本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，特別涉及特利加壓素脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：特利加壓素為三甘氨酰基賴氨酸加壓素醋酸鹽，是一種新型人工合成的血管加壓素類似物。二十世界八十年代初由瑞典輝凌公司生產(chǎn)上市，為加壓素的前體藥物，在注射入血液后分子中的甘氨?；幻复呋舛a(chǎn)生持續(xù)低水平的加壓素。其化學(xué)名稱為n-α-三甘氨酰-8-賴氨酸-加壓素，其結(jié)構(gòu)如式ⅰ所示：主要用于肝硬化靜脈曲張出血的止血，現(xiàn)臨床廣泛應(yīng)用于肝腎綜合征、肝硬化腹水、感染性休克、燒傷、急性肝功能衰竭、心臟驟停等的治療。目前市場上的翰唯，起始注射用量為2mg。每1mg注射粉針劑用5ml氯化鈉注射液溶解，緩慢進(jìn)行靜脈注射(超過1分鐘)，同時(shí)對血壓及心率觀測。維持劑量為每4小時(shí)靜脈給藥1-2mg，延續(xù)24-36小時(shí)，直至出血得到控制。蛋白多肽類藥物分子質(zhì)量大，穩(wěn)定性差，生物利用度低，體內(nèi)生物半衰期短，極易被生物體內(nèi)的酶分解等缺點(diǎn)，使他們在治療學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到局限。由于特利加壓素半衰期短，現(xiàn)有技術(shù)通過把藥物制備成長循環(huán)脂質(zhì)體，克服普通注射劑，但是普通脂質(zhì)體在體內(nèi)作用時(shí)間較短。因此提供一種特利 加壓素脂質(zhì)體及其制備方法，以延長其半衰期，提高緩釋效果具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種特利加壓素脂質(zhì)體及其制備方法。本發(fā)明提供的脂質(zhì)體通過調(diào)節(jié)處方可以獲得釋放更為緩慢的處方，延長在體內(nèi)外作用時(shí)間。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)由于特利加壓素等電點(diǎn)偏堿性，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)體內(nèi)部ph，使內(nèi)部ph呈弱堿性，藥物在弱堿性條件下沉積，藥物能夠緩慢釋放，從而達(dá)到更好的緩釋效果。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種特利加壓素脂質(zhì)體，其內(nèi)水相的ph值為7.9～8.9。在脂質(zhì)體中，必要成分磷脂和特利加壓素是在水相中形成磷脂雙層從而構(gòu)成脂質(zhì)體的，本發(fā)明中，對構(gòu)成水相的溶液不加特別限制，例如可以采用等滲或者非等滲的藥物成分的水溶液、緩沖液、生理鹽水、葡萄糖水溶液等。水溶液中也可以加入其它生理活性物質(zhì)如氨基酸、維生素等。均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述特利加壓素脂質(zhì)體的內(nèi)水相和/或外水相包括單糖、低聚糖、水溶性多糖、二元醇、小分子多元醇、高分子多元醇、有機(jī)酸、氨基酸、pbs磷酸緩沖鹽溶液、氯化鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、硫酸銨中的一種或兩者以上的混合物。磷脂是構(gòu)成脂質(zhì)體脂質(zhì)雙層的必須物質(zhì)，是完成本發(fā)明目的的必須成分。作為用來形成脂質(zhì)體的磷脂類物質(zhì)，只要可以形成脂質(zhì)雙層，可以使用任何天然或者合成的磷脂類物質(zhì)，也可以使用一種磷脂類物質(zhì)或者多種磷脂類物質(zhì)的混合物。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述特利加壓素脂質(zhì)體的脂質(zhì)包括磷脂，所述磷脂為peg化磷脂(dspe-peg，peg-pe)中的一種或兩者以上的混合物。