本發(fā)明涉及生物技術(shù)、生物科學(xué)和制藥工業(yè)領(lǐng)域，特別地涉及對分子進(jìn)行修飾以便改善其藥物代謝動力學(xué)，其中增加其在血液中的半衰期和其生物學(xué)活性?，F(xiàn)有技術(shù)近年來，生物分子用于在人類中的治療用途的使用有所增加，這主要是由于：(1)發(fā)現(xiàn)了新的蛋白質(zhì)和肽分子，(2)對于體內(nèi)作用機制有了更好的理解，(3)改善了蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)和肽的合成，和(4)改善了制劑或分子修飾技術(shù)，其使得能夠改善藥效動力學(xué)和藥物代謝動力學(xué)特性。在藥物的修飾釋放領(lǐng)域中的技術(shù)發(fā)展已經(jīng)使得能夠引入許多改變可注射藥物的釋放的系統(tǒng)，以便改善治療劑的藥效動力學(xué)和藥物代謝動力學(xué)特性。新的藥物釋放系統(tǒng)可以通過制劑的變化(例如，持續(xù)釋放產(chǎn)品或脂質(zhì)體)或者通過向藥物分子進(jìn)行添加(例如，PEG化，其僅為將藥物共價結(jié)合至一個或多個聚乙二醇(PEG)分子)來產(chǎn)生。新的釋放形式導(dǎo)致半衰期的增加、副作用的減少、藥物功效的提高以及患者的更好的生活質(zhì)量。持續(xù)釋放系統(tǒng)以受控的且預(yù)定的方式釋放藥物，并且尤其適合于其中避免在血漿中的濃度大幅波動是重要的那些藥物。由于保護了對于降解敏感的蛋白質(zhì)以及經(jīng)延長或經(jīng)修飾的釋放，已經(jīng)廣泛地研究了通過使用生物可降解的微球來進(jìn)行的分子的全身性釋放(Sinha，V.R.和Trehan，A.(2003).Biodegradablemicrospheresasproteindelivery，J.ControlledRelease，90(3)：261-280)。PEG化提供了一種用于修飾治療性蛋白質(zhì)以使生物分子的許多藥理學(xué)限制最小化的方法。例如，在血液中的半衰期由于數(shù)個原因而增加，其中包括：聚合物殘基可以阻止蛋白酶的攻擊以及該藥物被免疫系統(tǒng)識別，以及所述綴合物的相對于天然蛋白質(zhì)而言顯著更大的流體動力學(xué)體積使得腎濾過明顯地減少。雖然在許多情況下蛋白質(zhì)的體外生物學(xué)活性受到PEG化影響，但是在血液中的壽命的重大增加使得其治療作用是更有效的(HarrisJ.M.和ChessR.B.(2003)Effectofpegylationonpharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2：214-221)。PEG化的另一個益處為物理穩(wěn)定性的增加，這是由于其在空間上阻斷由疏水相互作用所誘導(dǎo)的降解途徑，并且產(chǎn)生減少在所述蛋白質(zhì)的熱不穩(wěn)定性中所牽涉的分子間相互作用的非特異性空間障礙。物理穩(wěn)定性的增加使得能夠獲得更穩(wěn)定的制劑(HarrisJ.M.和ChessR.B.(2003)Effectofpegylationonpharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2：214-221)。由于第二代經(jīng)活化的PEG的出現(xiàn)，能夠擁有允許更有選擇性的PEG化的基團(例如：優(yōu)先結(jié)合蛋白質(zhì)的N-末端的醛基團)和支化結(jié)構(gòu)(RobertsM.J.，BentleyM.D.，HarrisJ.M.(2002)ChemistryforpeptideandproteinPEGylation.Adv.DrugDeliv.Reviews.54：459-476)。所開發(fā)出的支化PEG包括具有兩個分枝的單官能PEG(專利號US5,932,462)、具有四個分枝的四官能PEG和具有八個分枝的八官能PEG。關(guān)于治療性蛋白質(zhì)的綴合，更有用的經(jīng)活化的PEG為單官能PEG，因為其避免該蛋白質(zhì)與該PEG聚合物之間的交聯(lián)。支化PEG還具有傘型效應(yīng)，其允許更好的對于蛋白質(zhì)表面的保護。具有兩個分枝的單官能PEG使得能夠獲得與干擾素α-2a的綴合物，其顯示出在臨床上比天然蛋白質(zhì)更好的結(jié)果(RajenderReddyK.，ModiM.W.，PedderS.(2002).Useofpeginterferonalfa-2a(40KD)(Pegasys)forthetreatmentofhepatitisC.Adv.DrugDeliv.Reviews.54：571-586)。存在有關(guān)于許多其中應(yīng)用了不同的修飾釋放技術(shù)的蛋白質(zhì)的報道，其中包括重組的人促紅細(xì)胞生成素(EPO)(rhEPO)。EPO為具有165個氨基酸的糖蛋白。取決于其糖基化程度，通過使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(縮寫為SDS-PAGE)而估計的它的分子量在27kDa和39kDa之間變化(Mikaye，T.等人，(1977).PurificationofHumanerythropoietin.J.Biol.Chem.252：5558-5564)。