專利名稱：表征分析物的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開的方法和設(shè)備涉及分析物的分析，這些分析物包括但不限于蛋白質(zhì)、多肽、 肽、脂類和多糖。具體而言，這些方法和設(shè)備涉及蛋白質(zhì)、多肽和/或肽的鑒定和/或測序。
背景技術(shù)：
分析物如蛋白質(zhì)的鑒定和/或測序?qū)τ卺t(yī)學(xué)診斷學(xué)、法醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)、生 物戰(zhàn)、公共衛(wèi)生和許多其它領(lǐng)域是至關(guān)重要的。鑒定一種具體病原體或試劑的能力可取決 于對該病原體或試劑的一種或多種特定分析物特征的鑒定。在疾病過程、新陳代謝、生長和 細(xì)胞分裂中所涉及的調(diào)節(jié)途徑的鑒定可取決于對分析物的鑒定和/或測序。雖然目前大量 研究涉及核酸或蛋白質(zhì)的鑒定和/或測序，但其它分析物如糖類、多糖、脂類、脂肪酸等也 具有重要性。這里公開的方法和設(shè)備集中于蛋白質(zhì)、多肽和肽的鑒定和/或測序。然而，它 們也用于分析其它類型的分析物?；贓dman降解技術(shù)的現(xiàn)有蛋白質(zhì)測序方法受到被測序蛋白質(zhì)長度的限制。精確 的序列確定被限制在每輪測序大約50到100個氨基酸殘基。可以是上千氨基酸殘基長度 的更長蛋白質(zhì)的測序要求切割成較小的片段和裝配成重疊的短序列。該過程費(fèi)力、昂貴、效 率低且耗時，并且通常需要使用放射活性標(biāo)記物和其它有害化學(xué)物質(zhì)，這可帶來安全和廢 物處理問題。多種技術(shù)可用于鑒定蛋白質(zhì)、多肽和肽。一般地，這些技術(shù)涉及抗體的結(jié)合和檢 測，所述抗體可以識別蛋白質(zhì)上的一種或多種表位域(印itopic domain) 0雖然基于抗體 的蛋白質(zhì)鑒定相當(dāng)快速，但這些測試方法偶然地可以顯示出不可接受的高水平的假陽性或 假陰性結(jié)果，原因在于抗體與不同抗原的交叉反應(yīng)性、靶分析物的低抗原性(導(dǎo)致該測試 的低靈敏度)、抗體與各種表面的非特異性結(jié)合，等等。它們也需要制備可以識別個體蛋白 質(zhì)或肽的抗體。因此，它們不適合用于鑒定從前未被表征過的新的蛋白質(zhì)。最近，質(zhì)譜已被 用于肽的鑒定和/或測序?？蓪⒌鞍踪|(zhì)和多肽切割成較小片段，并通過質(zhì)譜，鑒定這些片段 的氨基酸組成。分析足夠數(shù)目的重疊片段可以提供有關(guān)氨基酸序列的數(shù)據(jù)。該過程同樣費(fèi) 力、昂貴并需要基本純化待分析的蛋白質(zhì)或肽。在本領(lǐng)域中，存在著對適合于鑒定和/或測序分析物的方法和設(shè)備的需求，這些 分析物包括以前未被鑒定或表征的蛋白質(zhì)和肽。附圖簡述下面的附圖形成本說明書的一部分，并被包括以進(jìn)一步說明本公開方法和設(shè)備的 某些方面。參照這些附圖中一個或多個，結(jié)合此處所述的詳細(xì)說明，可以更好地理解這些方 法和設(shè)備。

圖1是流程圖，說明通過產(chǎn)生距離圖(distance map) 140，對蛋白質(zhì)進(jìn)行測序150 和/或鑒定160的非限制性示例設(shè)備100 (未按比例)和方法。圖2說明通過光檢測，測序和/或鑒定蛋白質(zhì)230的次級設(shè)備200 (未按比例)的 非限制性例子。圖3說明通過電檢測，測序和/或鑒定蛋白質(zhì)310的次級設(shè)備300 (未按比例)的 另一個非限制性例子。圖4顯示在半胱氨酸殘基上進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記的非限制性例子。圖5顯示在賴氨酸、精氨酸和N-末端殘基上進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記的非限制性例子。圖6顯示在天冬氨酸、谷氨酸和C-末端殘基上進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記的非限制性例子。圖7顯示在絲氨酸和蘇氨酸殘基上進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記的非限制性例子。圖8顯示四個不同類型核苷酸的拉曼光譜。每個不同類型的核苷酸具有特征拉曼 發(fā)射峰。數(shù)據(jù)是在沒有對核苷酸進(jìn)行表面增強(qiáng)或標(biāo)記的情況下收集的。圖9顯示用熒光素共價標(biāo)記的脫氧腺苷三磷酸(上曲線)和未標(biāo)記dATP (下曲線) 的 500nM 溶液的比較 SERS 光譜。dATP-熒光素從 Roche Applied Science (Indianapolis, IN)獲得。在熒光素標(biāo)記的dATP中，檢測到SERS信號的強(qiáng)烈增加。圖10說明ImM色氨酸的拉曼光譜，收集時間為1秒(上曲線)和0. 1秒(下曲線)。圖11顯示ImM半胱氨酸的拉曼光譜，收集時間為0. 1秒。圖12示例ImM甲硫氨酸的拉曼光譜，收集時間為1秒。圖13說明ImM組氨酸的拉曼光譜，收集時間為1秒。圖14顯示ImM苯丙氨酸的拉曼光譜，收集時間為1秒。圖15顯示ImM精氨酸的拉曼光譜，收集時間為0. 1秒。圖16顯示ImM酪氨酸的拉曼光譜，收集時間為1秒(上曲線)和0. 1秒(下曲 線)。圖17顯示ImM 5_氟色氨酸的拉曼光譜，收集時間為0. 1秒。圖18說明胎牛血清的拉曼光譜，在鋁板上干燥，收集時間為1秒。圖19顯示100%全牛血清的拉曼光譜，收集時間為1秒。圖20顯示0. 全牛血清的拉曼光譜，收集時間為1秒。圖21顯示通過血清蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化而獲得的各種片段的拉曼光譜。肽通 過反相高壓液相層析法(HPLC)，在C18柱上被分離。
詳細(xì)說明
定義如這里所使用，“一個(a) ”或“一個(an) ”指一個或多于一個的事項(xiàng)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”指氨基酸按線性方式裝配而成的聚合物分子。這些術(shù)語之間的區(qū)別主要是長度的區(qū)別，肽的長度通常為約2到約25個氨基酸殘基，多肽的 長度為約10到約100個氨基酸殘基，以及蛋白質(zhì)的長度約50個殘基或更長。這些術(shù)語重 疊，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員會了解，在下面的公開內(nèi)容提到蛋白質(zhì)或多肽或肽的地方，術(shù)語包 括任何長度的聚合物。在本說明書使用術(shù)語“蛋白質(zhì)”的地方，理解為該術(shù)語也包括“多肽” 和/或“肽”。也考慮，將被分析的蛋白質(zhì)可以包括天然存在的氨基酸殘基、修飾的氨基酸殘 基、衍生化的氨基酸殘基、氨基酸類似物和/或非天然存在的氨基酸。也包括已被任何標(biāo)簽 標(biāo)記的氨基酸殘基。雖然天然存在的蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基通常通過肽鍵連接在一起，但 在所公開方法的范圍內(nèi)，氨基酸殘基可以通過肽鍵或通過已知共價連接的任何其它類型連 接在一起。術(shù)語“納米孔(nanopore)”、“納米通道(nanochannel) ”和“納米管(nanotube) ” 分別指孔、通道或管，其直徑或?qū)挾仍?到999納米(nm)之間，更通常在1到lOOnm之間， 甚至更通常在1到lOnm之間。如這里所使用，術(shù)語“納米孔”、“納米管”和“納米通道”可 以被交換使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，在說明書提及“納米孔”的地方，不同的替代可 以使用“納米通道”或“納米管”。惟一的要求是納米孔、納米通道或納米管將一個充滿流體 的區(qū)室與另一個相連，并且允許被標(biāo)記蛋白質(zhì)的通過和檢測。如這里所使用，“可操作地連接(operably coupled) ”意指，在兩個或多個元件之 間存在功能關(guān)系和/或結(jié)構(gòu)關(guān)系。例如，如果布置檢測器，使得它可以鑒定通過納米孔的被 標(biāo)記氨基酸殘基，則該檢測器就是與該納米孔“可操作地連接”。類似地，如果室中的蛋白質(zhì) 可以通過納米孔，則該納米孔就是與該室可操作地連接。在檢測器和/或檢測器的傳感元 件被整合進(jìn)納米孔的地方，該檢測器也可以是與該納米孔“可操作地連接”。如這里所使用，“流體交通(fluid communication)”指兩個或多個區(qū)室之間的功 能性連接，其允許流體在這些區(qū)室之間通過。例如，如果流體可以從第一區(qū)室到第二區(qū)室和 /或從第二區(qū)室到第一區(qū)室，則該第一區(qū)室與該第二區(qū)室為“流體交通”。
說明性實(shí)施方式描述本公開的方法和設(shè)備用于快速、自動的蛋白質(zhì)測序和/或鑒定。超越現(xiàn)有技術(shù)方 法的優(yōu)勢包括高流通量、單個被標(biāo)記蛋白質(zhì)分子的靈敏檢測、氨基酸殘基距離的納米尺寸 分辨率以及蛋白質(zhì)測序和/或鑒定的較低單位花費(fèi)。下面的詳細(xì)描述包含許多具體的細(xì)節(jié)，以提供對所要求的方法和設(shè)備更全面的理 解。然而，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，顯而易見的是這些方法和設(shè)備可以在沒有這些具體 細(xì)節(jié)的情況下被實(shí)施。在其它情況下，本領(lǐng)域熟知的設(shè)備、方法、過程和各個組件在這里不 做詳細(xì)描述。如圖1所說明，可將核酸模板放置在一個或多個室120中，每個室120包含不同的 被標(biāo)記氨基酸?？梢酝ㄟ^體外翻譯或偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯，產(chǎn)生由核酸模板編碼的被標(biāo)記蛋 白質(zhì)。該被標(biāo)記蛋白質(zhì)可以通過一個或多個與各個室相連的納米孔，這些納米孔穿透一層 或多層可操作地連接于檢測器的傳感器層。當(dāng)被標(biāo)記蛋白質(zhì)通過納米孔時，被標(biāo)記氨基酸 殘基被檢測。被標(biāo)記氨基酸殘基之間的距離被測定，并對每一類型的被標(biāo)記氨基酸殘基匯 編距離圖140?？墒褂镁嚯x圖140測序150和/或鑒定160被標(biāo)記蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會了解，考慮的距離圖140可以顯示亞納米或更大尺寸上的距離。例如，在線性蛋白質(zhì)序列中的單個氨基酸具有大約0.6nm的尺寸。在典型的蛋白質(zhì)的 凝膠電泳過程中(約10伏特/cm的場強(qiáng))，分子可以在60分鐘內(nèi)移動大約100mm(或每秒 移動大約28，OOOnm)。由于現(xiàn)有的電檢測器能夠倒計(jì)數(shù)到毫微微秒級，因此相鄰氨基酸的檢 測很好地在檢測界限之內(nèi)。如果給定蛋白質(zhì)在電泳下的移動速率，1納秒的時間間隔將等 于0. 036nm的距離，其小于約0. 154nm的碳-碳鍵鍵長。檢測兩個相鄰的氨基酸殘基將用 大約20納秒。距離圖140的范圍可以從平均亞基距離(0.6nm)到全長蛋白質(zhì)的長度，其可 以是上千個氨基酸長。在可選的方法中，可以通過在例如包括被標(biāo)記氨基酸的溶液中培育細(xì)胞并從培育 的細(xì)胞中純化一種或多種蛋白質(zhì)，制備被標(biāo)記蛋白質(zhì)。在另一可選方法中，可以用編碼感興 趣蛋白質(zhì)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并使其形成被標(biāo)記蛋白質(zhì)。在用20個室120包含所有20 種不同被標(biāo)記氨基酸殘基的情況下，可以將距離圖140匯編成完整的蛋白質(zhì)序列150。
