本發(fā)明涉及藥物組合物，包含：(i)促進一種或多種長非編碼RNA(lncRNA)表達和/或活性的化合物，所述lncRNA選自SEQIDNO12、8-11和13；和/或(ii)抑制一種或多種lncRNA表達和/或活性的化合物，所述lncRNA選自SEQIDNO1-7、27和28。本發(fā)明也涉及用于治療或預防心臟肥大的化合物，所述化合物(i)促進一種或多種選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA表達和/或活性；和/或(ii)抑制一種或多種選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA表達和/或活性。本說明書中，引用了包括專利申請和廠商手冊在內的多個文件。這些文件的公開內容通過引用全文納入本文，盡管其不視作與本發(fā)明的專利性相關。更特別地，所有參考文獻通過引用納入，程度與各單獨文獻通過引用特定和單獨指示納入相同。哺乳動物轉錄組的大規(guī)模分析發(fā)現(xiàn)基因組轉錄產生復雜比例的RNA分子，其中僅一小部分用作蛋白合成模板。數(shù)個研究表明這些非編碼RNA(ncRNA)如其編碼蛋白質的對應物般具有重要生物學功能，指示改變ncRNA表達或功能影響會影響心血管疾病，包括心臟肥大和纖維化、冠狀動脈疾病以及心肌梗塞。心血管研究中體現(xiàn)最多的ncRNA是微RNA(miRNA，miR)。這些是由約20-22個核苷酸構成的內源、單鏈RNA，所述核苷酸結合其它轉錄物，降低其靶標的穩(wěn)定性和/或翻譯。例如，顯示miR-21和miR-132分別誘導纖維化或肥大，通過特異miRNA拮抗劑(化學改造的沉默miRNA的寡核苷酸)體內抑制這些miRNA可在壓力超負荷心臟疾病模型中避免(rescue)纖維化或肥大(Thum等.Nature.2008456(7224):980-4.；Ucar和Gupta等.NatCommun.20123:1078)。另一研究發(fā)現(xiàn)miR-24在缺血性心臟病中用作血管生成的關鍵調節(jié)因子(Fiedler等.Circulation.2011124(6):720-30)。近期研究表明與miRNA類似，長ncRNA(lncRNA)也在多個生物過程中起重要作用。LncRNA是范圍從200個核苷酸到多至100千堿基的mRNA樣轉錄物，根據(jù)其相對于蛋白編碼基因的基因組分布(對外顯子和/或內含子有義、反義、雙向或基因間)來分類。數(shù)個lncRNA轉錄物專門限于核，而其它也在胞質中發(fā)現(xiàn)。在此，其與蛋白以及其它RNA或DNA分子相互作用，使lncRNA能影響多種基因調控機制，包括染色質修飾、基因組印跡、核區(qū)室化和架構(architecture)以及轉錄和轉錄后調節(jié)(Schonrock等.CircRes.2012年10月26日；111(10):1349-62.；Caley等.ScientificWorldJournal.201010:90-102)。不出所料，lncRNA參與人類疾病，如癌、代謝和神經(jīng)元異常。然而，關于其在心血管生物學中的作用知之甚少。近期研究表明心臟和體壁中的心肌細胞分化及側中胚層組織發(fā)育分別需要2個lncRNABraveheart(Bvht)和FOXF1相鄰非編碼發(fā)育調控RNA(Fendrr)(Klattenhoff等.Cell.2013152(3):570-83.；Grote等.DevCell.201324(2):206-14)。2種lncRNA通過與染色質修飾復合體相互作用來調節(jié)細胞的表觀遺傳譜(profile)。近期報告也開始研究lncRNA在心血管疾病中的作用。全基因組關聯(lián)研究(GWAS)鑒定基因座中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，所述基因座編碼lncRNAMlAT(心肌梗塞相關轉錄物)或ANRIL(INK4基因座中的反義非編碼RNA)，其似乎與心肌梗塞或冠狀動脈疾病風險相關(Ishii等.JHumGenet.200651(12):1087-99.；McPherson等.Science.2007316(5830):1488-91)。lncRNAKcnq1ot1控制其反義基因Kcnql的表達，所述基因編碼鉀通道。由于鉀通道活性對正常心臟性能是必需的，lncRNA相關的經(jīng)改變調節(jié)可能導致心臟功能異常(Korostowski等.PLoSGenet.20128(9):e1002956)。心臟疾病研究的主要挑戰(zhàn)之一是鑒定調節(jié)基因網(wǎng)絡或特異胞內信號通路的新型和有效方法，其可證明本身為有效治療選擇或具有提高現(xiàn)有治療策略效率的潛能。意外發(fā)現(xiàn)特異lncRNA在心臟肥大發(fā)展中起作用，從而提供新型治療策略。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，包含：(i)促進一種或多種長非編碼RNA(lncRNA)表達和/或活性的化合物，所述lncRNA選自SEQIDNO12、8-11和13；和/或(ii)抑制一種或多種lncRNA表達和/或活性的化合物，所述lncRNA選自SEQIDNO1-7、27和28。根據(jù)本發(fā)明，術語“藥物組合物”涉及給患者施用的組合物，優(yōu)選人患者。本發(fā)明的藥物組合物包括上述化合物。任選地，其還包括能改變本發(fā)明化合物特征的分子，從而例如穩(wěn)定、調節(jié)和/或激活其功能。所述組合物可采用固體、液體或氣體形式，尤其可采用一種或多種粉末、片劑、溶液或氣霧劑形式。任選地，本發(fā)明的藥物組合物另外包括藥學上可接受載體或賦形劑。合適的藥物載體和賦形劑示例為本領域熟知且包括磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液如油/水乳液、各種類型的潤濕劑、無菌溶液、包括DMSO在內的有機溶劑等。含有這類載體或賦形劑的組合物能通過熟知的常規(guī)方法配制。這些藥物組合物能以合適劑量給對象施用。劑量方案由主治醫(yī)生和臨床因素確定。如醫(yī)學領域熟知，用于任意患者的劑量取決于許多因素，包括患者尺寸、體表面積、年齡、待施用的具體化合物、性別、施用時間和途徑、總體健康狀況和同步施用的其它藥物。用于給定情況的治療有效量易通過常規(guī)實驗測定并在普通臨床醫(yī)生或醫(yī)生的技術和判斷范圍內。一般，作為藥物組合物日常施用的方案應在每天1μg-5g單位范圍內。然而，更優(yōu)選的劑量范圍可為每天0.01mg-100mg，甚至更優(yōu)選0.01mg-50mg且最優(yōu)選0.01mg-10mg。此外，如果例如所述化合物是核酸序列如siRNA，施用的總體藥學上有效量的藥物組合物通常小于約75mg/kg體重，例如小于約70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg體重。更優(yōu)選地，量小于2000nmol核酸序列(如約4.4x1016個拷貝)/kg體重，例如小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075或0.00015nmolsiRNA試劑/kg體重。就反應發(fā)生觀察治療后變化和間隔所需的治療長度根據(jù)所需效果而變化。具體量可由本領域技術人員熟知的常規(guī)測試確定。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選包括藥學上可接受載體或賦形劑?！八帉W上可接受載體或賦形劑”指任何類型的無毒固體、半固體或液體填料、稀釋劑、包封材料或制劑輔料(還參見《藥物賦形劑手冊》(HandbookofPharmaceuticalExcipients)第6版,2010,醫(yī)藥出版社(PharmaceuticalPress))出版)?？刹捎脛┝繂挝慌渲莆锸┯盟鏊幬锝M合物，所述施用通過例如口服，胃腸外如皮下、靜脈內、肌肉內、腹腔內、鞘內、經(jīng)皮、透粘膜、硬膜下、通過電離子透入局部或外用、舌下、吸入霧化、氣霧劑或直腸等進行，任選地，所述配制物包括常規(guī)藥學上可接受載體或賦形劑。本文所用的術語“ncRNA”或“非編碼RNA”指定未翻譯成蛋白的功能RNA分子。從中轉錄非編碼RNA的DNA序列通常在本領域稱為RNA基因。術語“l(fā)ncRNA”或“長非編碼RNA”常用于本領域并指定含大于200個核苷酸的ncRNA。SEQIDNO12、1-11、13、27和28包括132-1598個核苷酸范圍的序列。本發(fā)明的化合物可配制為囊泡，如脂質體。由于其特異性和從藥物遞送方面提供的作用持續(xù)時間，脂質體引起極大興趣。脂質體遞送系統(tǒng)用于體內有效遞送核酸如siRNA到細胞(Zimmermann等.(2006)Nature,441:111-114)。脂質體是單層或多層囊泡，具有形成自親脂材料的膜和水性內部。所述水性部分包含待遞送的組合物。陽離子脂質體具有能融合細胞壁的優(yōu)勢。非陽離子脂質體盡管不能有效融合細胞壁，但由巨噬細胞和其它細胞體內吞噬。抑制一種或多種選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA表達的化合物-如項目(ii)所定義-是本發(fā)明所述降低或防止一種或多種基因轉錄的化合物，所述基因編碼選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA。這類化合物包括干擾轉錄機器和/或其與所述基因啟動子和/或啟動子遠端表達控制元件如增強子相互作用的化合物。抑制選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA表達的化合物特異抑制所述lncRNA表達，例如通過特異干擾控制lncRNA表達的啟動子區(qū)。優(yōu)選地，選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA轉錄減少至少50％，更優(yōu)選至少75％如至少90％或95％，甚至更優(yōu)選至少98％且最優(yōu)選約100％。抑制選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA活性的化合物-如項目(ii)所定義-根據(jù)本發(fā)明引起所述lncRNA執(zhí)行其功能但效率降低。抑制選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA活性的化合物特異抑制所述lncRNA的活性。優(yōu)選地，選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA活性減少至少50％，更優(yōu)選至少75％如至少90％或95％，甚至更優(yōu)選至少98％且最優(yōu)選約100％。測定RNA活性降低的途徑和方法在本領域已確立且描述于例如Esau等.(2004),JBC,279:52361-52365或Gribbings等.(2009),NatureCellBiology11,1143-1149。如項目(ii)所定義的化合物可以是反義分子、siRNA、shRNA、抗體、核酶、適體或小分子。這些和其它化合物在下文進一步詳述。抑制化合物的效率能通過如下方法定量：比較有和沒有抑制劑情況下的活性水平。例如，活性量度可作為：所形成lncRNA量的變化。這種方法可以高通量形式實現(xiàn)以同時測試數(shù)種抑制化合物的效率。高通量試驗獨立于生化、細胞或其它試驗，一般可在微量滴定板的孔中進行，其中各板可包含96、384或1536個孔。板的處理包括在環(huán)境溫度以外的溫度孵育、使測試化合物接觸試驗混合物，優(yōu)選由一種或多種計算機控制的機器人系統(tǒng)實施，包括移液裝置。在大的測試化合物庫待篩選和/或篩選在短時間內完成的情況下，可向各孔加入例如10、20、30、40、50或100種測試化合物的混合物。在孔顯示預期活性的情況下，所述測試化合物的混合物可去卷積以鑒定所述混合物中產生所述活性的更多測試化合物。促進一種或多種選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA表達的化合物-如項目(i)所定義-可以是提高或上調選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA轉錄的任何化合物。這類化合物的非限制性示例是提高基因轉錄的轉錄因子，所述基因編碼選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA，或是提高一種或多種選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA表達的小分子。轉錄因子是結合特異DNA序列的蛋白，從而控制遺傳信息從DNA向RNA轉錄。小分子是低分子量化合物，其定義上不是聚合物。促進一種或多種選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA活性的化合物-如項目(i)所定義-可以是引起所述lncRNA在細胞中有效執(zhí)行其功能的任何化合物。因此，采用最簡單形式的這種化合物可以是選自SEQIDNO12、8-11和13的重組生成或分離的lncRNA或其任何前體或片段。在此實施方式中，施用重組生成或分離的lncRNA增加待治療對象中的lncRNA濃度。此較高濃度促進對象中各lncRNA的總活性。所述片段必須保留或基本保留全長lncRNA的功能。這種化合物也可以是能生成這類lncRNA的載體或宿主。由此，所述片段必須是功能片段。