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述特利加壓素脂質(zhì)體的所述單糖選自赤蘚糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或果糖；所述低聚糖選自蔗糖、麥芽糖、乳糖、乳果糖、海藻糖、麥芽三塘和環(huán)糊精；所述水溶性多糖選自水溶性糊精、纖維素或淀粉的衍生物；所述二元醇、所述小分子多元醇選自乙二醇、丙二醇、甘油、木糖醇、山梨醇或甘露醇中的一種或兩者以上的混合物；所述高分子多元醇為聚乙二醇或其可藥用的衍生物、聚乙烯醇。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述特利加壓素脂質(zhì)體中所述所述peg化磷脂(dspe-peg)為磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇衍生物中的一種或兩者以上的混合物。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述特利加壓素脂質(zhì)體中所述peg化磷脂(dspe-peg)選自dspe-peg-2000，dspe-peg-5000，dspe-peg1000-nhs，peg-pe。均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述特利加壓素與所述脂質(zhì)的質(zhì)量比為1:(10～100)。優(yōu)選1:(10～30)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中中脂質(zhì)還包括膽固醇；所述膽固醇與所述磷脂的質(zhì)量比為1:(1～10)。優(yōu)選1:(1～3)。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述特利加壓素脂質(zhì)體的有機(jī)相中所述磷脂在有機(jī)溶劑中的濃度為10～100mg/ml；所述有機(jī)溶劑選自氯仿、丙酮、氯仿或乙醚。優(yōu)選氯仿或乙醚。在本發(fā)明中，pbs磷酸鹽緩沖液，其成分包括磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，磷酸氫二鉀合磷酸二氫鉀。本發(fā)明還提供了所述特利加壓素脂質(zhì)體，包括如下步驟：制備獲得含有特利加壓素的水相，調(diào)整ph值為7.9～8.9；制備獲得含有脂質(zhì)的有機(jī)相；取所述水相與所述有機(jī)相混合，制備獲得w/o初乳，干燥，純化。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，制備獲得w/o初乳的方法包括超聲、高速分散、乳勻機(jī)、噴嘴霧化等方法。實(shí)驗(yàn)室制備常采用高速分散器或渦旋混合器乳化；w/o初乳在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥，除去有機(jī)溶劑，加入適于儲存和生理上可以接受的鹽溶液，除去脂質(zhì)體中游離藥物，有凝膠過濾法，透析 法，超速離心法，超濾法，微柱離心法等。最后通過超濾或透析膜除去脂質(zhì)體中的游離藥物。脂質(zhì)體是由磷脂和其它兩親性物質(zhì)分散于水中，由一層或多層同心的脂質(zhì)雙分子膜包封而成的球狀體。最早由rahman等人將脂質(zhì)體作為藥物載體應(yīng)用。脂質(zhì)體常用制備方法主要有薄膜分散法，反相蒸發(fā)法，注入法，超聲波分散等，但是對于蛋白多肽，要獲得較高的包封率，逆向蒸發(fā)法可以獲得較高的包封率，薄膜分散法等。反相蒸發(fā)法最初由szoka提出，制備方法主要將磷脂等膜材溶于有機(jī)溶劑中，短時(shí)超聲振蕩，直至形成穩(wěn)定的w/o乳液，然后減壓蒸發(fā)除掉有機(jī)溶劑，達(dá)到膠態(tài)后，滴加緩沖鹽，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使器壁上的凝膠脫落，然后在減壓下繼續(xù)蒸發(fā)，制得水性混懸液，除去未包入的藥物，即得大單層脂質(zhì)體。此法可包裹較大的水容積，一般適用于包封水溶性藥物，大分子生物活性物質(zhì)等。本發(fā)明提供的脂質(zhì)體，磷脂可以選擇，，peg化磷脂(dspe-peg)如磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇衍生物等或其組合，內(nèi)水相/外水相可以選擇蔗糖，甘露醇，乳糖，山梨醇，葡萄糖，檸檬酸，氯化鈉，精氨酸，賴氨酸，pbs緩沖鹽等；還可以選擇性加入或不加調(diào)節(jié)脂質(zhì)體磷脂雙分子層膜流動性的膽固醇。