蛋白質(zhì)、多肽和肽將被分析的蛋白質(zhì)可以是[1]從天然來源純化的；[2]通過mRNA種類的體外 翻譯或通過DNA種類的偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯而被表達(dá)的；和/或[3]在已用基因或互補(bǔ) DNA(cDNA)種類轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中被表達(dá)的。這些方法并非限制性的，并且要被分析的蛋白 質(zhì)可以用本領(lǐng)域所知的任何方法制備。
蛋白質(zhì)純化將被分析的蛋白質(zhì)在分析前，可以部分或全部從多種來源純化。蛋白質(zhì)純化技術(shù) 是本領(lǐng)域熟知的。這些技術(shù)通常包括將細(xì)胞或組織的勻漿物初始地粗分級分離和/或提 取為蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)組分。分級分離可以利用，例如，在水溶液、去污劑和/或有機(jī)溶劑 中不同的溶解度；通過酶消化，去除各類污染物如核酸；用硫酸銨、聚乙二醇、抗體、熱變性 以及類似方法使蛋白質(zhì)沉淀，然后進(jìn)行超速離心分離。在蛋白質(zhì)純化中使用的各種去污劑 是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，離子表面活性劑(例如，十二烷基硫酸鈉、膽酸鈉、脫氧 膽酸鈉、溴化十六碳烷基三甲銨)和非離子表面活性劑(例如，Triton X-100、Tween-20, Brij-35、毛地黃皂苷、Noiiidet :P40、辛基葡糖苷)。當(dāng)利用電檢測被標(biāo)記殘基時，非離子 表面活性劑可以具有更大的用途。對于光學(xué)檢測，離子或非離子去污劑都可以使用。對于光 學(xué)檢測，在用于激發(fā)和檢測的波長處不表現(xiàn)基本吸收和/或發(fā)射的去污劑會具有更大的用 途。還原劑，例如二硫蘇糖醇或巰基乙醇可用于還原二硫鍵和分離蛋白質(zhì)聚集體。通 過透析、過濾和/或有機(jī)相萃取，可以除去低分子量污染物?？梢酝ㄟ^層析和/或電泳技術(shù)純化感興趣的蛋白質(zhì)(多種蛋白質(zhì))，以實(shí)現(xiàn)部分 或完全純化。適于純化蛋白質(zhì)、多肽和肽的方法包括但不限于離子交換層析、凝膠排阻層 析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、親和層析、免疫親和層析、羥基磷灰石層析、疏水作用層析、反相 層析、等電聚焦、快速蛋白質(zhì)液相層析(FPLC)和高壓液相層析(HPLC)。這些以及其它蛋白 質(zhì)純化方法是本領(lǐng)域已知的，并對于所要求的主題不是限制性的?？梢允褂萌魏我阎牡?白質(zhì)純化方法。不要求蛋白質(zhì)必須為最純的狀態(tài)。顯示出較低程度的相對純化的方法可以 在例如提高被標(biāo)記蛋白質(zhì)的回收率方面具有優(yōu)勢?？墒褂糜H和層析純化一些蛋白質(zhì)。該方法依賴于蛋白質(zhì)和與它特異性結(jié)合的分子之間的親和力。可以通過將蛋白質(zhì)結(jié)合配體與不溶性基質(zhì)(matrix)共價連接，制備層析物 質(zhì)，所述配體例如抗體、抗體片段、受體蛋白、底物(substrate)、抑制劑、這些配體的產(chǎn)物或 類似物，所述基質(zhì)例如柱層析珠子或尼龍或其它膜。然后，該基質(zhì)可用于從溶液中特異性吸 收靶蛋白質(zhì)。通過改變?nèi)軇l件(例如PH、離子強(qiáng)度、溫度、去污劑濃度等)，進(jìn)行洗脫。親 和層析的一個最常規(guī)形式是免疫親和層析。產(chǎn)生針對各種蛋白質(zhì)的抗體用于免疫親和層析 的方法是本領(lǐng)域熟知的?？梢蕴禺惖貥?biāo)記感興趣的蛋白質(zhì)，用以協(xié)助純化。通過找尋標(biāo)記物的存在的純化 方案，可以得到感興趣的蛋白質(zhì)。用側(cè)鏈特異性和/或選擇性試劑，可以翻譯后標(biāo)記蛋白 質(zhì)，如下所述。標(biāo)記蛋白質(zhì)的各種方法是本領(lǐng)域已知的，下面將詳細(xì)討論。
體外翻譯蛋白質(zhì)可以用帶有mRNA模板的體外翻譯系統(tǒng)表達(dá)。進(jìn)行體外翻譯的完整試劑 盒(Complete kits)可以從商業(yè)來源獲得，例如 Ambion(Austin，TX), Promega(Madison, WI) > Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ)、Invitrogen (Carlsbad, CA)禾口 Novagen (Madison, WI) 0這種試劑盒可以利用總RNA、純化的聚腺苷酸化的mRNA和/或從細(xì) 胞、組織或其它樣品獲得的純化的各個mRNA種類。制備用于體外翻譯的不同RNA片段和/ 或各個mRNA種類的方法是已知的。(例如，Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ；Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York, NY,1994)。通常使用的體外翻譯系統(tǒng)基于兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物、麥胚提取物和大腸桿菌 (E. coli)提取物。基于兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的體外翻譯系統(tǒng)對于真核翻譯特別強(qiáng)有力和有 效。這些系統(tǒng)包含細(xì)胞粗提取物，其包括核糖體亞基、轉(zhuǎn)運(yùn)RNAs(tRNAs)、氨酰tRNA合成酶、 起始因子、延伸因子及終止因子和/或翻譯所需的所有其它組分。這些提取物中存在的天 然氨基酸可以用一種或多種不同類型的被標(biāo)記氨基酸補(bǔ)充。根據(jù)用途，標(biāo)記物可以被限制 于單種氨基酸?？蛇x地，可以將待翻譯的樣品分成不同的次級樣品，將每一個次級樣品暴露 于不同類型的被標(biāo)記氨基酸。對于光學(xué)檢測方法，色氨酸或5-氟-色氨酸顯示天然熒光，可 以用于拉曼光譜?？梢栽诘鞍踪|(zhì)合成前或通過翻譯后修飾，將標(biāo)記物添加在其它氨基酸殘 基上。在補(bǔ)充體外翻譯系統(tǒng)中使用的其它組分和這些系統(tǒng)使用的方法是本領(lǐng)域已知的(參 見,例如Ambion網(wǎng)站)?？梢詫Ⅲw外翻譯與基因的轉(zhuǎn)錄相結(jié)合，以產(chǎn)生mRNA。這種偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系 統(tǒng)可以使用PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和/或插入標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)載體中的DNA序列，這些表達(dá)載體例如 BACs (細(xì)菌人工染色體)、YACs (酵母人工染色體)、黏粒、質(zhì)粒、噬菌體和/或其它已知的表 達(dá)載體中的DNA序列。偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)可從商業(yè)來源獲得(例如，Proteinscript II kit, Ambion, Austin, TX ；Quick Coupled System, Promega, Madison, WI ；Expressway, Invitrogen, Carlsbad, CA)。這些系統(tǒng)可以整合各種組分，以最佳化轉(zhuǎn)錄和翻譯的效果，例 如聚腺苷酸化的序列、共有核糖體結(jié)合(Kozak)序列、Shine-Dalgarno序列和/或其它本 領(lǐng)域所知的調(diào)節(jié)序列。被標(biāo)記蛋白質(zhì)可以在分析之前從粗體外翻譯混合物中純化，或可選地，可以不經(jīng) 純化就進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)純化的使用部分取決于是用粗RNA組分還是用純化RNA種類作為翻譯的模板。
在宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)可以將編碼感興趣的靶蛋白質(zhì)的核酸整合進(jìn)表達(dá)載體，以轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞和產(chǎn)生 編碼的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域已知的宿主細(xì)胞系的非限制性例子包括細(xì)菌如大腸桿菌(E.coli)、 酵母如畢赤酵母(pichia pastoris)以及哺乳動物細(xì)胞系，例如VER0細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞系、 中國倉鼠卵巢細(xì)胞系、人胚胎腎(HEK)293細(xì)胞、小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤N2A細(xì)胞，或W138、BHK、 C0S-1、C0S-7、293、H印G2、3T3、RIN、L-929和MDCK細(xì)胞系。這些和其它宿主細(xì)胞系可以從 標(biāo)準(zhǔn)來源獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(R0ckville，MD)或商業(yè)賣主。可以表達(dá)完整的基因，或可以表達(dá)編碼部分蛋白質(zhì)的基因片段。通過標(biāo)準(zhǔn)克隆技 術(shù)，可以將編碼感興趣的蛋白質(zhì)(多種蛋白質(zhì))的基因或基因片段插入表達(dá)載體。通過已知 技術(shù)，可以制備含有在給定細(xì)胞或組織類型中表達(dá)的部分或全部信使RNA的表達(dá)文庫?？?以篩選這些文庫，篩選編碼特定的感興趣的蛋白質(zhì)的克隆，例如使用抗體或寡核苷酸探針 以及已知的篩選技術(shù)。通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可以進(jìn)行基因工程，使DNA片段(多個片段)在原核或真 核體系中表達(dá)。任何已知的表達(dá)系統(tǒng)可用于蛋白質(zhì)表達(dá)。