還能使用選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA的直系同源或同源序列，來自不同種類，包括其前體或功能片段。在此方面，具有SEQIDNO12、8-11和13的人lncRNA的優(yōu)選同源序列分別是具有SEQIDNO:25、21-24和26的各小鼠同源物。最優(yōu)選的同源序列是SEQNO:12?；蛘?，這種化合物可以是通過直接或間接與lncRNA相互作用維持或甚至提高選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA活性的化合物。例如，這種化合物能防止選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA被核糖核酸酶降解或可以是相互作用伴侶如另一lncRNA，其結合選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA并促進其活性。如項目(i)所定義的化合物在下文進一步詳述。如項目(i)所定義的化合物的效率還能通過如下方法定量：在lncRNA的表達和/或活性促進化合物如轉錄因子存在或所述化合物缺失情況下，比較選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA表達和/或活性水平。例如，所形成lncRNA量的變化可用作活性量度。所述方法優(yōu)選以高通量形式實現(xiàn)，如上文進一步詳述。在第二方面，本發(fā)明涉及(i)促進一種或多種選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA表達和/或活性的化合物；和/或(ii)抑制一種或多種lncRNA表達和/或活性的化合物以治療或預防心臟肥大的化合物，所述lncRNA選自SEQIDNO1-7、27和28。結合本發(fā)明第一方面，如項目(i)和(ii)所定義的化合物在上文進一步詳述。同一化合物能與本發(fā)明第二方面聯(lián)用。心臟肥大定義為心臟尺寸增加，而心肌細胞數(shù)沒有增加。這引起心臟壁增厚。病理性心臟肥大響應不同壓力形式所導致血液動力學超負荷而發(fā)生，如高血壓、瓣膜疾病和心肌梗塞(Ml)。延長的心臟細胞肥大性生長引起心律失常、心力衰竭且可導致猝死(FreyN,OlsonEN.Cardiachypertrophy:thegood,thebad,andtheugly.AnnuRevPhysiol.2003；65:45-79)。因此，根據(jù)本發(fā)明，心臟肥大是不健康的心臟肥大(或病理性心臟肥大)，如響應壓力或疾病例如高血壓、心肌損傷(心肌梗塞)、心力衰竭或神經(jīng)激素的心臟肥大。不健康的心臟肥大保持不同于健康的心臟肥大(生理性肥大或“運動員心臟”)，后者是正常的心臟反應，例如響應健身鍛煉或懷孕。在健康對象中，賽艇運動員或自行車手往往心臟最大，平均左心室壁厚度是1.3厘米，相比之下普通成年人為1.1厘米。為鑒定在心臟肥大發(fā)展中起作用的lncRNA，采用主動脈縮窄(TAC)小鼠模型(參見deAlmeida等.(2010),JVisExp.2010年4月,(38))。TAC小鼠模型在1991年建立。自此，該模型廣泛用作有價值的工具以盡可能減少人心臟肥大并闡明參與心臟肥大反應的基礎信號傳遞過程。來自TAC小鼠的分離RNA用于完整心臟以及心肌細胞特異樣品中的總lncRNA譜，應用平臺NCode和Arraystar。意外發(fā)現(xiàn)TAC小鼠中的特異lncRNA相較負對照小鼠顯著失調。這些lncRNA選自譜數(shù)據(jù)(見表5)。通過PCR確認小鼠心臟組織中存在轉錄物且通過實時PCR驗證失調。從下文示例明顯看出，本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)相較負對照小鼠，具有SEQIDNO1-7、27和28的人lncRNA的小鼠同源物(即SEQIDNO14-20的lncRNA)在TAC小鼠模型中顯著上調。在此方面，應注意人序列SEQIDNO1、27和28都是SEQIDNO:14的小鼠序列同源物。由于人和小鼠不同的基因組重復事件，存在超過一個人同源物。發(fā)現(xiàn)所有3個人同源物在人心臟組織中表達且最突出發(fā)現(xiàn)在來自主動脈狹窄患者的肥厚心臟中上調(見圖13B)。這些小鼠和人同源lncRNA的上調與心臟肥大發(fā)展明顯相關。因此，SEQIDNO14-20的小鼠lncRNA以及SEQIDNO1-7、27和28的同源人lncRNA是促肥大lncRNA?？深A期同源人lncRNA具有與小鼠lncRNA相同的功能。于是抑制SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA在人中的表達和/或活性會對治療或預防心臟肥大有益。從下文示例更顯而易見的是，本發(fā)明揭示相較負對照小鼠，具有SEQIDNO12、8-11和13的人lncRNA的小鼠同源物(即SEQIDNO25、21-24和26的lncRNA)在TAC小鼠模型中顯著下調。這些小鼠lncRNA的下調與心臟肥大發(fā)展明顯相關。因此，SEQIDNO25、21-24和26的小鼠lncRNA以及SEQIDNO12、8-11和13的同源人lncRNA是抗肥大lncRNA。于是促進SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA在人中的表達和/或活性會對治療或預防心臟肥大有益。結論是SEQIDNO14-20的小鼠lncRNA是促肥大lncRNA，而SEQIDNO25、21-24和26的小鼠lncRNA是抗肥大lncRNA，所述結論通過獨立的體外模型進一步就促肥大RNAlncRNAGM11641(SEQIDNO:14，人同源物SEQIDNO1、27和28)、抗肥大lncRNAGm17499(SEQIDNO:21，人同源物SEQIDNO:8)和抗肥大lncRNAH19(SEQIDNO:25，人同源物SEQIDNO:12)用實驗證明。Gm11641在本文中也稱為Chast(心臟肥大相關轉錄物)。肥大心肌細胞的標志是細胞尺寸相對于非肥大細胞增加。HL-1小鼠心肌細胞的體外肥大性生長和細胞尺寸增加能由苯腎上腺素(PE)和異丙腎上腺素(ISO)誘導。因此，在第一實驗設置中，PE和ISO刺激后的HL-1小鼠心肌細胞尺寸在一定條件下研究，其中(a)lncRNAGm11641表達受抑制以及(b)在一定條件下，其中l(wèi)ncRNAGm11641表達提高(見圖11)。與TAC小鼠模型結果一致，發(fā)現(xiàn)lncRNAGm11641過表達引起細胞尺寸相較負對照增加，而抑制lncRNAGm11641可減少心肌細胞尺寸且進一步削弱PE/ISO誘導的細胞尺寸增加。此外，Gm11641過表達增加左心室肌肉質量并誘導心肌細胞生長(圖38)。這些結果顯示lncRNAGm11641的促肥大功能。對應實驗在第二和第三實驗設置中進行，分別用lncRNAsGm17499和H19。同樣與TAC小鼠模型結果一致，lncRNAGm17499表達提高可防止促肥大刺激引起的HL-1細胞尺寸增加，而lncRNAGm17499沉默會引起HL-1心肌細胞增大，指示此轉錄物的抗肥大功能(見圖22)。這些結果顯示lncRNAGm17499的抗肥大功能。在抑制lncRNAH19的實驗中觀察到類似結果(見圖28-30)。重要的是，在人健康和肥厚心臟(歸因于主動脈狹窄)組織中檢測H19表達時，發(fā)現(xiàn)H19在肥厚心臟中強烈下調(見圖31)。另外，H19敲減小鼠的體內結果表明H19對肥厚基因程序產生有益效果并用于抗肥大治療(見圖34和35)。根據(jù)本發(fā)明第二方面的優(yōu)選實施方式，所述心臟肥大是心室肥大。大部分心臟肥大病例影響心室。盡管左心室肥大更常見，心臟肥大也能在右心室或2個心室中發(fā)生。心室是負責將血泵入肺(右心室)或身體其它部分(左心室)的心臟小室。根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面的優(yōu)選實施方式，如(ii)所定義的化合物是(a)核酸序列，其包括與lncRNA至少12個連續(xù)核苷酸互補的核苷酸序列或由其組成，所述lncRNA選自SEQIDNO1-7、27和28，(b)核酸序列，其包括與一個或多個選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA互補鏈具有至少69％相同性的核苷酸序列或由其組成，(c)核酸序列，其包括根據(jù)(a)或(b)的核苷酸序列由其組成，其中U被T取代，(d)表達載體，表達如(a)-(c)中任一項所定義的核酸序列，優(yōu)選地，在心臟特異啟動子控制下表達，或(e)宿主，包括(d)的表達載體。根據(jù)本發(fā)明，術語“核酸序列”或“核苷酸序列”包括DNA如cDNA，或在一個優(yōu)選實施方式中，是基因組DNA和RNA。應理解本文所用的術語“RNA”包括所有RNA形式，包括在一個優(yōu)選實施方式中的mRNA或miRNA。術語“核酸序列”根據(jù)本發(fā)明可與術語“多核苷酸”互換使用。此優(yōu)選實施方式的項目(a)-(c)所定義的核酸序列包含這樣序列或由其組成，所述序列包含選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA的核苷酸或與其互補。因此，這些核酸序列包括或是反義核酸序列。用于使靶基因表達沉默的反義技術已確立并廣泛用于本領域以治療多種疾病。本發(fā)明此優(yōu)選實施方式的項目(a)所述分子包括這樣的序列或由其組成，所述序列與SEQIDNO1-7、27和28中至少13個核苷酸、至少14個核苷酸、至少15個核苷酸、至少16個核苷酸、至少17個核苷酸、至少18個核苷酸、至少19個核苷酸、至少20個核苷酸、至少21個核苷酸、至少22個核苷酸、或所有23個核苷酸互補，依次更優(yōu)選。這些至少13個核苷酸、至少14個核苷酸、至少15個核苷酸、至少16個核苷酸、至少17個核苷酸、至少18個核苷酸、至少19個核苷酸、至少20個核苷酸或至少21個核苷酸優(yōu)選是SEQIDNO1-7、27和28的連續(xù)部分，即所述核苷酸在各SEQIDNO中連續(xù)。項目(a)所述分子優(yōu)選是“siRNA”。根據(jù)本發(fā)明，“siRNA”指小干擾RNA，也稱為短干擾RNA或沉默RNA。siRNA是一類18-30個，優(yōu)選20-25個，最優(yōu)選21-23個或21個核苷酸長度雙鏈RNA分子，在生物學中起多種作用。最顯著的是，siRNA參與RNA干擾(RNAi)通路，其中siRNA干擾特異基因表達。除了其在RNAi通路中的作用，siRNA還作用于RNAi相關通路，如作為抗病毒機制或基因組染色質結構成形。siRNA具有明確結構：短雙鏈RNA(dsRNA)，有利地，有至少一條RNA鏈帶突出。各鏈通常有5'磷酸基團和3'羥基(-OH)基團。此結構是dicer處理的結果，dicer是將長dsRNA或短發(fā)夾RNA轉變成siRNA的酶。siRNA還能外源(人工)引入細胞以產生感興趣基因特異性敲減。因此，序列已知的任何基因原則上能根據(jù)與合適定制siRNA的序列互補性來靶向。雙鏈RNA分子或其代謝加工產物能介導靶標特異性核酸修飾，尤其是RNA干擾和/或DNA甲基化。還優(yōu)選至少一條RNA鏈具有5'-和/或3'-突出。雙鏈末端之一或兩者優(yōu)選具有1-5個核苷酸的3'-突出，更優(yōu)選1-3個核苷酸且最優(yōu)選2個核苷酸。一般，本發(fā)明考慮適于用作siRNA的任何RNA分子。迄今最有效的沉默用siRNA雙鏈體獲得，所述雙鏈體由21-nt有義和21-nt反義鏈組成，配對成具有2-nt3'-突出。2-nt3'突出的序列對限于毗鄰第一堿基對的未配對核苷酸的靶識別的特異性作用小(Elbashir等.Nature.2001年5月24日；411(6836):494-8)。3'突出中的2'-脫氧核苷酸與核糖核苷酸一樣有效，但通常合成更便宜且可能更具核酸酶抗性。本發(fā)明所述siRNA包含反義鏈，所述反義鏈包含與SEQIDNO1-7、27和28中至少13個核苷酸、至少14個核苷酸、至少15個核苷酸、至少16個核苷酸、至少17個核苷酸、至少18個核苷酸、至少19個核苷酸、至少20個核苷酸、至少21個核苷酸、至少22個核苷酸、或所有23個核苷酸(依次更優(yōu)選)互補的序列或由其組成。這些至少13個核苷酸、至少14個核苷酸、至少15個核苷酸、至少16個核苷酸、至少17個核苷酸、至少18個核苷酸、至少19個核苷酸、至少20個核苷酸或至少21個核苷酸優(yōu)選是SEQIDNO1-7、27和28的連續(xù)部分，即所述核苷酸在各SEQIDNO中連續(xù)。項目(a)所述分子優(yōu)選是“shRNA”。根據(jù)本發(fā)明，“shRNA”是短發(fā)夾RNA，其是形成(緊的)發(fā)夾彎的RNA序列，所述發(fā)夾彎也能用于經(jīng)RNA干擾使基因表達沉默。shRNA優(yōu)選利用U6啟動子來表達。shRNA發(fā)夾結構由細胞機器切割成siRNA，其隨后結合RNA誘導沉默復合體(RISC)。此復合體結合并切割mRNA，其匹配與之結合的shRNA。本發(fā)明所述shRNA包括：與SEQIDNO1-7、27和28中至少13個核苷酸、至少14個核苷酸、至少15個核苷酸、至少16個核苷酸、至少17個核苷酸、至少18個核苷酸、至少19個核苷酸、至少20個核苷酸、至少21個核苷酸、至少22個核苷酸、或所有23個核苷酸(依次更優(yōu)選)互補的序列或由其組成。