本發(fā)明涉及包含胡桃萃取物的抗肥胖劑。本發(fā)明特別涉及一種通過防止中性脂肪量、膽固醇量、脂肪量或體重的增加，從而預(yù)防或防止肥胖的抗肥胖劑。該抗肥胖劑除了抑制滑膜蛋白與PGC-1β的結(jié)合以外，也抑制滑膜蛋白所致PGC-1β的泛素化，從而發(fā)揮所述作用功效。

背景技術(shù)：

日本特開2008-184383號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)1)揭示一種高脂血癥或脂肪肝的治療或預(yù)防劑，其含有源自胡桃的多酚。該文獻(xiàn)揭示從胡桃的種皮萃取的多酚成分對治療高脂血癥或脂肪肝是有效的。

肥胖是指脂肪組織過量積蓄在體內(nèi)的狀態(tài)，是提高糖尿病、循環(huán)器官系疾病、憂郁癥等各種健康上的風(fēng)險(xiǎn)的原因(參照非專利文獻(xiàn)1)。該問題在現(xiàn)代社會(huì)中產(chǎn)生非常大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)損失。對脂肪細(xì)胞代謝的分子機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究(參照非專利文獻(xiàn)2及3)。

又，近年來罹患運(yùn)動(dòng)障礙癥候群的患者持續(xù)增加。罹患運(yùn)動(dòng)障礙癥候群的患者因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)器官的障礙，因此有時(shí)會(huì)成為包括臥床狀態(tài)也必須加以看護(hù)的狀態(tài)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開2008-184383號(hào)公報(bào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：Wickelgren,I.(1998).Obesity:how big a problem？Science 280,1364-1367.

非專利文獻(xiàn)2：Lefterova,M.I.,and Lazar,M.A.(2009).New developments in a dipogenesis.Trends Endocrinol Metab 20,107-114.

非專利文獻(xiàn)3：Rosen,E.D.,and MacDougald,O.A.(2006).Adipocyte differentiation from the inside out.Nat Rev Mol Cell Biol 7,885-896.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的問題

如上所述，期望用來預(yù)防或治療肥胖的抗肥胖劑。

又，期望用以預(yù)防或治療運(yùn)動(dòng)障礙癥候群的運(yùn)動(dòng)障礙癥候群的預(yù)防或治療劑。

另一方面，專利文獻(xiàn)1揭示從胡桃的種皮萃取的成分對治療高脂血癥或脂肪肝是有效的，但未揭示在預(yù)防或治療肥胖是有效的。

在此，本發(fā)明的目的是提供抗肥胖劑。本發(fā)明的目的特別是提供一種通過防止中性脂肪量、膽固醇量、脂肪量或體重的增加，從而預(yù)防或防止肥胖的抗肥胖劑。

用于解決問題的手段

所述課題是通過下面的發(fā)明所解決。

本發(fā)明的第1方面涉及一種抗肥胖劑，其含有胡桃的枝、殼或葉的萃取物作為有效成分。

胡桃的枝、殼或葉的萃取物優(yōu)選為胡桃的枝、殼或葉的醇萃取物，更優(yōu)選為胡桃的枝的醇萃取物。

該抗肥胖劑優(yōu)選為中性脂肪量、膽固醇量、脂肪量或體重的增加預(yù)防劑。

胡桃的枝、殼或葉的萃取物例如是通過以下工序所制造的物：

對胡桃的枝、殼或葉1重量份混合4重量份以上30重量份以下而濃度為20重量％～60重量％的醇，并至少進(jìn)行1次加熱回流，從而獲得第1回流液的第1加熱回流工序，

將第1加熱回流工序所得第1回流液過濾，從而獲得第1濾液及第1殘?jiān)牡?過濾工序，

對第1過濾工序所得殘?jiān)?重量份混合2重量份以上20重量份以下而濃度為20重量％～60重量％的醇，并至少進(jìn)行1次加熱回流，從而獲得第2回流液的第2加熱回流工序，

