組織工程是旨在通過恢復器官功能來改善全世界數(shù)百萬人的生活質(zhì)量的新興領(lǐng)域。組織工程組合細胞和支架，以便發(fā)展3D結(jié)構(gòu)，以便在體外重新生成器官并重現(xiàn)疾病。除恢復器官功能之外，組織工程還可以提供重要的生物醫(yī)學應用，包括用于治療藥物和生物制劑的體外試驗的平臺、用于測試藥物毒性的平臺，用于對新設(shè)備和介入性技術(shù)的評估的平臺，以及用于發(fā)現(xiàn)新生物標志物的平臺。人類肝臟是分成多個功能子單元，稱為段(帶有單個門靜脈和動脈供應，肝臟靜脈和膽汁引流的8個段)和區(qū)段(共享血管和膽道蒂的更多段)的單一器官。這些解剖特征使人類肝臟分為可以用于肝臟切除和分段肝臟移植實踐中的多個功能子單元。傳統(tǒng)上，來自門靜脈和肝臟動脈系統(tǒng)的血以順行的方式灌注人類肝臟；血被肝臟靜脈系統(tǒng)排出，膽汁由肝臟通過膽管系統(tǒng)分泌。肝臟具有各種各樣的功能，包括解毒、蛋白質(zhì)合成，消化所需的生物化學物質(zhì)的產(chǎn)生，以及在碳水化合物和脂類代謝中起著關(guān)鍵作用。肝臟是存活所必需的；當前沒有長期補償肝功能不存在的辦法。此獨特功能是通過以構(gòu)成3D支架的細胞外基質(zhì)(ECM)-蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡嚴格地組織的實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞合作地形成。由于病毒感染、酒精及其他情況導致的肝臟疾病越來越多，當前，在英國，每年導致10,000人死亡，在美國，導致32,000人死亡。肝臟移植是晚期急性或慢性肝病的唯一有效的治療方案，并與極好的長期存活和生活質(zhì)量相關(guān)聯(lián)。然而，可供移植的肝源是有限的，需求卻是越來越大。等待時間越來越長，15％至25％的適于肝臟移植的人在等待中死亡或身體變得太差。開發(fā)人工肝臟將會減少由于肝臟疾病而導致的死亡，并將為沒有器官供移植的病人提供解決方案。另外，用于研究肝臟纖維化(HF)以及肝細胞癌(HCC)發(fā)展的所有模型具有固有的問題。如此，對2D單層單細胞培養(yǎng)或混合細胞培養(yǎng)的研究形成了大多數(shù)體外研究的主軸，但是，大大地遠離現(xiàn)實。另外，大多數(shù)動物模型，雖然與人類疾病共有許多特征，但是，不與人類共有相同的基因表達模式，它們作為體內(nèi)模型的有效性是有限的。如此，有開發(fā)再現(xiàn)人類疾病的復雜性的模型的尚未滿足的需求。近年來，評估了使用例如豬和羊之類的大型動物的肝臟，獲得用于利用人類細胞來再增殖的合適的支架的可能性。然而，除肝臟的新陳代謝能力的內(nèi)在差別之外，細胞外ECM支架在不同的物種中具有不同的宏觀特征和微觀特征。具體而言，人類肝臟的分段和分葉不如其他物種那么明顯。另外，人類肝臟的微觀小葉解剖和結(jié)構(gòu)是獨特的，并且不同于例如豬之類的其他哺乳動物，因為肝臟小葉之間的纖維化邊界在人類中不存在(并且，人類小葉結(jié)構(gòu)沒有正式的結(jié)構(gòu)邊界)。豬肝臟的典型的纖維化邊界的存在代表了在利用人類細胞再增殖之后從豬肝臟中獲取的支架用于人類的移植中的主要問題。實際上，豬的不同的結(jié)構(gòu)可能會導致門靜脈高壓，因為搭橋會容易導致正常人類肝臟中的流動阻塞。重現(xiàn)3D人類ECM蛋白質(zhì)的成份和組織的3D人類肝臟組織的體外發(fā)展是組織工程領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)之一。一種有前途的方法涉及通過組織去細胞化方法來制作生物支架。然而，由于人類所特有的并且不同于其他哺乳動物的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)的固有的差異，以前的其他作者的報告未能獲得3D人類肝臟支架。盡管報告了小鼠、大鼠、白鼬、羊和豬肝臟的去細胞化，但是，沒有出版物描述人類肝臟生物支架的成功產(chǎn)生。發(fā)明人認識到，可以使用包括利用不同的細胞破壞試劑的組的一個或多個處理循環(huán)的方法來去細胞化人類肝臟組織，而不會破壞細胞外基質(zhì)。這可以對維護人類肝臟的細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和形態(tài)的非細胞的支架的可重復的生產(chǎn)有用。本發(fā)明的一個方面提供生產(chǎn)人類肝臟支架的方法，包括(i)提供人類肝臟組織，(ii)以機械方式破壞組織中的細胞，(iii)對組織中的細胞施加滲透應力，(iv)可任選地使組織暴露于蛋白酶和/或DNA酶中，以及(v)使組織暴露于洗滌劑中，以及(vi)重復步驟(iii)、步驟(iv)和步驟(v)，以及可任選地，步驟(ii)中的每一個步驟一次或多次，由此，生產(chǎn)人類肝臟支架。在一些實施例中，該方法可以包括步驟(iv)。在其他實施例中，可以省略步驟(iv)(即，方法不包括步驟(iv))。通過要求保護的方法生產(chǎn)的人類肝臟支架包括非細胞的人類肝臟細胞外基質(zhì)(ECM)(即，支架是去細胞化的)，并保留源肝臟組織的ECM的三維結(jié)構(gòu)和生物活性。在細胞被以機械方式破壞之后，按順序使肝臟組織暴露于不同的去細胞化試劑(即，滲透應力試劑，蛋白酶/DNA酶和洗滌劑)中。步驟(iii)、(iv)和(v)，以及可任選地，步驟(ii)可以以任何順序執(zhí)行一次或多次，以去細胞化支架。在一些實施例中，可以以任何順序，對肝臟組織執(zhí)行包括步驟(iii)、(iv)和(v)，以及可任選地步驟(ii)中的任何一個、兩個或全部三個步驟的多個循環(huán)。在一些實施例中，步驟(ii)可以重復一次或多次。例如，可以對肝臟組織執(zhí)行包括步驟(ii)的多個循環(huán)。這可以例如當使用例如超聲波之類的非凍融技術(shù)來以機械方式破壞細胞時有用。優(yōu)選地，在步驟(iii)至(vi)中，對肝臟組織施加流體切應力。這會促進組織內(nèi)去細胞化試劑的滲透，例如，滲透到肝竇狀隙中，并將細胞和細胞碎片與細胞外基質(zhì)(ECM)分離?？梢允褂萌魏芜m當?shù)募夹g(shù)在肝臟組織中生成流體切應力，包括灌注、攪動或負壓。