在調(diào)查研究中已證明，通過撤除低氧刺激，在血液中EPO的信使核糖核酸(mRNA)快速減少，其中可能在3小時時無法檢測，這表明其半衰期是短的(Lacombe，C.等人，(1988)Peritubularcellsarethesiteoferythropoietinsynthesisinthemurinehypoxickidney.J.Clin.Invest.81：620-623；Koury，S.T.等人，(1989)Quantitationoferythropoietinproducingcellsinkidneysofmicebyinsituhybridation：Correlationwithhematocrit，renalerythropoietinmRNAandserumerythropoietinconcentration.Blood74：645-651)。據(jù)估計，EPO在血漿中的半衰期在4小時和13小時之間變化；當(dāng)與其他具有治療用途的分子相比較時，該時間是非常短的。這使得需要有規(guī)律地使用該激素的患者必須頻繁地注射以維持接近正常水平的紅細(xì)胞水平(Spivak，J.L.1992.Themechanismofactionoferythropoietin：Erythroidcellresponse.J.W.Fisher(Ed.)BiochemicalPharmaeologyofBloodandBlood-FormingOrgans.Springer-VerlagBerlin.HandbookofExperimentalPharmacology.101：49-114；Jelkmann，W.(1986).RenalErythropoietin：PropertiesandProduction.Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.104：139-205)。為了增加rhEPO的半衰期，對該分子進(jìn)行了突變以增加N-糖基化位點(Burke，Paul(2003).Deviceforthesustainedreleaseofaggregation-stabilized，biologicallyactiveagent.美國專利申請?zhí)?0030133979)，它被包囊在微球(MorlockM.等人，(1998).ErythropoietinloadedmicrospherespreparedfrombiodegradableLPLG-PEO-LPLGtriblockcopolymers：proteinstabilizationandin-vitroreleaseproperties.JControlRelease4，56(1-3)：105-115)和脂質(zhì)體(MoriyaH.等人，(1997).Pharmacokineticandpharmacologicalprofilesoffreeandliposomalrecombinanthumanerythropoietinafterintravenousandsubcutaneousadministrationsinrats.PharmRes.14(11)：1621-1628)中，并且已經(jīng)報道獲得了rhEPO的二聚體，這旨在增加其生物學(xué)活性(BrunoD.等人，(2001).Dimericerythropoietinfusionproteinwithenhancederythropoieticactivityinvitroandinvivo.Blood，Vol.97，No.12，3776-3782)。在臨床中具有最多結(jié)果的修飾之一為rhEPO與聚合物的化學(xué)綴合(JollingK.等人，(2005).Mixed-EffectsModellingoftheInterspeciesPharmacokineticScalingofPegylatedHumanErythropoietin.EurJPharmSci；24：465-475)。在該經(jīng)PEG化的rhEPO的開發(fā)中，所遇到的困難為綴合過程的低的產(chǎn)率，這是由于形成了單PEG化種類和二PEG化種類，其中后者是該過程的污染物。由于所有上面所陳述的內(nèi)容，仍然令人感興趣的是獲得新的EPO與聚合物的綴合物，其提供相對于未修飾的分子而言的治療優(yōu)勢。發(fā)明描述本發(fā)明通過提供這樣的綴合物而解決了上面所提出的問題，所述綴合物包含促紅細(xì)胞生成素(EPO)和含有兩個單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分枝的不對稱支化聚合物結(jié)構(gòu)，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之間，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之間。以這種方式，本發(fā)明提供了包含單官能支化PEG結(jié)構(gòu)的綴合物，所述單官能支化PEG結(jié)構(gòu)具有與由Papadimitriou所使用的(專利號US7,202,208)類似的分子大小，但其采用具有二條有著不同分子量的鏈的PEG結(jié)構(gòu)。