將第2加熱回流工序所得第2回流液過濾并獲得第2濾液的第2過濾工序，

將第1濾液與第2濾液混合，并濃縮至糖度5％以上40％以下為止，從而獲得第1濃縮液的第1濃縮工序，及

將第1濃縮工序所獲得的第1濃縮液干燥，從而獲得干燥萃取物的干燥工序。

本發(fā)明的第2方面涉及運(yùn)動(dòng)障礙癥候群的預(yù)防劑或治療劑，其含有胡桃的枝、殼或葉的萃取物作為有效成分。

發(fā)明的效果

如實(shí)施例中所證實(shí)，胡桃的萃取物(特別是枝或殼的萃取物)可有效防止中性脂肪量、膽固醇量、脂肪量或體重的增加。這顯示胡桃的萃取物作為抗肥胖劑是有效的。

亦即，根據(jù)本發(fā)明可提供一種抗肥胖劑，其含有胡桃的枝、殼或葉的萃取物作為有效成分。根據(jù)本發(fā)明特別可提供一種通過防止中性脂肪量、膽固醇量、脂肪量或體重的增加，從而預(yù)防或防止肥胖的抗肥胖劑。

附圖說明

圖1的照片是代替表示胡桃萃取物性狀的圖。

圖2的照片是代替表示胡桃萃取物抑制滑膜蛋白與PGC-1β的結(jié)合的功效的試驗(yàn)結(jié)果的蛋白質(zhì)印跡法的圖。

圖3的照片是代替表示體外試管內(nèi)泛素化測定的結(jié)果的蛋白質(zhì)印跡法的圖。

圖4的圖表是代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠體重變化的影響的圖。

圖5的圖表是代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠食物攝取量的影響的圖。

圖6的圖表是代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠體重變化的影響的圖。

圖7的圖表是代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠食物攝取量的影響的圖。

圖8的圖表是代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠附睪脂肪重量變化的影響的圖。

圖9A的圖表是代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠血液成分變化的影響(GOT、GPT、ALP)的圖。

圖9B的圖表是代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠血液成分變化的影響(TP、ALB、BUN、UA)的圖。

圖9C的圖表是代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠血液成分變化的影響(TC、TG)的圖。

圖9D的圖表是代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠血液成分變化的影響(Na、K、Cl、Ca、Fe、P)的圖。

圖9E的圖表是代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠血液成分變化的影響(Amy、CPK、GLU)的圖。

圖10A的圖表是代替表示胡桃萃取物對源自關(guān)節(jié)風(fēng)濕患者的滑膜細(xì)胞(HFLS-RA株、M0024株)的細(xì)胞增殖影響的圖。

圖10B的圖表是代替表示胡桃萃取物對源自關(guān)節(jié)風(fēng)濕患者的滑膜細(xì)胞(M0019株、M0027株)的細(xì)胞增殖影響的圖。

圖10C的圖表是代替表示胡桃的葉萃取物及胡桃枝熱水萃取物對源自關(guān)節(jié)風(fēng)濕患者的滑膜細(xì)胞(M0024株、M0017株)的細(xì)胞增殖影響的圖。

具體實(shí)施方式

以下使用圖說明本發(fā)明的實(shí)施形態(tài)。本發(fā)明并不限定在以下說明的形態(tài)，也包括本領(lǐng)域技術(shù)人員從以下形態(tài)所了解范圍進(jìn)行適當(dāng)修正。

本發(fā)明的第1方面涉及一種抗肥胖劑，其含有胡桃的枝、殼或葉以及胡桃的枝、殼或葉的萃取物作為有效成分。本發(fā)明特別涉及一種通過防止中性脂肪量、膽固醇量、脂肪量或體重的增加，從而以預(yù)防或防止肥胖的抗肥胖劑。本發(fā)明的優(yōu)選例涉及通過抑制滑膜蛋白與PGC-1β的結(jié)合的抗肥胖劑、或通過抑制滑膜蛋白所致PGC-1β的泛素化的抗肥胖劑。

胡桃(胡桃)是周知的樹木。胡桃的種類并無特別限定。優(yōu)選的胡桃為日本胡桃、姬核桃、波斯胡桃及胡桃科黃杞。胡桃科黃杞(Engelhardtia chrysolepis)是中國南部山中所生長的胡桃科常綠高木。