優(yōu)選地，通過灌注或攪動，在人類肝臟組織中生成流體切應力。對用于生成流體切應力的技術(shù)的選擇可以取決于肝臟組織或應用。例如，可以利用去細胞化試劑灌注整個肝臟、單瓣扇段，段或其他肝臟結(jié)構(gòu)單元以生成流體切應力。可以將例如肝臟組織塊(LTC)之類的小肝臟樣本浸入在去細胞化試劑中，并攪動以生成流體切應力。可以從不適合用于移植臨床用途的人類肝臟中獲取如此處所描述的用于去細胞化的人類肝臟組織。可以根據(jù)相應的國家法律和倫理原則，獲取合適的肝臟。在一些實施例中，肝臟組織可以是沒有表現(xiàn)出與損壞或疾病相關(guān)聯(lián)的病理的正常組織。在其他實施例中，肝臟組織可以是表現(xiàn)出與損傷或疾病相關(guān)聯(lián)的病理的病理組織。例如，肝臟組織可以是多脂的，纖維化的，發(fā)炎的或表現(xiàn)出與疾病或損傷相關(guān)聯(lián)的一個或多個其他特征。在一些實施例中，病理肝臟組織可以表現(xiàn)出與急性或慢性肝病相關(guān)聯(lián)的病理，包括病毒感染，例如甲肝、乙肝、丙肝、丁肝或戊肝、酒精或毒素損傷、肝臟纖維化(HF)、非酒精脂肪肝疾病(NAFLD)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、酒精性肝病、缺血性肝炎、巨細胞性肝炎，以及例如肝細胞癌(HCC)之類的肝癌。可另選地，病理肝臟組織可以表現(xiàn)出與影響肝臟的其他疾病相關(guān)聯(lián)的病理，例如淀粉樣變性。用病理肝臟組織產(chǎn)生的肝臟支架可能具有用健康肝臟組織產(chǎn)生的支架不同的結(jié)構(gòu)和成份。例如，與健康的肝臟組織相比，在從病理肝臟組織產(chǎn)生的支架中，病理支架的形態(tài)或例如膠原、肌腱蛋白和層粘連蛋白之類的ECM成份的量或相對量可能會改變。這可能對獲取用于疾病建模的特定疾病改變的肝臟支架有用?？梢詮幕加懈闻K疾病或影響肝臟的疾病(例如，以肝臟損傷或肝功能改變?yōu)樘卣鞯募膊?的個體獲取病理肝臟組織。如此處所描述的獲取和存儲用于去細胞化的肝臟組織的方法當前是已知的。例如，可以使肝臟肝素化以防止凝聚，和/或利用防凍劑灌注，以在融化之后減少或防止組織破壞。如此處所描述的適于去細胞化的人類肝臟組織可包括整個肝臟或肝臟的某些部分，包括肝臟功能單元，例如肝臟的葉瓣扇段、段或子段、或小樣本或切片。肝臟的一部分可以包括一個或多個肝臟功能單元，例如葉瓣扇段、段或子段。合適的功能單元可以是帶血管的和/或包括血管-膽道蒂。例如，肝臟組織可以包括人類肝臟的S8的子段，人類肝臟的段S1至S8中的一段或多段，或多段部分，例如左外側(cè)(S2+S3±S1)，左肝臟(S2+S3+S4+S1)、右肝臟(S5+S6+S7+S8)、右側(cè)肝臟(S6+S7)、右擴展肝臟(S4+S5+S6+S7+S8+S1)。在某些優(yōu)選實施例中，肝臟組織可以是人類肝臟的左側(cè)(S2+S3±S1)或左肝臟(S2+S3+S4+S1)部分。如此處所描述的去細胞化的肝臟組織的量和質(zhì)量可以取決于支架的計劃的用途。例如，用于移植的去細胞化的肝臟組織的質(zhì)量可以取決于個體的體重和個體中的功能性肝臟組織的量。在其他實施例中，該部分可以是寬度、長度和/或直徑為0.2-2cm，優(yōu)選地0.2-1.25cm，更優(yōu)選地0.2-1.0cm的小非血管化肝臟切片或楔形物(例如，具有0.008cm3至2cm3，更優(yōu)選地0.008cm3至1cm3，例如，大約0.125cm3體積的切片)。優(yōu)選地，切片是用于在標準實驗室容器，例如多孔板中操作的合適的大小，并可以是例如具有大約0.5cm的側(cè)邊的大致的立方體。小的非血管化肝臟切片或楔形物可以用于小規(guī)模地再現(xiàn)3D人類微環(huán)境的復雜性，用于肝臟疾病建模、藥物篩選、生物標志物識別和驗證以及疾病診斷的發(fā)展?？梢允褂媒M織切塊機、鉆取活檢、針吸活檢或通過對實質(zhì)的切片，例如方塊的簡單解剖刀切割，獲取合適的切片?？梢詮囊粋€肝臟中獲取如此處所描述的用于去細胞化的多個肝臟部分，如此，一個捐贈的人類肝臟可以用于一個以上的病人或可以同時用于臨床和疾病建模應用。方法可以包括提供丟棄的人類肝臟整體或其一部分。在如此處所描述的去細胞化之前，人類肝臟整體可以被分成一個或多個部分。在一些實施例中，可以在步驟(i)之前利用防凍劑處理人類肝臟組織。例如，在被凍結(jié)之前，可以利用細胞內(nèi)和/或細胞外的防凍劑處理組織。合適的防凍劑包括DMSO、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4，戊二醇(MPD)，以及蔗糖。在第一個去細胞化步驟中，對人類肝臟組織中的細胞進行機械破壞以促進它們的損壞和去除。可以通過破壞肝臟組織的細胞而不會影響細胞外基質(zhì)的任何合適的技術(shù)，包括凍/融、超聲處理，或高強度聚焦超聲(HIFU)，以機械方式破壞細胞。在一些實施例中，在初步處理之后，機械破壞技術(shù)可以不重復。例如，例如在暴露于其他去細胞化試劑之后的凍/融處理可能會導致ECM破壞。在其他實施例中，在初步處理之后，可以對肝臟組織中的細胞進行機械破壞一次或多次(例如，在上文的步驟(vi)中)。例如，可以對組織進行HIFU或超聲處理一次或多次。優(yōu)選地，通過對人類肝臟組織進行一個或多個凍/融循環(huán)處理，以機械方式破壞細胞。例如，可以在-20℃或更低，優(yōu)選地，-50℃或更低，-60℃或更低，-70℃或更低，凍結(jié)組織，然后，解凍一次或多次?？梢栽?℃至37℃方便地解凍被凍結(jié)的組織。在某些優(yōu)選實施例中，可以在大約4℃解凍組織，以最小化組織內(nèi)的可能會破壞ECM的溫度梯度。例如，可以在大約-80℃凍結(jié)組織達24小時或更長時間，然后，在大約4℃解凍。優(yōu)選地，經(jīng)凍結(jié)/融化的人類肝臟組織是干燥的以防止ECM破壞。在一些實施例中，可以在凍結(jié)/融化步驟之前，干燥人類肝臟組織，例如，在室溫下，暴露5至30分鐘?？梢栽诘葷B緩沖液中，例如鹽水，如0.90％(w/v)NaCl或PBS，對肝臟組織進行凍結(jié)/融化處理。在機械破壞之后，通過一系列的按順序的暴露于滲透試劑、酶和洗滌劑(即，去細胞化試劑)中的處理，去細胞化人類肝臟組織。