表達(dá)載體可以包括各種已知的蛋 白質(zhì)表達(dá)調(diào)節(jié)元件，例如啟動子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止序列、聚腺苷酸化位點(diǎn)等。在細(xì)菌表達(dá)載體中常規(guī)使用的啟動子包括0 -內(nèi)酰胺酶、乳糖和色氨酸啟動子系 統(tǒng)。酵母表達(dá)載體中的合適的啟動子序列包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動 子。用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的啟動子可以來源于哺乳動物細(xì)胞的基因組(例如金屬硫蛋白 啟動子)或來源于哺乳動物病毒(例如腺病毒晚期啟動子或SV40的早期和晚期啟動子)。 許多其它啟動子是已知的，并可以被用于所公開方法的實(shí)踐中。使用的真核表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于，用例如重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)， 或用重組花椰菜花葉病毒或煙草花葉病毒感染的植物細(xì)胞系統(tǒng)。在示例性昆蟲細(xì)胞系統(tǒng) 中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒被用作載體，以在草地夜蛾 (Spodopterafrugiperda)細(xì)胞或 Hi5 細(xì)胞系(Invitrogen, Carlsbad, CA)中表達(dá)夕卜源基 因。核酸編碼序列被克隆到例如在多角體蛋白啟動子的控制下的病毒的多角體蛋白基因 中。包含克隆基因的重組病毒然后被用于感染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞， 并表達(dá)插入的基因(例如，美國專利4，215，051 ；Kitts等，Biotechniques 14:810-817， 1993 ；Lucklow等，J. Virol. ,67 =4566-79,1993)。其它示例性昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體基于桿狀 病毒載體，例如 pBlueBac (Invitrogen, Sorrento, CA)。在哺乳動物細(xì)胞系中的示例性表達(dá)系統(tǒng)可以用腺病毒作為表達(dá)載體。編碼序列可 以被連接到例如腺病毒晚期啟動子上。可以通過體外或體內(nèi)重組，將克隆的基因插入到腺 病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)(例如E1或E3區(qū))中的插入形成能夠在哺乳動 物宿主細(xì)胞中感染和表達(dá)克隆蛋白質(zhì)的重組病毒。這些公開的例子不是限制性的，可以使 用任何已知的表達(dá)載體。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以與未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇區(qū)分開。可以使用許多選擇系 統(tǒng)，包括但不限于，胸腺嘧啶核苷激酶基因、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因、氨甲蝶 呤抗性基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和潮霉素抗性基因。包含在標(biāo)準(zhǔn)克隆載體中的這些基因要么將抗性賦予細(xì)胞毒劑，要么允許細(xì)胞在養(yǎng)分缺乏的培養(yǎng)基中生長。被表達(dá)的蛋白質(zhì)可以在分析之前被部分或完全純化。通過將被克隆的序列表達(dá) 為包含短前導(dǎo)序列的融合蛋白，可以協(xié)助蛋白質(zhì)的純化，該短前導(dǎo)序列允許快速親和純化。 這種融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的例子是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Pharmacia，Piscataway, NJ)、 麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)(NEB, Beverley, MA)、FLAG 系統(tǒng)(IBI, New Haven, CT)和 6xHis 系統(tǒng) (Qiagen, Chatsworth, CA)。前導(dǎo)序列可以通過蛋白酶的特異性識別位點(diǎn)與蛋白質(zhì)連接，允 許在分析蛋白質(zhì)前移去該前導(dǎo)序列。合適的蛋白酶識別序列的例子包括那些被煙草蝕刻 病毒蛋白酶(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)或 Factor Xa(New England Biolabs, Beverley, MA)識別的序列?？蛇x地，被表達(dá)的蛋白質(zhì)可以通過上面討論的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化。雖然上述方法涉及蛋白質(zhì)的分析，但它們也能夠用于其它類型分析物的分析。例 如，可在被標(biāo)記的單糖和多糖中培育的細(xì)胞可以被純化以及鑒定和/或測序，如這里所述。 可以將被標(biāo)記的亞基(如單糖)衍生化，以防止它代謝和轉(zhuǎn)化為不同的結(jié)構(gòu)。這些分析物 的亞基和聚合物形式是本領(lǐng)域已知的。
蛋白質(zhì)的標(biāo)記待分析的蛋白質(zhì)可以包括被標(biāo)記的氨基酸殘基?？梢杂帽绢I(lǐng)域所知的任何方法標(biāo) 記氨基酸。被標(biāo)記的氨基酸殘基可以在合成過程中被整合到蛋白質(zhì)中?？蛇x地，可以在蛋 白質(zhì)合成之后，通過共價或非共價鍵合，將標(biāo)記物連接到氨基酸殘基。在本公開的方法中使用的標(biāo)記物可以包括但不限于任何可通過電學(xué)技術(shù)、光學(xué)技 術(shù)、分光光度技術(shù)、光化學(xué)技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)、免疫化學(xué)技術(shù)和/或其它化學(xué)技術(shù)檢測的 成分。標(biāo)記物可包括但并不限于，導(dǎo)電標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、 生物發(fā)光標(biāo)記物和磷光標(biāo)記物、納米顆粒、金屬納米顆粒、金納米顆粒、銀納米顆粒、色原、 抗體、抗體片段、基因工程抗體、酶、底物、輔因子、抑制劑、結(jié)合蛋白、磁性顆粒以及自旋標(biāo) 記物?？梢允褂玫目晒鈾z測標(biāo)記物的非限制性例子包括丹磺酰氯、異硫氰酸羅丹明、 TRIT (四甲基羅丹明異硫醇)、NBD (7-硝基苯并_2_噁-1，3- 二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯 二甲酸、對苯二酸、間苯二酸、甲酚固紫、甲酚藍(lán)紫、亮甲酚藍(lán)、對氨基苯甲酸、藻紅、生物素、 地高辛、熒光素、5-羧基-4'，5' -二氯-2'，V -二甲氧基熒光素、5-羧基-2'，4'， 5'，7' _四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、氨基吖啶、6-羧基羅丹明、6-羧基 四甲基氨基酞菁、次甲基偶氮(azomethine)、花菁、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、稀土金屬穴狀 化合物、三聯(lián)吡啶二胺銪、銪穴狀化合物或螯合物、二胺、雙花青、La Jolla藍(lán)色染料、別藻 藍(lán)蛋白、藻藍(lán)蛋白C、藻藍(lán)蛋白R、硫胺素、藻紅青素、藻紅素R、螢光素或吖啶鐺酯。這些以 及其它發(fā)光標(biāo)記物可以從商業(yè)渠道獲得，例如MolecularProbes (Eugene，OR)，并通過本領(lǐng) 域已知的方法，連接到氨基酸上?？蛇x地，某些預(yù)先被標(biāo)記的氨基酸是商業(yè)可得的(例如 MolecularProbes, Eugene, OR)。氨基酸殘基可以被標(biāo)記上可電檢測的標(biāo)記物，例如金屬納米顆粒。可以使用尺寸 在lnm到3nm之間的金或銀納米顆粒，但也可以使用其它不同尺寸和質(zhì)量的納米顆粒。制 備納米顆粒的方法是已知的。(參見，例如，美國專利號6，054，495 ；6, 127，120 ；6, 149, 868 ； Lee和Meisel，J. Phys. Chem. 86 :3391_3395，1982)。納米顆粒也可以從商業(yè)渠道獲得(例如 Nanoprobes Inc. , Yaphank, NY ；Polysciences, Inc. , Warrington, PA)。修飾的納 米顆粒是商業(yè)可得的，例如來自Nanoprobes，Inc. (Yaphank, NY)的Nanogold 納米顆粒。 Nanogold 納米顆?？梢杂脝蝹€或多個馬來酰亞胺、胺或其它基團(tuán)連接每個納米顆粒而 獲得。Nanogold 納米顆粒也可以以正電荷或負(fù)電荷形式得到?？梢栽诎被釟埢徽?合進(jìn)蛋白質(zhì)之前或之后，將這種被修飾的納米顆粒共價地連接到該氨基酸殘基上?？梢詫?納米顆?；蚱渌鼧?biāo)記物通過任何已知的連接化合物(linker compound)連接到氨基酸殘基 上，以降低空間位阻和促進(jìn)蛋白質(zhì)的聚合。被標(biāo)記的氨基酸殘基可以被整合進(jìn)由核酸模板制得的蛋白質(zhì)?？蛇x地，可在蛋白 質(zhì)合成后，將標(biāo)記物連接到特定類型的氨基酸殘基。在一些方法中，可以通過抗體-抗原相 互作用連接標(biāo)記物?？梢詫?biāo)記物如熒光素或生物素連接到蛋白質(zhì)分子的一個末端，例如 N-末端或C-末端。用側(cè)鏈特異性和/或選擇性的試劑，可以在翻譯后標(biāo)記蛋白質(zhì)。這些試劑以及翻 譯后修飾的方法是本領(lǐng)域已知的?？墒褂玫姆窍拗菩缘氖纠栽噭┌ㄒ宜狒?賴氨酸、 半胱氨酸、絲氨酸和酪氨酸)；三硝基苯磺酸鹽/酯(賴氨酸)；碳二亞胺(谷氨酸、天冬氨 酸)；苯甲酰甲醛(精氨酸)；2，3_ 丁二酮(精氨酸)；磷酸吡哆醛(賴氨酸)；對氯汞苯甲 酸(半胱氨酸)；5，5' -二硫代雙(2-硝基-苯甲酸)(半胱氨酸)；焦碳酸二乙酯(賴氨 酸、組氨酸)；N-溴丁二酰亞胺(色氨酸)和四硝基甲烷(半胱氨酸、酪氨酸)?？梢詫@些 試劑進(jìn)行修飾，以連接各種類型的標(biāo)記物，例如拉曼標(biāo)記物?？蛇x地，包含與各種類型氨基 酸側(cè)鏈連接的活性基團(tuán)的拉曼標(biāo)記物和/或金納米顆粒可以從商業(yè)渠道獲得(Molecular Probes，Eugene，OR ；Nanoprobes, Inc.，Yaphank，NY)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的各種交聯(lián)劑，將標(biāo)記物連接到蛋白質(zhì)，例如同雙功能交聯(lián) 劑、異雙功能交聯(lián)劑和/或可光活化的交聯(lián)劑。這些試劑的非限制性例子包括雙酰亞胺鹽 (bisimidate) ； 1，5_ 二氟_2，4_ ( 二硝基苯)；辛二酸的N-琥珀酰亞胺酯；酒石酸二琥珀酰 亞胺酯；二甲基_3，3' - 二硫代-雙丙酰亞胺酯；N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代) 丙酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯氮化物；以及4-疊氮乙二醛。交聯(lián)劑的使用方法是本 領(lǐng)域熟知的。