胡桃的枝包括胡桃的枝部分的樹皮、從胡桃的枝剝開樹皮的部分、及胡桃的干的樹皮。其中，作為胡桃的枝的優(yōu)選部分為胡桃的枝部分的樹皮。本發(fā)明所使用胡桃的枝優(yōu)選為其粗細(xì)度為1mm以上10cm以下。枝的粗細(xì)度是指枝的剖面中直線長最長的部分。也可為枝的粗細(xì)度為0.2cm以上3cm以下的。

胡桃的枝可直接使用生木，也可使用經(jīng)干燥的。又，胡桃的枝可使用經(jīng)粉碎(裁切為細(xì)段)的，也可使用成為粉狀的。

胡桃的枝一般包括含有丹寧酸、5-羥基-1,4-萘醌(胡桃醌)、1,4,5-三羥基萘(氫化胡桃醌)、胡桃定、胡蘿卜素、肌醇、鄰苯三酚即焦倍酚、維生素C及其衍生物的物質(zhì)。

胡桃的殼是從去除果肉的種子再去除果仁的部分。

使用胡桃的枝、殼或葉作為萃取原料，并以冷水、溫水、熱水等水、有機(jī)溶劑、或水與有機(jī)溶劑的混合液作為萃取溶劑而萃取，從而可取得胡桃的枝、殼或葉的萃取物。該萃取所使用的有機(jī)溶劑的例子為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇等碳數(shù)1～5的低級(jí)醇、丙二醇、1,3-丁二醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、氯仿、甲苯、戊烷、己烷、環(huán)己烷、庚烷等的單獨(dú)或2種以上的組合。萃取溶劑的優(yōu)選例為水、碳數(shù)1～5的低級(jí)醇、該醇與水的混合液、及丙二醇與水的混合液。胡桃的枝的萃取物優(yōu)選為胡桃的枝的醇萃取物。以醇萃取胡桃的枝、殼或葉時(shí)，醇的濃度優(yōu)選為20重量％以上60重量％以下，也可為25重量％以上35重量％以下。

胡桃的枝的萃取物的萃取方法并無特別限制，可廣泛使用冷浸法、溫浸法、浸透法、其它植物萃取物制造中一般使用的方法等。

胡桃的萃取物揭示在例如日本專利第4167849號(hào)、日本專利第5319522號(hào)、日本特表2012-533597號(hào)公報(bào)、日本特開2005-289999號(hào)公報(bào)，本發(fā)明可適當(dāng)使用該文獻(xiàn)所揭示的方法，從而獲得胡桃的枝的萃取物。

胡桃的萃取物的優(yōu)選制造方法如下。當(dāng)然，只要是制造胡桃的萃取物，可適當(dāng)調(diào)整條件、或追加任意工序。

對胡桃的枝、殼或葉1重量份混合4重量份以上30重量份以下而濃度為20重量％～60重量％的醇，至少進(jìn)行1次加熱回流，從而獲得第1回流液(第1加熱回流工序)。醇的濃度優(yōu)選為20重量％以上60重量％以下，也可為25重量％以上35重量％以下。相對胡桃的枝、殼或葉1重量份，醇溶液的重量可為5重量份以上20重量份以下。胡桃的枝、殼或葉優(yōu)選為盡可能的裁切為細(xì)段的等。加熱回流可適當(dāng)使用周知回流裝置進(jìn)行。

過濾第1加熱回流工序所得的第1回流液，從而獲得第1濾液及第1殘?jiān)?第1過濾工序)。第1過濾工序的過濾方法可適當(dāng)采用周知過濾方法。

對第1過濾工序所得的殘?jiān)?重量份混合2重量份以上20重量份以下而濃度為20重量％～60重量％的醇，至少進(jìn)行1次加熱回流，從而獲得第2回流液(第2加熱回流工序)。醇的濃度優(yōu)選為20重量％以上60重量％以下，也可為25重量％以上35重量％以下。相對于胡桃的枝、殼或葉1重量份，醇溶液的重量也可為4重量份以上15重量份以下。

過濾第2加熱回流工序所得的第2回流液，從而獲得第2濾液(第2過濾工序)。

混合第1濾液與第2濾液，濃縮至糖度成為5％以上40％以下為止，從而獲得第1濃縮液(第1濃縮工序)。液體的濃縮方法為現(xiàn)有技術(shù)。最簡單的濃縮方法為加熱混合液并通過蒸發(fā)減少水分量的方法。

