先前存儲在該配置文件的最大值。圖40A-B中給出了一個實例，其顯示了使用不同的拉曼探針從聚苯乙烯和聚乙烯的兩層模型夾層結(jié)構(gòu)中獲得的拉曼光譜的比較。分層組織模型的拉曼光譜用于驗證光纖拉曼探針的深度選擇性以及光譜質(zhì)量。來自頂層到底層(例如分別為1002cm^-1和1296cm^-1)的信號的比率用作給定光纖共焦探針的深度選擇的定性和定量指示。該實施例包括確保深度選擇小于先前存儲在配置文件中的最大值。

在進(jìn)行了各種測量之后執(zhí)行信號分析(2412)。這是為了識別諸如故障檢測、校準(zhǔn)問題等問題。如果檢測到問題，則系統(tǒng)被定義為未通過(2414)?；蛘撸绻麤]有遇到問題，則系統(tǒng)通過(2416)。

另一實施例包括與GUI集成或作為GUI的程序指令集或軟件框架，當(dāng)執(zhí)行拉曼內(nèi)窺鏡診斷時可響應(yīng)于用戶的選擇/輸入基于光譜和病變顯示和存儲拉曼數(shù)據(jù)。例如，如果選擇第一或按下第一按鈕，則來自第一病變的拉曼數(shù)據(jù)將被保存。如果選擇第二或按下第二按鈕，則來自第二病變的拉曼數(shù)據(jù)將被保存等。這樣的系統(tǒng)還包括存儲患者信息、積分時間、激光激發(fā)功率、時間、日期、診斷、探針本底信號、系統(tǒng)校準(zhǔn)功能、內(nèi)窺鏡視頻和包含測量細(xì)節(jié)的日志文件?？梢蕴峁┘傻哪_踏板裝置，以供臨床醫(yī)生連接和保存數(shù)據(jù)。如果按下腳踏開關(guān)，所獲取的數(shù)據(jù)將被存儲為第一個病變。如果再一次按下，數(shù)據(jù)將被存儲為第二個病變等。腳踏開關(guān)還可以包含用于打開和關(guān)閉激光激發(fā)的安全踏板。

另一實施例包括程序指令集或軟件框架，用于顯示臨床拉曼診斷以及記錄的寬視場視頻成像。內(nèi)窺鏡視頻成像(即WLR/NBI/AFI)和視頻記錄已經(jīng)整合到拉曼內(nèi)窺鏡軟件中?？梢栽谥T如計算機(jī)屏幕的顯示設(shè)備上顯示寬視場內(nèi)窺鏡視頻和成像組織的體內(nèi)拉曼診斷。內(nèi)窺鏡視頻與測得的組織拉曼光譜在時間上同步。因此，拉曼光譜診斷可以與視頻回放同時顯示。這使得臨床醫(yī)生能夠為每個患者追溯拉曼內(nèi)窺鏡診斷和所采樣的可疑組織部位之間的精確相關(guān)性。這種整合的成像和拉曼內(nèi)鏡檢查軟件在臨床系統(tǒng)上具有顯著性提高，可實現(xiàn)查看歷史臨床數(shù)據(jù)。

CCDs和弱組織拉曼信號的有限動態(tài)范圍在拉曼內(nèi)窺鏡應(yīng)用中仍然具有挑戰(zhàn)性，這是因為體內(nèi)組織表現(xiàn)出不同程度的自體熒光。對于一些組織(如胃、肺、舌背、肝)，檢測器飽和可在0.1秒或甚至小于0.05秒內(nèi)發(fā)生。對于這些組織，與其他組織類型(如食管、鼻咽、喉、子宮頸等)相比，拉曼信號可具有明顯的噪聲。一般來說，組織的拉曼信號強(qiáng)度與激光激發(fā)功率和曝光時間成線性比例。信噪比(S/N)與曝光時間的平方根成比例。目前，用戶使用拉曼內(nèi)窺鏡技術(shù)為每個獲得的光譜手動調(diào)整曝光時間或激光激發(fā)功率。這在實時應(yīng)用中是非常不切實際的。因此，確定一自動化方法以防止CCD飽和，并且確保在臨床條件下可接受的時間內(nèi)獲得具有最佳S/N比的拉曼光譜是關(guān)鍵的。拉曼內(nèi)窺鏡技術(shù)需要真正的實時診斷，以在臨床醫(yī)學(xué)中獲得廣泛接受。新方法自動調(diào)整激光激發(fā)功率、曝光時間和光譜累積，以在具有高S/N比的臨床拉曼測量期間實現(xiàn)不間斷的實時診斷；該新方法在該需求下是非常具有價值的。作為代表性示例，提出了兩種自動化技術(shù)或方法。