這些至少13個核苷酸、至少14個核苷酸、至少15個核苷酸、至少16個核苷酸、至少17個核苷酸、至少18個核苷酸、至少19個核苷酸、至少20個核苷酸或至少21個核苷酸優(yōu)選是SEQIDNO1-7、27和28的連續(xù)部分，即所述核苷酸在各SEQIDNO中連續(xù)。上述本發(fā)明優(yōu)選實施方式的項目(b)所述分子能與靶l(wèi)ncRNA相互作用，更具體地，與靶l(wèi)ncRNA雜交。通過形成雜交體，lncRNA功能減少或被阻斷。已描述涉及這類反義技術的標準方法(參見例如Melani等.,CancerRes.(1991)51:2897-2901)。因此，本發(fā)明所述術語“反義分子”涉及核酸分子，優(yōu)選具有與給定lncRNA，即“有義”序列，互補的堿基序列的RNA分子。項目(b)所述分子的特別優(yōu)選示例是內切核糖核酸酶制備的siRNA(esiRNA)。esiRNA是siRNA寡核苷酸混合物，由內切核糖核酸酶如大腸桿菌(Escherichiacoli)核糖核酸酶III或dicer切割項目(b)所述長雙鏈RNA(dsRNA)產生。esiRNA是使用化學合成siRNA進行RNA干擾(RNAi)的替代概念。esiRNA是長雙鏈RNA體外酶消化。為產生esiRNA，lncRNA模板的cDNA可由PCR擴增并帶有2個噬菌體-啟動子序列標簽。然后，RNA聚合酶用于產生與靶-基因cDNA互補的長雙鏈RNA。此互補RNA隨后用來自大腸桿菌的核糖核酸酶III消化產生siRNA的短重疊片段，長度為18-25堿基對。此短雙鏈RNA的復合混合物類似Dicer體內切割產生的混合物并因而稱為內切核糖核酸酶制備的siRNA或短esiRNA。因此，esiRNA是都靶向同一mRNA序列的異源siRNA混合物。esiRNA引起高度特異和有效的基因沉默。項目(b)所述分子與選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA的序列相同性是至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％和100％，依次更優(yōu)選。本領域已知測定序列相同性的途徑和方法。優(yōu)選地，用BLAST(基本局部比對搜索工具)程序測定關于一種或多種選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA的序列相同性。核酸序列的優(yōu)選示例是一種或多種選自SEQIDNO14-20的lncRNA的互補鏈，所述核酸序列包括與一種或多種選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA互補鏈具有至少69％相同性的核苷酸序列。本發(fā)明的反義分子、siRNA和shRNA優(yōu)選用適當保護的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)RNA合成儀來化學合成。RNA合成試劑供應商包括Proligo(德國漢堡)、Dharmacon研究公司(DharmaconResearch，美國科羅拉多州拉法葉)、皮爾斯化學公司(PierceChemical，Perbio科學公司(PerbioScience)的部分,美國伊利諾伊州羅克福德)、GRC(GlenResearch，美國弗吉尼亞州斯特林)、ChemGenes(美國馬薩諸塞州阿什蘭)和Cruachem(英國格拉斯哥)。反義分子、siRNA和shRNA有力但可逆沉默lncRNA和基因的能力在體內使這些分子尤其適合用于本發(fā)明的藥物組合物。給人施用siRNA的方法參見DeFougerolles等.,CurrentOpinioninPharmacology,2008,8:280-285。這種方法也適合施用其它小RNA分子如shRNA。因此，這種藥物組合物可直接配制為鹽水施用，通過基于脂質體和基于聚合物的納米顆粒方法施用，作為綴合或絡合的藥物組合物施用，或經(jīng)病毒遞送系統(tǒng)施用。直接施用包括注入組織、鼻內和氣管內施用?；谥|體和基于聚合物的納米顆粒方法包括陽離子脂質GenzymeLipid(GL)67、陽離子脂質體、殼聚糖納米顆粒和陽離子細胞穿透肽(CPP)。綴合或絡合的藥物組合物包括PEI-復合的反義分子、siRNA、shRNA或miRNA。此外，病毒遞送系統(tǒng)包括流感病毒包膜和病毒體。反義分子、siRNA和shRNA可包括修飾核苷酸如鎖核酸(LNA)。LNA核苷酸的核糖部分用連接2'氧和4'碳的額外橋修飾。所述橋“鎖住”Z'-內式(北)構象中的核糖，其通常見于A型雙鏈體。需要時，LNA核苷酸能與寡核苷酸中的DNA或RNA殘基混合。這種寡聚物經(jīng)化學合成且市售可得。鎖定的核糖構象提高堿基堆積和主干預組織。這顯著增強寡核苷酸的雜交特性(熔解溫度)。尤其優(yōu)選的siRNA示例是GapmeR(LNATMGapmeR(Exigon))。GapmeR是有力的反義寡核苷酸，用于高度有效抑制mRNA和lncRNA功能。GapmeR包含一段中央的DNA單體，兩側是LNA塊。GapmeR優(yōu)選長14-16個核苷酸且可選全硫代磷酸化。DNA缺口激活核糖核酸酶H介導的靶RNA降解，也適于直接靶向核中的轉錄物。GapmeR用于示例，如下調心肌細胞系HL-1的lncRNAGM11641(SEQIDNO:14)(圖9)?？膳c上面優(yōu)選實施方式項目(d)聯(lián)用的合適表達載體示例在下文詳述。根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面的另一優(yōu)選實施方式，如(ii)所定義的化合物是適體、核酶、抗體、蛋白藥物或小分子抑制劑。此實施方式的適體、核酶、抗體、蛋白藥物或小分子抑制劑特異結合一種或多種選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA，從而抑制一種或多種選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA活性。本發(fā)明所述術語“適體”指DNA或RNA分子，采用天然D構象或L構象(“鏡像異構(spiegelmer)”)，根據(jù)其結合其它分子的能力選自隨機庫。所選適體結合核酸、蛋白、有機小化合物和甚至完整生物體。適體數(shù)據(jù)庫維持于http://aptamer.icmb.utexas.edu/。更特別地，適體能分類為DNA或RNA適體或肽適體。前者由寡核苷酸鏈組成(通常較短)，后者由可變肽短結構域組成，兩端都結合蛋白支架。核酸適體是核酸種類，其通過重復多輪的體外選擇或等同的SELEX(指數(shù)富集配體進化)進行加工，以結合多種分子靶標如小分子、蛋白、核酸和甚至細胞、組織及生物體。本發(fā)明考慮的分子靶標是核酸，即選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA。因此，能針對本發(fā)明靶分子生成適體。肽適體是設計成干擾細胞內其它蛋白相互作用的肽。其由兩端都結合蛋白支架的可變肽環(huán)組成。此雙重結構限制使肽適體的結合親和性大幅增加到與抗體相當?shù)乃?納摩爾范圍)?？勺儹h(huán)長度通常由10-20個氨基酸組成，所述支架可以是具有良好溶解性質的任何蛋白。目前，細菌蛋白硫氧還蛋白-A是最常用的支架蛋白，可變環(huán)插入還原活性位點，其是野生型蛋白中的-Cys-Gly-Pro-Cys-環(huán)，2條半胱氨酸側鏈能形成二硫鍵。肽適體選擇能用不同系統(tǒng)完成，但目前最常用的是酵母雙雜交系統(tǒng)。適體提供用于生物技術和治療應用的效用，因為其提供比得上常用生物分子尤其是抗體的分子識別特性。除了其區(qū)分識別，適體提供相比抗體的優(yōu)勢，因為其能在試管中完整加工，易由化學合成生成，具有所需存儲特性，并且在治療應用引起很少免疫原性或不引起。非修飾適體從血流中迅速清除，半衰期為數(shù)分鐘到數(shù)小時，主要歸因于核酸酶降解和通過腎從體內清除，這是適體固有低分子量的結果。適體迅速清除可在應用如體內診斷成像中具有優(yōu)勢。數(shù)種修飾如2'-氟-取代嘧啶、聚乙二醇(PEG)連接等對科學家而言可用，適體半衰期能增加到日或甚至周時間尺度。術語“核酶”指沒有蛋白時用作酶的RNA分子。這些RNA分子催化或自催化作用并能在特定靶位點切割例如其它RNA，但也發(fā)現(xiàn)其催化核糖體的轉氨酶活性。選擇合適靶位點和對應核酶能如Zaher和Unrau(2007),RNA13(7):1017-1026所述完成。良好表征的小自切割RNA示例是錘頭、發(fā)夾狀丁型肝炎病毒和體外選擇的前導依賴性核酶。這些小催化劑的組織與較大核酶如Ⅰ型內含子相反。催化自切割的原理在過去10年中已得到完善。在有核酶活性的RNA分子中，錘頭狀核酶的特征鑒定最好。由于顯示錘頭狀結構能整合入異源RNA序列且核酶活性能因此轉至這些分子，看來能對幾乎任何靶序列產生催化序列，只要靶序列包含潛在匹配切割位點。構建錘頭狀核酶的基本原理如下：選擇一個含有GUC(或CUC)三聯(lián)體的有趣RNA區(qū)。取2條寡核苷酸鏈并在其之間插入催化錘頭狀序列，所述鏈各有6-8個核苷酸。就多種靶序列合成此類分子。其顯示體外催化活性，一些情況下還顯示體內催化活性。最佳結果通常用短核酶和靶序列獲得。靶序列是短RNA序列，即選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA。選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA是用于生成核酶的真實靶序列，所述核酶能特異切割來自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA。適體和核酶還可包括修飾核苷酸，如鎖核酸(LNA)。例如，本發(fā)明所用的術語“抗體”包括多克隆或單克隆抗體。此外，術語“抗體”也包括其仍保留結合親和性的衍生物或片段?？贵w片段或衍生物包括Fab或Fab'片段、Fd、F(ab')2、Fv或scFv片段、單結構域VH或V樣結構域，如VhH或V-NAR-結構域，以及多聚形式，如微抗體、雙價抗體、三價抗體、四價抗體或化學綴合的Fab'-多體(參見例如Altshuler等.,2010.,Holliger和Hudson,2005)。術語“抗體”也包括實施方式如嵌合(人恒定結構域、非人可變結構域)、單鏈和人源化(人抗體，除了非人CDR)抗體。用于生成抗體和其片段的多種技術為本領域熟知并描述于例如Altshuler等,2010。因此，多克隆抗體能在用抗原與添加劑和佐劑的混合物免疫后獲自動物血液，單克隆抗體能通過經(jīng)連續(xù)細胞系培養(yǎng)提供抗體的任何技術生成。這類技術的示例描述于例如Harlow和Lane(1988)及(1999)，且包括最初由Kohler和Milstein,1975描述的雜交瘤技術、三源雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(參見例如Kozbor,1983；Li等.,2006)和EBV-雜交瘤技術以生成人單克隆抗體(Cole等.,1985)。此外，重組抗體可獲自單克隆抗體或能用多種展示法重頭制備，如噬菌體、核糖體、mRNA或細胞展示。用于表達重組(人源化)抗體或其片段的合適系統(tǒng)可選自例如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞系或轉基因動物或植物(參見例如美國專利6,080,560；Holliger和Hudson,2005)。此外，描述以用于生成單鏈抗體所述的技術(參見美國專利4,946,778)能適于生成對本發(fā)明靶標特異的單鏈抗體。BIAcore系統(tǒng)所采用的表面等離子體共振能用于增加噬菌體抗體效率。術語“蛋白藥物”指定作為人蛋白衍生物的設計師藥物。這些蛋白用作支架以通過完善的篩選程序(參見Tomlinson等(2004),NATUREBIOTECHNOLOGY,22(5):521-522)形成蛋白藥物。用作支架以設計蛋白藥物的人蛋白的非限制性示例是轉鐵蛋白、C型凝集素、三粘連蛋白(trinectins)、結構域抗體、kunitz結構域、脂質運載蛋白和FynSH3結構域。小分子抑制劑是低分子量有機化合物，其按照定義并非聚合物。本發(fā)明的小分子優(yōu)選是以高親和性結合SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA且另外抑制SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA活性的分子。小分子的分子量上限優(yōu)選是1500Da，更優(yōu)選1000Da且最優(yōu)選800Da，這允許迅速擴散穿過細胞膜的可能性，從而其能到達胞內作用位點。本領域已建立了有機小分子庫和高通量技術，用于通過特異靶分子如本情況中選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA，來篩選這類庫。反義分子、siRNA、shRNA、抗體、酶、核酶、適體、蛋白藥物或小分子抑制劑可融合脂質，如膽固醇。向核酸分子引入脂質修飾且尤其是膽固醇修飾的途徑和方法參見Krutzfeldt等.2005(Nature438,685-689)。例如，膽固醇可經(jīng)羥基脯氨醇連接核酸分子。這種修飾提高核酸分子尤其是小RNA攝入細胞的效率。根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面的另一優(yōu)選實施方式，如(i)所定義的化合物是(a)核酸序列，其包括一個或多個選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA核酸序列或與其具有至少69％相同性的核酸序列，或由其組成，(b)表達如(a)所定義核酸序列的表達載體，優(yōu)選在心臟特異啟動子控制下表達，或(c)含有(b)的表達載體的宿主。