這些按順序的對不同去細胞化試劑的暴露將細胞和細胞碎片與細胞外基質(zhì)(ECM)分離，并從肝臟組織去除它們。滲透應力會導致肝臟組織中的細胞的裂解，并放大機械破壞的效果。可以通過將組織暴露于對組織中的細胞具有不同的滲透壓力(即，非等滲試劑)的一種或多種滲透試劑中，產(chǎn)生滲透應力。可以將組織暴露于具有比細胞更低的滲透壓力的一種或多種低滲試劑，并使細胞處于低滲環(huán)境中和/或具有比細胞更高的滲透壓力的一種或多種高滲試劑中，并使細胞處于高滲環(huán)境中。在一些實施例中，可以優(yōu)選低滲試劑。高滲試劑可以，例如，在將DNA與蛋白質(zhì)分離時有用。合適的高滲試劑是本領(lǐng)域已知的，包括鹽水(例如，>0.9％(w/v)NaCl，例如3％至7％(w/v)NaCl)，可任選地，可以例如利用磷酸鹽、硼酸鹽或三羥甲基氨基甲烷，以及聚乙二醇溶液，緩沖該鹽水。低滲試劑可以，例如在通過簡單的滲透效應引起細胞裂解時有用，ECM的分子和結(jié)構(gòu)的變化最小。合適的低滲試劑是本領(lǐng)域已知的，包括水、去離子水和<0.9％(w/v)NaCl的鹽水。在一些實施例中，使用酶來破壞肝臟組織中的細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)，并斷開細胞與ECM的連接。例如，可以利用蛋白酶降解組織中的蛋白質(zhì)。合適的蛋白酶是本領(lǐng)域已知的，并包括胰蛋白酶。可以將肝臟組織暴露于0.0025-0.25％(w/v)胰蛋白酶，例如，0.025％胰蛋白酶中。在一些實施例中，可以將肝臟組織暴露于含有例如EDTA之類的螯合劑的溶液中的蛋白酶，螯合劑螯合例如Ca2+之類的二價金屬離子，并破壞細胞對ECM的粘附。在一系列暴露于去細胞化試劑的處理中，可以在暴露于洗滌劑之前，將肝臟組織暴露于蛋白酶。這會使通過蛋白酶與ECM分離的細胞或細胞物質(zhì)通過洗滌劑從組織中洗掉。在其他實施例中，可以不使用蛋白酶來去細胞化肝臟組織。在一些實施例中，可以利用脫氧核糖核酸酶(DNA酶)來降解組織中的基因組結(jié)構(gòu)和脫氧核糖核酸。合適的DNA酶是本領(lǐng)域已知的，包括DNA酶I?？梢詫⒏闻K組織暴露于1000-10000KUDNA酶1中，例如，大約2000KUDNA酶1。脫氧核糖核酸酶處理可以特別適用于使用例如脫氧膽酸鈉之類的溫和的洗滌劑的方法中。在一些實施例中，DNA酶可以在鹽平衡溶液中，例如，1MNaCl。在其他實施例中，可以不使用脫氧核糖核酸酶來去細胞化肝臟組織。在一些實施例中，可以不使用脫氧核糖核酸酶或蛋白酶來去細胞化肝臟組織。洗滌劑使組織中的脂質(zhì)和脂肪溶解，并促進細胞碎片從ECM中的去除。洗滌劑可包括陰離子洗滌劑，例如十二烷基磷酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉(SdC)，以及TritonTMX-200。例如，可以將肝臟組織暴露于0.01至5％SDS，例如，0.01-1％SDS；0.01至5％脫氧膽酸鈉(SdC)，例如，大約4％脫氧膽酸鈉；和/或0.01至5％TritonTMX-200，例如，3％TritonTMX-200。洗滌劑可包括非離子洗滌劑，例如聚乙二醇和TritonTMX100，例如，聚乙二醇p-(1,1,3,3-四甲基丁基)-二苯醚。例如，可以將肝臟組織暴露于0.01至5％TritonTMX-100，或1至3％TritonTMX-100，例如，3％TritonTMX-100。洗滌劑可包括兩性離子洗滌劑，例如CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸內(nèi)鹽)、硫代甜菜堿-10(3-(癸基二甲基銨)丙磺酸內(nèi)鹽)、硫代甜菜堿-16(正十六烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸內(nèi)鹽)，以及三(正丁基)磷酸酯。例如，可以將肝臟組織暴露于0.01至5％的兩性離子洗滌劑，例如，0.01-1％的兩性離子洗滌劑。本領(lǐng)域已知有很多其他合適的洗滌劑，可從商業(yè)源(例如，美國，密蘇里州，SigmaAldrich公司)獲得。在某些優(yōu)選實施例中，可以在單獨的步驟中將肝臟組織暴露于第一洗滌劑和第二洗滌劑。例如，方法可以包括(a)將組織暴露于陰離子洗滌劑，例如SDS，以及(b)將組織暴露于非離子型洗滌劑，例如TritonTMX-100。在一些實施例中，用于每一處理步驟中的去細胞化試劑的濃度可以逐步增大到最大值。例如，使用的洗滌劑的濃度可以逐步增大到最大值。初始洗滌劑濃度可以充分低，以避免堵塞肝臟組織中的血管的細胞物質(zhì)的聚集物或塊的形成。在初始洗滌劑處理之后，將洗滌劑的濃度提高，以有效地去除所有細胞物質(zhì)。因此，步驟(iii)可以包括將肝臟組織暴露于濃度逐漸地提高的洗滌劑。優(yōu)選地，當重復步驟(iii)時，使用最高濃度。例如，可以將肝臟組織暴露于0.005％-0.02％SDS，例如，大約0.01％SDS，接下來是暴露于0.05％SDS至0.2％SDS，例如，大約0.1％SDS，接下來是暴露于0.5％SDS至2％SDS，例如，大約1％SDS。隨后的洗滌劑處理步驟(即，步驟iii的重復)可以使用0.5％SDS至2％SDS，例如，大約1％SDS。在某些優(yōu)選實施例中，可以通過利用試劑灌注組織，將肝臟組織暴露于去細胞化試劑。優(yōu)選地，在逆行的方向，而不是在順行的方向，灌注肝臟組織。用于在體外進行組織灌注的合適的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過將插管插入到血管、管道或空腔中，例如，腔靜脈或肝靜脈中，準備肝臟組織以進行灌注。然后，可以通過插管術(shù)，利用去細胞化試劑，灌注被插管的組織。在優(yōu)選實施例中，利用去細胞化試劑對肝臟組織的灌注的速率不是恒定的。例如，對組織的灌注的初始速率可以低(例如，<0.99ml/min/g組織)，以避免對肝臟組織的結(jié)構(gòu)破壞。在去細胞化的過程中，隨著步驟(iii)至(v)的重復，肝臟組織變得不太能抵御灌注，提高灌注速率(例如，>1ml/min/g組織)。這會增大組織中的流體切應力。