干燥第1濃縮工序所得的第1濃縮液，從而獲得干燥萃取物(干燥工序)。干燥方法也可適當(dāng)采用周知干燥方法。干燥工序的例子有噴霧干燥。

本發(fā)明的抗肥胖劑可為醫(yī)藥，也可為所謂的補(bǔ)充品(營養(yǎng)補(bǔ)助食品)。又，本發(fā)明的抗肥胖劑可為機(jī)能性食品或機(jī)能性食品的成分，也可為例如調(diào)味料等的食品添加物。本發(fā)明的抗肥胖劑可為通過涂布在對象部分以減瘦要變瘦的部分的化妝料。

本發(fā)明的抗肥胖劑優(yōu)選為中性脂肪量、膽固醇量、脂肪量或體重的增加預(yù)防劑。中性脂肪量或膽固醇量的增加預(yù)防劑，是通過給藥而可有效防止血中的中性脂肪量或膽固醇量增加的情形的藥劑。脂肪量的增加預(yù)防劑，是可通過給藥而減少特定部位的脂肪量、或可防止脂肪增加的藥劑。體重的增加預(yù)防劑，是可通過給藥而防止對象的體重增加的藥劑。

本發(fā)明也提供一種通過向?qū)ο?例如人體或人體以外的哺乳類)給藥胡桃的枝、殼或葉的萃取物，并使對象攝取胡桃的枝、殼或葉的萃取物，從而防止對象的肥胖的方法。又，本發(fā)明也提供一種包括相同的工序從而防止對象的中性脂肪量、膽固醇量、脂肪量或體重增加的方法。

本發(fā)明的胡桃的枝、殼或葉的萃取物如實(shí)施例所實(shí)證，對治療關(guān)節(jié)風(fēng)濕也是有效的。因此，本發(fā)明作為含有胡桃的枝、殼或葉的萃取物作為有效成分的關(guān)節(jié)風(fēng)濕的治療劑或預(yù)防劑也是有效的。又，本發(fā)明對罹患關(guān)節(jié)風(fēng)濕并希望攝取抗肥胖劑的對象特別有效。

關(guān)節(jié)風(fēng)濕是運(yùn)動(dòng)障礙癥候群的一要因。運(yùn)動(dòng)障礙癥候群大致上分為運(yùn)動(dòng)器官本身的疾病、及老化所造成運(yùn)動(dòng)器官機(jī)能不全所致的。運(yùn)動(dòng)障礙癥候群中，運(yùn)動(dòng)器官本身的疾病可舉出退化性骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、伴隨其的脊柱后彎、易骨折性、變形性脊椎癥、及脊椎管狹窄癥。又，關(guān)節(jié)風(fēng)濕會(huì)引起疼痛、關(guān)節(jié)可動(dòng)區(qū)域受限制、肌無力、麻痹、骨折、及痙攣，伴隨此所產(chǎn)生的平衡能力、體力、移動(dòng)能力的降低也是運(yùn)動(dòng)障礙癥候群的例子。又，老化所造成身體能力衰弱所引起的肌無力、持久力降低、反應(yīng)時(shí)間延長、運(yùn)動(dòng)速度降低、敏捷性降低、深層感覺降低、及平衡能力降低，也是運(yùn)動(dòng)障礙癥候群的例子。本發(fā)明的胡桃的枝、殼或葉的萃取物對運(yùn)動(dòng)障礙癥候群的預(yù)防或治療是有效的。該有效成分只要適當(dāng)采用第1方面中所述的即可。以下將含有本發(fā)明的胡桃的枝、殼或葉的萃取物的醫(yī)藥稱為本發(fā)明的藥劑。

本發(fā)明的藥劑可與生理學(xué)上所容許的載體、賦形劑、或稀釋劑等混合，并作為醫(yī)藥組成物并通過口服或非口服而給藥。作為口服劑，可形成顆粒劑、散劑、錠劑、膠囊劑、溶劑、乳劑、或懸濁劑等劑型。作為非口服劑，可選擇注射劑、點(diǎn)滴劑、外用藥劑、或栓劑等劑型。注射劑可為皮下注射劑、肌肉注射劑、或腹腔內(nèi)注射劑等。外用藥劑可為經(jīng)鼻給藥劑、吸入劑(噴霧劑)、或軟膏劑等。作為使用在肺纖維化癥的預(yù)防、治療時(shí)的劑型，以副作用少且作用在肺特別有效此點(diǎn)來看，優(yōu)選為吸入劑(噴霧劑)。以含有作為主成分的本發(fā)明的藥劑的方式而形成所述劑型的制劑技術(shù)為現(xiàn)有技術(shù)。