出人意料地，該備選方案給該藥物提供了新的優(yōu)勢。在本發(fā)明的綴合物中，所述具有兩個分枝的PEG的聚合物結(jié)構(gòu)的總分子量在27kDa和37kDa之間。在本發(fā)明的一個實施方案中，mPEG1的分子量為12kDa，并且mPEG2的分子量為20kDa。使用具有所示分子量的不對稱的支化PEG鏈(而非線性PEG鏈)使得能夠減少二PEG化的污染物的形成，并且出人意料地，顯著地增加該分子的半衰期以及其物理化學(xué)穩(wěn)定性。另一個預(yù)料不到的結(jié)果是，所述具有該不對稱支化單官能PEG的經(jīng)PEG化的分子的生物學(xué)活性保持完整。在文獻(xiàn)中已經(jīng)廣泛報道了具有PEG化的生物分子的生物學(xué)活性的喪失(HarrisJ.M.和ChessR.B.(2003).Effectofpegylationonpharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov.2：214-221)。具有兩個不對稱分枝的單官能PEG通過將兩個具有不同分子大小的線性PEG鏈結(jié)合在核心上來獲得。其他作者使用了類似的過程，其中取得良好的結(jié)果(專利號US5,932,462)。為了能夠?qū)蓚€線性PEG鏈結(jié)合至核心，需要它們具有活性基團。該基團可以從在現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種基團中選擇。例如，該活性基團尤其可以為：琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、琥珀酰亞胺基碳酸酯、對-硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亞胺基丙酸酯、琥珀酰亞胺基丁酸酯。在本發(fā)明中優(yōu)選的線性PEG為用琥珀酰亞胺基碳酸酯進(jìn)行活化的那種。這是由于兩個主要原因：a)它與氨基基團之間的反應(yīng)的良好的產(chǎn)率，和b)獲得該經(jīng)官能化的PEG的工藝過程是容易的。獲得該經(jīng)官能化的PEG的工藝過程是在該
技術(shù)領(lǐng)域：
中工作的人員所已知的(MironT.，WilchekM.(1993).ASimplifiedMethodforthePreparationofSuceinimidylCarbonatePolyethyleneGlycolforCouplingtoProteins.BioconjugateChem.4：568-569)。一旦該線性PEG被活化，則隨后使其與被選擇作為核心的分子進(jìn)行反應(yīng)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述核心為L-賴氨酸，因為它是生物相容性分子，其具有可以用于稍后進(jìn)行活化的兩個游離的氨基基團和一個羧基基團。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，將EPO綴合至如下所示的不對稱支化聚合物結(jié)構(gòu)：在一個特別的實施例中，在形成為該綴合物的一部分的所述聚合物結(jié)構(gòu)中，mPEG1的分子量為12kDa且mPEG2的分子量為20kDa，或者mPEG1的分子量為20kDa且mPEG2的分子量為12kDa。該具有兩個不對稱分枝的衍生物可以通過使用色譜法來進(jìn)行純化，然后用不同的反應(yīng)性基團來進(jìn)行活化以用于與生物分子進(jìn)行綴合。任何用于活化其他PEG結(jié)構(gòu)的官能團均可以用于在本發(fā)明中所描述的不對稱支化PEG。這些官能團的例子尤其為：N-羥基琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基碳酸酯、不同類型的醛、馬來酰亞胺。另一種類型的允許該結(jié)構(gòu)結(jié)合至蛋白質(zhì)的官能團為螯合基團，例如次氮基三乙酸酯，其可以借助于過渡金屬而綴合至存在于肽主鏈中的組氨酸。待使用的反應(yīng)性基團的選擇取決于想要在其上結(jié)合PEG的蛋白質(zhì)的殘基。在由Huang所提交的專利申請(EP1479711A1)的實施例中，顯示了支化的PEG結(jié)構(gòu)，其在所述分枝的每一個中具有不同的分子量；但是所述分枝的分子大小比本發(fā)明的小。在專利申請?zhí)朎P1479711A1中，發(fā)明人提出，相對于未修飾的藥物的生物學(xué)活性而言，該綴合物的生物學(xué)活性降低。然而，在本發(fā)明中，出人意料地，EPO與總分子量在27kDa和37kDa之間的具有兩個不對稱分枝的單官能PEG的綴合物的生物學(xué)活性與未修飾的EPO的生物學(xué)活性類似。另一方面，在本發(fā)明中證明，根據(jù)由Huang所提交的專利申請的具有兩個有著較低分子量的分枝的PEG結(jié)構(gòu)的半衰期短于本發(fā)明的EPO與具有兩個分別為12kDa和20kDa的分枝的PEG的綴合物的半衰期。在本發(fā)明中所獲得的該結(jié)果是出人意料的。用該包含不對稱聚合物結(jié)構(gòu)(PEG2，32K)的綴合物，實現(xiàn)了不限制生物學(xué)活性的所述分子的空間分布，通過減少多PEG化產(chǎn)物的形成而改善了綴合反應(yīng)，并且顯著地改善了藥物代謝動力學(xué)參數(shù)。