此優(yōu)選實施方式項目(a)所述核酸序列可以是選自SEQIDNO12、8-11和13的重組生成或分離的lncRNA，其任何前體或任何片段，只要維持在全長上與選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA具有至少69％的序列相同性。可使用選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA直系同源或同源序列，來自不同種類，包括其前體或功能片段。優(yōu)選使用SEQIDNO:21-26的各小鼠同源物。所述片段必須保留或基本保留全長lncRNA的功能。因此，所述片段必須是功能片段。所含核酸序列與SEQIDNO8-13的lncRNA具有至少69％相同性的特別優(yōu)選序列示例分別是SEQIDNO21-26的小鼠同源lncRNA。最優(yōu)選的小鼠同源lncRNA是SEQIDNO:25。項目(a)所述核酸序列與選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA序列相同性越來越偏好至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％和100％。本領域已知測定序列相同性的途徑和方法。優(yōu)選地，BLAST(基本局部比對搜索工具)程序用于測定關于一種或多種選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA的序列相同性。根據(jù)上面優(yōu)選實施方式的項目(b)和(c)，這種化合物也可以是能生成如項目(a)所定義核酸序列的表達載體或宿主。表達載體可以是用于將特定轉錄物引入靶細胞的質粒。一旦表達載體在細胞內，基因所編碼的蛋白通過細胞轉錄和翻譯機器核糖體復合物生成。質粒一般改造成包含用作增強子和/或啟動子區(qū)域和引起轉錄物有效轉錄的調節(jié)序列。根據(jù)本發(fā)明，所述表達載體優(yōu)選包含心臟特異啟動子。本領域已知心臟特異啟動子，例如來自Boecker等.(2004),MolImagin.；3(2):69-75。這確保核酸序列僅表達于心臟且可避免其它器官表達帶來的潛在的不需要的副作用。表達載體的非限制性示例包括原核質粒載體如pUC系列、pBluescript(Stratagene)、表達載體pET系列(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)，以及與哺乳動物細胞表達相容的載體如pREP(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMCIneo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、plZD35、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)、pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。例如，適合畢赤酵母(Pichiapastoris)的質粒載體示例包括質粒pA0815、pPIC9K和pPIC3.5K(都是Invitrogen)。為配制藥物組合物，根據(jù)良好生產規(guī)范選擇合適載體。本領域已知這類載體，例如來自Ausube等,HumGeneTher.2011年4月；22(4):489-97或Allay等.,HumGeneTher.2011年5月；22(5):595-604。典型哺乳動物表達載體包含啟動子元件，其介導起始轉錄mRNA、蛋白編碼序列以及終止轉錄和轉錄物聚腺苷酸化所需信號。此外，也可納入元件如復制起點、藥物抗性基因、調節(jié)因子(作為誘導型啟動子的一部分)。lac啟動子是用于原核細胞的典型誘導型啟動子，其能用乳糖類似物異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)誘導。對于重組表達和分泌，感興趣多核苷酸可在例如PelB前導信號與稱為pHEN4的噬菌粒中基因III之間連接，所述PelB前導信號指導周質中的重組蛋白(參見Ghahroudietal,1997,FEBSLetters414:521-526)。額外元件可包括增強子、Kozak序列和側翼有RNA剪接用供體和受體位點的間插序列。高度有效轉錄能用以下啟動子完成：來自SV40的早期和晚期啟動子，來自逆轉錄病毒的長末端重復(LTR)如RSV、HTLVI、HIVI，巨細胞病毒(CMV)的早期啟動子。然而，還能使用細胞元件(如人肌動蛋白啟動子)。例如，用于實踐本發(fā)明的合適表達載體包括載體如pSVL和pMSG(Pharmacia,瑞典烏普薩拉)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)?；蛘撸亟M(多)肽能表達于穩(wěn)定細胞系，所述細胞系包含整合入染色體的基因構建體。用選擇性標記如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素共轉染能鑒定和分離轉染的細胞。還能擴增轉染的核酸以表達大量編碼的(多)肽。DHFR(二氫葉酸還原酶)用于開發(fā)攜帶數(shù)百個或甚至數(shù)千個感興趣基因拷貝的細胞系。另一有用的選擇性標記是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等.1991,BiochemJ.227:277-279；Bebbington等.1992,Bio/Technology70:169-175)。使用這些標記，所述哺乳動物細胞生長于選擇性培養(yǎng)基并選擇抗性最高的細胞。如上所示，表達載體優(yōu)選包括至少一種選擇性標記。這些標記包括二氫葉酸還原酶、G418或用于真核細胞培養(yǎng)的新霉素抗性以及用于大腸桿菌(E.coli)和其它細菌培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。對于載體修飾技術，參見Sambrook和Russel(2001),《分子克?。簩嶒炇沂謨浴?MolecularCloning:ALaboratoryManual),第3卷。一般，載體可包含一個或多個復制起點(ori)和用于克隆或表達的遺傳系統(tǒng)，一個或多個用于宿主中選擇的標記如抗生素抗性，以及一個或多個表達盒。例如，合適的復制起點(ori)包括ColE1、SV40病毒和M13復制起點。例如，插入載體的編碼序列能由標準方法合成，或分離自天然來源。連接編碼序列與轉錄調節(jié)元件和/或其它氨基酸編碼序列能用已建立的方法完成。確保原核或真核細胞中表達的轉錄調節(jié)元件(部分表達盒)為本領域技術人員熟知。這些元件包括確保轉錄起始的調節(jié)序列(如翻譯起始密碼子、啟動子、增強子和/或絕緣子)、內部核糖體進入位點(IRES)(Owens,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98(2001),1471-1476)，和任選地，確保轉錄終止和轉錄物穩(wěn)定的poly-A信號。額外調節(jié)序列可包括轉錄以及翻譯增強子，和/或天然相關或異源啟動子區(qū)。優(yōu)選地，如本發(fā)明上述優(yōu)選實施方式的項目(a)所定義的核苷酸序列操作性連接這類允許原核或真核細胞中表達的表達控制序列。所述宿主可以是原核或真核細胞。合適的真核宿主可以是哺乳動物細胞、兩棲動物細胞、魚細胞、昆蟲細胞、真菌細胞或植物細胞。細菌細胞的代表性示例是大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)細胞；真菌細胞的代表性示例是酵母細胞；昆蟲細胞的代表性示例是果蠅S2和夜蛾Sf9細胞。優(yōu)選所述細胞是哺乳動物，如人細胞。能使用的哺乳動物宿主細胞包括人Hela、293、H9和Jurkat細胞，小鼠NIH3T3和C127細胞，Cos1、Cos7和CV1、鵪鶉QC1-3細胞，小鼠L細胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。所述細胞可以是細胞系一部分，優(yōu)選人細胞系。本領域已知用于上述宿主細胞的合適培養(yǎng)基和條件。所述宿主優(yōu)選是宿主細胞，更優(yōu)選分離的宿主細胞。所述宿主還優(yōu)選是非人宿主。根據(jù)本發(fā)明第一和第二方面的另一優(yōu)選實施方式，如(i)所定義的化合物是(a)轉錄因子，促進一個或多個選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA表達，和/或(b)小分子，提高一個或多個選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA表達。本文所用的術語“轉錄因子”定義結合特異DNA序列的蛋白或肽，從而控制一個或多個選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA編碼基因的轉錄。轉錄因子在活化選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA表達中的效率能用以下方法定量：比較有和沒有轉錄因子情況下的lncRNA水平。例如，所形成lncRNA量的變化可用作活性量度。這種方法以高通量形式實現(xiàn)，從而同時測試數(shù)種抑制化合物的效率。高通量形式如上文進一步詳述。提高一個或多個選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA表達的小分子是低分子量有機化合物，其按照定義并非聚合物。本發(fā)明的小分子優(yōu)選是以高親和性結合SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA且另外抑制SEQIDNO11、8-11和13的lncRNA活性的分子。小分子的分子量上限優(yōu)選是1500Da，更優(yōu)選1000Da且最優(yōu)選800Da，這允許迅速擴散穿過細胞膜的可能性，從而其能到達胞內作用位點。本領域已建立了有機小分子庫和高通量技術，用于通過特異靶分子如本情況中選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA，來篩選這類庫。在第三方面，本發(fā)明涉及診斷患者心臟肥大的方法，包括(a)在獲自所述患者的樣品中檢測一個或多個選自SEQIDNO12、1-11、13、27和28的lncRNA表達水平，和(b)比較所述一個或多個lncRNA表達水平與獲自健康對象的樣品中一個或多個lncRNA表達水平，其中一個或多個選自SEQIDNO1-7、27和28的lncRNA下調大于2倍；和/或一個或多個選自SEQIDNO12、8-11和13的lncRNA上調大于2倍指示患者心臟肥大。本發(fā)明第三方面所述方法還可包括檢測和比較，與SEQIDNO12、1-11、13、27和28中任一種具有至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％和至少99.5％相同性(依次更優(yōu)選)的一個或多個lncRNA的表達水平。本領域已知測定序列相同性的途徑和方法。優(yōu)選地，BLAST(基本局部比對搜索工具)程序用于測定關于一種或多種選自SEQIDNO1-7、27和28和/或12、8-11和13的lncRNA的序列相同性。本發(fā)明第三方面所述方法還可包括檢測和比較與SEQIDNO1-7、27和28和/或12、8-11和13中任一種的差異不超過10個，如5、4、3、2或1個核苷酸(依次更優(yōu)選)的一個或多個lncRNA的表達水平。核苷酸差異可以是加入、缺失和/或取代核苷酸。盡管同源但仍比較其表達的序列也可彼此不同，越來越偏好不超過10個，如5、4、3、2或1個核苷酸。術語“樣品”指定組織樣品或體液樣品。體液樣品優(yōu)選選自血液、血清、血漿、尿、唾液、羊水、腦脊液和淋巴。組織樣品優(yōu)選是器官樣品，如心臟、肝或腎樣品。至于將所述方法應用于體液樣品，應理解lncRNA表達水平對應于lncRNA濃度，因為lncRNA不直接在體液中表達，但從細胞分泌，所述細胞將lncRNA表達到體液中?！盎颊摺被颉皩ο蟆痹诒疚闹溉恕Ｐg語“檢測lncRNA表達水平”指測定lncRNA的量或產量。lncRNA初始在細胞內表達。根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，SEQIDNO1-7、27和28和/或12、8-11和13的lncRNA能在患者樣品中檢測到，尤其是心臟組織樣品。因此，“樣品中表達”的lncRNA是表達水平能通過下文進一步詳述的途徑和方法在樣品中檢測到的lncRNA。如果ncRNA的量或產量顯著高于對照樣品中相應ncRNA的量或產量，則ncRNA在測試樣品中上調。同樣，如果ncRNA的量或產量顯著低于對照樣品中相應ncRNA的量或產量，則ncRNA在測試樣品中下調。此背景下，術語“相應ncRNA”指例如測試樣品中SEQIDNO:1的lncRNA表達水平與對照樣品中SEQIDNO:1的lncRNA表達水平作比較，或同樣，試樣品中SEQIDNO:2的lncRNA表達水平與對照樣品中SEQIDNO:2的lncRNA表達水平作比較。這參照適用于測定大于一種選自SEQIDNO12、1-11、13、27和28的lncRNA表達的情況。例如，若在測試樣品中測定SEQIDNO12、1-11、13、27和28的所有l(wèi)ncRNA表達水平，其與對照樣品中SEQIDNO12、1-11、13、27和28的所有l(wèi)ncRNA表達水平作比較。