優(yōu)選地，在暴露于去細胞化試劑的兩個或更多循環(huán)中，將灌注速率逐步地提高到最大值(補償階段)，然后，保持在此最大值或此最大值附近(穩(wěn)定階段)。在一些實施例中，可以首先以0.1-1.99ml/min/g組織的流速，例如，0.5至1.5ml/min/g，利用去細胞化試劑灌注組織，并逐步地提高到2-20ml/min/g組織，例如，2-8ml/min/g。在其他實施例中，可以首先以0.01-0.99ml/min/g組織的流速，例如，0.5至1.5ml/min/g，利用去細胞化試劑灌注組織，并在5至10天內(nèi)，優(yōu)選地，大約9天，逐步地提高到1-10ml/min/g組織，例如，2-8ml/min/g。可利用每一去細胞化試劑灌注肝臟組織，每克實體組織大約0.004小時至大約5小時(對于>40克的組織樣本)，或每克實體組織大約2小時至大約12小時(對于<40克的組織樣本)。例如，如此處所描述的去細胞化可用1-60天，例如，7-60天，取決于肝臟組織的初始質(zhì)量。利用不同的去細胞化試劑灌注組織的順序可以變化，取決于在去細胞化的過程中，利用每一試劑灌注肝臟組織至少一次，至少兩次或至少三次。暴露于不同的洗滌劑的順序基于它們的不同的作用機理。機械破壞(第一步驟)促進強烈的細胞破碎。暴露于低滲溶液(第二步驟)在沖洗細胞物質(zhì)時，增強細胞裂解。然后，可任選地將肝臟組織暴露于蛋白水解酶(第三步驟)以去除附著于ECM的細胞物質(zhì)。最后，將肝臟暴露于不同的洗滌劑中(第四步驟)，以有效地沖洗掉細胞物質(zhì)?？梢砸粤魉俚暮瘮?shù)重復該四個步驟。步驟(i)的機械破壞促進人類組織內(nèi)的強烈的細胞破碎。通常，步驟(i)在去細胞化開始時執(zhí)行一次，但是，在一些實施例中，可以在去細胞化過程中，引入HIFU或超聲介導的機械破壞多于一次。由機械破壞所引起的細胞裂解通過步驟(ii)中的滲透應力增強。暴露于滲透溶液還將細胞碎片從組織中洗掉。然后，可任選地，在步驟(iii)中，將肝臟組織暴露于DNA酶，或優(yōu)選地，蛋白水解酶，以去除附著于ECM的細胞物質(zhì)。最后，在步驟(iv)中，將肝臟暴露于一種或多種洗滌劑，以從組織中沖洗掉細胞物質(zhì)。可以利用增大的流體切應力，重復步驟(iii)至(iv)一次或多次。在一些實施例中，方法可以包括通過向肝臟組織灌注，按以下順序，重復步驟(iii)至(v)：(iii)、(iv)、(iii)、(iv)(v)、[(iii)、(v)]n、(iii)、(iv)、[(iii)、(v)]n，其中，n是1至25。在表1中示出了合適的灌注去細胞化方案?？扇芜x地，在該方法中，步驟(ii)還可以重復一次或多次?？梢韵蚋闻K整體或其功能單元灌注去細胞化試劑，以生成匹配源組織大小和結(jié)構(gòu)的ECM支架。在一些實施例中，隨后可以利用細胞重新增殖此支架，以獲得例如適于直接移植到人類體中的功能正常的肝組織。在一些實施例中，肝臟組織可以是病理的。利用去細胞化試劑向病理的肝臟組織的灌注，可以用于，例如，生成可以利用細胞重新增殖以進行3D疾病建模的ECM支架。在其他優(yōu)選實施例中，可以通過將組織浸入試劑中，并，例如，在旋轉(zhuǎn)式攪拌機上對它進行攪動，將人類肝臟組織暴露于去細胞化試劑。可以在去細胞化試劑中攪動肝臟組織的切片或樣本，以生成小規(guī)模地再現(xiàn)3D人類微環(huán)境的復雜性的支架，用于肝臟疾病的建模。樣本可以是正常的或病理的肝臟組織。合適的樣本寬度/長度或直徑范圍可以在0.2-2cm或0.2-1.0cm之間。例如，樣本可以是大致5mm寬的切片或方塊，在本文中稱為“肝臟組織方塊”(LTC)?？梢愿鶕?jù)標準技術(shù)，使用組織切塊機、針吸活檢，打孔活檢或通過對人類肝實質(zhì)的切片或方塊的簡單解剖刀切割，獲取用于通過攪動方案來去細胞化的肝臟組織樣本。攪動浸于去細胞化試劑中的肝臟組織可以對它施加流體切應力。合適的攪動可包括旋轉(zhuǎn)搖動，例如，在旋轉(zhuǎn)式攪拌機或磁力攪拌器中，以100-1000rpm，優(yōu)選地，大約900rpm的速度。在一些實施例中，可以對被攪動的組織進行下列各項的一個或多個循環(huán)的處理：(a)使組織暴露于滲透應力試劑中，例如，低滲或高滲試劑中，(b)使組織暴露于蛋白酶和/或DNA酶中，以及(c)使組織暴露于洗滌劑中，其中，在每一循環(huán)中，(a)、(b)和(c)可以以任何順序發(fā)生。例如，可以對組織進行下列各項的一個或多個循環(huán)的處理：(a)使組織暴露于低滲試劑中，(b)使組織暴露于洗滌劑中，以及(c)使所述組織暴露于DNA酶中，例如，可以執(zhí)行1至25個循環(huán)?？梢詫⒔M織暴露于例如水之類的低滲試劑中，達12至36小時，優(yōu)選地，大約24小時?？梢栽?℃將組織暴露于低滲試劑中?？梢詫⒔M織暴露于例如SdC，例如4％SdC之類的洗滌劑中，達4至12小時，優(yōu)選地，大約6小時。可以在環(huán)境溫度下將組織暴露于洗滌劑中?？梢詫⒔M織暴露于DNA酶中，達大約3小時?？梢栽诃h(huán)境溫度下將組織暴露于DNA酶中。例如，可以在1MNaCl中，將組織暴露于2000KUDNA酶1中。方法還可以進一步包括在暴露于上文提出的去細胞化試劑中的任何一種之后，將組織暴露于清洗液中。可以在上述步驟中的一個或多個之間和/或在循環(huán)之間，例如，在步驟(a)和(b)之間，在步驟(b)和(c)之間和/或在步驟(c)之后和在任何循環(huán)重復之前，洗滌組織。例如，可以在環(huán)境溫度下用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或補充有抗生素-抗真菌劑的PBS沖洗組織達5至30分鐘，優(yōu)選地，大約5分鐘。合適的抗生素-抗真菌劑是本領(lǐng)域已知的。在其他實施例中，可以對組織進行下列各項的一個或多個循環(huán)的處理：(a)使組織暴露于例如水之類的低滲試劑中，(b)使組織暴露于例如胰蛋白酶之類的蛋白酶中，優(yōu)選地，在dH2O(去離子水)中。(c)使組織暴露于第一洗滌劑中，例如，如SDS之類的陰離子洗滌劑，(d)使組織暴露于第二洗滌劑中，例如，如TritonTMX-100之類的離子型洗滌劑?？梢栽诃h(huán)境溫度下將組織暴露于例如水之類的低滲試劑中，達15至30分鐘。可以在環(huán)境溫度下，將組織暴露于蛋白酶中，例如，dH2O(去離子水)或EDTA中的0.025％胰蛋白酶，達12至36小時。