參考圖41所示的第一技術(shù)或方法，曝光時間是固定的(如在0.1秒)(3102)，而激光激發(fā)功率被指定為可變的并且根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)(3104)。測量拉曼光譜(3106)并確定信噪比(3108)。該光譜中的噪聲估計以傅立葉變換、微分或其它方法為基礎(chǔ)來量化噪聲水平。如果拉曼光譜的信噪比(S/N)比較差(3110)，則在隨后的測量中，在讀出之前累積若干拉曼光譜(例如n＝2...3)(3112)。如果對于給定光譜CCD是飽和的(3114)，則隨后的拉曼測量的激光激發(fā)功率根據(jù)飽和度(3116)降低一定量。如果光譜不飽和，它用于診斷(3118)。飽和度被定義為飽和像素的年齡％。如果以強(qiáng)度計數(shù)(<70％或>90％的動態(tài)范圍)讀出光譜(3120)，則隨后的拉曼測量的激光激發(fā)功率被比例放大，使得信號強(qiáng)度在70-90％動態(tài)范圍(3122)。一個實施例對該激光激發(fā)功率施加上限(例如25mW)。在另一個實施例中，一致地執(zhí)行若干光譜(如n＝2)的累積。本底減影、預(yù)處理，異常值檢測、疾病預(yù)測和顯示都可以被執(zhí)行(3124)。

參考圖42所示的第二技術(shù)或方法，激光激發(fā)功率是固定的(如在25mW)(3202)，而曝光時間被指定為可變的(3204)。測量拉曼光譜(3206)并確定信噪比(3208)。噪聲估計以傅立葉變換、微分或其它方法為基礎(chǔ)來量化噪聲水平。如果拉曼光譜的信噪比(S/N)比較差(3210)，則在隨后的測量中，在讀出之前累積若干拉曼光譜(例如n＝2...3)(3212)。如果對于給定光譜CCD是飽和的(3214)，則隨后的拉曼測量的曝光時間根據(jù)飽和度(3216)降低一定量。如果光譜不飽和，則用于診斷(3218)。飽和度被定義為飽和像素的年齡％。如果光譜具有較低的強(qiáng)度計數(shù)(<70％或>90％的動態(tài)范圍)，則隨后的拉曼測量的曝光時間被比例放大，使得信號強(qiáng)度在70-90％動態(tài)范圍(3222)。一個實施例對該曝光時間施加上限(例如0.5s)。在另一個實施例中，如果整合時間非常低(例如<0.1s)，則一致地執(zhí)行若干光譜的累積。本底減影、預(yù)處理，異常值檢測、疾病預(yù)測和顯示都可以被執(zhí)行(3224)。

圖36和37分別詳述的上述兩個功能被整合在操作軟件中。僅調(diào)整激光功率的好處在于，曝光時間恒定并且可以非常低(如0.1秒)。上述方法在臨床拉曼內(nèi)窺鏡中具有重要價值，實現(xiàn)了具有高S/N比的不間斷實時診斷，而且可以推廣到其它形式，例如表面增強(qiáng)拉曼內(nèi)窺鏡(SERS)、反射率和熒光光譜。曝光時間、激光激發(fā)功率和累積的自動調(diào)整，以改善信號質(zhì)量、防止CCD飽和并實現(xiàn)實時診斷的一般思想是本申請一實施例的重要特征。另一個實施例包括激光激發(fā)與采集的同步。換言之，在信號采集之前激光激發(fā)被打開，并且在采集之后該激光激發(fā)被關(guān)閉。

本申請另一實施例包括在不同光纖探針和不同器官之間切換的能力。對于每種類型的光纖探針(例如共焦或容積式探針)，存在針對每個器官(即喉、結(jié)腸鼻咽、胃、食道、口腔、皮膚、子宮頸、膀胱等)的診斷模型的數(shù)據(jù)庫。例如，如果用戶選擇鼻咽作為器官，則將屬于該鼻咽的一個或多個模型加載到系統(tǒng)中。圖43中示出了代表性的數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)。該模型可以包括多變量診斷算法和/或多變量異常值檢測模型。

應(yīng)當(dāng)理解，上述各個實施例不應(yīng)被理解為旨在限制性。相反，可以對一個或多個實施例進(jìn)行組合和對說明書中示出的具體示例進(jìn)行變型。這些過程中的一些可以在硬件，軟件或其任何組合中實現(xiàn)。