納米孔、納米通道和納米管被標(biāo)記的蛋白質(zhì)或其它聚合物可以通過一個或多個納米孔、納米通道或納米管， 以便分析。如這里所使用，術(shù)語納米孔、納米管和納米通道被交換使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員會 認(rèn)識到，當(dāng)說明書提到納米孔時，不同的選擇方式可以使用納米通道或納米管。惟一的要求 是納米孔、納米通道或納米管將一個充滿流體的區(qū)室與另一個相連，并且允許被標(biāo)記蛋白 質(zhì)的通過和檢測。
尺寸特征使用的納米孔的直徑可以是大約0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或1 Onm。然而，該直徑 的范圍可以為 1-3、1-5、1-10、1-20、1-50、1-100、5-10、5-20、10-20、20-50、30-75、50-75、 50-100、75-100、100-300、300-400、400-500或 100-99911111?？梢赃x擇納米孔的直徑，以便一
次通過線性構(gòu)型的單個蛋白質(zhì)。在某些可選方式中，納米孔的直徑可以被選擇為太小，以致不能通過球狀或折疊構(gòu)象的蛋白質(zhì)。各種折疊和未折疊蛋白質(zhì)的尺寸是本領(lǐng)域已知的，并 可以通過已知技術(shù)如過濾或超離心進(jìn)行估計(jì)。可以用已知方法，將待分析的蛋白質(zhì)解折疊 和/或部分或全部變性，以促進(jìn)它們以線性構(gòu)象通過納米孔。這些方法包括但不限于，暴露 于堿性或酸性PH的介質(zhì)；使用高或低的鹽濃度；使用去污劑如十二烷基硫酸鈉、辛基葡糖 苷或Triton X-100 ；使用離液劑如脲或胍鹽(guanidinium)；用二硫化物還原劑如二硫蘇 糖醇或巰基乙醇處理；暴露于有機(jī)溶劑，等等?？蛇x地，可以通過蛋白質(zhì)的有限蛋白水解消 化，產(chǎn)生線性肽。當(dāng)氨基酸殘基要用大體積基團(tuán)標(biāo)記時，納米孔可以大一些，以允許被標(biāo)記 蛋白質(zhì)通過。在使用納米管或納米通道代替納米孔的選擇方式中，同樣的尺寸考慮適用于 納米管或納米通道的直徑或?qū)挾取?br> 納米孔、納米管和納米通道的制造單個地或以陣列形式制造納米孔、納米管和/或納米通道可以使用本領(lǐng)域已知的 任何納米級制造技術(shù)?？梢允褂靡阎募{米光刻方法(nanolithography methods)，在包 括傳感器層的固態(tài)基質(zhì)上，建造納米孔、納米通道和/或納米管，納米光刻方法包括但不限 于，化學(xué)氣相沉積、電化學(xué)沉積、化學(xué)沉積、電鍍、熱擴(kuò)散和蒸發(fā)、物理氣相沉積、溶膠_凝膠 沉積、聚焦電子束、聚焦離子束、分子束外延、蘸水筆納米光刻術(shù)、活性離子束蝕刻、化學(xué)輔 助離子束蝕刻、微波輔助等離子體蝕刻、電氧化、掃描探針方法、化學(xué)蝕刻、激光消融(laser ablation)或本領(lǐng)域已知的任何其它方法(例如美國專利US 6，146，227)。納米孔、納米管和/或納米通道可以穿透一層或多層傳感器層。傳感器層可以包 括半導(dǎo)體材料，這些半導(dǎo)體材料包括但不限于，硅、二氧化硅、四氮化三硅、鍺、砷化鎵和/ 或金屬基組分如金屬或金屬氧化物?？梢酝ㄟ^電子束、離子束和/或激光光刻以及蝕刻技 術(shù)，處理傳感器層，以形成通道、凹槽或孔。通過從掃描隧道顯微鏡(STM)或原子力顯微鏡 (AFM)的探針(tip)或從溶液進(jìn)行場蒸發(fā)，可以將包含金屬的導(dǎo)電層沉積在半導(dǎo)體表面。通 過將半導(dǎo)體表面氧化為絕緣成分，可以形成絕緣層。通過本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)，可以將通道或凹槽蝕刻進(jìn)半導(dǎo)體表面，這些技術(shù) 包括但不限于在氧化物蝕刻溶液中使用STM/SFM探針的方法。形成通道之后，可以使兩 個半導(dǎo)體表面相對，形成貫穿半導(dǎo)體的一個或多個納米孔或納米通道。采用本領(lǐng)域已知 的技術(shù)，可以使用STM探針方法，形成納米孔、納米檢測器、納米線(nanowire)、納米引線 (nanolead)、納米通道以及其它納米結(jié)構(gòu)?？梢允褂脪呙杼结?、化學(xué)蝕刻技術(shù)和/或微加工 技術(shù)，在半導(dǎo)體基板上切割出微米尺寸或納米尺寸的通道、凹槽或孔。可以采用納模塑法(nano-molding)，其中形成的納米管，例如碳納米管或金屬納 米管被放置在半導(dǎo)體芯片基板上或在半導(dǎo)體芯片基板上生長。在基板上沉積另外的材料之 后，將納米管移去，留下納米通道和/或納米孔壓印在基板材料中。這種納米結(jié)構(gòu)可以被建 造成具有分子電極性質(zhì)的簇，其可以起檢測器的作用。使用高通量電子束光亥 IJ 系統(tǒng)(high-throughput electron-beamlithography system)，可制造出納米孔和/或納米通道。電子束光刻可用來在硅芯片上寫出像5nm那么 小的特征。靈敏性抗蝕劑諸如聚甲基丙烯酸甲酯被涂布于硅的表面，可以不使用掩模而形 成圖案。電子束陣列可以與具有微通道放大器的場發(fā)射簇(field emitter cluster)結(jié) 合，以增加電子束的穩(wěn)定性，允許在低電流下的操作。SoftMask 計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)可以被用來控制在硅或者其它芯片上的納米級特征的電子束光刻。納米孔和/或納米通道可以用聚焦原子激光(例如，Bloch等，"Optics with an atom laser beam, “ Pgys. Rev. Lett. 87 :123_321，1)來制造。聚焦原子激光可以被用于 光刻法(lithography)，這很像標(biāo)準(zhǔn)激光或者聚焦電子束。這樣的技術(shù)可以在芯片上制造出 微米級或甚至納米級的結(jié)構(gòu)。在另一個可選方式中，可以使用蘸水筆納米光刻術(shù)形成納米 通道(例如，Ivanisevic 等,"Dip-Pen Nano 1 ithography on SemiconductorSurfaces, "J. Am. Chem. Soc.，123 =7887-7889,1)。蘸水筆納米光刻術(shù)使用AFM技術(shù)在表面如硅芯片上沉 積分子。尺寸上像15nm那么小的特征都可以被形成，具有l(wèi)Onm的空間分辨率。使用蘸水筆 納米光刻，結(jié)合常規(guī)的光刻(photolithography)技術(shù)，可形成納米孔和/或納米通道。例 如，抗蝕劑層上的微米級的線可以用標(biāo)準(zhǔn)的光刻術(shù)來形成。使用蘸水筆納米光刻，可以通過 沉積額外的抗蝕劑化合物來使線的寬度以及蝕刻之后通道的對應(yīng)直徑變窄。蝕刻更窄的線 之后，可形成納米級的通道?？蛇x地，可用AFM移除光致抗蝕劑(photoresist)材料以形成 納米級的特征。離子束光刻可用于在芯片上形成納米孔和/或納米通道(例如，Siegel，丨‘Ion Beam Lithography, “ VLSI Electronics, MicrostructureScience, <BR>Vol. 16, Einspruch and Watts Eds.，Academic Press, NewYork, 1987) 精細(xì)聚焦的離子束可被用 來直接在抗蝕劑層上寫出納米級痕跡而不使用掩模。可選地，寬的離子束可以與掩模結(jié)合 使用以形成小至lOOnm級別的痕跡?；瘜W(xué)蝕刻，例如氫氟酸蝕刻，可以用來移除未被抗蝕劑 保護(hù)的暴露的硅或其它芯片材料。技術(shù)人員將會意識到上面公開的技術(shù)并不是限制，納米 孔和/或納米通道可以使用本領(lǐng)域所知的任何方法來形成?？梢酝ㄟ^涂覆，修飾納米孔、納米管或納米通道的表面，例如，將表面從疏水性轉(zhuǎn) 化為親水性表面，和/或減少表面對聚合物如蛋白質(zhì)的吸附。常規(guī)芯片材料如玻璃、硅和/ 或石英的表面修飾在本領(lǐng)域是已知的(例如，美國專利us 6，263，286)。這些修飾可以包括 但不僅限于涂覆以可通過商業(yè)途徑獲得的毛細(xì)涂料(Supelco，Bellafonte, PA)、具有各種 官能團(tuán)諸如聚環(huán)氧乙烷或丙烯酰胺的硅烷，或者其它任何已知的涂料。當(dāng)這些涂料干擾標(biāo) 記物檢測，例如使用電檢測器時干擾電導(dǎo)率，它們是不合適的。
碳納米管納米孔可以包括納米管，可以與納米管連接，或被納米管取代，例如碳納米管?？?以將碳納米管涂覆有機(jī)或無機(jī)成分，在碳納米管上留下沉積層“模子(mold)”。當(dāng)納米管被 移去并與有機(jī)或無機(jī)沉積層分離時，可以在“模子”中形成納米孔或納米通道?？梢栽诎雽?dǎo) 體中形成碳納米管，而其它組件如傳感器層可以在納米管周圍形成?？梢杂没瘜W(xué)氣相沉積法(chemical vapor exposition，CVD)，制造碳納米管，采 用沉積在硅上的乙烯和鐵催化劑(例如，Cheung等PNAS 97 =3809-3813, 2000) 0可以使用 AFM Si3N4探針，通過CVD法，在硅芯片上形成單壁碳納米管(例如，Cheung等，2000 ；Wong 等Nature 394 =52-55,1998)。通過在高載荷( 1 y N)、高掃描速度(30Hz)和大掃描尺寸 (40 u m)下，與硅或CVD菱形表面(GE Suprabrasives，Worthington，0H)接觸幾分鐘，可以 在硅AFM探針上形成1-5 u m2的平坦表面。通過在2. IV時陽極化100秒，可以在AFM探針 末端制造大約lOOnm直徑、1 u m深的孔。可以將被陽極化的探針在0. 03% K0H的水溶液中蝕刻50秒，然后可用乙醇除去過量的硅，在探針的表面形成納米孔?？刹捎靡阎姆椒?，將碳納米管與AFM探針連接。例如，根據(jù)Murphy等的方法 (Austr. J. Soil Res. 13 =189-201,1975)，可以合成由氧化鐵納米顆粒組成的鐵催化劑。使 用-0. 5V時的鉬反電極可以從膠狀懸浮液將鐵催化劑(0. 5到4nm顆粒)電化學(xué)沉積到孔 中(Cheung等，2000)。可以在水中洗滌探針，以除去過量的氧化鐵顆粒。通過加熱，可以在 氧氣中氧化AFM探針，并通過在碳源存在下有控制地加熱和冷卻，在催化劑上生長碳納米 管(Murphy等，1975 ；Cheung等，2000)。形成的碳納米管的直徑應(yīng)當(dāng)對應(yīng)于所用的氧化鐵 催化劑的顆粒大小(0. 5到4nm)。在這些條件下制備的各個單壁碳納米管垂直于AFM探針 的平坦化表面排列?？梢酝ㄟ^已知的方法，除去殘留的鐵催化劑。用已知技術(shù)，可以將碳納米管切割為預(yù)先確定的長度。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式 中，用丙烯酸膠粘劑，可以將碳納米管連接到棱錐形鍍金硅懸臂上。通過在氧氣氛中，在 探針和鈮表面之間應(yīng)用偏電壓，可以將碳納米管縮短到確定長度(Wong等，Nature 394 52-55,1998)?？蛇x地，可以用高能量束使碳納米管變短。這種高能量束可以包括但不限于 激光束、離子束和電子束。截短碳納米管的可選方法是本領(lǐng)域已知的(例如，美國專利US 6，283，812)。可以將預(yù)先形成的碳納米管連接到芯片材料上，例如硅、玻璃、陶瓷、鍺、聚苯 乙烯和/或砷化鎵(例如美國專利US 6，283，812和6，062，931)。第一組碳納米管可以用作半導(dǎo)體芯片上的冷陰極發(fā)射體，和包含蛋白質(zhì)的第二 組納米管相連。當(dāng)應(yīng)用10到50伏特的外部電壓時，第一組納米管可以用于形成至少106 伏/cm的局部電場。第一組納米管中的該電場可以用于驅(qū)使蛋白質(zhì)通過第二組納米管， 或者產(chǎn)生電信號或電磁信號，以檢測被標(biāo)記的氨基酸殘基(Chuang等，2000 ；美國專利US 6，062，931)。來自第三組納米管的電磁輻射可以激發(fā)與通過第二組納米管的蛋白質(zhì)相連的 發(fā)光標(biāo)記物，導(dǎo)致發(fā)射被光檢測器檢測的光，該光檢測器與第一組納米管可操作地相連。