這使得能夠減少在需要治療的人中的治療劑量。在本發(fā)明中用于獲得具有兩個不對稱分枝的PEG結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)原料為12kDa的mPEG(12KPEG)和20kDa的mPEG(20KPEG)。這些mPEG的分子量具有由制造商所確立的范圍，因為PEG為多分散聚合物。例如，根據(jù)制造商之一的說明書，多分散性應(yīng)當(dāng)?shù)陀?.1％。在該情況下，由該制造商所報告的分子量范圍對于12KPEG將為12.0±1.2kDa；20KPEG的分子量范圍將為20.0±2.0kDa。為了測定每批PEG起始材料之間的分子量的該差異是否影響藥物代謝動力學(xué)的結(jié)果，用具有相應(yīng)于所述說明書的極值的分子量的PEG批次來進(jìn)行實驗(實施例11)。取分子量為11kDa的12KPEG和分子量為18kDa的20KPEG用于形成EPO與總分子量為29kDa的具有兩個分枝的PEG結(jié)構(gòu)的綴合物(PEG2，29K-EPO)。還取分子量為13kDa的12KPEG和分子量為22kDa的20KPEG用于形成EPO與總分子量為35kDa的具有兩個分枝的PEG結(jié)構(gòu)的綴合物(PEG2，35K-EPO)。結(jié)果顯示，當(dāng)使用不同起始批次的12KPEG和20KPEG時，藥物代謝動力學(xué)參數(shù)是類似的。因此，由PEG2，29K-EPO和PEG2，35K-EPO的結(jié)構(gòu)所形成的綴合物被認(rèn)為與由具有由制造商所指明的理論重量的結(jié)構(gòu)所形成的那些，即EPO與具有兩個分枝(其中之一為12kDa，和另一為20kDa)的PEG的綴合物(PEG2，32K-EPO)，基本上相同。蛋白質(zhì)與經(jīng)活化的PEG的綴合在合適的緩沖液中進(jìn)行。除了其他因素外，緩沖劑的特征尤其取決于該聚合物的官能團以及綴合的目的。例如，如果希望通過游離的氨基基團與被官能化為N-羥基琥珀酰亞胺酯的PEG進(jìn)行綴合，那么可以根據(jù)綴合反應(yīng)的pH在一定程度上預(yù)測綴合位點。在8.0和9.0之間的pH有利于通過賴氨酸的ε-氨基基團來進(jìn)行綴合。一旦獲得綴合物，就使用各種技術(shù)來對其進(jìn)行表征。分析所述綴合物的化學(xué)、物理和生物學(xué)特性，以實現(xiàn)對于經(jīng)純化的綴合物的可能的最完全的表征。例如，所述綴合物的濃度通?？梢酝ㄟ^紫外光譜學(xué)(在280nm處的吸光度)來測定，因為PEG殘基實際上不影響該蛋白質(zhì)的摩爾消光系數(shù)。經(jīng)純化的產(chǎn)物的純度優(yōu)選地通過SDS-PAGE來測定，因為色譜法例如凝膠過濾色譜法對于相應(yīng)于目的綴合物的信號和相應(yīng)于污染物的信號的區(qū)分很差。其他物理化學(xué)特性可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常用操作程序來進(jìn)行研究。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語“促紅細(xì)胞生成素(EPO)”是指保持了其生物學(xué)活性的EPO分子的任何變體；例如，截短的分子。所述EPO可以通過重組脫氧核糖核酸(DNA)技術(shù)來獲得，其中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的表達(dá)和純化系統(tǒng)。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，所述綴合物包含rhEPO。本發(fā)明的目標(biāo)綴合物還包含通過上面所描述的方法在經(jīng)由現(xiàn)有技術(shù)的任何操作程序(例如，氨基酸置換)進(jìn)行修飾后而獲得的任何EPO變體。本發(fā)明的目標(biāo)還為藥物組合物，其包含任何在本文中所公開的PEG-EPO綴合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明的另一個方面為用于獲得經(jīng)PEG化的EPO的方法，其特征在于，將所述蛋白質(zhì)綴合至含有兩個mPEG分枝的不對稱支化聚合物結(jié)構(gòu)，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之間，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之間。通過本發(fā)明的方法，引起在施用了所述蛋白質(zhì)的哺乳動物的血液中所述EPO的半衰期增加，如果與未與PEG進(jìn)行綴合的EPO的半衰期相比較。因此，本發(fā)明提供了用于改善所述蛋白質(zhì)的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的方法，以便減少施用給有此需要的受試者的劑量。在本發(fā)明的背景下，EPO的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的改善是指所述蛋白質(zhì)的半衰期和/或平均停留時間的增加。