樣品的表達水平能通過本領域可用的任何合適途徑和方法定量。一般，能使用相對和絕對定量工具(mean)及方法。絕對定量不需要已知標準或對照。表達水平能直接量化。如本領域熟知，絕對定量可依賴于預定標準曲線。相對定量中，表達水平相對于參照(如已知對照表達水平)量化。同樣在沒有對照的情況下，當比較例如熒光強度時，能相對定量表達水平。例如，評價RNA濃度的方法可包括測量結合核酸并在結合時選擇性發(fā)熒光的染料熒光強度。這種方法包括逆轉錄反應和生成cDNA，其中測定cDNA的量，從而間接確定RNA的量。基于熒光的方法特別用于RNA濃度過低以至于無法用分光光度法精確評估的情況和/或在260nm吸收的污染物使通過分光光度法精確定量困難或不可能的情況。比較一種或多種lncRNA在不同樣品間的表達水平時，所述比較的可靠性優(yōu)選通過納入不變內源對照(參照基因的表達)來提高以校正潛在的樣品間變化。這種涉及不變內源對照的標準化在本領域常規(guī)進行。例如，用于表達水平標準化的途徑和方法如實時RT-PCR(參見例如Bustin,JournalofMolecularEndocrinology,(2002)29,23-39)或微陣列表達分析(參見例如Calza和Balwitan,MethodsMolBiol.2010；673:37-52)已得到確立。用于小RNA序列表達水平標準化的方法也已確立(參見例如Mestdagh等.(2009)GenomeBiol.；0(6):R64)。在RT-PCR或微陣列用于根據(jù)本發(fā)明測定表達水平的情況下，表達水平優(yōu)選針對加標RNA標準化(參見例如McCormick等.(2011),Silence,2:2)。已知量的加標RNA在制備期間混合樣品。更優(yōu)選地，RNA在完成RNA分離過程前外部加標到血漿和/或血清，其中樣品是血漿和/或血清。熟知加標RNA技術且商業(yè)試劑盒可獲自多個廠商。加標RNA優(yōu)選是加標秀麗隱桿線蟲(C.elegans)RNA。從下文實施例可明顯看出，一個或多個選自14-20和15-26的小鼠lncRNA水平失調指示心臟肥大，如TAC小鼠模型所證明。因此，可預期一個或多個選自12、1-11、13、27和28的各人同源lncRNA表達水平具有診斷患者心臟肥大的預測價值。選自12、1-11、13、27和28的lncRNA可聯(lián)合其它心臟肥大診斷標志物以提高診斷方法置信度。高表達水平的選自1-7、27和28的lncRNA和低表達水平的選自12、8-11和13的lncRNA指示心臟肥大。在下文實施例中，采用SEQIDNO29-62的引物序列以檢測lncRNA表達水平，其中奇數(shù)是正向引物而偶數(shù)是反向引物。連續(xù)數(shù)字如SEQIDNO29和30、SEQIDNO31和32、SEQIDNO33和34等是引物對。SEQIDNO29/30的引物對用于檢測小鼠lncRNAH19(SEQIDNO:25)的表達水平，而SEQIDNO31/32的引物對用于檢測人lncRNAH19(SEQIDNO:12)的表達水平。SEQIDNO39/40的引物對用于檢測小鼠lncRNAGm11641(SEQIDNO:14)的表達水平，而3個人同源lncRNASEQIDNO1、27和28的表達水平能分別通過SEQIDNO33/34、SEQIDNO35/36和SEQIDNO37/38的引物對檢測。一個或多個這些引物對優(yōu)選用于本發(fā)明第三方面所述診斷方法。一個或多個這些引物對同樣優(yōu)選納入下文所述的本發(fā)明試劑盒。依次更優(yōu)選大于2倍下調、大于3倍下調、大于4倍下調、大于5倍下調、大于6倍下調、大于7倍下調和大于8倍下調。同樣，依次更優(yōu)選大于2倍上調、大于3倍上調、大于4倍上調、大于5倍上調、大于6倍上調、大于7倍上調和大于8倍上調。上調和下調的更高閾值可增加本發(fā)明第三方面所述方法的可靠性。根據(jù)本發(fā)明第三方面的優(yōu)選實施方式，所述樣品是血液樣品或血源性樣品。所述血源性樣品優(yōu)選是血漿或血清。根據(jù)本發(fā)明第三方面的另一優(yōu)選實施方式，所述樣品是心臟組織樣品。所述心臟組織樣品優(yōu)選包括心臟壁的肌肉細胞，且最優(yōu)選心室壁的肌肉細胞。根據(jù)本發(fā)明第三方面的另一優(yōu)選實施方式，檢測一個或多個lncRNA表達水平包括(a)定量PCR，優(yōu)選定量實時PCR，或(b)模板/RNA擴增法，然后用基于熒光或發(fā)光的定量法測定一個或多個lncRNA表達水平。定量PCR(qPCR)中，擴增產物的量與熒光強度相關聯(lián)，采用熒光報告分子。測量熒光信號以計算初始模板量的點可以是反應結束(終點半定量PCR)或擴增仍在推進時(實時qPCR)。終點半定量PCR中，在擴增反應完成后收集熒光數(shù)據(jù)，通常30-40個循環(huán)后，此終熒光用于反演計算PCR前存在的模板量。更敏感和可重復的實時qPCR法隨著擴增推進來測量各循環(huán)的熒光。這在限制試劑、抑制劑積聚或聚合酶失活開始對擴增效率產生影響前，允許模板定量基于擴增指數(shù)期中的熒光信號。這些早期反應循環(huán)的熒光讀數(shù)會測量擴增的模板量，其中樣品間的反應比終點的可重復性高許多。模板/RNA擴增法然后用基于熒光或發(fā)光的定量法測定一個或多個lncRNA表達水平的非限制性示例是組合轉錄介導擴增技術(TMA)與雜交保護實驗(HPA)的方法。更詳細地，這種方法可包括雜交一種或多種與任何SEQIDNO12、1-11、13、27和28互補的寡核苷酸(“捕獲寡核苷酸”)。在兩種或更多SEQIDNO12、1-11、13、27和28被靶向的情況下，單獨捕獲寡核苷酸用于選自12、1-11、13、27和28的各序列。雜交的靶序列隨后在磁性微粒上捕獲，其在磁場中與樣品分開。洗滌步驟可用于移出外來組分。靶擴增通常經(jīng)TMA發(fā)生，TMA是基于轉錄的核酸擴增法，采用2種酶即莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆轉錄酶和T7RNA聚合酶。一組獨特的引物用于選自12、1-11、13、27和28的各靶序列。逆轉錄酶用于產生靶序列的DNA拷貝(含用于T7RNA聚合酶的啟動子序列)。T7RNA聚合酶從DNA拷貝生成多拷貝的RNA擴增子。檢測lncRNA表達水平通過HPA實現(xiàn)，用與一個或多個擴增子互補的單鏈、化學發(fā)光標記的核酸探針。優(yōu)選地，可區(qū)分標記的探針用于各靶擴增子。標記的核酸探針與擴增子特異性雜交。然后，“選擇試劑”通過滅活未雜交探針上的標記來區(qū)分雜交和未雜交探針。檢測步驟中，雜交探針生成的化學發(fā)光信號用光度計測量并報告為“相對光單位”(RLU)，從而定量lncRNA表達水平。根據(jù)本發(fā)明第三方面的另一優(yōu)選實施方式，所述方法包括在檢測長非編碼RNA表達水平前，測試患者樣品和/或對照患者樣品內RNA的預擴增步驟。進行預擴增步驟在僅少量(測試和/或對照)樣品可用的情況下特別具有優(yōu)勢。預擴增步驟允許增加樣品內的RNA量，然后進入表達水平分析。預擴增RNA的途徑和方法為本領域熟知(參見例如Vermeulen等(2009)BMCResNotes.,2:235)。在測試和對照樣品中的RNA都預擴增的情況下，優(yōu)選采用同一方法用于預擴增步驟，從而維持測試樣品相較對照樣品的相對RNA量。在僅測試或對照樣品的RNA預擴增或兩種RNA樣品由不同方法預擴增的情況下，表達水平數(shù)據(jù)可能必須就預擴增步驟標準化；參見例如Mestdagh等.(2009),GenomeBiology2009,10:R64。在第四方面，本發(fā)明涉及診斷患者心臟肥大的試劑盒，所述試劑盒包括檢測一個或多個選自SEQIDNO12、1-11、13、27和28的lncRNA表達水平的方法，以及如何使用試劑盒的說明書。關于如何使用試劑盒的說明書優(yōu)選告知高表達水平的選自1-7、27和28的lncRNA和低表達水平的選自12、8-11和13的lncRNA指示心臟肥大。檢測一個或多個選自SEQIDNO12、1-11、13、27和28的lncRNA表達水平的工具優(yōu)選(i)定量PCR，優(yōu)選定量實時PCR，所需的工具，或(ii)模板/RNA擴增法，然后用基于熒光或發(fā)光的定量法測定一個或多個lncRNA表達水平所需的工具。這些工具結合本發(fā)明第三方面如上文進一步詳述，且可包括在試劑盒中。因此，所述工具優(yōu)選包括寡核苷酸，如熒光雜交探針或引物，其與一個或多個選自SEQIDNO12、1-11、13、27和28的lncRNA特異性雜交。所述試劑盒的其它成分可以是熒光或發(fā)光染料，優(yōu)選偶聯(lián)所述寡核苷酸。所述試劑盒的其它成分也可以是酶，如逆轉錄酶和/或聚合酶。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，檢測一個或多個選自SEQIDNO12、1-11、13、27和28的lncRNA表達水平的工具優(yōu)選包括檢測SEQIDNO:12的lncRNA的工具。所述試劑盒的多種組分可包裝于一個或多個容器，如一個或多個小瓶。除了所述組分，小瓶還可包括防腐劑或緩沖劑用于存儲。根據(jù)本發(fā)明第四方面的一個優(yōu)選實施方式，所述工具是引物對，用于特異檢測一個或多個選自SEQIDNO12、1-11、13、27和28的lncRNA表達水平。根據(jù)本發(fā)明所有四方面的一個優(yōu)選實施方式，一個或多個lncRNA是至少3個lncRNA，優(yōu)選至少5個lncRNA。采用SEQIDNO12、1-11、13、27和28的至少3個lncRNA，優(yōu)選至少5個lncRNA，更優(yōu)選至少10個lncRNA，甚至更優(yōu)選至少20個lncRNA和最優(yōu)選所有l(wèi)ncRNA，會額外增加本發(fā)明藥物組合物、醫(yī)學應用、方法和試劑盒的效力。采用這些數(shù)量的lncRNA可平衡與本發(fā)明方法和試劑盒聯(lián)用的特定化合物、探針或方法相關的潛在差異。在本發(fā)明的藥物組合物和醫(yī)學應用中，這些數(shù)量的lncRNA可增加對待治療對象的有益效果。根據(jù)本發(fā)明所有四方面的一個優(yōu)選實施方式，一個或多個lncRNA是或包括SEQIDNO:12的lncRNA。SEQIDNO:12是人lncRNAH19。同源小鼠lncRNAH19由SEQIDNO:25表示。lncRNAH19的抗肥大性質由下文的實施例3證明。在人和其它動物中發(fā)現(xiàn)H19lncRNA基因。H19基因的調節(jié)被良好描述為基因組印跡典范且還參與人類遺傳病和癌癥。出生后，H19主要表達于肌肉組織，在該處其促進分化和再生。lncRNA在心臟中的生物學功能仍不明了。就發(fā)明者的最佳知識而言，H19在心臟肥大中的作用或功能未知，但意外發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明有關。H19在多個哺乳動物種中進化上保守，包括小鼠和人(見圖32和33)。根據(jù)本發(fā)明所有四方面的另一優(yōu)選實施方式，一個或多個lncRNA是或包括SEQIDNO:1,27或28的lncRNA，其中最優(yōu)選SEQIDNO:1。如上文所討論，SEQIDNO:1、27或28是小鼠lncRNAGM11641(SEQIDNO:14)的人同源lncRNA，應注意人與小鼠不同的基因組重復事件產生各小鼠lncRNA的一種以上同源人lncRNA(見圖13A和B)。lncRNAGM11641的促肥大性質在下文實施例中由2個獨立心臟肥大測試系統(tǒng)證明，所述系統(tǒng)是TAC小鼠模型和苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)處理的HL-1小鼠心肌細胞。根據(jù)本發(fā)明所有四方面的另一優(yōu)選實施方式，一個或多個lncRNA是或包括SEQIDNO:8的lncRNA。如上文所討論，SEQIDNO:8是小鼠lncRNAGm17499(SEQIDNO:21)的人同源lncRNA。lncRNAGm7499的抗肥大性質在下文實施例中由獨立測試系統(tǒng)證明。附圖說明圖1：驗證心臟樣品中的lncRNAGM11641表達。小鼠心臟RNA用脫氧核糖核酸酶I處理，然后逆轉錄。用OligodT(20)或隨機引物組進行cDNA合成。圖2：(A)通過RT-PCR在手術后6周驗證假手術和TAC小鼠的全心臟樣品中的候選lncRNAGM11641(別名Chast)。FC–變化倍數(shù).*p<0.05.n＝5。(B)通過cDNA末端快速擴增(RACE)驗證Gm11641(別名Chast)轉錄物。此圖顯示來自小鼠心臟RNA中3'和5'RACE的結果，包括用于各方法的引物組。圖3：候選lncRNAGM11641的器官表達。FC–變化倍數(shù).圖4：候選lncRNA在來源于小鼠心臟的心肌細胞、心臟成纖維細胞和內皮細胞中的表達。FC–變化倍數(shù)。圖5：TAC手術后6周，lncRNAGm11641在心肌細胞、心臟成纖維細胞或內皮細胞中的表達。FC–變化倍數(shù).*p<0.05。圖6：候選lncRNA的亞細胞定位。β-肌動蛋白(ActB)、GAPDH、Xist和Neatl作為對照分析。圖7：呈現(xiàn)慢病毒過表達質粒，命名為pLV+，攜帶lncRNA的完整轉錄序列(如，此情況中的lncRNAGm17499)。圖8：慢病毒介導的lncRNAGm11641過表達。FC–變化倍數(shù).***p<0.001。