半導(dǎo)體芯片上的離子通道納米孔可以包括在脂質(zhì)雙層膜中的單個離子通道(例如，Kasianowitz等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 13770-13773,1996) 這種離子通道可以包括但不限于，金黃色葡 萄球菌(Staphylococcus aureus) a -溶血素和/或線粒體電壓依賴型陰離子通道。這些 離子通道可以在延長的時間期間保持開放。施加在蛋白質(zhì)上的電場可以使這些分子通過脂 質(zhì)雙層膜中的離子通道?？蓪㈦x子通道整合進(jìn)芯片，并與檢測器可操作地相連。
微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)可以將本公開設(shè)備中的納米孔、傳感器層和其它組件整合進(jìn)一個或多個微電子機(jī) 械系統(tǒng)(MEMS)中。MEMS是集成系統(tǒng)，其包括機(jī)械元件、執(zhí)行元件、控制元件、檢測器元件和 /或電子元件。所有這些組件可以用已知的微細(xì)加工技術(shù)在常規(guī)的芯片上制造，包括硅基基 材或其等同基材(例如 Voldman 等，Ann. Rev. Biomed Eng. 1 401-425,1999)。MEMS的電子組件可以用集成電路(IC)工藝制造(例如，CM0S、Bipolar或BICM0S 工藝)?？梢杂冒雽?dǎo)體芯片制造領(lǐng)域所知的照相平版印刷術(shù)(photolithographic)和蝕刻 方法使它們形成圖案。微機(jī)械組件可以用“微加工”工藝制造，選擇性地蝕刻掉部分硅片和 /或添加新的結(jié)構(gòu)層，以形成機(jī)械組件和/或機(jī)電組件。MEMS制造中的基礎(chǔ)技術(shù)包括，在基材上沉積材料的薄膜；通過照相平版印刷成像法或其它已知的平版印刷方法，在膜的上 面施加有圖案的掩模；以及選擇性地蝕刻這些膜。薄膜的厚度范圍可以是幾納米到100微 米。使用的沉積技術(shù)可以包括化學(xué)方法，例如化學(xué)氣相沉積(CVD)、電鍍、外延工藝和熱氧 化；以及物理方法，例如物理氣相沉積(PVD)和澆鑄(casting)?？梢杂眠@些已知的技術(shù)， 形成厚度為5nm或更小的傳感器層?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)的平版印刷(lithography)技術(shù)，形成微 米級或亞微米級的傳感器層，可操作地與檢測器和納米孔相連。制造方法是非限制性的，并可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，例如原子層沉積、脈 沖直流磁控濺射、真空蒸發(fā)、激光切割、注塑、分子束外延、蘸水筆納米光刻術(shù)、活性離子束 蝕刻、化學(xué)輔助離子束蝕刻、微波輔助等離子體蝕刻、聚焦離子束銑削、電子束或聚焦離子 束技術(shù)或壓印技術(shù)?？梢允褂弥圃旒{米機(jī)電系統(tǒng)的方法。(參見，例如，Craighead，Science 290:1532-36,0。)考慮，將設(shè)備的一些或所有組件建造為集成MEMS器件的一部分。采用本領(lǐng)域已知 的STM技術(shù)，包括導(dǎo)電金屬如金、鉬或銅的納米電極可以可操作地連接到納米孔、納米通道 和/或納米管(例如，Kolb等，Science 275 1097-1099，1997)。納米電極、檢測器和其它 組件可以通過納米線相連。
檢測器
光檢測器使用激發(fā)光源和光檢測器可以檢測標(biāo)記帶有光標(biāo)記物的氨基酸殘基(例如， Sepaniak 等，J. Microcol. Separations 1 155-157,1981 ；Foret 等，Electrophoresis 7 430-432，1986 ；Horokawa 等，J. Chromatog. 463 :39_491989 ；美國專利 US 5，302, 272.)。示 例性的光源包括二極管激光器、垂直腔表面發(fā)射激光器、邊發(fā)射激光器、表面發(fā)射激光器和 量子腔激光器(quantum cavity laser)，例如Continuum Corporation的釹釔鋁石榴石 (Nd :YAG)泵浦的鈦藍(lán)寶石(Ti sapphire)可調(diào)固態(tài)激光器和Lambda Physik激基泵浦的 染料激光器。示例性的光檢測器包括光敏二極管、雪崩光敏二極管、光電倍增管、多正極光 電倍增管、光電晶體管、真空光敏二極管、硅光敏二極管、光纖檢測器或光電晶體管檢測器 和電荷耦合器件(CCDs)。可以用雪崩光敏二極管(APD)檢測低的照明水平。APD方法使用 光敏二極管陣列，以達(dá)到電子倍增效應(yīng)(美國專利US 6，197，503)。使用已知的N阱互補(bǔ)型金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)工藝(OrbitSemiconductor， Sunnyvale, CA)，可以將光檢測器、光源和納米孔制造到半導(dǎo)體芯片中?？蛇x地，可以在絕 緣體上硅薄膜CMOS工藝(silicon-on-insulator CMOS process)中，制造檢測器、光源和 納米孔(美國專利US 6, 117, 643) 0在一些可選方式中，可以將二極管激光器照明裝置陣 列和CCD檢測器放置在半導(dǎo)體芯片上(美國專利US 4，874，492和5，061，067 ；Eggers等， BioTechniques 17:516-524,1994)?？蓪⒐鈾z測器垂直于光源放置，以使背景光最小化?？梢酝ㄟ^一層或多層不透光 層，使光源與光檢測器在光學(xué)上分離。通過發(fā)光標(biāo)記物的激發(fā)而產(chǎn)生的光子被光纖收集，并 被傳遞到芯片上的(XD檢測器(例如美國專利US 6，274，320)?？捎涗洐z測被標(biāo)記氨基酸 殘基的時間并形成氨基酸殘基距離圖。
可將光源如發(fā)光二極管和/或半導(dǎo)體激光器整合進(jìn)半導(dǎo)體芯片(美國專利US 6，197，503)。也可以將形成激光或二極管光束的衍射光學(xué)元件結(jié)合進(jìn)芯片。可使用488nm 處的空氣冷卻氬激光激發(fā)熒光素標(biāo)記的蛋白質(zhì)。通過包括光纖、棱鏡、成像光譜儀和0°C熱 電制冷CCD相機(jī)的光學(xué)系統(tǒng)，可以收集發(fā)射光。光檢測器的可選例子是本領(lǐng)域已知的(例 如美國專利US 5，143,8545)。
拉曼光譜法可以用拉曼光譜法，檢測被標(biāo)記的氨基酸殘基。在光譜光度測量檢測中使用的拉 曼標(biāo)記物是本領(lǐng)域熟知的(例如，美國專利US5，306，403 ；6，002，471 ；6, 174,677)。可以用 激光器、光敏二極管或其它光源激發(fā)被標(biāo)記的氨基酸殘基，并通過各種拉曼技術(shù)，檢測被激 發(fā)的氨基酸殘基，這些拉曼技術(shù)包括但不限于，表面增強(qiáng)拉曼光譜法(SERS)、表面增強(qiáng)共振 拉曼光譜法(SERRS)、標(biāo)準(zhǔn)拉曼散射、共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光譜法(CARS)、 受激拉曼散射、逆轉(zhuǎn)拉曼光譜法、受激增益拉曼光譜法、超拉曼散射、分子光學(xué)激光檢測器 (molecularoptical laser examiner (MOLE))或拉曼微探針或拉曼顯微法或共焦拉曼顯微 測譜術(shù)、三維或掃描拉曼、拉曼飽和光譜、時間分辨共振拉曼、拉曼去耦光譜法或紫外拉曼 顯微法。在SERS和SERRS中，對于吸附在粗糙金屬表面如銀、金、鉬、銅或鋁表面上的分子 而言，拉曼檢測的靈敏度被增強(qiáng)106倍或更多倍?？梢杂美舾薪饘偃玢y或金，涂覆納米 孔和/或傳感器層的部分，以便產(chǎn)生增強(qiáng)的拉曼信號。
FRET檢測也可以用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，分析蛋白質(zhì)。FRET是一種光譜現(xiàn)象，用于檢 測熒光給體與受體分子之間的相近性。選擇給體和受體對，以便給體的熒光發(fā)射與受體的 激發(fā)譜重疊。當(dāng)兩個分子以小于100埃的距離相聯(lián)系時，給體的激發(fā)態(tài)能被非輻射地轉(zhuǎn)移 到受體。如果受體分子是熒光體，則其發(fā)射光被增強(qiáng)。FRET的構(gòu)成和使用方法是已知的(例 如美國專利US 5,866,336)。給體熒光體分子可以被連接到氨基酸殘基，而受體熒光體分子可以與納米孔或傳 感器層連接。在被光源激發(fā)之后，給體熒光體分子可以將其能量轉(zhuǎn)移給受體分子，形成受體 分子的增強(qiáng)熒光信號，可以被光檢測器檢測。
電檢測器當(dāng)被標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過納米孔時，電檢測器可以檢測來自導(dǎo)電層的電信號。電 信號的非限制性例子包括穿過納米孔測量的電流、電壓、阻抗、電容、電動勢、信號符號 (signal sign)、頻率或噪聲特征(noisesignature)。電檢測器可以與一層或多層導(dǎo)電層、 電源和一個或多個穿透導(dǎo)電層的納米孔可操作地連接。檢測器可以包括電流表、電壓表、電 容計(jì)和/或電導(dǎo)率表等。其它電組件如電阻和/或電容可以被包括在與檢測器相連的電路 中。在某些方法中，第一和第二緩沖液室可以充滿低電導(dǎo)率的緩沖水溶液?？梢越o納 米孔側(cè)部的導(dǎo)電層施加電位。當(dāng)只存在緩沖液時，導(dǎo)電層之間的電阻高。通過納米孔的蛋 白質(zhì)的未標(biāo)記區(qū)域的存在可以使跨過納米孔的電導(dǎo)率輕微提高。標(biāo)記有高導(dǎo)電性標(biāo)記物如金屬納米顆粒的氨基酸殘基的通過會導(dǎo)致電導(dǎo)率的提高，在檢測器產(chǎn)生可檢測信號?？梢詼y量可檢測電信號之間的時間間隔，并用于形成距離圖，其表示對于每一類型的被標(biāo)記氨 基酸，被標(biāo)記氨基酸殘基在蛋白質(zhì)分子上的位置。通過與已知蛋白質(zhì)序列比較，可使用距離 圖(多個距離圖)，鑒定蛋白質(zhì)。通過匯編20種氨基酸殘基中每一種的這種圖，確定蛋白質(zhì) 的完整序列是可能的。