例如，口服給藥用的錠劑，可通過在本發(fā)明的藥劑添加混合賦形劑、崩解劑、結(jié)合劑、及潤滑劑等并壓縮整形而制造。賦形劑一般使用乳糖、淀粉、或甘露醇等。崩解劑一般使用碳酸鈣、羧基甲基纖維素鈣等。結(jié)合劑一般使用阿拉伯膠、羧基甲基纖維素、或聚乙烯吡咯烷酮。潤滑劑周知有滑石、硬脂酸鎂等。

又，注射劑可通過將本發(fā)明主成分的藥劑與適當(dāng)?shù)姆稚┮黄鹑芙猓偃芙饣蚍稚⒃诜稚┒@得。通過選擇分散劑而可形成水性溶劑及油性溶劑的任一種劑型。要形成水性溶劑，則以蒸餾水、生理食鹽水、或林格氏液等作為分散劑。油性溶劑中，將各種植物油、丙二醇等利用在分散劑。此時(shí)可視需要添加對羥苯甲酸酯等保存劑。又，可在注射劑中添加氯化鈉、葡萄糖等周知等張度劑。又，可添加如苯扎氯銨、鹽酸普魯卡因之類的止痛劑。

又，可通過將本發(fā)明的藥劑形成為固形、液狀、或半固形狀的組成物，從而作為外用劑。有關(guān)固形、或液狀的組成物，通過形成與所述的相同的組成物，從而可作為外用劑。半固形狀的組成物可在適當(dāng)溶劑中視需要添加增黏劑而調(diào)制。溶劑可使用水、乙醇、或聚乙二醇等。增黏劑一般使用膨潤土、聚乙烯醇、丙烯酸、甲基丙烯酸、或聚乙烯吡咯烷酮等。該組成物中可添加苯扎氯銨等保存劑。又，通過組合作為載體的可可脂之類的油性基材、或纖維素衍生物之類的水性凝膠基材，從而可形成栓劑。

本發(fā)明的藥劑是在安全給藥量的范圍內(nèi)，對包括人體的哺乳動(dòng)物來給予必要量(藥劑有效量)。本發(fā)明的藥劑的給藥量可考慮劑型種類、給藥方法、患者年齡或體重、患者癥狀等，最后由醫(yī)師或獸醫(yī)師判斷而適當(dāng)決定。胡桃的枝的萃取物的濃度、給藥量只要因應(yīng)對象年齡、用途、給藥方法而適當(dāng)調(diào)整即可。例如本發(fā)明的藥劑為口服給藥時(shí)，可含有0.01重量％以上10重量％以下胡桃的枝的萃取物。又，胡桃的枝的萃取物例如可在每1次給藥1μg以上10g以下。優(yōu)選的胡桃的枝的萃取物量為5μg以上5g以下。

實(shí)施例

[制造例1]

用以下順序調(diào)整胡桃萃取物(將胡桃殼萃取物、胡桃枝萃取物及胡桃葉萃取物總稱為胡桃萃取物)。將200kg的胡桃殼或胡桃枝與10倍量的30％醇(2000公升)混合，通過加熱回流進(jìn)行萃取操作2小時(shí)。胡桃殼使用包住果仁(食用部分)的堅(jiān)硬核的部分，胡桃枝使用胡桃的枝部分的樹皮、及剝除樹皮的部分。為了從混合液去除植物殘?jiān)褂?0網(wǎng)孔過濾，接下來使用150網(wǎng)孔過濾，從而獲得萃取液A。將網(wǎng)孔上的植物殘?jiān)c8倍量的30％醇(1600公升)混合，通過加熱回流再次進(jìn)行萃取操作1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，為了從混合液去除植物殘?jiān)?，使?0網(wǎng)孔過濾，接下來使用150網(wǎng)孔過濾，從而獲得萃取液B。