圖9：抑制HL-1細胞中的lncRNAGM11641。在48小時孵育時間后評估表達水平。FC–變化倍數(shù).*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,n.s.＝不顯著。圖10：用苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)肥厚性刺激后，HL-1細胞中的LncRNAGM11641表達。在48小時刺激后評估表達水平。**p<0.01。圖11：HL-1細胞中由慢病毒介導的lncRNAGm11641過表達和基于GapmeR的沉默，所述細胞用苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)刺激。***p<0.001，*p<0.05。圖12：肥厚條件和lncRNAGm11641失調下的心鈉素(ANP)表達。*p<0.05,n.s.＝不顯著。圖13：(A)用UCSC基因組瀏覽器呈現(xiàn)不同物種中l(wèi)ncRNAGm11641(ENSMUST00000130556)的潛在同源物。(B)人中的LncRNAGm11641同源物。鼠Gm11641和其在大鼠及人中同源物的詳細序列和結構比對(上部)。通過基因特異PCR驗證人轉錄物(左下；n＝至少3次獨立實驗)。SEQIDNO:1的人Gm11641同源物在健康供體心臟組織(n＝23)或主動脈狹窄患者(n＝21)中的表達。*p<0.05.FC＝變化倍數(shù)。圖14：相較假手術動物組織，驗證TAG心臟的全心臟樣品中的候選lncRNA。FC–變化倍數(shù).***p<0.001,*p<0.05,n.s.＝不顯著。圖15：(A)驗證候選lncRNA衍生Arraystar小鼠LncRNA微陣列V2.0，比較來自12周健康或13周假手術相比13周TAC小鼠心臟的心肌細胞(CMC)樣品。候選AJ409495是潛在的編碼蛋白且在以下結果呈現(xiàn)中不考慮。FC–變化倍數(shù).CMC-心肌細胞.***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05,n.s.＝不顯著。(B)在TAC后數(shù)個時間點后(A7＝4-8)微陣列驗證全心臟樣品中由心臟肥大引起的H19抑制。*p<0.05；**p<0.01.FC＝變化倍數(shù)。圖16：候選lncRNA的器官表達。FC＝變化倍數(shù)。圖17：候選lncRNA在小鼠心臟源性心肌細胞、心臟成纖維細胞或內皮細胞中的表達。FC＝變化倍數(shù)。圖18：候選lncRNA的亞細胞定位。β-肌動蛋白、GAPDH、Xist和Neatl作為對照分析。圖19：呈現(xiàn)慢病毒過表達質粒，命名為pLV+Gm17499，攜帶lncRNAGm17499的完整轉錄物序列。圖20：慢病毒介導的lncRNAGm17499過表達。FC-變化倍數(shù).**p<0.01。圖21：不同反義化學以抑制候選lncRNAGm17499。在48小時孵育時間后評估表達水平。FC-變化倍數(shù).*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n.s.＝不顯著。圖22：HL-1細胞中l(wèi)ncRNAGm17499的基于siRNA的沉默和慢病毒介導的過表達，所述細胞用苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)刺激。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，n.s.＝不顯著。a.u.＝任意單位。圖中的比例尺代表50μΜ。圖23：肥厚條件和lncRNAGm17499失調下的肥厚相關基因表達。第一行代表ANP表達，第二行是BNP且最后一行顯示Mcipl.4水平。*p<0.05,n.s.＝不顯著。圖24：TAC手術后4和6周驗證候選lncRNAH19表達。**p<0.001,*p<0.05.n＝5-7。圖25：用促肥大苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)或血管緊張素II(ATII)處理72小時后在原代新生大鼠心肌細胞(NRCM)中的LncRNAH19表達，n.s.-不顯著.*p<0.05。圖26：(A)施用esiRNA的心肌細胞系HL-1(小鼠)和H9C2(大鼠)中的lncRNAH19抑制(處理后48小時)。RLUC–esiRNA針對海腎螢光素酶(負對照)，H19-esiRNA針對H19。*p<0.05.(B)相較非靶向對照(海腎螢光素酶，RLUC)，HL-1心肌細胞中通過esiRNA的H19抑制。(C)應用慢病毒轉導(pLV)的H19過表達。n＝至少3次獨立實驗。**p<0.01；***p<0.001.FC＝變化倍數(shù)。圖27：抑制H19(通過esiRNA)的鼠心肌細胞系HL-1的細胞尺寸，所述細胞用促肥大刺激苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)或血管緊張素II(ATII)處理48小時。RLUC-esiRNA針對海腎螢光素酶(負對照)，H19-esiRNA針對H19。*p<0.05.n.s.–不顯著。(B)慢病毒過表達(pLV+)H19后的HL-1心肌細胞反應。測定心鈉素和腦鈉素(ANP,BNP)以及β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)的表達水平。n＝至少3次獨立實驗。**p<0.01,***p<0.001.FC＝變化倍數(shù)。圖28：抑制H19(通過esiRNA)的大鼠心肌細胞系H9C2的細胞尺寸，所述細胞用促肥大刺激苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)或血管緊張素II(ATII)處理48小時。RLUC-esiRNA針對海腎螢光素酶(負對照)，H19-esiRNA針對H19。***p<0.001,**p<0.01.n.s.-不顯著。圖29：抑制H19(通過esiRNA)的原代新生大鼠心肌細胞(NRCM)的細胞尺寸，所述細胞用促肥大刺激苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)或血管緊張素II(ATII)處理48小時。RLUC-esiRNA針對海腎螢光素酶(負對照)，H19-esiRNA針對H19。***p<0.001,**p<0.01.n.s.-不顯著。圖30：抑制H19(通過esiRNA)的原代新生大鼠心肌細胞(NRCM)的細胞尺寸，所述細胞用促肥大刺激苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)或血管緊張素II(ATII)處理72小時。RLUC-esiRNA針對海腎螢光素酶(負對照)，H19-esiRNA針對H19。***p<0.001.n.s.-不顯著。圖31：人健康(n＝22)和肥厚(主動脈狹窄；n＝23)心臟組織通過實時PCR(RT-PCR)的H19表達分析。AS:主動脈狹窄.**p<0.01。圖32：用UCSC基因組瀏覽器呈現(xiàn)不同物種中H19序列的保守性。圖33：通過Dotplot分析對H19序列的序列比較。小鼠和大鼠以及小鼠和人之間能觀察到強保守性。豬中也存在同源物。圖34：H19敲除小鼠和其野生型同窩仔中的TAC手術。6周后，觀察到誘導心臟與體重之比。n＝2-8.HW＝心臟重量,BW＝體重,Wt＝野生型。圖35：體內AAV9-H19過表達6周引起肥厚基因程序(每動物2+E12拷貝)逆轉。n＝3.*p<0.05.FC＝變化倍數(shù)。圖36：Gm11641表達的潛在轉錄調節(jié)因子。GM11641啟動子中轉錄因子結合位點的生物信息學預測。這也包括促肥大轉錄因子NFAT(活化T細胞核因子)。在有組成型活化NFAT通路(n＝4)的鈣調磷酸酶轉基因小鼠(CnATG)中，誘導Gm11641表達，而NFAT抑制劑1R-VIVIT抑制HL-1心肌細胞中的GM11641表達(n＝至少3次獨立實驗)。*p<0.05；FC＝變化倍數(shù)，GM11641在圖36中稱為“Chast”(心臟肥大相關轉錄物)。圖37：應用AAV9(注射后6周)的小鼠中GM11641的心臟特異過表達。描述AAV9構建體(左)和小鼠心臟中相較對照載體(右)的過表達效率。n＝3.*p<0.05；FC＝變化倍數(shù)，Gm11641在圖36中稱為“Chast”。圖38：體內AAV9-GM11641過表達6周引起心臟肥大(每動物0.5+E12拷貝)。這引起誘導心臟與體重之比和左心室質量以及心肌細胞直徑擴大。n＝3.*p<0.05.LVmass＝左心室質量,DAPI＝4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DNA染色)；WGA＝麥胚凝集素(膜染色),a.u.＝任意單位，Gm11641在圖36中稱為“Chast”。圖39：TAC手術和通過AAV9過表達Gm1164(每動物0.5+E12拷貝)6周引起誘導心臟與體重之比。n＝5-8。實施例實施例1-促肥大lncRNAGm116411.1lncRNA譜和驗證為鑒定TAC(主動脈縮窄)后6周在全心臟樣品中失調的lncRNA候選物，進行由Arraystar提供的一般lncRNA概況分析(Arraystar小鼠LncRNA微陣列V2.0)。從此平臺中鑒定lncRNAGM11641(ENSMUST00000130556)為候選物(表1)。表1：獲自NcodeTM小鼠非編碼RNA微陣列的LncRNAGm11641，比較6周假手術和6周TAC小鼠的全心臟樣品。名稱標識符來源大小關系FC調節(jié)Gm11641ENSMUST00000130556Ensembl923bp反義3,85上調心臟內所述lncRNA的表達經(jīng)獲自心臟RNA的cDNA的聚合酶鏈式反應(PCR)驗證，所述心臟RNA用脫氧核糖核酸酶I處理，然后用OligodT(20)或隨機引物組逆轉錄(圖1)。為進一步驗證轉錄物，切下所得PCR帶并測序。TAC手術后候選lncRNAGm11641的上調通過實時PCR(RT-PCR)驗證(圖2A)。為進一步驗證轉錄物，切下所得PCR帶并測序。第二步中，通過cDNA末端快速擴增(RACE)分析轉錄物序列，小鼠心臟RNA作為起始材料。這可驗證2個外顯子(圖2B)。Gm11641在HL-1細胞中過表達并通過質譜評價小肽。沒有發(fā)現(xiàn)重疊潛在短開放閱讀框的肽，顯示Gm11641是非編碼RNA。1.2候選lncRNAGm11641的器官表達為測定不同器官中l(wèi)ncRNAGm11641的豐度和組織特異表達(圖3)，在14個不同組織樣品中測量其表達，包括心臟、主動脈、血漿、骨髓、骨骼肌、肺、肝、脾、腎、腦、淋巴結、胸腺、膽囊和皮膚。LncRNAGm11641在幾乎所有測試器官中表達。這包括心臟和血漿，表明此轉錄物作為潛在治療靶標和診斷生物標志物。1.3候選lncRNAGm11641在心臟細胞部分中的表達在3個主要心臟細胞類型中檢測lncRNAGm1164的表達譜：心肌細胞、心臟成纖維細胞和內皮細胞(圖4)。因此，成年小鼠心臟細胞分離自數(shù)個單獨心臟，施用逆行灌注和酶解法操作并測定各部分的lncRNA候選物水平。LncRNAGM11641在所有心臟細胞類型中表達。1.4TAG后在細胞心臟部分中的LncRNAGm11641由于lncRNAGm11641在所有心臟細胞中表達，旨在鑒定特定細胞類型，其有助于全心臟樣品中觀察到的肥厚誘導lncRNAGm11641上調(圖2)。采用假手術和TAG手術后心臟(手術后6周)的細胞分級分離實驗顯示，此lncRNAGm11641上調在心肌細胞中特定觀察到，但心臟成纖維細胞或內皮細胞中沒有(圖5)，指示lncRNAGM11641在心臟肥大中的潛在作用。1.5候選lncRNAGM11641的亞細胞定位lncRNA的生物學功能主要由其亞細胞定位決定。因此，將獲自HL-1細胞(心肌細胞系)的總RNA生化分離成胞質、核可溶性和染色質相關部分(根據(jù)：Cabianca等Cell.1；149(4):819-31.)。不同部分的lncRNAGm11641相對豐度通過RT-PCR測量。已知的管家基因GAPDH和β-肌動蛋白以及l(fā)ncRNAXist和Neatl分別用作胞質定位或染色質結合富集的對照(圖6)。如預期管家mRNAGapdh和β-肌動蛋白(ActB)常見于細胞溶質，已知的表觀遺傳調節(jié)因子如Xist和NeatllncRNA主要發(fā)現(xiàn)與染色質相關。相較胞質或染色質相關轉錄物，lncRNAGm11641看來存在于亞細胞部分(細胞溶質、核可溶性和染色質相關)，提示在所有細胞區(qū)室中的潛在作用。這進一步表明lncRNAGM11641可調節(jié)轉錄和翻譯后過程。1.6候選lncRNAGm11641的過表達為穩(wěn)定過表達lncRNAGm11641，將獲自對應數(shù)據(jù)庫(見表1)的全長轉錄物克隆到慢病毒過表達載體(由MHH實驗血液學研究所的A.Schambach友情提供)的多克隆位點(MCS)。此質粒攜帶雙向啟動子，所述啟動子允許從同一基因調控元件生成lncRNA轉錄物，但在物理上與標示基因GFP(綠色熒光蛋白)和選擇盒分開。所述構建體通過慢病毒轉導引入HL-1心肌細胞(見圖7)。相較攜帶空載體(pLV+空)或缺乏構建體(未轉導)的細胞，慢病毒介導的HL-1細胞轉導顯示穩(wěn)定的lncRNAGm11641過表達(圖8)。1.7lncRNA的抑制為下調lncRNAGm11641應用的GapmeR反義寡核苷酸，LNATMGapmeR(Exigon)包含一段中央的DNA單體，兩側是修飾核苷酸塊(LNA，鎖核酸)。DNA缺口激活核糖核酸酶H介導的靶RNA降解，也適于直接靶向核中的轉錄物。