實(shí)施例
實(shí)施例1 蛋白質(zhì)鑒定和/或測序的設(shè)備圖2和圖3提供分析蛋白質(zhì)230、310的方法和設(shè)備的非限制性例子。設(shè)備可以包 括一個或多個次級器件200、300。各個次級器件200、300可以包括充滿流體的第一室280、 350和第二室290、360，它們被傳感器層212、323隔開。一個或多個納米孔255、330可以延 伸通過傳感器層212、323，并允許被標(biāo)記蛋白質(zhì)230、310通過。納米孔255、330可以可操作 地連接到一個或多個檢測器257、345，這些檢測器在被標(biāo)記氨基酸殘基235、245、315通過 納米孔255、330時，可以檢測它們。在第一和第二室280、350、290、360中的電極262、264、 350、355可以用于產(chǎn)生電場，該電場驅(qū)使被標(biāo)記蛋白質(zhì)230、310從第一室280、350通過納 米孔255、330到第二室290、360。通過電壓調(diào)節(jié)器260、335，可以控制電梯度(electrical gradient)，該電壓調(diào)節(jié)器可以與計(jì)算機(jī)265、340可操作地連接。電梯度的性質(zhì)是非限制性 的，使用的電壓可以是交流電、直流電、脈沖場直流電(pulse field direct current)、反 相電流或其它任何已知類型的電梯度。
構(gòu)建傳感器層如圖3所說明，可使用照相平版印刷術(shù)，在硅基板上構(gòu)建多層面結(jié)構(gòu) (multiplaner structure) (0. 5X0. 5 μ m)陣列，每個結(jié)構(gòu)具有硅基支持物和一層或多層金 膜或其它導(dǎo)電層327，這些導(dǎo)電層被一層或多層絕緣層325分離，絕緣層包括例如氧化硅。 其它絕緣層325覆蓋在頂導(dǎo)電層和底導(dǎo)電層327上，使傳感器層323與第一室350和第二 室360中的介質(zhì)絕緣。可以用標(biāo)準(zhǔn)的半導(dǎo)體技術(shù)，在芯片上形成導(dǎo)電層和絕緣層325、327?？梢詫鄬用娼Y(jié)構(gòu)的芯片分成兩個或多個部分?？稍诿總€芯片部分的側(cè)部 上，垂直于導(dǎo)電層和絕緣層，涂覆抗蝕劑層?？捎肁FM/STP探針，在覆蓋各個結(jié)構(gòu)的抗蝕劑 層中蝕刻5-lOnm的線?？捎没瘜W(xué)蝕刻，在每個結(jié)構(gòu)中形成納米尺寸的凹槽。當(dāng)芯片部件被 對齊并融合在一起時，這些凹槽形成延伸通過傳感器層323的納米孔330。用上述已知的方 法，可以形成連接導(dǎo)電層327與電檢測器345的納米線。這些納米線可用于在導(dǎo)電層327 上施加電壓。隨著標(biāo)記有導(dǎo)電標(biāo)記物如金納米顆粒315的蛋白質(zhì)310通過納米孔330，可以 檢測電流、電阻和/或其它電性質(zhì)的變化。在光刻和蝕刻之前，可以在被分割芯片的側(cè)部上 形成絕緣材料的薄層，以阻止電流通過納米孔330。在可選的器件200中，如圖2所示例，傳感器層212可以包括一層或多層不透光層 215和感光層(photon sensing layer) 220，其覆蓋在支持層225上，用以對標(biāo)記有光標(biāo)記 物235、245的氨基酸殘基進(jìn)行光檢測。不透光層215可以由任何已知的不透光材料制成， 例如鉻、銀或金金屬的薄層。類似地，感光層220可以由在光標(biāo)記物235、245發(fā)射的光波長處相對半透明的任何材料制成，例如玻璃、硅或某種塑料。多種材料和結(jié)構(gòu)可用于感光層220。在某些非限制性的例子中，感光層220可以 用于簡單地將光引導(dǎo)到光檢測器257的感光元件。在其它可選方式中，可以將感光元件結(jié) 合到納米孔255中。例如，通過用不同類型的材料(例如，P摻雜和N摻雜的硅或砷化鎵 (GaAs))形成層，或通過在納米孔255的內(nèi)部表面涂覆上不同類型的半導(dǎo)體材料，可以將感 光PN結(jié)直接制造在圍繞納米孔255的感光層220中。形成P摻雜和N摻雜半導(dǎo)體層的方法 在計(jì)算機(jī)芯片和/或光變換器(opticaltransducer)制造領(lǐng)域是熟知的。光變換器將光信 號變換為對應(yīng)的電信號?？捎糜跈z測光發(fā)射的不同類型的已知光傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)包括那些基于光 導(dǎo)材料、光伏元件(光電元件)、光電發(fā)射材料(光電倍增管、光電管)和半導(dǎo)體pn結(jié)(光 電二極管)的結(jié)構(gòu)。在光導(dǎo)元件中，半導(dǎo)體例如CdS、PbS、PbSe、InSb, InAs、HgCdTe或PbSnTe的行為 如同電阻。半導(dǎo)體串聯(lián)在一起，具有恒定的電壓源和負(fù)載電阻。負(fù)載電阻上的電壓用于測 量半導(dǎo)體材料的電阻。入射輻射，例如以來自標(biāo)記氨基酸殘基的發(fā)射光形式，導(dǎo)致帶隙激發(fā) 并降低了半導(dǎo)體的電阻。光敏二極管包含反相偏壓半導(dǎo)體pn結(jié)。P型半導(dǎo)體(例如摻硼的硅、摻鈹?shù)腉aAs) 具有過剩的電子空穴，而η型半導(dǎo)體(例如摻磷的硅、摻硅的GaAs)具有過剩的電子。在反 相偏壓下，耗盡層在P型和η型半導(dǎo)體之間的pn結(jié)處形成。當(dāng)施加外部電勢時，反相偏壓 被引發(fā)，迫使P型半導(dǎo)體中的電子空穴和η型半導(dǎo)體中的過剩電子從pn結(jié)遷移。當(dāng)材料被 照射時，形成電子-空穴對，其在偏壓下移動，形成通過pn結(jié)的臨時電流。可以將光敏二極 管和其它類型的光傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)整合進(jìn)納米孔255，并用作光檢測器257的感光元件?？梢栽谛酒贤扛簿酆衔锊牧希栽鰪?qiáng)信號檢測。這種聚合物材料可以包括，但 不限于，聚甲基丙烯酸甲酯、紫外可固化聚氨酯和環(huán)氧化合物以及其它具有光學(xué)透明性、 在激發(fā)波長處具有低熒光性、具有導(dǎo)電性和/或絕緣性的聚合物。這些材料可以被形成合 適的結(jié)構(gòu)，例如通過聚合物澆鑄和化學(xué)或光化學(xué)固化方法(Kim等，Nature 376 =581-584, 1995)。
實(shí)施例2 光檢測如圖2所說明，標(biāo)記有光標(biāo)記物235的氨基酸殘基被光源210如激光器激發(fā)。激 發(fā)光通過第一室280中的透明窗240，將光標(biāo)記物235激發(fā)到較高能量狀態(tài)。被標(biāo)記的氨基 酸通過不透光層215，切斷激發(fā)光的來源并使光檢測器257屏蔽光源210。當(dāng)光標(biāo)記物235 通過感光層220時，它發(fā)射光子，并返回未激發(fā)狀態(tài)245。發(fā)射的光可以被光檢測器257檢 測。被檢測的信號可以被放大器270放大，并被計(jì)算機(jī)265儲存和/或處理。計(jì)算機(jī)265 也可以記錄每個被標(biāo)記的氨基酸通過納米孔255的時間，使得可以計(jì)算相鄰被標(biāo)記氨基酸 殘基之間的距離和匯編每種被標(biāo)記氨基酸的距離圖。在示例性方法中，可以使用高度靈敏的冷卻CCD 檢測器257。冷卻CCD檢測器 257具有高達(dá)80%的單光子檢測概率、高的空間分辨象素尺寸(5微米)和通過近紅外 光譜可見的靈敏度。(Sheppard，Confocal Microscopy :Basic Principles and System Performance in !Multidimensional Microscopy, Cheng et al. Eds.，Springer-Verlag, NewYork, NY pp. 1-51，1994.)。在其它例子中，可以使用卷絲圖像強(qiáng)化耦合器件(coiledimage-intensified coupling device (ICCD))，作為光檢測器257，其接近單光子計(jì)數(shù)水平 (美國專利US 6，147，198)。納米通道板起光電倍增管的作用，其中少量光子觸發(fā)撞擊在磷 光屏上的電子的雪崩，產(chǎn)生受照的圖像。磷光圖像被通過光纖耦合器連接于放大器270的 CXD芯片區(qū)域257感知。芯片上的CXD檢測器257對紫外光、可見光和/或紅外光譜的光敏 感(美國專利US 5，846，708)。
實(shí)施例3 電檢測
如圖3所說明，氨基酸殘基可以被標(biāo)記上標(biāo)記物315，根據(jù)其電性質(zhì)，可以被檢測。 在一個非限制性例子中，該標(biāo)記物315可以包括金納米顆粒315。當(dāng)連接有金納米顆粒315 的氨基酸殘基通過納米孔330時，它在納米孔330的電導(dǎo)率、電阻和其它電性質(zhì)上產(chǎn)生可檢 測的變化。納米孔330側(cè)部的導(dǎo)電層327與電檢測器345可操作地連接，該電檢測器可以 檢測任何電信號，例如電壓、電導(dǎo)、電阻、電容等。可以將檢測器345與計(jì)算機(jī)340可操作地 連接，以處理和儲存數(shù)據(jù)?？梢詷?gòu)建顯示被標(biāo)記氨基酸殘基之間距離的距離圖，并用于鑒定 和/或測序被標(biāo)記的蛋白質(zhì)。直徑為2到5nm的納米孔可以提供第一室350和第二室360之間的流體交通。 可以合成標(biāo)記有Inm金納米顆粒315的蛋白質(zhì)310和/或?qū)⑺胖迷诘谝皇?50中。電 檢測器345如電壓檢測器345和電源可以與納米孔330側(cè)部的導(dǎo)電層327可操作地相 連。使用 AxopatchA (Axon Instruments, Foster City，CA)或 Dagan 3900A 膜片鉗放大 器(patchclamp amplifier) (Dagan Instruments, Minneapolis, MN),可將流過納米孑L 330的電流轉(zhuǎn)化為電壓，并放大。采用Frequency Devices (Haverhill, ΜΑ)低通Bessel 過濾器過濾信號。使用 National Instruments (Austin, TX) AT-MI0-16-X 16 位操作臺和 LAN WIND0WS/CVI程序，數(shù)字化數(shù)據(jù)。使用一種高導(dǎo)磁率合金(mu-metal)箱(Amuneal， Philadelphia, PA)，使芯片屏蔽電和磁的噪聲源(參見，kasianowicz等，1996)。