以該方式，本發(fā)明公開了化學(xué)修飾EPO分子的方法，以便增加所述分子的半衰期，其特征在于，將所述蛋白質(zhì)綴合至含有兩個mPEG分枝的不對稱支化聚合物結(jié)構(gòu)，其中所述mPEG分枝之一的分子量在10kDa和14kDa之間，和另一mPEG分枝的分子量在17kDa和23kDa之間。在本發(fā)明的一個實施方案中，在所述不對稱支化聚合物結(jié)構(gòu)中所述mPEG分枝之一的分子量為12kDa，和另一mPEG分枝的分子量為20kDa。在本發(fā)明的一個實施方案中，在本發(fā)明的方法中，綴合至EPO的不對稱支化聚合物結(jié)構(gòu)如下所示：在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施方案中，在綴合至EPO的不對稱支化聚合物結(jié)構(gòu)中，mPEG1的分子量為12kDa且mPEG2的分子量為20kDa，或者mPEG1的分子量為20kDa且mPEG2的分子量為12kDa。在一個更優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明的方法中，所述EPO為rhEPO。附圖簡述圖1.EPO與PEG2，32K的綴合反應(yīng)產(chǎn)物的具有雙重染色(考馬斯亮藍(lán)和碘)的SDS-PAGE的結(jié)果。樣品1相應(yīng)于EPO的陽性對照，和樣品2相應(yīng)于EPO與PEG2，32K的綴合反應(yīng)產(chǎn)物。圖2.EPO與PEG2，40K的綴合反應(yīng)產(chǎn)物的具有雙重染色(考馬斯亮藍(lán)和碘)的SDS-PAGE的結(jié)果。樣品1相應(yīng)于EPO的陽性對照，和樣品2相應(yīng)于EPO與PEG2，40K的綴合反應(yīng)產(chǎn)物。圖3.通過使用凝膠過濾色譜法而獲得的用于評價不同PEG-EPO綴合物的色譜圖。圖4.通過紅細(xì)胞正常的小鼠的方法測定的天然的EPO和單PEG化的EPO的體內(nèi)生物學(xué)活性。圖5.通過胰蛋白酶降解測定法而獲得的關(guān)于PEG2，32K-EPO綴合物、PEG2，40K-EPO綴合物和未修飾的EPO的結(jié)果。呈現(xiàn)了通過SDS-PAGE進(jìn)行追蹤的降解動力學(xué)。圖6.通過紅細(xì)胞正常的小鼠的方法測定的不同PEG-EPO綴合物和未修飾的EPO的生物學(xué)活性。實施方式的詳細(xì)描述/實施例實施例1.被活化為N-羥基琥珀酰亞胺酯的PEG的獲得mPEG20K-OH的活化反應(yīng)將50g未活化的分子量為20kDa的mPEG(mPEG20K-OH)在450mL甲苯中共沸干燥3小時。在該時間過后，抽取出200mL溶劑，并讓溶液冷卻直至達(dá)到環(huán)境溫度。然后，添加60mL無水二氯甲烷(DCM)作為助溶劑。稱取4.9g二琥珀酰亞胺基碳酸酯，并將其溶解在40mL二甲基甲酰胺中。將上述溶液加入到包含mPEG20K-OH的燒瓶中。稱取2.5g二甲氨基吡啶，并將其溶解在20mLDCM中。將上述溶液加入到包含mPEG20K-OH的燒瓶中，并開始攪拌。讓其在環(huán)境溫度下反應(yīng)過夜。通過使用玻璃纖維膜來對反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾，以去除固體產(chǎn)物。用1.5L無水乙醚使濾液沉淀，并在真空中進(jìn)行過濾。在真空中收集沉淀物，在高度真空中干燥4小時，并貯存于-20℃。實現(xiàn)以PEG琥珀酰亞胺基碳酸酯(PEG20K-SC)的形式回收了初始的mPEG20K-OH質(zhì)量的96％，其中活化度為96.0±0.8％。mPEG12K-OH的活化反應(yīng)依照用于mPEG20K-OH的活化反應(yīng)的相同操作程序，但在本情況下，使用未活化的分子量為12kDa的mPEG(mPEG12K-OH)作為起始原料。L-賴氨酸與PEG20K-SC和PEG12K-SC的反應(yīng)稱取9.1gL-賴氨酸，并將其溶解在30mL的0.1M硼酸溶液(pH8.0)中。添加20g的PEG20K-SC和15mL的L-賴氨酸在硼酸中的溶液。使溶液在攪拌下保持12小時。然后，用300mL蒸餾水稀釋反應(yīng)混合物，并且用鹽酸溶液將混合物的pH調(diào)整至3.5。將混合物轉(zhuǎn)移至其中加入了100mLDCM的分液漏斗中。手動攪拌，并抽取出下面的相(有機相)。共進(jìn)行5次萃取。將20g硫酸鈉加入到包含有機相的燒瓶中，并手動攪拌直至該相完全清澈。通過使用玻璃纖維膜，在真空中進(jìn)行過濾。盡最大可能地，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行濃縮。添加500mL乙醚并手動攪拌，以使產(chǎn)物沉淀。在真空中進(jìn)行過濾，并且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將產(chǎn)物(20K的單PEG化的L-賴氨酸)在真空中干燥1小時。在第二個反應(yīng)步驟中，將9gPEG12K-SC添加至15g20K的單PEG化的L-賴氨酸。將反應(yīng)物溶解在215mLDCM中，并添加0.14mL三乙胺。通過使用玻璃纖維膜，將反應(yīng)混合物在真空中進(jìn)行過濾。