采用此技術，成功下調心肌細胞系HL-1中的lncRNAGM11641(圖9)。1.8候選lncRNAGm11641的功能鑒定1.8.1肥大心肌細胞對Gm11641水平的體外影響心肌細胞肥大是細胞水平上對心臟壓力或容積應力的適應性反應。體外肥大性生長能通過包括苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)在內的刺激誘導。因此，HL-1細胞用這2種化合物誘導并研究對Gm11641表達的影響(圖10)。1.8.2Gm11641失調對心肌細胞尺寸的影響肥大心肌細胞的標志是細胞尺寸相對于非肥大細胞增加。因此，研究用PE和ISO刺激后的HL-1細胞尺寸以及應用上述去調控工具后受抑制和提高的lncRNAGM11641表達。結果在圖11中示范性給出。在基礎條件下，lncRNAGm11641過表達引起由細胞表面積測量的細胞尺寸增加，顯示此轉錄物足以誘導心肌細胞肥大。據(jù)此，基于GapmeR的lncRNAGM11641抑制減少心肌細胞尺寸并進一步削弱PE/ISO-誘導的細胞尺寸增加。這些結果證明lncRNAGM11641的促肥大功能。1.8.3對肥大相關基因的影響肥大誘導的心肌細胞生長伴有“胚胎基因程序”重新誘導，因為基因表達模式模擬胚胎發(fā)育期間所見的那些。應用涉及候選lncRNAGM11641的相同條件(刺激和去調控)，測量肥大相關基因的表達水平，包括ANP、BNP(心鈉素和腦鈉素)、Mcip1.4(調控鈣調磷酸酶互作蛋白1，外顯子4同種型)、a-和β-MHC(肌球蛋白重鏈)。圖12代表ANP結果，而其它基因的測量未顯示。與細胞尺寸測量相當，lncRNAGm11641過表達引起肥大指標ANP的表達誘導，而敲減增強PE/ISO誘導的ANP升高，支持lncRNAGm11641用作促肥大轉錄物。1.8.4.微陣列表達數(shù)據(jù)為鑒定由GM11641調節(jié)的心臟相關基因，在鼠HL-1心肌細胞系中慢病毒過表達或GapmeR-介導的Gm11641(別名Chast)抑制后進行全基因組微陣列mRNA表達分析。結果表明GM11641上調或抑制對HL-1心肌細胞轉錄組產生強烈影響。一些心臟相關基因如Axl、Pak3、Myo18B、Egr1、Ogn和Noslap(表2)在GM11641過表達和抑制后相互調節(jié)。這些結果表明GM1641表達去調控可影響心肌細胞中的轉錄mRNA表達譜并激活促肥大通路。表2：相互調節(jié)的mRNA在GM11641沉默(GapmeR)和過表達(pLV+)后的微陣列結果。FC＝變化倍數(shù)GapmeR(FC)pLV+(FC)Axl-1,4991,510Pak3-1,4231,345Egr1-1,7981,366Ogn-1,1921,207Myo18b1,405-1,477Noslap1,487-2,0671.9保守為在包括人的其他物種中鑒定lncRNAGM11641同源物，應用BLAST，這是比對DNA一級序列與序列數(shù)據(jù)庫的算法。此比對結果產生以下結果(表2)：表3：不同物種的基于BLAST的轉錄物GM11641序列比對。UCSC基因組瀏覽器用于顯示跨物種的比對(圖13A)。所述比對鑒定了小鼠lncRNAGm11641的人同源物。Gm11641的更詳細序列和結構比對揭示GM11641同源物存在于大鼠、豬和人，以反義方向位于蛋白編碼基因Plekhm的內含子中(圖13B)。人同源物標注為：gi|528476558|ref|NC_018928.2|:62843244-62843536智人染色體17，備擇集合CHM1_1.1.，或gi|568815581:64783259-64783551智人染色體17,GRCh38.p2原集合人心臟組組織中GM11641同源物的存在通過基因特異PCR確認(圖13B)。從分離自總人心臟組組織的RNA制備互補DNA(cDNA)。無逆轉錄的cDNA制備反應用作內控以排除任何可能的污染DNA擴增。接著，在23個對照心臟和21個來自主動脈瓣狹窄患者的肥大心臟中檢測該人同源物的表達。與肥大小鼠心臟所得結果一致，人Gm11641同源物也在人肥大心臟組織中上調(圖13B)，證明本研究的發(fā)現(xiàn)具有翻譯潛能。1.10Gm11641表達的調節(jié)在心肌細胞中，肥大反應由生長因子和細胞因子安排，所述細胞因子影響數(shù)個信號級聯(lián)，尤其是鈣依賴性信號傳遞。轉錄因子NFAT(活化T細胞的核因子)是該通路的關鍵調節(jié)因子，最終引起促肥大程序激活。因此，確定此關鍵調節(jié)因子是否對GM11641表達有影響。生物信息學工具預測GM11641啟動子中數(shù)個肥大相關轉錄因子的結合位點。這也包括NFAT結合位點(圖36)。為更詳細研究NFAT的影響，評估鈣調磷酸酶轉基因小鼠心臟中的GM11641表達，且在組成型活化NFAT信號傳遞后發(fā)現(xiàn)Gm11641表達誘導。由11R-VIVIT體外抑制NFAT導致HL-1心肌細胞中的GM11641水平降低。此數(shù)據(jù)表明Gm11641表達取決于促肥大NFAT通路。1.11Gm11641的體內研究病理性肥大是對壓力或疾病如高血壓、心臟肌肉損傷、心瓣膜狹窄或神經(jīng)激素的反應。這引起心臟肌肉質量增加并最終導致心室壁增厚，尤其是左心室。盡管肌肉質量升高，心臟泵送能力未增加。相反，心臟性能受干擾并可能最終導致完全衰竭。為分析Gm11641的體內作用，此轉錄物用腺病毒載體(AAV)過表達。AAV是缺乏包膜且攜帶單鏈DNA的小病毒。為轉移遺傳物質，AAV依賴輔助病毒。然而，AAV載體轉導不引起其它有助于其低免疫原性的病毒基因表達。在所有血清型中，AAV9似乎是最親心性的。因此，AAV9在心臟特異性肌鈣蛋白T啟動子控制下應用以實現(xiàn)針對心肌細胞的Gm11641誘導(圖37)。應用AAV9-Gm11641構建體，在全心臟樣品中實現(xiàn)20倍的Gm11641誘導。在功能水平上，觀察到誘導心臟與體重之比(圖38，左上)，表明Gm11641過表達可增加左心室的肌肉質量(圖38，右上)。進一步分析心肌細胞的尺寸，發(fā)現(xiàn)Gm11641誘導心肌細胞生長(圖38，下部)。此外，左心室壓力負荷過重通過TAG手術施加，GM1641由AAV9過表達6周。如預期，主動脈縮窄以及簡單注射AAV9-Gm11641會引起心臟與體重之比增加。有趣的是，TAG手術和施用AAV9-Gm11641使心臟質量誘導加劇(圖39)。1.12結論總之，基于lncRNAGm11641的所測試心臟肥大模型中的發(fā)現(xiàn)，此lncRNA對心臟肥大有診斷和治療價值。實施例2-鑒定促肥大和抗肥大lncRNA2.1lncRNA譜分析和驗證為實現(xiàn)一般lncRNA譜分析，進行微陣列分析，應用Agilent/LifeTechnologies提供的平臺(NCodeTM小鼠非編碼RNA微陣列)和Arraystar(Arraystar小鼠LncRNA微陣列V2.0)。通過PCR確認候選轉錄物在心臟組織中表達(在獲自RNA的cDNA樣品中，所述RNA用脫氧核糖核酸酶I處理，或之前沒有逆轉錄)且通過實時PCR驗證去調控。下表3和4以及圖14和15總結了從不同微陣列驗證的候選lncRNA：表4：獲自Arraystar小鼠LncRNA微陣列V2.0的lncRNA候選物，分析來自6周假手術和TAC小鼠的全心臟樣品表5：獲自Arraystar小鼠LncRNA微陣列V2.0的lncRNA候選物，分析12周健康vs.13周TAC小鼠心臟的心肌細胞特異部分。2.2候選lncRNA的器官表達為測定不同器官中的lncRNA表達特異性(圖16)，在14個不同組織樣品中測量候選轉錄物表達，包括心臟、主動脈、血漿、骨髓、骨骼肌、肺、肝、脾、腎、腦、淋巴結、胸腺、膽囊和皮膚。大部分lncRNA在數(shù)個器官中豐富。轉錄物Gm8459、H19和Gm12224-1看來在包括心臟的肌肉組織中最特定富集。2.3候選lncRNA在心臟細胞部分中的表達在3個主要心臟細胞類型中檢測候選lncRNA的表達譜：心肌細胞、心臟成纖維細胞和內皮細胞(圖17)。因此，成年小鼠心臟細胞分離自數(shù)個單獨心臟，施用逆行灌注和酶解法操作并測定各部分的lncRNA候選物水平。2.4候選lncRNA的亞細胞定位為進一步闡明lncRNA的作用機制，通過將獲自HL-1細胞(心肌細胞系)的總RNA生化分離成胞質、核可溶性和染色質相關部分(根據(jù)：Cabianca等Cell.1；149(4):819-31.)，分析亞細胞定位。不同部分的轉錄物相對豐度通過RT-PCR測量。已知的基因GAPDH和β-肌動蛋白以及Xist和Neatl分別用作胞質定位或染色質結合富集的對照(圖18)。發(fā)現(xiàn)超過一半的lncRNA候選物是染色質相關，而核可溶性lncRNA不在候選物中。僅一個轉錄物在細胞質中富集(Gm8459)。2.5候選lncRNA的過表達為穩(wěn)定過表達候選lncRNA，將獲自對應數(shù)據(jù)庫的全長轉錄物克隆到慢病毒過表達載體(由MHH實驗血液學研究所的A.Schambach友情提供)的多克隆位點(MCS)。此質粒攜帶雙向啟動子，所述啟動子允許從同一基因調控元件生成lncRNA轉錄物，但在物理上與標示基因GFP(綠色熒光蛋白)分開。所述構建體通過慢病毒轉導引入HL-1細胞(見圖19)。以下結果就lncRNA候選物Gm17499示范性給出。相較攜帶空載體(pLV+空)或沒有構建體(未轉導)的細胞，慢病毒介導的HL-1細胞轉導顯示穩(wěn)定的lncRNAGm17499過表達(圖20)。2.6lncRNA的抑制為下調lncRNA轉錄物，應用3種不同反義化學：siRNA、esiRNA和GapmeR。SiRNA(小干擾RNA)類似微RNA，即參與RNA干擾通路的短分子(20-25個核苷酸)。其結合互補核苷酸序列并誘導其通過胞質定位機器來降解。EsiRNA(EupheriaBiotech/Sigma-Aldrich)是內切核糖核酸酶制備的siRNA，由長雙鏈RNA切割產生。此反義種類不僅靶向一種特異序列(就siRNA的情況而言)，而且遍及靶標的數(shù)種序列。LNATMGapmeR(Exigon)包含一段中央的DNA單體，兩側是修飾核苷酸塊(LNA，鎖核酸)。DNA缺口激活靶RNA降解，且適于直接靶向核中的轉錄物。示范性地，顯示應用所有3種化學的Gm17499(圖21)以及H19的結果。H19用esiRNA和Malat1成功下調并用GapmeR(此lncRNA用作GapmeR技術的正對照)抑制。2.7候選lncRNA的功能鑒定2.7.1對心肌細胞尺寸的影響心肌細胞肥大是細胞水平上對心臟壓力或容積應力的適應性反應。體外肥大性生長能通過包括苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)在內的刺激誘導。因此，HL-1細胞用這2種化合物誘導并研究在經(jīng)改變lncRNA水平下的心肌細胞尺寸。就lncRNAGm17499給出示范性結果(圖22)。lncRNAGm17499表達提高可防止促肥大刺激引起的細胞尺寸增加，而其沉默引起心肌細胞擴大，指示此轉錄物的抗肥大功能。2.7.2對肥大相關基因的影響肥大誘導的心肌細胞生長伴有“胚胎基因程序”重新誘導，因為基因表達模式模擬胚胎發(fā)育期間所見的那些。應用涉及候選lncRNAGM117499的相同條件(刺激和去調控)，測量肥大相關基因的表達水平，包括ANP、BNP(心鈉素和腦鈉素)和Mcip1.4(調控鈣調磷酸酶互作蛋白1，外顯子4同種型)(圖23)。2.8結論總之，基于上述發(fā)現(xiàn)，所測試心臟肥大模型(左心室壓力負荷過重)中失調的lncRNA對心臟肥大有診斷和治療價值。特別地，以下lncRNA至關重要：表6：所研究lncRNA候選物的匯總表7：所研究lncRNA候選物的人同源物實施例3-進一步鑒定抗肥大lncRNAH193.1在4和6周假手術/TAC中的差異表達為鑒定TAC(主動脈縮窄)后6周全心臟樣品或TAC后13周小鼠心臟心肌細胞中的lncRNA候選物，進行Arraystar提供的一般lncRNA譜(Arraystar小鼠LncRNA微陣列V2.0)。從此平臺中，除了Gm17499和Gm11641，lncRNAH19(NR_001592.1)鑒定為潛在候選物之一(表8和9)。表8：獲自Arraystar小鼠LncRNA微陣列V2.0的H19lncRNA，分析來自6周假手術和TAC小鼠的全心臟樣品。表9：獲自Arraystar小鼠LncRNA微陣列V2.0的H19lncRNA，分析12周健康vs.13周TAC小鼠心臟的心肌細胞特異部分。TAG手術后4和6周的候選lncRNAH19下調通過實時PCR(RT-PCR)驗證(圖24A和B)；心肌細胞特異陣列的驗證如上所示(表8和圖15A和B)。在TAG手術后6周的全心臟樣品中確認H19抑制。另外，在肥厚和心力衰竭早期以及后期觀察到此抑制(圖15B)。CMC特異陣列的驗證揭示，此抑制可見于心肌細胞(圖15A)，表明H19可能參與心臟肥大發(fā)展且調節(jié)H19水平具有治療價值。第二心臟肥大模型是持續(xù)輸注血管緊張素II(ATII)。此化合物是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的核心產物，并通過其縮血管作用引起血壓增加。關于血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑效果的臨床研究顯示ATII也在心臟肥大、重塑和心力衰竭的病理生理學中發(fā)揮中心作用。為誘導心臟肥大，微滲泵(Alzet泵)皮下植入小鼠，持續(xù)2周。此模型中，觀察到與TAC模型相同的H19水平下降，突出此lncRNA在心臟肥大中的相關性(圖15C)。3.2候選lncRNAH19的器官表達為測定不同器官中的lncRNAH19表達豐度和組織特異性(圖16)，在14個不同組織樣品中測量其表達，包括心臟、主動脈、血漿、骨髓、骨骼肌、肺、肝、脾、腎、腦、淋巴結、胸腺、膽囊和皮膚。