合并萃取液A與萃取液B，以濃縮溫度60℃以下進(jìn)行一次濃縮至糖度(Brix值)成為10-20％為止。接下來將所得一次濃縮液以濃縮溫度60℃以下進(jìn)行二次濃縮至糖度(Brix值)成為25-35％為止。為了將所得二次濃縮液殺菌，以90℃進(jìn)行1小時(shí)殺菌工序進(jìn)行2次殺菌。

接下來通過將殺菌的濃縮液噴霧干燥，從而獲得干燥萃取物。噴霧干燥工序以入口溫度140-230℃、出口溫度80-100℃的條件進(jìn)行。將所得干燥萃取物使用60網(wǎng)孔過篩，所得過篩品20kg(產(chǎn)率：約7％)為胡桃萃取物。

[制造例2]

除了制造例1中萃取溶劑由30％醇變更為60％醇以外，以與制造例1相同方式制造胡桃萃取物。

[制造例3]

除了制造例1中萃取溶劑由30％醇變更為80％醇以外，以與制造例1相同方式制造胡桃萃取物。

所述制造例1及3所制造的胡桃萃取物的性狀表示在圖1。本胡桃萃取物為圖1所示的粉末，作為粉末，相較于以80％醇所萃取，以30％醇所萃取是較易于使用的。

[試驗(yàn)例1]

為了調(diào)查胡桃萃取物對滑膜蛋白與PGC-1β的結(jié)合的抑制活性，而進(jìn)行體外的結(jié)合測定。又，本實(shí)施例中的蛋白質(zhì)使用0.4μg的MBP-PGC-1β-His(MBP融合PGC-1β)、及2μg的GST-SynoΔTM(跨膜域缺失的GST融合滑膜蛋白，參照日本特開2008-74753號(hào)公報(bào))。將0.4μg的MBP-PGC-1βHis與2μg的GST-SynoΔTM在緩沖液(包括20mM的Tris HCl pH8.0、100mM的NaCl、1mM的EDTA、0.1％NP-40、1mM DTT、5％甘油、及蛋白酶抑制劑)內(nèi)結(jié)合12小時(shí)，以抗GST抗體檢測滑膜蛋白。其結(jié)果表示在圖2。圖2是表示胡桃萃取物對滑膜蛋白與PGC-1β的結(jié)合抑制功效的蛋白質(zhì)印跡法。圖2中，殼30、殼60及殼80各別表示在制造例1、制造例2及制造例3所制造的胡桃殼萃取物，枝30、枝60、及枝80各別表示在制造例1、制造例2及制造例3所制造的胡桃枝萃取物，349表示5-羥基-1，4-萘醌(滑膜蛋白抑制劑、陽性對照)。

圖2表示胡桃殼萃取物、胡桃枝萃取物及胡桃葉萃取物具有滑膜蛋白與PGC-1β的結(jié)合抑制活性。

[試驗(yàn)例2：被檢測物質(zhì)的泛素化抑制]

為了檢討胡桃萃取物對滑膜蛋白所致PGC-1β的泛素化的抑制活性的濃度相依性，而進(jìn)行體外的泛素化測定。本實(shí)施例中的蛋白質(zhì)使用GST-β5(PGC-1β)、及MBP-Syno ΔTM-His。其結(jié)果表示在圖3。圖3為表示胡桃萃取物對PGC-1β的泛素化抑制活性的濃度相依性的蛋白質(zhì)印跡法。圖3中，348表示5,8-二羥基-1,4-萘醌(滑膜蛋白抑制劑、陽性對照)。

從圖3可知，胡桃殼萃取物、胡桃枝萃取物及胡桃葉萃取物皆具有高度PGC-1β的泛素化抑制活性。

[試驗(yàn)例3：體內(nèi)抗肥胖作用的檢驗(yàn)]