盡最大可能地，將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行濃縮。添加300mL乙醚并手動攪拌2分鐘，以使產(chǎn)物沉淀。在真空中進(jìn)行過濾，并且在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將所獲得的產(chǎn)物(具有兩個不對稱分枝的PEG，所述不對稱分枝之一為12kDa，和另一為20kDa(PEG2，32K-COOH))在真空中干燥1小時。該過程的總產(chǎn)率大于70％。PEG2，32K-COOH的純化在高度為80cm的DEAE-Sepharose柱中進(jìn)行PEG2，32K-COOH的純化，并且采用40mL/分鐘的體積流量。預(yù)先用4.5L的0.2M氫氧化鈉溶液對凝膠進(jìn)行衛(wèi)生處理。將柱用50mM硼酸溶液(pH9.0)進(jìn)行平衡。然后，將柱用5L蒸餾水進(jìn)行洗滌。施加溶解在水中的PEG2，32K-COOH樣品，直至達(dá)到40μS/cm的電導(dǎo)率，其大于水的電導(dǎo)率。在施加樣品之后，將柱用3L純化水進(jìn)行洗滌。用5L的10mM氯化鈉溶液來進(jìn)行樣品的洗脫。收集500mL的級分。然后，用3L的1M氯化鈉溶液使柱再生。該過程的總回收率大于90％，其中純度大于95％。被活化為N-羥基琥珀酰亞胺酯的支化PEG(PEG2，32K-NHS)的獲得將1gPEG2，32K-COOH溶解在DCM中。添加0.01gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和0.02g二環(huán)己基碳二亞胺。使反應(yīng)混合物在攪拌下保持12小時。然后，用5mLDCM進(jìn)行稀釋，并且通過玻璃纖維膜進(jìn)行過濾。將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行濃縮，并添加400mL乙醚以使產(chǎn)物沉淀。將混合物在真空中進(jìn)行過濾，并收集固體產(chǎn)物(PEG2，32K-NHS)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將該固體產(chǎn)物在真空中干燥1小時。達(dá)到大于95％的活化度，以及大于90％的初始聚合物質(zhì)量的回收。實施例2.與PEG2，32K-NHS相綴合的EPO的獲得綴合反應(yīng)將6克PEG2，32K-NHS添加到在50mM硼酸鹽溶液(pH8.0)中以5mg/mL的初始濃度包含1grhEPO的溶液中。使反應(yīng)物體系在4℃下保持2小時，其中緩慢地進(jìn)行攪拌。通過用50mM硼酸(pH8.0)進(jìn)行稀釋直至0.9mg/mL的最終蛋白質(zhì)濃度來終止反應(yīng)。如在圖1中所顯示的，通過經(jīng)SDS-PAGE而獲得的凝膠的光密度分析法來測定反應(yīng)產(chǎn)率。總回收率大于40％，其中多PEG化的產(chǎn)物小于3％。單PEG化的EPO的純化為了將rhEPO與PEG的綴合反應(yīng)的產(chǎn)物分開，即將單PEG化的EPO與游離的EPO和二PEG化的EPO分開，設(shè)計了通過陰離子交換色譜法的純化方案。通過使用高度為12cm的裝填有Q-Sepharose的柱來進(jìn)行該分開過程。預(yù)先用22mL的0.2M氫氧化鈉溶液對凝膠進(jìn)行衛(wèi)生處理。通過33mL純化水，隨后通過33mL的50mM硼酸(pH8.0)的平衡溶液。施加在該平衡溶液中進(jìn)行稀釋直至0.9mg/mL的濃度的、來自綴合反應(yīng)的樣品。通過使用氯化鈉濃度從0.175M至0.5M漸增的相同的平衡緩沖液來順次進(jìn)行包含EPO與PEG2，32K-NHS的綴合物(PEG2，32K-EPO)的樣品的洗脫。體積流量為1.2mL/分鐘，和負(fù)載量為0.58mg蛋白質(zhì)/mL凝膠。該過程的回收率為40％的單PEG化的EPO，和純度為97％。實施例3.被活化為N-羥基琥珀酰亞胺酯的支化PEG(PEG2，40K-NHS)的獲得為了獲得PEG2，40K-NHS，依照在實施例1中所描述的操作程序，但在與賴氨酸的反應(yīng)的第二個步驟中使用PEG20K-SC。實現(xiàn)大于50％的總產(chǎn)率，其中活化度大于90％。實施例4.與PEG2，40K-NHS相綴合的EPO的獲得綴合反應(yīng)將6克PEG2，40K-NHS添加到在50mM硼酸鹽緩沖溶液(pH8.0)中以5mg/mL的初始濃度包含1grhEPO的溶液中。使反應(yīng)物體系在4℃下保持2小時，其中緩慢地進(jìn)行攪拌。通過用50mM硼酸(pH8.0)進(jìn)行稀釋直至0.9mg/mL的最終蛋白質(zhì)濃度來終止反應(yīng)。如在圖2中所顯示的，通過經(jīng)SDS-PAGE而獲得的凝膠的光密度分析法來測定反應(yīng)產(chǎn)率。總回收率大于40％，其中多PEG化的產(chǎn)物小于1％。單PEG化的EPO的純化為了將EPO與PEG的綴合反應(yīng)的產(chǎn)物分開，即將單PEG化的EPO與游離的EPO和二PEG化的EPO分開，設(shè)計了通過陰離子交換色譜法的純化方案。通過使用高度為12cm的裝填有Q-Sepharose的柱來進(jìn)行該分開過程。