實(shí)施例4:標(biāo)記蛋白質(zhì)對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記的示例性方法在圖4至圖7中公開。如圖所示，半胱氨酸殘基被 特定地用巰基特異性試劑標(biāo)記。通過暴露于已知的硫醇還原劑，如二硫蘇糖醇或β-巰基 乙醇，將蛋白質(zhì)410中天然存在的半胱氨酸殘基從二硫化物還原。在移除過量的還原劑后， 例如通過超過濾或在凝膠滲透柱上柱層析，包含被還原半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)410可以用 硫醇特異性試劑420標(biāo)記。在一個非限制性例子中，acrydite ( 一種丙烯酰胺)標(biāo)記物420 可以與內(nèi)源性半胱氨酸反應(yīng)，產(chǎn)生被標(biāo)記的蛋白質(zhì)430?？蛇x地，胺標(biāo)記物430可以通過暴 露于N-琥珀酰亞胺基-4-馬來酰亞胺丁酸酯(或鹽)450被活化?；罨鶊F(tuán)450共價地結(jié) 合于胺標(biāo)記物440。然后，被活化的復(fù)合物460結(jié)合于巰基，導(dǎo)致被標(biāo)記蛋白質(zhì)470的形成。圖5說明，在胺殘基如賴氨酸、精氨酸和蛋白質(zhì)510的N末端殘基上標(biāo)記蛋白質(zhì) 510的示例性方法。如圖5所示，蛋白質(zhì)510上的胺殘基可以通過與試劑520如N-琥珀酰 亞胺基-4-馬來酰亞胺丁酸酯(或鹽)反應(yīng)被活化。然后被活化的蛋白質(zhì)530可以與硫醇 化標(biāo)記物540反應(yīng)，形成共價鍵并產(chǎn)生被標(biāo)記蛋白質(zhì)550。在另一個非限制性例子中，水溶 性碳二亞胺570如EDACd-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺)可以用于交聯(lián)蛋白質(zhì) 510上的胺殘基與羧基化標(biāo)記物560。碳二亞胺570與標(biāo)記物結(jié)合并活化該標(biāo)記物，形成被活化的中間體580，其可與胺殘基共價地鍵合。碳二亞胺活化基團(tuán)570被消除而形成被標(biāo)記的蛋白質(zhì)590。圖6顯示，在羧基殘基如谷氨酸、天冬氨酸和C末端殘基上標(biāo)記蛋白質(zhì)610的示例 性方法。通過與水溶性碳二亞胺615如EDAC反應(yīng)，可以活化含有羧基殘基的蛋白質(zhì)610，然 后與胺標(biāo)記物625反應(yīng)，形成被標(biāo)記的蛋白質(zhì)630。可選地，可以通過與EDAC 615和半胱 胺635同時反應(yīng)，活化蛋白質(zhì)610上的羧基殘基。這導(dǎo)致二硫化物修飾的蛋白質(zhì)640的形 成，其可以與acrydite (—種丙烯酰胺)標(biāo)記物645反應(yīng)，形成被標(biāo)記的蛋白質(zhì)650。在另 一個可選方式中，可以通過與EDAC615和半胱胺635反應(yīng)，以及被活化蛋白質(zhì)640與馬來酰 亞胺標(biāo)記物655反應(yīng)，活化蛋白質(zhì)610上的羧基殘基，形成被標(biāo)記的蛋白質(zhì)660。圖7說明，在絲氨酸、蘇氨酸殘基或糖基化殘基上標(biāo)記蛋白質(zhì)的示例性方法。糖蛋 白710可以用過碘酸鹽715氧化，產(chǎn)生二醛糖衍生物720。二醛720將與胺標(biāo)記物725自發(fā) 地反應(yīng)，形成希夫堿(Schiff' sbase)標(biāo)記的蛋白質(zhì)730。希夫堿730反應(yīng)是可逆的。例 如，用硼氫化鈉735還原，形成不可逆地標(biāo)記的蛋白質(zhì)740。在另一個可選方式中，蛋白質(zhì) 745上的絲氨酸或蘇氨酸殘基可以被氧化，例如用半乳糖氧化酶750，形成醛衍生化的蛋白 質(zhì)755。醛衍生化的蛋白質(zhì)755可以與胺標(biāo)記物725反應(yīng)，形成希夫堿標(biāo)記的蛋白質(zhì)760。 同樣，用硼氫化鈉735還原，產(chǎn)生不可逆地標(biāo)記的蛋白質(zhì)765。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，這些公開的方法只是示例性的。用于標(biāo)記側(cè)鏈特異 蛋白質(zhì)的許多方法是本領(lǐng)域已知的(例如，Bell和Bell，Proteins and Enzymes, Ch. 7， pp. 132-183, Prentice-Hall, Inc. , EnglewoodCliffs, NJ, 1988)，而且可以使用任何這樣的 已知方法，用光標(biāo)記物、電標(biāo)記物或這里公開的其它任何類型的標(biāo)記物或本領(lǐng)域已知的其 它標(biāo)記物標(biāo)記蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5 分析物的拉曼檢測
方法和設(shè)備在某些非限制性方法中，可使用拉曼光譜法分析分析物。在一個非限制性的例子 中，拉曼檢測單元的激發(fā)光束由鈦藍(lán)寶石激光器(Mira by Coherent)產(chǎn)生，波長為近紅 外波長(750-950nm)，或由鎵鋁砷化物二極管激光器(PI-ECL系列，Process Instruments) 產(chǎn)生，波長為785nm或830nm。使用脈沖激光束或連續(xù)光束。將激發(fā)光束通過分色鏡(Kaiser Optical的全息階式濾波器或Chroma或Omega Optical的雙色干涉濾光器)，成為與收集 的光束共線的幾何形狀。透射的光束通過顯微鏡物鏡(Nikon LU系列)，被聚焦在放置有目 標(biāo)分析物(核苷酸或嘌呤或嘧啶堿基)的拉曼活性基質(zhì)上。來自分析物的拉曼散射光被同一顯微鏡物鏡收集，并通過分色鏡，到達(dá)拉曼檢測 器。拉曼檢測器包括聚焦透鏡、攝譜儀和陣列檢測器。聚焦透鏡聚焦拉曼散射光，通過攝譜 儀的入口狹縫。攝譜儀(ActonResearch)包括光柵，光柵按波長分散光線。分散的光線成 像在陣列檢測器(RoperScientific公司的背景照明深度耗盡CXD照相機(jī))上。陣列檢測 器與控制器電路相連，并與計(jì)算機(jī)連接，以傳輸數(shù)據(jù)及控制檢測器功能。對于表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)，拉曼活性基質(zhì)由金屬納米顆?；蚋采w金屬的納米 結(jié)構(gòu)組成。用Lee和MeiselCJ· Phys. Chem. ,86 =3391,1982)的方法，制備銀納米顆粒，大小為5到200nm?？蛇x地，將樣品放置在顯微鏡物件下面的鋁基質(zhì)上。下面討論的附圖是 在鋁基質(zhì)上的靜止樣品中收集的。通過被照明樣品的光學(xué)采集體積(opticalcollection volume)，確定被檢測的分子數(shù)目。展示了低至單分子水平的檢測靈敏度。單個核苷酸也可通過SERS檢測，其中使用微流體通道。核苷酸可以通過微流體通道(約5到200μπι寬)被輸送到拉曼活性基質(zhì)。微流體通道可通過模塑聚 二甲基硅氧烷(PDMS)來制造，其中使用Anderson等公開的技術(shù)(“Fabrication of topologically complexthree-dimensional microfiuidic systems in PDMS by rapidprototyping, ” Anal. Chem. 72 :3158_3164，2000)。在存在銀納米顆粒的情況下進(jìn)行SERS時，核苷酸、嘌呤或嘧啶分析物與LiCl (最 終濃度為90 μ M)和納米顆粒(銀原子最終濃度為0. 25Μ)混合。采用室溫的分析物溶液， 收集SERS數(shù)據(jù)。也用拉曼光譜法，分析滾環(huán)擴(kuò)增制備的寡核苷酸。將1皮摩爾(pmol)的滾環(huán)擴(kuò) 增(RCA)引物加入到0. Ipmol的環(huán)形單鏈M13DNA模板中。用1XT7聚合酶160緩沖液 (20mM(毫摩爾)Tris-HCl、ρΗ7· 5、IOmM MgCl2、ImM 二硫蘇糖醇)、0· 5mM dNTPs 和 2. 5 單位 的T7DNA聚合酶，在37°C溫育該混合物2小時，形成RCA產(chǎn)物。通過混合和溫育不含DNA聚 合酶的相同試劑，制備陰性對照(negative control) 0將1 μ L的RCA產(chǎn)物和1 μ L的陰性對照樣品分開點(diǎn)放在鋁盤上并進(jìn)行空氣干燥。 用5μ L的IXPBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗每個點(diǎn)。重復(fù)沖洗三次，最后的沖洗完畢后，對鋁盤 進(jìn)行空氣干燥。用2mL蒸餾水稀釋1毫升銀膠體溶液。將8微升的稀釋銀膠體溶液與2 μ L 0.5Μ LiCl混合，并加入到鋁盤上的RCA產(chǎn)物點(diǎn)上。將同樣的溶液加入到陰性對照物點(diǎn)上。 按上面所述收集拉曼信號。
結(jié)果使用上述系統(tǒng)，通過SERS，分析核苷一磷酸、嘌呤堿基和嘧啶堿基。表1顯示各種 分析物的當(dāng)前檢測限。表1核苷一磷酸、嘌呤和嘧啶的SERS檢測 只對腺嘌呤核苷酸優(yōu)化了條件。確定LiCl (最終濃度為90 μ M)，以提供腺嘌呤核 苷酸的最佳SERS檢測。通過使用其它堿金屬鹵化物鹽例如NaCl、KCl、RbCl或CsCl，可有 助于其它核苷酸的檢測。要求保護(hù)的方法并不被所用的電解質(zhì)溶液限制，可以考慮使用其 它類型的電解質(zhì)溶液，例如MgCl、CaCl, NaF, KBr, LiI等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，不顯 示強(qiáng)拉曼信號的電解質(zhì)溶液將對核苷酸的SERS檢測提供最小的干擾。結(jié)果表明，上面公開 的拉曼檢測系統(tǒng)和方法能夠檢測和鑒定單個分子的分析物。圖8顯示四種不同類型核苷酸的IOOmM溶液的拉曼發(fā)射光譜，其中不存在表面增 強(qiáng)并且沒有拉曼標(biāo)記。溶液中不加入LiCl。使用10秒的數(shù)據(jù)收集時間。激發(fā)發(fā)生在514nm 處。較低濃度的核苷酸可用較長的收集時間、添加電解質(zhì)和/或表面增強(qiáng)進(jìn)行檢測。如圖 8所示，未增強(qiáng)的拉曼光譜顯示了四種未標(biāo)記核苷一磷酸中每一種的特征發(fā)射峰。表面增強(qiáng)拉曼發(fā)射光譜在存在LiCl和銀納米顆粒的情況下，從InM的鳥嘌呤溶 液、IOOnM的胞嘧啶溶液和IOOnM的胸腺嘧啶溶液獲得(未圖示)。使用785nm的激發(fā)波長。 各光譜顯示了可區(qū)分的拉曼發(fā)射峰(未圖示)。圖9顯示dATP (下曲線)和用熒光素標(biāo)記的dATP (上曲線)的500nM溶液的SERS 光譜,在 785nm 處激發(fā)。dATP-熒光素從 Roche AppliedScience (Indianapolis, IN)購得。 該圖表明，用熒光素標(biāo)記之后，SERS信號大大提高。RCA產(chǎn)物是SERS可檢測的，其中發(fā)射峰在約833和877nm處(未圖示)。在此方 案的條件下，用LiCl增強(qiáng)劑，腺嘌呤部分的信號強(qiáng)度強(qiáng)于鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的信 號強(qiáng)度。陰性對照(未圖示)表明，拉曼信號對RCA產(chǎn)物是特異性的，因?yàn)樵跊]有擴(kuò)增時未 觀察到信號。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，所公開的方法只是示例性的，公開的用于分析核苷 酸和寡核苷酸的拉曼檢測技術(shù)也可用于氨基酸和蛋白質(zhì)。采用所公開的技術(shù)，可以例如用 拉曼標(biāo)記，共價地標(biāo)記蛋白質(zhì)上特定類型的氨基酸殘基。被標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以通過納米孔， 并用例如拉曼光譜法檢測被標(biāo)記的殘基。如上所公開，可以用拉曼光譜法，在單分子水平， 檢測被標(biāo)記或未被標(biāo)記的殘基。對被標(biāo)記氨基酸殘基的檢測可以用于構(gòu)建距離圖、鑒定和 /或測序感興趣的蛋白質(zhì)或其它分析物。