可以在環(huán)境溫度下將組織暴露于第一洗滌劑中，例如，0.01-1％SDS，達12至96小時?？梢栽诃h(huán)境溫度下將組織暴露于第二洗滌劑中，例如，0.01-3％TritonTMX100，達12至72小時。在上述步驟中的一個或多個步驟之間和/或在多個循環(huán)之間，可以洗滌組織?？梢栽谏鲜霾襟E中的一個或多個步驟之間和/或在多個循環(huán)之間，例如，在步驟(a)和(b)之間，在步驟(b)和(c)之間，在步驟(c)和(d)之間，和/或在步驟(d)之后和在任何循環(huán)重復之前，洗滌組織。例如，可以在環(huán)境溫度下用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或補充有抗生素-抗真菌劑的PBS沖洗組織達5分鐘至3小時，例如，30分鐘至1小時。例如，方法可以包括對被攪動的組織進行下列各項的一個或多個循環(huán)的處理：(a)使組織暴露于去離子水中，(b)在PBS中洗滌組織，(c)使組織暴露于SdC中，(d)在PBS中洗滌組織，(e)使組織暴露于DNA酶中，以及(f)在PBS中洗滌組織?？梢灾貜筒襟E(a)至(f)4-8次，優(yōu)選地，大約4次?？梢酝ㄟ^定軌振蕩器以600-1200rpm，例如，大約900rpm；或通過磁力攪拌器以150-600rpm，例如，300-400rpm，提供合適的攪動。在一些實施例中，可以在步驟(a)之前交替地將組織暴露于水和葡萄糖溶液中，達4-12小時，例如，8小時。在其他實施例中，上文所描述的方法還可以進一步包括：(f)將組織暴露于例如9％鹽水之類的高滲試劑中。暴露于去細胞化試劑的每一循環(huán)的持續(xù)時間可以是2-3天。使用攪動方案來去細胞化支架的總時間可以是2.5-25天，例如，大約8天。在去細胞化之后，可以，例如，通過暴露于消毒試劑中，對支架進行消毒。合適的消毒試劑包括γ輻射、電解水和化學試劑，例如過氧乙酸?？梢詫⒅Ъ鼙┞队?.01％過氧乙酸和4％乙醇中，例如，達30分鐘至2小時。如此處所描述的，可以利用消毒試劑灌注支架，或?qū)⑵浣谙驹噭┲胁⑦M行攪動。在去細胞化和消毒之后，可以測試肝臟支架，例如，是否不存在細胞和/或存在ECM成份，例如膠原質(zhì)、層粘連蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖、透明質(zhì)酸、粘連蛋白、生長因子和細胞外蛋白酶。包括宏觀可視化、顯微術(shù)和免疫組織化學技術(shù)的合適的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。去細胞化的人類肝臟支架可能在組織切片中缺少使用標準組織染色方法可檢測的肌絲、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞，以及細胞碎片和核。如此處所描述的生產(chǎn)的去細胞化的人類肝臟支架保留了源肝臟組織的3D器官形態(tài)和結(jié)構(gòu)以及ECM生物活性。在一些實施例中，通過上文所描述的方法生產(chǎn)的去細胞化的肝臟支架的結(jié)構(gòu)和形態(tài)可以通過電子顯微技術(shù)確認。取決于源組織，肝臟支架可以包括正常的ECM或可以是疾病改變的ECM。例如，肝臟支架可以包括一個或多個肝臟疾病或病理特有的一種或多種結(jié)構(gòu)變化。人類肝臟支架允許在支架中培養(yǎng)的細胞的有效附著、遷移、增殖和三維組織。去細胞化的人類肝臟支架還可以提供生物活性分子和生物感應屬性，這些屬性維持細胞表現(xiàn)型和功能屬性，并促進組織特異性基質(zhì)的產(chǎn)生。在如此處所描述的去細胞化的人類肝臟支架的產(chǎn)生之后，方法可以包括利用細胞重新增殖支架以產(chǎn)生人工肝臟組織。合適的細胞包括人類原代和細胞系肝細胞(例如，肝臟星形細胞、枯否細胞、肝竇細胞)、原代肝細胞、內(nèi)皮細胞、iPSC(誘導性多能干細胞)或源自病人特定iPSC的細胞，胚胎干細胞(hESC)、間充質(zhì)干細胞(hMSC)、源自肝細胞的間充質(zhì)干細胞(HDMSC)胎兒干細胞(例如，羊水干細胞和胎兒肝細胞)、癌細胞和內(nèi)皮祖細胞(EPC)。在一些實施例中，可以利用從病人獲取的自體人類細胞重新增殖去細胞化的人類肝臟支架，例如，以產(chǎn)生人工肝臟組織，用于植入到病人體中。在其他實施例中，可以利用異源的人類細胞，即，源自不同的人類個體的細胞，重新增殖去細胞化的人類肝臟支架，例如，以產(chǎn)生人工肝臟組織，用于植入到病人體中。在一些實施例中，在植入之前，可以篩選異源的人類細胞，以檢查與病人的免疫相容性?？梢酝ㄟ^利用在支架之內(nèi)接種細胞，并在適合的條件下培養(yǎng)，重新增殖去細胞化的支架。例如，可以將細胞直接注入到去細胞化的支架的實質(zhì)中；通過主要血管通路，灌注；和/或滴落到去細胞化的支架的表面上。本發(fā)明的其他方面使用上文所描述的方法，加以必要的變更，提供來自例如非人類靈長類動物、豬、羊、馬或奶牛之類的非人類動物的肝臟組織的去細胞化，以產(chǎn)生非人類肝臟支架。如上文所描述的，可以利用人類細胞再增殖非人類支架，以產(chǎn)生在非人類ECM支架內(nèi)包括人類細胞的人工肝臟組織。這可以用于產(chǎn)生人工肝臟組織，用于植入到病人體中。在一些實施例中，可以分割如此處所描述的產(chǎn)生的去細胞化的人類肝臟支架或人工肝臟組織，以去除例如管道和血管之類的一種或多種肝臟組織結(jié)構(gòu)?？梢钥扇芜x地利用如上文所描述的細胞重新增殖從去細胞化的人類肝臟支架去除的結(jié)構(gòu)。從肝臟支架或組織去除的結(jié)構(gòu)可以用于移植，例如，治療如下面所描述的疾病，或疾病建模。本發(fā)明的其他方面提供上文所描述的方法產(chǎn)生的人類肝臟支架或人工肝臟組織。如此處所描述的產(chǎn)生的人類肝臟支架是非細胞的，并顯示源肝臟組織的細胞外基質(zhì)孔隙結(jié)構(gòu)和形態(tài)。從多脂源肝臟組織產(chǎn)生的人類肝臟支架表現(xiàn)出源組織特有的增大的脂質(zhì)含量。從纖維化的源肝臟組織產(chǎn)生的人類肝臟支架表現(xiàn)出源組織特有的增大的ECM成份。支架或組織可以用于疾病建模。如上文所描述的，合適的支架可以來源于正常的肝臟組織或病理的肝臟組織。