H19顯示在肌肉組織中的強富集，包括心臟、骨骼肌和膽囊。3.3候選lncRNAH19在心臟細胞部分中的表達在3個主要心臟細胞類型中檢測lncRNAH19的表達譜：心肌細胞、心臟成纖維細胞和內皮細胞。因此，成年小鼠心臟細胞分離自數(shù)個單獨心臟，施用逆行灌注和酶解法操作并測定各部分的lncRNA候選物水平。發(fā)現(xiàn)H19在所有心臟細胞類型中表達(圖17)。3.4候選lncRNAH19的亞細胞定位lncRNA的生物學功能主要由其亞細胞定位決定。因此，將獲自HL-1細胞(心肌細胞系)的總RNA生化分離成胞質、核可溶性和染色質相關部分(根據(jù)：Cabianca等Cell.11；149(4):819-31.)。不同部分的lncRNAH19相對豐度通過定量RT-PCR測量。已知的管家基因GAPDH和β-肌動蛋白以及l(fā)ncRNAXist和Neatl分別用作胞質定位或染色質結合富集的對照。H19見于所有亞細胞部分，細胞溶質、核可溶性和染色質相關的心肌細胞區(qū)室(圖18)。這表明H19具有調節(jié)轉錄和翻譯后過程的可能性。3.5候選lncRNAH19的抑制為下調H19lncRNA，應用稱為esiRNA的反義化學。EsiRNA(Eupheria生物技術/西格瑪-奧德里奇)是內切核糖核酸酶制備的siRNA，由長雙鏈RNA切割產生。此反義種類不僅靶向一種特異序列(就siRNA的情況而言)，而且遍及靶標的數(shù)種序列。相較對照轉染(RLUC，海腎螢光素酶)，lncRNAH19在衍生自小鼠(HL-1)和大鼠(H9C2)的2個不同心肌細胞系中顯著下調(圖26A和B)。為穩(wěn)定過表達此轉錄物，將全長轉錄物克隆到慢病毒過表達載體的多克隆位點(MCS)。此質粒攜帶雙向啟動子，所述啟動子允許從同一基因調控元件生成lncRNA轉錄物，但在物理上與標示基因GFP(綠色熒光蛋白)和選擇盒分開。所述構建體通過慢病毒轉導引入HL-1心肌細胞。相較攜帶對照載體(pLV+空)的細胞，慢病毒介導的HL-1細胞轉導顯示穩(wěn)定的H19過表達(圖26C)。3.6lncRNAH19的功能鑒定3.6.1肥大心肌細胞對H19水平的體外影響心肌細胞肥大是細胞水平上對心臟壓力或容積應力的適應性反應。體外肥大性生長能通過包括苯腎上腺素(PE)及異丙腎上腺素(ISO)或血管緊張素II(ATII)在內的刺激誘導。因此，HL-1細胞用這些化合物刺激并研究其對H19表達的影響(圖25)。3.6.2H19抑制對心肌細胞尺寸的影響肥大心肌細胞的標志是細胞尺寸相對于非肥大細胞增加。因此，研究用PE和ISO或ATII刺激后的心肌細胞尺寸，同時用esiRNA抑制H19。H19敲減導致48小時后大鼠H9C2細胞系以及72小時后原代新生大鼠心肌細胞(NRCM)中的心肌細胞尺寸顯著增加(圖28-30)。用PE和ISO處理后，在大鼠心肌細胞以及ATII處理后的NRCM中都觀察到此效果。在HL-1細胞系中，觀察到相當?shù)内厔?圖27A)。此外，H19在HL-1細胞中過表達。HL-1心肌細胞中的H19過表達導致心臟壓力標記心鈉素和腦鈉素(ANP,BNP)減少以及另一主要心臟肥大標記β-MHC(β-肌球蛋白重鏈)水平降低(圖27A)，進一步證明H19誘導具有心臟保護作用。3.7健康和患病的人心臟組織中H19表達的分析主動脈瓣狹窄指主動脈瓣鈣化，其抑制血液流動。因此，心臟需要在高壓泵血，最終引起心臟肌肉肥大性生長。在22個健康心臟組織和23個肥大(主動脈瓣狹窄)心臟組織中測量H19表達，發(fā)現(xiàn)H19表達在肥厚心臟中大幅降低(圖31)。來自人對象的此數(shù)據(jù)證實小鼠和大鼠體外模型中的本文所述發(fā)現(xiàn)，進一步證明H19是真實治療靶標以預防心臟肥大。3.8H19的進化保守性數(shù)個研究顯示H19序列以及H19印跡機制在人和嚙齒動物間高度保守。這也能用UCSC基因組瀏覽器顯示(圖32)。通過Dotplot分析對多種H19序列的更詳細比對突出了這些發(fā)現(xiàn)(圖33)并顯示鼠和大鼠序列以及鼠和人序列之間的強序列關系。進一步比較揭示人H19顯示豬中的同源物，確保H19相關治療策略在大動物模型內的性能。3.9H19的體內研究為研究H19對心臟重塑的體內影響，研究H19敲除小鼠。H19缺失由新霉素抗性盒完成，所述盒取代啟動子和H19的完整3kb轉錄單位(壓力描述：129S2/SvPas背景中的H19tmiLda)。H19敲除動物和其野生型同窩仔(wt)接受主動脈縮窄(圖34)。如預期，手術后6周，wt顯示誘導和心臟與體重之比。就假手術小鼠也觀察到該心臟質量增重，比較wt和H19敲除動物，而缺乏H19基因的經(jīng)TAC手術小鼠顯示表型加劇。為更詳細分析H19在心臟肥大中的作用和開發(fā)潛在治療策略，此轉錄物用腺病毒載體(AAV)過表達。AAV9在心臟特異性肌鈣蛋白T啟動子控制下應用以實現(xiàn)針對心肌細胞的H19誘導(圖35)。應用AAV9-H19構建體，在全心臟樣品中實現(xiàn)150倍的H19誘導。分析心臟肥大特異標記的轉錄水平變化。其中有心臟肥大中下調的轉錄物α-MHC，上調的β-MHC。通過H19體內過表達，觀察到α-MHC到β-MHC的逆轉(圖35)，表明腺病毒施用H19對肥厚基因程序產生有益效果并用作治療策略。序列表<110>漢諾威醫(yī)學院<120>用于心臟肥大治療和診斷的LncRNA<130>X1554PCT<150>EP14165504.3<151>2014-04-22<160>62<170>BiSSAP1.3<210>1<211>293<212>DNA<213>Homosapiens<220><223>chromosome17,GRCh38.p2PrimaryAssembly<400>1aaggggaaacaagtgccctcagaggcgcttggctgaggatggagaggggctgagcccact60ggcagggcagaaccaggtcatgtgccatggccctccactgggcctccctcccccagtttc120tcttctcttctctggccctaccatctattgtccttgggggaagctgtggcacctagatgg180gcagagggtgccaacttgtaatctgaaaggggccttcaaggacaggaaatcgcagatctg240aatgttgtctgtttccatcccattttaccgcaatctgatttccctgagaatta293<210>2<211>267<212>DNA<213>Homosapiens<220><223>AT2receptor-interactingprotein1mRNA,completecds<400>2tctgtggtggaatgacatttgctgtgtaggcatctttcctctgactgtatttcttggcct60tgaagagtactgagtttaaaaagacagtatgtgacagtccatggaaattgcctcttctgt120gaaatctcgccacctgctccgaagacatgttgttgtctcccaaattctccttatccacca180ttcacatacgactgacggccaaaggattgcttcgaaaccttcgacttccttcagggttta240ggagaagcactgttgttttccacacag267<210>3<211>735<212>DNA<213>Homosapiens<220><223>chromosome5cloneCTC-222O22,completesequence<400>3agtcatttccctggatggtttcttgcctgcactgctgaaacaacagcatccgaactgcac60tgggaactgtggaaccacccagctccgccgccagagaagccggagccccgggccccccgc120cggcatctctgcgctgcgttggcctctggctcgcaccggctcccacctggctgggaacat180gggagtccgtttgcccttgccggcaggtggggtggctacctgggaccctagcagggcaca240tctctccatctttctgcttctgggctttctgaaaagcttctaagtcctggtacctcttgc300aactctcttctaaggatcctttccaaagatttctttttccatttttcttttcccctgggg360aagctttggttgaatattttctctgctttacttcttcaacccaacctcctctcatcaggg420cttaactttttttgcgacttgttttaacttaagatacggaatgaacacatatgtacctac480atacatacataaatacaaataggcatttatataaatgcatatatataatagttattttcc540aagagcacacctctctggcacttttcattgatacctcggtcgtttacctgtttgggattt600gacaagatccagactcagtttggctgtggattttgattgctttacaaatggttattatta660tttttttcacaagaactgggtctccagcactcactaaggtaagctctaagacttattgct720tttcctgtccagctg735<210>4<211>320<212>DNA<213>Homosapiens<220><223>cDNAFLJ37793fis,cloneBRHIP3000473<400>4aggctgaccggttccctgatgtgttacctgcttctgctactgatccaaactgcagaactt60ctcattcatccccaaggcctccaggcagtatccaatggggaatcagctctaaaaggaacc120agaccaacgttttccagccccttcattctgcttccctctgtgtgaggaaaggatagaaat180gttcaggacatcatcatacaggctcctcatctacaaagttccagtagcagtgacgcctac240acggaagacttggaactgcaaacaggctggggtcacctcagtgacatctgacgctgtcca300accagaagttcgatttttgt320<210>5<211>726<212>DNA<213>Homosapiens<220><223>chromosome1,GRCh38PrimaryAssembly<400>5taggacagaaaacctgagttctaattccagctttgccagtcgtcccgtccgtgatatatt60acctaactcctccagaactcagttttctaacctataaaatgaagacattgtgctagatga120tctttgtggttccttcaagctctggatctctaattccatgattagtaatgtatgtatgtg180tatataaatatgcttatctgtagaaatgggcccatttgaaaagtggagacaaggtctgcc240caggtgcatttattgtgccagaaacagtgaattcctaaataagttcataaaatcttgttt300tacaattcaatggtagtgcttaatgttactgtctgaaatccactgtttaaccagatggaa360gactggggccattcaaaacattattagttcacaagtgtttgctgttaaaatgcttcaata420aaactcatttgttaaagtcagaaattcaactcttctgtacttgggcaggtcccagcagcc480ccttggcaggctagttttgtgcatgggcctttgcaagctatataaacgttaggtgttggc540ttgattatgataaatatgagcaggctccctggagaacagtccagaaaaaaagagttatag600ttctcacaaactggtgacatgaatccattaagctgtgtggcattttccagtgtaaagaca660ttgtttgctggctacgatctctgactttttgtggcatatgaggtgtaaaatgttgtcaaa720aaagaa726<210>6<211>132<212>DNA<213>Homosapiens<220><223>chromosome5,GRCh38PrimaryAssembly<400>6atgacaatacctggcaccctagagctgcccggagaaatcccagaactgttggtgatgctg60gggctgctccagtaacaatcatccgcacacacccaccaagactggcctgtgggaagaaag120aagagctgccaa132<210>7<211>156<212>DNA<213>Homosapiens<220><223>chromosome5,GRCh38PrimaryAssembly<400>7acacaatagctaagacccaaactgggattagataccccactatgcttagccctaaactcc60aatagttaaatcaacaaaactattcaccagaacactacaagcaatagcttaaaactcaaa120ggacttggcggtgctttatatccctctagaggagcc156<210>8<211>259<212>DNA<213>Homosapiens<220><223>thymopoietin(TMPO),chromosome12,GRCh38PrimaryA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