實(shí)施例6 氨基酸、蛋白質(zhì)和肽的拉曼檢測如實(shí)施例5所公開，進(jìn)行氨基酸、蛋白質(zhì)和肽的拉曼光譜法。如圖10至圖17所示， 色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和酪氨酸的SERS光譜都顯示了可 區(qū)分的SERS光譜，其具有特征拉曼發(fā)射峰。氨基酸的衍生化也導(dǎo)致拉曼光譜的變化(比較 圖10與圖17，進(jìn)行ImM的色氨酸與5-氟色氨酸的SERS光譜比較)。氟殘基的連接導(dǎo)致色 氨酸的SERS光譜的明顯變化(圖10和圖17)。光譜也與氟殘基被連接的位置相關(guān)，5-氟 色氨酸(Sigma Chemicals, St. Louis,MO)產(chǎn)生了與6_氟色氨酸(未圖示)不同的SERS光譜。如前面的實(shí)施例所討論，結(jié)論是拉曼光譜技術(shù)如SERS可以用于鑒定和區(qū)分不同類型的氨基酸殘基。圖10至圖16所示的SERS光譜是從未標(biāo)記的氨基酸上獲得的。如圖9 所示，對于核苷酸殘基，用拉曼標(biāo)記物共價修飾可以使得衍生化殘基的信號強(qiáng)度大大提高。 如上所述，側(cè)鏈特異性標(biāo)記可以用于將不同類型的拉曼標(biāo)記連接到不同類型的氨基酸殘基 上。SERS光譜也從全蛋白質(zhì)上獲得。圖18顯示在鋁板上干燥的牛血清的示例性 SERS 光譜。在 829、839、848、852、865、872、877、886 和 896nm 處觀察到發(fā)射峰。牛血清 蛋白的SERS光譜是相似的，在光譜中只觀察到細(xì)小的差 別(未圖示)。全牛血清的SERS檢 測導(dǎo)致低到0. 血清的特征峰檢測(圖19和圖20)。圖19顯示了 100%全牛血清的SERS 光譜。將160 μ 1等分試樣的銀納米顆粒(用蒸餾水1 2稀釋)與20 μ 1牛血清和40 μ 1 0. 5Μ LiCl混合。收集時間為1秒，得到圖19所示的光譜。SERS光譜顯示，發(fā)射峰在826、 832、839、842、848、854、862、873、876 和 886nm 處。0. 1 %牛血清樣品也導(dǎo)致可檢測的 SERS 光譜(圖20)，可檢測的峰在842、848、854、876、882和886nm處。SERS光譜也從一系列肽獲得，這些肽由血清蛋白的胰蛋白酶消化而產(chǎn)生。通過在 C18柱上進(jìn)行反相HPLC，分離被消化的肽。在三氟乙酸鹽和丙烯腈的酸性混合物中，進(jìn)行肽 的洗脫。得到的肽用SERS光譜法分析(圖21)。可見，不同的肽顯示出可區(qū)分的SERS光 譜，不同大小的峰出現(xiàn)在 827、833、844、848、853、857、859、862、870、874 和 880nm 處。獲得的結(jié)果表明，SERS光譜可用于鑒定和區(qū)分蛋白質(zhì)或肽內(nèi)的不同類型的氨基酸 殘基，可以得到用于蛋白質(zhì)檢測、鑒定和/或測序的距離圖。根據(jù)本公開內(nèi)容，在沒有不適當(dāng)實(shí)驗(yàn)方法的情況下，可制造和使用這里公開的和 要求保護(hù)的所有方法和設(shè)備。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯而易見的是，在不偏離要求保護(hù)主 題的概念、精神和范圍的情況下，可以對這里所述的方法和設(shè)備進(jìn)行改變。更具體地，顯然， 化學(xué)及生理學(xué)關(guān)聯(lián)的某種試劑(物質(zhì))可以替代這里所述的試劑(物質(zhì))，而獲得相同的或 相似的結(jié)果。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有這些類似的替代和修飾都被認(rèn)為在所要求 保護(hù)主題的精神、范圍和概念之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種方法，包括a)獲得一種或多種被標(biāo)記的蛋白質(zhì)、多肽或肽；b)將所述被標(biāo)記的蛋白質(zhì)、多肽或肽通過一個或多個納米孔；c)檢測在所述被標(biāo)記的蛋白質(zhì)、多肽或肽中的被標(biāo)記氨基酸殘基；d)對于每種被標(biāo)記的氨基酸，匯編氨基酸距離圖；和e)基于所述距離圖，鑒定所述蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括a)將模板核酸放進(jìn)至少一個室中，每個室包含不同類型的被標(biāo)記氨基酸；和b)產(chǎn)生一種或多種由所述模板核酸編碼的被標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽或肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括a)從生物學(xué)樣品，獲得一種或多種蛋白質(zhì)、多肽或肽；和b)翻譯后標(biāo)記所述蛋白質(zhì)、多肽或肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)、多肽或肽是通過將所述距離圖與氨 基酸距離圖文庫比較而被鑒定的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)、多肽或肽是通過將所述距離圖與已 知蛋白質(zhì)的序列比較而被鑒定的。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中每個室與不同組的納米孔可操作地連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每個納米孔可操作地與檢測器相連。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中一次只有一個被標(biāo)記的蛋白質(zhì)、多肽或肽通過納 米孔。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述被標(biāo)記的氨基酸在每個室中的量為該室中相 同氨基酸總量的約0. 5%到約50%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中第一個被標(biāo)記的氨基酸通過所述納米孔與第二 個被標(biāo)記的氨基酸通過所述納米孔的時間長度對應(yīng)于沿所述被標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽或肽上所 述第一個氨基酸和第二個氨基酸之間的距離。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記物選自發(fā)光標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、磷光 標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、導(dǎo)電標(biāo)記物、核磁共振標(biāo)記物、質(zhì)譜標(biāo)記物、電子自旋共振標(biāo)記 物、電子順磁共振標(biāo)記物和拉曼標(biāo)記物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述被標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽或肽的至少一端被連接 到可鑒定的標(biāo)記物上。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述被標(biāo)記的氨基酸用光檢測器檢測。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述被標(biāo)記的氨基酸用電檢測器檢測。
15.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括分析來自各個室的被標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽或 肽的多樣性。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括，基于所述距離圖，確定所述蛋白質(zhì)、多肽 或肽的至少部分序列。
17.一種方法，包括a)用被標(biāo)記的亞基接觸一個或多個細(xì)胞；b)從所述細(xì)胞中獲得包括被標(biāo)記亞基的一個或多個拷貝的分子；c)使所述被標(biāo)記分子通過一個或多個納米孔；d)檢測所述被標(biāo)記分子上的被標(biāo)記亞基；e)匯編亞基距離圖；和f)由所述距離圖鑒定出所述分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述分子選自核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、 肽、多糖和脂類。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分子是蛋白質(zhì)、多肽或肽，并且所述細(xì)胞用 編碼所述蛋白質(zhì)、多肽或肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，進(jìn)一步包括用被標(biāo)記的亞基接觸至少兩組細(xì)胞，每 組細(xì)胞與不同類型的被標(biāo)記亞基接觸。
全文摘要
這里公開的方法和設(shè)備用于測序和/或鑒定蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。包含被標(biāo)記的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)可以被合成并通過納米孔。當(dāng)被標(biāo)記的氨基酸通過納米孔時，與納米孔可操作地相連的檢測器可以檢測它們?？梢詤R編每種被標(biāo)記氨基酸殘基的距離圖。距離圖可用于測序和/或鑒定蛋白質(zhì)。這里也公開了用于蛋白質(zhì)測序和/或鑒定的設(shè)備。在可選的方法中，用同樣的技術(shù)，可以分析其它類型的分析物。
文檔編號G01N33/53GK101846688SQ201010004769
公開日2010年9月29日 申請日期2003年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月29日
發(fā)明者A·伯林, X·蘇 申請人:英特爾公司