一種疾病建模的方法，可以包括：提供如上文所描述的產(chǎn)生的人類肝臟支架或人工人類肝臟組織，確定化合物、藥物、生物制劑、設(shè)備或治療干預對支架或組織或其中的細胞的影響。此處所描述的方法可以用于建模肝臟疾病或影響肝臟的疾病，例如肝臟纖維化、肝癌和轉(zhuǎn)移、肝臟藥物毒性、移植后免疫響應，以及自身免疫肝炎。生物制劑可包括例如HBV和HCV之類的病毒。去細胞化的肝臟支架可以用于對肝臟疾病的診斷。合適的支架可以來源于來自被懷疑患有肝臟疾病的個體的肝臟組織。一種診斷人類個體的肝臟疾病的方法可以包括：從個體提供如上文所描述的產(chǎn)生的肝臟支架的樣本確定樣本中的一種或更多種肝臟支架蛋白質(zhì)的存在和量。樣本中的肝臟支架蛋白質(zhì)的存在和量可以指示個體中肝臟疾病的存在。支架或組織可以用于治療，例如，用于個體的肝臟組織的替換或補充。治療肝臟疾病的方法可以包括：將如上文所描述的產(chǎn)生的人類肝臟支架或人工人類肝臟組織植入到有需要的個體中。植入的支架或組織可以替換或補充個體的現(xiàn)有的肝臟。本發(fā)明的另一方面提供如上文所描述的產(chǎn)生的人類肝臟支架或人工人類肝臟組織，用于對個體的肝臟疾病或機能障礙的治療中。例如，人類肝臟支架或人工人類肝臟組織可以被植入個體的身體中，以再生完整的新肝臟或改善損傷的肝臟的修復，或可以從身體外面支持個體的肝功能。本發(fā)明的其他方面，使用上文所描述的方法，加以必要的變更，提供人類胰腺組織的去細胞化，以產(chǎn)生人類胰腺支架。如上文所描述的，可以利用人類細胞再增殖人類胰腺支架，以產(chǎn)生在人類ECM支架內(nèi)包括人類細胞的人工胰腺組織。這可以用于產(chǎn)生人工胰腺組織，用于植入到病人體中。例如，本發(fā)明的另一方面提供生產(chǎn)人類胰腺支架的方法，包括(i)提供人類胰腺組織，(ii)以機械方式破壞組織中的細胞，(iii)對組織中的所述細胞施加滲透應力，(iv)使組織暴露于蛋白酶和/或DNA酶中，以及(v)使組織暴露于洗滌劑中，以及(vi)重復步驟(iii)、步驟(iv)和步驟(v)，以及可任選地，步驟(ii)中的每一個步驟一次或多次，由此，生產(chǎn)人類胰腺支架?？梢愿鶕?jù)上文對于肝臟支架所描述的方法中的任何一種，產(chǎn)生人類胰腺支架，只是術(shù)語“肝臟”和“肝臟的”替換為“胰腺”和“胰腺的”。通過上文所描述的方法產(chǎn)生的去細胞化的人類胰腺支架可以利用細胞重新增殖，以產(chǎn)生人工胰腺組織。本發(fā)明的各方面提供通過此處所描述的方法產(chǎn)生的去細胞化的人類胰腺支架和人工胰腺組織。人類胰腺支架和人工胰腺組織可以用于疾病建模，如上文對于肝臟支架和組織所描述的診斷和治療的方法，加以必要的變更。本發(fā)明的另一方面提供生物反應器，包括：如上文所描述的產(chǎn)生的人類肝臟支架；用于將培養(yǎng)基引入到支架中的輸入管道；以及用于將培養(yǎng)基從支架中引出的輸出管道。優(yōu)選地，利用人類細胞接種肝臟支架，用于支架的重新增殖。這可以用于產(chǎn)生人工肝臟組織。上文描述了用于接種支架的合適的細胞。生物反應器還可以進一步包括培養(yǎng)基貯器。輸入管道可以是可連接或適用于連接到貯器，以便利用來自貯器的培養(yǎng)基灌注生物反應器中的支架，以便允許通過被接種到支架中的細胞，重新細胞化支架。生物反應器還可以進一步包括用于容納肝臟支架的組織腔。支架可以被包含在生物反應器中的合適的培養(yǎng)基中。組織腔中的肝臟支架和貯器中的培養(yǎng)基可以在含氧量正常的條件下保持在37℃，以允許再增殖。生物反應器還可以進一步包括一個或多個傳感器，用于確定或監(jiān)測當支架在利用接種的細胞重新增殖時支架中的肝功能的存在或量。本發(fā)明的另一方面提供生物反應器，包括：如上文所描述的產(chǎn)生的人工人類肝臟組織；用于將血引入到人工人類肝臟組織中的輸入管道；以及用于將血從人工人類肝臟組織中引出的輸出管道。優(yōu)選地，生物反應器是身體外的。輸入和輸出管道可以是可連接的或適用于連接到個體的血管系統(tǒng)，以便利用個體的血灌注生物反應器中的人工人類肝臟組織，以便向個體提供肝功能，例如，以減少由內(nèi)生的肝功能的丟失所引起的毒素的積聚。生物反應器還可以進一步包括用于容納人工人類肝臟組織的組織腔。人工人類肝臟組織可以被包含在生物反應器中的合適的培養(yǎng)基中。本發(fā)明的另一方面提供適用于使用上文所描述的方法來產(chǎn)生人類肝臟支架的去細胞化系統(tǒng)和裝置。去細胞化系統(tǒng)可以包括：去細胞化設(shè)備，包括用于容納用于去細胞化的人類肝臟組織的組織腔，以及三個或更多試劑貯器，用于容納用于引入到組織腔中的去細胞化試劑。試劑貯器可以可操作地連接到組織腔，以便來自貯器的試劑可以被引入到腔中。試劑貯器可以包含低滲試劑、蛋白酶和/或DNA酶以及洗滌劑。組織腔可以包含肝臟組織。在一些實施例中，系統(tǒng)還可以進一步包括適用于從人類肝臟樣本產(chǎn)生肝臟組織切片并將它們裝入去細胞化器的組織腔中的采樣機。去細胞化設(shè)備還可以進一步包括一個或多個泵，用于將去細胞化試劑從試劑貯器中驅(qū)動到組織腔中，并可任選地從組織腔中去除去細胞化試劑。腔可以包括用于引入去細胞化試劑的入口和用于去除試劑的出口。在一些實施例中，可以將組織腔中的人類肝臟組織浸于通過入口從貯器被引入到腔的去細胞化試劑或生理溶液中。在暴露于去細胞化試劑之后，根據(jù)此處所描述的去細胞化方案，可以通過出口去除試劑，并進一步將去細胞化試劑引入到腔中。系統(tǒng)還可以進一步包括攪拌器，用于攪動浸于組織腔中的去細胞化試劑中的人類肝臟組織。在其他實施例中，可以利用來自試劑貯器的去細胞化試劑在逆行的方向灌注組織腔中的人類肝臟組織?？梢愿鶕?jù)此處所描述的去細胞化方案，連續(xù)地向組織中灌注多種去細胞化試劑。在灌注過程中，可以將肝臟組織浸于生理溶液或培養(yǎng)基中。去細胞化設(shè)備可以包括至少一個插管設(shè)備，用于向組織腔中的肝臟組織插管，以允許在逆行的方向進行灌注。合適的插管設(shè)備可以包括大小合適的空心管，用于引入到人類肝臟組織的血管、管道，和/或空腔中。通常，一個或多個血管、管道，和/或空腔被插入在組織腔中的組織中。