預(yù)先用22mL的0.2M氫氧化鈉溶液對凝膠進(jìn)行衛(wèi)生處理。通過33mL蒸餾水，隨后通過33mL的50mM硼酸(pH8.0)的平衡溶液。施加在該平衡溶液中進(jìn)行稀釋直至0.9mg/mL的濃度的、來自綴合反應(yīng)的樣品。通過使用氯化鈉濃度從0.175M至0.5M漸增的相同的平衡緩沖液來順次進(jìn)行包含EPO與PEG2，40K-NHS的綴合物(PEG2，40K-EPO)的樣品的洗脫。體積流量為1.2mL/分鐘，和負(fù)載量為0.58mg蛋白質(zhì)/mL凝膠。該過程的回收率為40％，并且獲得97％的純度。實施例5.經(jīng)PEG化的EPO的物理化學(xué)表征綴合物濃度的測定通過在分光光度計中測量在280nm處的吸光度來進(jìn)行測定。通過使用0.743的關(guān)于EPO的摩爾消光系數(shù)來進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的計算。通過凝膠過濾色譜法來進(jìn)行表征通過使用高效液相色譜法(HPLC)的泵和具有226nm濾波器的紫外線檢測器來進(jìn)行色譜法分開。施加質(zhì)量為100μg蛋白質(zhì)。用Superdex-200基質(zhì)來進(jìn)行所述色譜法。分析經(jīng)PEG化的EPO的兩種變化形式(PEG2，32K-EPO和PEG2，40K-EPO)和未修飾的EPO。在圖3中觀察到在對于每種變化形式所估計的分子量和所得的保留時間之間存在的對應(yīng)關(guān)系。以較短的保留時間洗脫出PEG2，40K-EPO綴合物，因為其具有較大的分子大?。浑S后洗脫出PEG2，32K-EPO綴合物；和最后洗脫出未修飾的EPO。實施例6.PEG2，32K-EPO綴合物的生物學(xué)表征通過紅細(xì)胞正常的小鼠的方法來進(jìn)行經(jīng)PEG化的EPO的效力的測定。按照三只動物/組，用0.2mL的不同稀釋度(300、450和600IU/mL，其相當(dāng)于3、4.5和6μg/小鼠)的PEG2，40K-EPO和PEG2，32K-EPO樣品、參考材料(作為陽性對照)以及陰性對照(僅稀釋劑)通過皮下途徑對處女雌性B6D2F1系小鼠(16-18g)進(jìn)行接種。另外還使用兩只動物，向其接種50mM硼酸鹽緩沖溶液(pH8.0)，以便評價其毒性。在接種72小時后，通過眶后途徑抽取每只動物的血液樣品，并放置在包含4μL肝素鈉(5000IU)的小瓶中。取40μL外周血，并將其與120μL由0.3mM亞甲藍(lán)、1.29mM檸檬酸鈉、5mL生理鹽水和10mL蒸餾水構(gòu)成的溶液相混合，并且將其在37℃的水浴中溫育1小時。之后，通過用由0.08mMEDTA四鈉、0.15mM氯化銨和9.98mM碳酸氫鈉構(gòu)成的裂解溶液進(jìn)行處理來實施選擇性溶血6分鐘。通過用生理鹽水進(jìn)行過度稀釋來終止紅細(xì)胞裂解，并在Neubauer計數(shù)池中以目視方式對網(wǎng)織紅細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。通過使用模式的和未知形式的平行線的隨機設(shè)計來進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和效力計算，以在α＝0.05的顯著性水平下檢測線性和平行性的有效性。所獲得的值必須符合歐洲藥典的規(guī)定，所述歐洲藥典規(guī)定，基于該假設(shè)而計算出的效力的關(guān)聯(lián)性值(以百分比表示)不應(yīng)當(dāng)?shù)陀?0％，也不應(yīng)當(dāng)高于125％，并且所計算出的效力的置信界限應(yīng)當(dāng)位于在64％和156％之間的范圍內(nèi)。在圖4中觀察到從網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)實驗中直接獲得的數(shù)據(jù)的圖，在所述實驗中施用漸增的量(以“IU的效力”測量的)的EPO。應(yīng)用用于比較平均值的Tukey-Kramer統(tǒng)計學(xué)檢驗，以便分析體內(nèi)活性值。所述數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析證明，在所述值之間沒有顯著差異(P＜0.05)。在經(jīng)PEG化的EPO和用作陽性對照的未修飾的EPO之間的生物學(xué)活性的差異位于該測定法的變化范圍之內(nèi)(±50％)。重要的是強調(diào)，用于實施該測定法的劑量為300、450和600IU的效力。這些是已被確立用于檢測天然EPO的生物學(xué)活性的劑量，然而使用Amgen公司的產(chǎn)品(MirceraTM，其為綴合至分子量為30kDa的線性聚合物結(jié)構(gòu)的EPO(PEG1，30K-EPO))來進(jìn)行的測定法所需要的最小劑量為6000IU的效力。但是，在本發(fā)明中所進(jìn)行的測定法之中，以低20倍的劑量，檢測到了經(jīng)PEG化的EPO的體內(nèi)生物學(xué)活性。實施例7.對于蛋白酶降解的抗性為了驗證不同PEG-EPO分子對于蛋白酶降解的抗性，進(jìn)行了體外實驗，在該體外實驗中用胰蛋白酶消化經(jīng)PEG化的EPO和天然蛋白質(zhì)(作為對照)。