使用野生型小鼠檢驗(yàn)胡桃萃取物的給藥是否會(huì)誘發(fā)小鼠的體重減少。將以滅菌Milli-Q調(diào)整至50mg/ml濃度的胡桃萃取物(殼30)及胡桃萃取物(枝30)，個(gè)別以1g/kg的用量口服給藥在出生后7～8周后的野生型小鼠，毎日測定小鼠的體重。每隔一天給藥以一周3次的頻率進(jìn)行共計(jì)25次的給藥。作為對照組，以所述方式將溶劑給藥在野生型小鼠。其結(jié)果表示在圖3。圖4的圖表表示胡桃萃取物對野生型小鼠體重變化的影響。由圖4給藥胡桃萃取物的小鼠可確認(rèn)出相較于對照組，體重減少。

[試驗(yàn)例4：胡桃萃取物給藥對食物攝取量的影響]

為了調(diào)查給藥胡桃萃取物的小鼠的體重的減少是否是食物攝取量減少所致，在實(shí)施試驗(yàn)例3的同時(shí)測定小鼠的食物攝取量。其結(jié)果表示在圖5。圖5的圖表表示胡桃萃取物對野生型小鼠食物攝取量的影響。由圖5可知，相照對照，給藥胡桃萃取物的小鼠食物攝取量并無差別。亦即，體重減少并非食物攝取量減少所致。

[試驗(yàn)例5：體內(nèi)的抗肥胖作用的檢驗(yàn)]

使用野生型小鼠，檢驗(yàn)在經(jīng)常攝取高脂肪食品條件下，胡桃萃取物的給藥是否會(huì)誘發(fā)小鼠的體重減少。

將以DMSO及玉米油調(diào)整至50mg/ml濃度的胡桃萃取物(殼30)及胡桃萃取物(枝30)，分別以50mg/kg的用量口服給藥在生后7～8周后的野生型小鼠，毎日測定小鼠的體重。每隔一天給藥以一周3次的頻率進(jìn)行共計(jì)31次的給藥。作為對照組，以所述方式將溶劑給藥在野生型小鼠。其結(jié)果表示在圖6。圖6的圖表表示胡桃萃取物對野生型小鼠體重變化的影響。由圖6來看，從給藥開始10天前后，與比較例的小鼠相比，給藥胡桃萃取物的小鼠雖然觀測到體重增加，但其后的體重差并不大，顯示胡桃萃取物具有對接種油脂的肥胖防止功效。

[試驗(yàn)例6：胡桃萃取物給藥對食物攝取量的影響]

為了調(diào)查給藥胡桃萃取物的小鼠的體重增加與食物攝取量的關(guān)系，而在實(shí)施試驗(yàn)例5時(shí)測定小鼠的食物攝取量。其結(jié)果表示在圖7。圖7的圖表表示胡桃萃取物對野生型小鼠食物攝取量的影響。由圖7可知，殼30群中，相比對照小鼠在食物攝取量并無變化。另一方面，由圖7可知，枝30群中，相比對照小鼠則食物攝取量較多。合并考慮圖6及圖7，與對象小鼠相比，可知枝30群的食物攝取量雖然較多，但實(shí)際上可抑制體重增加。

[試驗(yàn)例7：體內(nèi)附睪脂肪重量變化的檢驗(yàn)]

使用野生型小鼠，檢驗(yàn)胡桃萃取物的給藥是否會(huì)誘發(fā)小鼠附睪脂肪重量的減少。

與試驗(yàn)例5相同方式，將以DMSO及玉米油調(diào)整濃度至50mg/ml濃度的胡桃萃取物(殼30)及胡桃萃取物(枝30)，分別以50mg/kg的用量口服給藥在生后7～8周后的野生型小鼠。每隔一天給藥以一周3次的頻率進(jìn)行共計(jì)31次的給藥。作為對照組，以所述方式將溶劑給藥在野生型小鼠。解剖試驗(yàn)開始后第71天的小鼠并測定附睪脂肪重量。其結(jié)果表示在圖8。圖8的圖表表示胡桃萃取物對野生型小鼠附睪脂肪重量變化的影響。圖表表示第71天的小鼠的體重每100g中的附睪脂肪重量。

從圖8可確認(rèn)，相對對照組僅給藥溶劑的小鼠群，給藥胡桃萃取物(枝30)的小鼠群附睪脂肪重量減少。亦即，胡桃萃取物(枝30)顯示抑制附睪脂肪重量增加的功效。

[試驗(yàn)例8：血液成分的變化的檢驗(yàn)]