在一些實施例中，設(shè)備可以包括入口插管設(shè)備，用于將去細胞化試劑引入到肝臟組織中，以及出口插管設(shè)備，用于從肝臟組織引出去細胞化試劑。去細胞化設(shè)備還可以進一步包括用于通過導管向肝臟組織灌注的灌注器。灌注器可包括用于通過一個或多個導管，以及管子，通過人類肝臟組織從貯器中移動去細胞化試劑的機構(gòu)(例如，泵、氣壓、重力)，適配器和/或用于利用來自試劑貯器的去細胞化試劑，灌注組織腔中的被插管的肝臟組織的連接器。插管和灌注是本領(lǐng)域已知的技術(shù)。去細胞化設(shè)備可以適用于為組織腔中的肝臟組織維持無菌的環(huán)境。在去細胞化過程中，可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)，維持無菌，例如控制和過濾氣流和/或利用，例如，抗生素、抗真菌劑或其他抗微生物劑來灌注，以防止不希望有的微生物的生長。合適的抗微生物的化合物是本領(lǐng)域已知的。去細胞化設(shè)備可以適用于監(jiān)測某些灌注特征(例如，壓力、容積、流動模式、溫度、氣體、pH)、機械力(例如，心室壁運動和應力)。例如，系統(tǒng)可以包括監(jiān)測系統(tǒng)(例如，生物反應器)和/或肝臟組織的傳感器?？梢允褂脗鞲衅鱽肀O(jiān)測在插管的肝臟組織中流動的液體的壓力；系統(tǒng)中的環(huán)境溫度和/或肝臟組織的溫度；在插管的肝臟組織中流動的液體的pH和/或流速；和/或重新細胞化肝臟組織的生物活性。除具有用于監(jiān)測這樣的特征的傳感器之外，用于去細胞化和/或重新細胞化肝臟組織的系統(tǒng)可以包括用于維持或調(diào)整這樣的特征的控件?？丶砂ńM件，例如溫度計、恒溫器、電極、壓力傳感器、溢流閥、用于打開和關(guān)閉至去細胞化試劑的液體連接并改變流體速率和流向的閥門。為幫助確保穩(wěn)定條件(例如，溫度)，腔、貯器和管子可以是水套的。用于生成人類肝臟支架的系統(tǒng)可以通過可編程處理器來控制。例如，處理器可以接收和處理來自傳感器中的一個或多個傳感器的信息。處理器可以將信息以及指令傳輸回生物反應器和/或肝臟組織?？梢詫⑻幚砥餍薷幕蚓幊虨楦鶕?jù)如此處所描述的去細胞化方法，基于肝臟組織的重量和內(nèi)電阻，對于該特定肝臟組織，計算每一種去細胞化試劑的暴露時間和灌注壓力。處理器可以通過系統(tǒng)中的一個或多個泵和/或閥門控制，改變?nèi)ゼ毎噭┖透淖児嘧毫?。處理器可以記錄對于每一個去細胞化步驟的預負荷和后負荷(分別是灌注之前和之后的壓力)以及流速。系統(tǒng)可以適用于監(jiān)測正在接受去細胞化的肝臟組織的生物活性。例如，可以監(jiān)測肝臟組織的機械活動、機械壓力，和/或壁應力?？紤]到本公開，本發(fā)明的各種進一步的方面和實施例對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。本發(fā)明的其他方面和實施例提供上文所描述的方面和實施例，術(shù)語“包括”替換為術(shù)語“由......組成”，以及上文所描述的方面和實施例，術(shù)語“包括”替換為術(shù)語“基本上由......組成”。應當理解，本申請公開了上文所描述的上述方面和實施例中的任何一種的所有組合，除非上下文要求別的。類似地，本申請公開了優(yōu)選的和/或可選的特征的所有組合，無論是單獨地還是與其他方面的任何一個方面一起，除非上下文要求別的。對上述實施例的修改，進一步的實施例以及對其修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明之后是顯而易見的，如此，這些都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本說明書中所提及的所有文件和序列數(shù)據(jù)庫條目都為各種目的，以引用的方式并入本文中。此處所使用的“和/或”被理解為兩個指定的特征或組件中的每一個的特定的公開，有或者沒有另一個。例如，“A和/或B”理解為(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一項的特定的公開，就如同每一項都是在本文中分別地陳述一樣?，F(xiàn)在將通過示例并參考下面所描述的圖形，說明本發(fā)明的某些方面和實施例。圖1示出了相對于去細胞化過程的14天內(nèi)灌注的不同階段的流速(以ml/min為單位)。圖2示出了在去細胞化之前的125mm3肝臟組織方塊(LTC)。圖3示出了自然組織和在4個去細胞化循環(huán)之后去細胞化的LTC(dLTC)的組織學比較。H&E(蘇木精和曙紅)染色示出了在LTC去細胞化之后細胞的去除，SR(天狼星紅)染色示出了膠原質(zhì)的保留(紅色)和細胞材料(黃色)的去除。圖4示出了在去細胞化之后膠原質(zhì)(頂部)和DNA(底部)的定量測量。在不同的攪動速度(900C1-900C4)之后的膠原質(zhì)的量化表現(xiàn)出了當與新鮮組織相比時膠原質(zhì)的量的保留。去細胞化是有效率的，在1個處理循環(huán)之后(底部)DNA含量已明顯地下降(p<0.01)。圖5示出了具有人類肝臟星狀細胞系LX2的人類肝臟支架的再增殖。H&E染色示出了當比較在重新細胞化之后第1天與第21天時漸進的LX2細胞遷移到LTC支架中(上方組)。再增殖的過程的特征在于：利用增殖標記物Ki67的免疫染色檢測到的顯著的細胞增殖(下方組)。圖6示出了在利用LX2再增殖14天之后總的細胞計數(shù)的增大。重要的是，人類肝臟支架中的總的細胞計數(shù)在14天和21天之間顯著增大(LH組)。KI67免疫組織化學示出了85％以上的細胞在所有不同的時間點增殖(RH組)。圖7示出了利用人類肝細胞癌細胞系SK-Hep的去細胞化的人類肝臟支架的再增殖。H&E和HVG(蘇木精范吉森)染色示出了在生物工程1天之后細胞的附著以及當比較在重新細胞化之后第1天與14天時漸進的細胞遷移到人類肝臟支架中。圖8示出了帶有抗人Nanog(右)和同種型對照(左)SK-Hep的FACS染色。圖9示出了在1和7天之后利用人類肝細胞癌細胞系SK-Hep對去細胞化的人類肝臟支架的再增殖。通過免疫組織化學來分析Nanog表達。顯然，在第一天附著于ECM的細胞和在第7天在支架內(nèi)遷移的細胞是Nanog陽性細胞。圖10示出了在14天之后利用人類肝細胞癌細胞系SK-Hep對去細胞化的人類肝臟支架的再增殖。