EPO的所述兩種經(jīng)PEG化的變化形式均顯示出比天然EPO更強的對于蛋白酶降解的抗性。在圖5中顯示了用作對照的EPO以及兩種經(jīng)PEG化的變化形式即PEG2，32K-EPO和PEG2，40K-EPO的降解動力學(xué)結(jié)果?？梢杂^察到，經(jīng)PEG化的EPO的所述兩種變化形式呈現(xiàn)出比天然EPO更強的對于蛋白酶降解的抗性。實施例8.PEG2，32K-EPO綴合物的藥物代謝動力學(xué)通過比較未修飾的EPO、PEG2，32K-EPO綴合物、PEG2，40K-EPO綴合物和PEG1，30K-EPO綴合物來進(jìn)行藥物代謝動力學(xué)研究。使用重2kg的新西蘭品系的兔子。半衰期(t1/2)、曲線下面積(縮寫為AUC)和平均停留時間(縮寫為MRT)的結(jié)果顯示在表1中。表1.EPO、PEG2，32K-EPO綴合物、PEG2，40K-EPO綴合物和PEG1，30K-EPO綴合物的比較藥物代謝動力學(xué)。可以看出，所有經(jīng)PEG化的EPO具有比未修飾的EPO更長的半衰期。PEG2，32K-EPO綴合物的半衰期比用PEG1，30K-EPO所獲得的半衰期長得多(2.4倍)?？紤]到這兩種綴合物具有非常相似的分子大小，該結(jié)果是出人意料的。該不對稱支化分子還具有比PEG2，40K-EPO綴合物(其也是支化的并且具有更大的分子量)更長的半衰期，這也未預(yù)料到。實施例9.不同EPO綴合物的藥物代謝動力學(xué)結(jié)果的比較通過比較下列綴合物來進(jìn)行藥物代謝動力學(xué)研究：PEG2，32K-EPO綴合物，其具有一個分子量為12kDa的分枝和另一個分子量為20kDa的分枝；綴合至不對稱PEG結(jié)構(gòu)的EPO，所述不對稱PEG結(jié)構(gòu)具有一個分子量為5kDa的分枝和另一個分子量為7kDa的分枝(PEG2，12K-EPO)；EPO與對稱結(jié)構(gòu)的綴合物，所述對稱結(jié)構(gòu)具有兩個各為7kDa的分枝(PEG2，14K-EPO)；以及EPO與分子量為12kDa的線性PEG的綴合物(PEG1，12K-EPO)。為了實施該研究，以與PEG2，32K-EPO綴合物類似的方式來獲得PEG2，12K-EPO綴合物，但使用具有更低分子量的mPEG。以與PEG2，40K-EPO綴合物類似的方式來獲得PEG2，14K-EPO綴合物，但使用具有更低分子量的mPEG。通過如下方式來獲得PEG1.12K-EPO綴合物：如在實施例1的開始部分所描述的，活化分子量為12kDa的mPEG；隨后，如在實施例2中所描述的，進(jìn)行與rhEPO的綴合。為了進(jìn)行比較，使用重2kg的新西蘭品系的兔子。結(jié)果顯示在表2中。本發(fā)明的綴合物(PEG2，32K-EPO)顯示出具有比其余所分析的綴合物更長的半衰期。表2.不同EPO綴合物的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)。實施例10.不同EPO綴合物的生物學(xué)活性的比較以與在實施例6中所描述的類似的方式來測量所述綴合物的生物學(xué)活性。比較對于下列綴合物所獲得的結(jié)果：(1)PEG2，32K-EPO；(2)PEG2，12K-EPO；(3)PEG2，14K-EPO；和(4)PEG1，12K-EPO。作為對照，使用未修飾的rhEPO。在圖6中可以觀察到，本發(fā)明的綴合物(PEG2，32K-EPO)保持了未修飾的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，這與其余所分析的綴合物不同，在其余所分析的綴合物中生物學(xué)活性在PEG化發(fā)生時降低。實施例11.藥物代謝動力學(xué)研究，其中使用形成PEG2，32K-EPO綴合物的兩個不對稱分枝的mPEG的分子量極限由于PEG是多分散的并且用于形成不對稱PEG結(jié)構(gòu)即PEG2，32K的起始材料可能與12kDa和20kDa的分子量的理論值有變化，因而進(jìn)行EPO與分子量為29kDa(PEG2，29K-EPO)和35kDa(PEG2，35K-EPO)的不對稱PEG結(jié)構(gòu)的綴合物的藥物代謝動力學(xué)研究。這些是形成為本發(fā)明的EPO綴合物的一部分的PEG的總分子量的界限。以與PEG2，32K-EPO綴合物相同的方式來獲得PEG2，29K-EPO綴合物和PEG2，35K-EPO綴合物。使用重2kg的新西蘭品系的兔子。結(jié)果顯示在表3中。正如可以看出的，在所研究的綴合物變化形式中，在藥物代謝動力學(xué)參數(shù)方面沒有差異。表3.有著具有不同分子量的PEG的綴合物的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的結(jié)果。參數(shù)PEG2，32K-EPOPEG2，29K-EPOPEG2，35K-EPOt1/2(小時)165.93+/-74.41159.24+/-19.84174.01+/-25.66AUC(IU/mL·小時)83.59+/-44.6379.76+/-21.6785.55+/-34.75MRT(小時)238.94+/-12.05243.42+/-18.54235.34+/-12.43當(dāng)前第1頁1 2 3