使用野生型小鼠，檢驗(yàn)胡桃萃取物的給藥是否會(huì)誘發(fā)小鼠血液成分的變化。

具體而言，在實(shí)施試驗(yàn)例7時(shí)，從試驗(yàn)開始后第71天的小鼠抽血，調(diào)查血清中的成分(GOT、ALP、GPT、TP、BUN、ALB、UA、TC、TG、Na、Ca、K、Fe、Cl、P、Amy、GLU、CPK)的濃度。其結(jié)果表示在圖9A～圖9D。圖9A～圖9D的圖表為代替表示胡桃萃取物對野生型小鼠血液成分變化的影響的圖。圖9A表示血中的GOT(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、GPT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、及ALP(堿性磷酸酶)量。圖9B表示血中的TP(總蛋白)、ALB(白蛋白)、BUN(尿素氮)、UA(尿酸)量。圖9C表示血中的TC(總膽固醇值)、及TG(中性脂肪量：甘油三酸酯量)。圖9D表示血中的Na、K、Cl、Ca、Fe、及P量。圖9E表示血中的Amy(淀粉酶)、CPK(肌酸激酶)、及GLU(葡萄糖)量。

從圖9C來看，特別枝30群顯示總膽固醇值、中性脂肪量降低。考慮到枝30群的食物攝取量比對照多，則顯示枝30具有減少總膽固醇值、中性脂肪量的功能。

[比較例1]

以與所述相同方式使用多種濃度的醇，從而獲得胡桃的果實(shí)及胡桃的種皮的萃取物。除了使用胡桃的果實(shí)的萃取物及胡桃的種皮的萃取物以外，進(jìn)行與試驗(yàn)例5至試驗(yàn)例8相同的實(shí)驗(yàn)。由結(jié)果可知，相比胡桃的果實(shí)萃取物及胡桃的種皮萃取物，胡桃的枝的萃取物對總膽固醇值、中性脂肪量、脂肪量及體重增加具有顯著功效。

[試驗(yàn)例9：胡桃萃取物對滑膜細(xì)胞的增殖抑制功效]

用以下方法檢討對源自關(guān)節(jié)風(fēng)濕患者的滑膜細(xì)胞的增殖的功效。將滑膜細(xì)胞以1×10³/well播種在96well plate，在6～24小時(shí)后，以成為20μg/ml的方式添加胡桃萃取液或DMSO。4天后，使用Cell Counting Kit-8(Dojindo)測定細(xì)胞的增殖。結(jié)果表示在圖10A～圖10C?？v軸表示以添加DMSO的滑膜細(xì)胞的增殖為1時(shí)的相對值。由圖可知，相比對照組，胡桃萃取物將滑膜細(xì)胞的增殖抑制至60～80％。進(jìn)而在滑膜細(xì)胞添加3、10、30，及100μg/ml的胡桃萃取物并檢討濃度相依性。如圖10A～圖10C所示，顯示胡桃萃取液為濃度相依性地抑制滑膜細(xì)胞增殖。

[試驗(yàn)例10：胡桃萃取物對關(guān)節(jié)風(fēng)濕的治療功效]

參考Kuzuna等的方法[Chemical and Pharmaceutical Bulletin(Chem.Pharm.Bull.)，23，1184-1191(1975)]，使用佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠而檢討胡桃萃取物對關(guān)節(jié)風(fēng)濕的治療功效。作為佐劑，使用將(Difco公司)的Mycobacterium butyricum的干燥死菌以1％濃度懸濁在流動(dòng)石蠟。接下來在雄性Fischer大鼠的右后肢足跖皮下注入50μl的佐劑，藉此引發(fā)關(guān)節(jié)炎。3周后，將未注入佐劑的左后肢(非炎癥足)伸展5次，僅將有5次鳴叫反應(yīng)的小鼠使用在其后的試驗(yàn)。將以各種醇濃度萃取的胡桃萃取物(枝或殼的萃取物)通過經(jīng)口給藥、局部注射而進(jìn)行給藥。其結(jié)果可知，胡桃萃取液具有關(guān)節(jié)風(fēng)濕的治療功效。

產(chǎn)業(yè)可利用性

本發(fā)明可利用在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)、及化妝品制造業(yè)。