通過免疫組織化學來分析Nanog表達(棕色)，細胞用蘇木精(藍色)復染色。在14天之后再增殖的過程是通過Nanog陽性和Nanog陰性細胞來表征的(底部)。值得注意的是，在此階段，Nanog陽性細胞環(huán)繞重新增殖的支架(頂部)，特征類似于人類肝細胞癌的發(fā)展。圖11使用兩個不同的光背景，示出了去細胞化的人類肝臟左葉的宏觀外觀，以突出顯示血管樹的保留。圖12示出了去細胞化的血管的(門靜脈、肝動脈和肝門板)和膽道樹的組織切片。H&E示出了在去細胞化的組織中不存在細胞。SR和EVG染色分別示出了膠原質(zhì)(紅色)和彈性蛋白(藍色)的保留。圖13示出了新鮮的肝臟組織和去細胞化的人類肝臟左葉段(S1、S2、S3和S4)的組織學比較。H&E染色示出了在去細胞化之后細胞的去除，SR和EVG(彈性范吉森)染色分別示出了膠原質(zhì)(紅色)和彈性蛋白(藍色)的保留。圖14示出了利用人類肝臟星狀細胞系LX2的人類肝臟支架的再增殖。H&E和HVG染色示出了在生物工程1天之后的細胞附著以及當比較在重新細胞化之后第1天與14天時漸進的細胞遷移到人類肝臟支架中。圖15示出了包括由典型的小葉結(jié)構(gòu)包圍的肝門束的低放大倍數(shù)(90x)SEM圖像。圖16示出了確認支架非細胞性并清楚地定義了曾經(jīng)被肝細胞占據(jù)的空間(即，無肝細胞的空間)的300xSEM圖像。圖17示出了高放大倍數(shù)(2500x)SEM圖像，示出了構(gòu)建出無肝細胞的空間的保留得極好的結(jié)締組織纖維的三維網(wǎng)絡?？s略語：SdC脫氧膽酸鈉；PBS/AAPBS+抗生素抗真菌素；T/E0.025％胰蛋白酶/EDTA0.025％；SDS十二烷基硫酸鈉；TX100TritonX100；RT室溫；PAA過氧乙酸；EtOH乙醇。1.方法1.1人類肝臟采集和插管根據(jù)對于移植的標準方法，肝素化不適合用于肝臟移植的丟棄的人類肝臟器官(DHLO)。通過0.2-1.0cm的小非血管化肝臟單元(肝臟組織方塊，LTC)的多個塊細分，和/或通過血管膽道蒂的單元的分段的或子分段的準備，充分地準備DHLO。人類肝臟整體或者，可另選地，左葉(段2-3-4±1)、右葉(段5-8)或左側(cè)肝臟(段2-3±1)以及肝臟組織方塊(LTC)在-80℃凍結(jié)，達至少24小時，以促進細胞裂解。1.2人類肝臟左葉整體的灌注去細胞化首先，在4℃，在PBS中將整個人類肝臟葉瓣解凍一夜。其次，腔靜脈或肝靜脈被插入了導管，以啟動逆行的灌注系統(tǒng)。最后，應用5CDF，以實現(xiàn)完全的器官去細胞化，如表1、2和圖1所示。采用兩個灌注階段：a)急劇地增大流速以補償阻力b)隨著去細胞化的進行，穩(wěn)定流速。在圖1中示出了流速的兩個階段。1.3人類LTC的攪動去細胞化在37℃，解凍LTC達1-1.5h。在表3至5中示出了LTC的去細胞化的方案。2.結(jié)果在4個去細胞化循環(huán)之后，在組織學上比較自然肝臟組織和去細胞化的LTC(dLTC)。發(fā)現(xiàn)去細胞化循環(huán)從LTC中去除了細胞和細胞物質(zhì)，同時保留了膠原質(zhì)(圖3)。在去細胞化之后，在dLTC中量化膠原質(zhì)和DNA。當與新鮮的組織(900C1-900C4)相比時(圖4頂部)，發(fā)現(xiàn)dLTC中的膠原質(zhì)的量在不同的攪動速度時被保留。去細胞化是有效率的，在僅僅1個處理循環(huán)之后(圖4底部)DNA含量明顯地下降(p<0.01)。利用人類肝臟星狀細胞系LX2重新增殖去細胞化的人類LTC。發(fā)現(xiàn)LX2細胞在重新細胞化之后在21天內(nèi)逐步地遷移到LTC支架(圖5上方組)。發(fā)現(xiàn)人類肝臟支架中的總的細胞計數(shù)在利用LX2再增殖的14天之后增大，并在14和21天之間顯著增大(圖6LH組)。對于增殖標記物Ki67的免疫染色示出了，再增殖的過程由顯著的細胞增殖來表征(圖5下方組)，在所有不同的時間點，85％以上的細胞增殖(圖6RH組)。利用人類肝細胞癌細胞系SK-Hep重新增殖去細胞化的人類肝臟支架。觀察到在生物工程1天之后細胞的附著，在重新細胞化之后的14天內(nèi)，SK-Hep細胞逐步地遷移到人類肝臟支架(圖7)。在第一天附著于ECM的細胞和在第7天在支架內(nèi)遷移的細胞被示為Nanog陽性細胞(圖8和9)。在14天之后再增殖的過程由Nanog陽性和Nanog陰性細胞來表征(圖10)。值得注意的是，在14天之后，發(fā)現(xiàn)Nanog陽性細胞環(huán)繞重新增殖的支架，特征類似于人類肝細胞癌的發(fā)展(圖10；上方組)。發(fā)現(xiàn)人類肝臟左葉的血管樹在去細胞化之后保留(圖11)。發(fā)現(xiàn)去細胞化的組織中沒有細胞，同時膠原質(zhì)和彈性蛋白被保留(圖12)。新鮮的肝臟組織和去細胞化的人類肝臟左葉段(S1、S2、S3和S4)的比較確認了在去細胞化之后的細胞的去除和膠原質(zhì)和彈性蛋白的保留(圖13)。利用人類肝臟星狀細胞系LX2重新增殖去細胞化的人類肝臟左葉段。發(fā)現(xiàn)在1天之后LX1細胞附著于去細胞化的支架，并在14天內(nèi)逐步地遷移到支架中(圖14)。通過掃描電子顯微術(shù)來分析去細胞化的人類肝臟支架。SEM圖像確認了支架非細胞性，并示出了清楚地定義的曾經(jīng)被肝細胞占據(jù)的空間(即，無肝細胞的空間)的存在。發(fā)現(xiàn)構(gòu)建無肝細胞的空間的結(jié)締組織纖維的三維網(wǎng)絡，以及肝門束和小葉結(jié)構(gòu)被極好地保留(圖15-17)。表1表2時間試劑溫度rpm24hdH204℃9004-6hSdC4％RT9005minPBSRT9003hDnaseRT9005minPBS/AART900表3時間試劑溫度rpm12-36hdH2O4℃100-10004-12hSdC4％RT100-10005-30minPBSRT100-10003hDnaseRT100-10005-30minPBS/AART100-1000表4時間試劑溫度rpm15-30mindH20RT100-100012-36hT/E0.025％RT100-100012-72hSDS0.01-1％RT100-100012-72hTX1003％RT100-10005-30minPBS/AART100-1000表5表6當前第1頁1 2 3