普通脂質(zhì)體進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，未經(jīng)修飾的脂質(zhì)體大部分運(yùn)轉(zhuǎn)至肝臟和脾臟等單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(mps)豐富的部位，少量被肺，骨髓及腎攝?。欢渭?xì)胞膜受體對直接暴露于表面的磷脂負(fù)電基進(jìn)行識別，因而首先被肝細(xì)胞吞噬，因此大部分脂質(zhì)體在到達(dá)靶部位之前已被吞噬，無法在靶部位達(dá)到有效的治療濃度。聚乙二醇的加入可有效改善這一問題。長循環(huán)脂質(zhì)體由于表面peg層的存在，可增強(qiáng)脂質(zhì)體膜的親水性，減少血漿蛋白與脂質(zhì)體膜的相互作用，阻止脂質(zhì)體的凝聚說融合，可在一定程度上避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對脂質(zhì)體的攝取，使得脂質(zhì)體在體內(nèi)具有較長的半衰期。阿霉素長循環(huán)脂質(zhì)體得以發(fā)展的基礎(chǔ)正是peg化長循環(huán)脂質(zhì)體的應(yīng)用。由于脂質(zhì)體的組成中含有peg-dspe，作用是阻止血漿蛋白吸附于脂質(zhì)體的表面，從而減少mps的攝取。本發(fā)明提供了一種特利加壓素脂質(zhì)體，其內(nèi)水相的ph值為7.9～8.9。使用該脂質(zhì)體制劑解決了藥物作用時(shí)間短的缺點(diǎn)。特利加壓素等電點(diǎn)偏堿性，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)體內(nèi)部ph值，使內(nèi)部ph呈弱堿性，藥物在弱堿性條件下沉積，藥物能夠緩慢釋放，從而達(dá)到更好的緩釋效果。本發(fā)明提供的脂質(zhì)體后可以維持較長作用時(shí)間，血藥濃度平穩(wěn)，不良反應(yīng)發(fā)生率低。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種特利加壓素脂質(zhì)體及其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明旨在提供一種能有效延長特利加壓素在體內(nèi)釋放時(shí)間的脂質(zhì)體，該組合物含有活性成分特利加壓素，通過選擇合適的處方和工藝獲得適合病人需求的組合物。本發(fā)明提供的脂質(zhì)體，磷脂可以選擇等或其組合；peg化磷脂(dspe-peg)如磷脂酰乙醇胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇衍生物等或其組合，如dspe-peg-2000，dspe-peg-5000，dspe-peg1000-nhs等；內(nèi)水相/外水相可以選擇蔗糖，甘露醇，乳糖，山梨醇，葡萄糖，檸檬酸，氯化鈉，精氨酸，賴氨酸，pbs緩沖鹽，氫氧化鈉，碳酸氫鈉，碳酸鈉，硫酸胺等；還可以選擇性加入或不加調(diào)節(jié)脂質(zhì)體磷脂雙分子層膜流動性的膽固醇。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的脂質(zhì)體處方，藥脂比從1：10到1：100，特別優(yōu)選的是1：10到1：30；膽固醇與磷脂的質(zhì)量比為1：10到1：1，特別優(yōu)選的是1：3到1：1；磷脂在有機(jī)溶劑中的用量為10mg/ml到100mg/ml；有機(jī)溶劑可以使用氯仿，丙酮，氯仿，乙醚等，優(yōu)選的是氯仿，乙醚或其組合。主要通過以下技術(shù)放案實(shí)現(xiàn)：制備工藝過程一般包括：含有藥物的水相與脂質(zhì)的有機(jī)相混合制備w/o初乳，有機(jī)相中的有機(jī)溶劑一般采用易揮發(fā)的溶劑，通常為氯仿或氯仿與乙醚的混合液。脂質(zhì)為磷脂、膽固醇等。制備初乳的方法可以從制備乳劑的方法中選擇，包括超聲、高速分散、乳勻機(jī)、噴嘴霧化等方法。實(shí)驗(yàn)室制備常采用高速分散器或渦旋混合器乳化；w/o初乳在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥，除去有機(jī)溶劑，加入適于儲存和生理上可以接受的鹽溶液，除去脂質(zhì)體中游離藥物，注意有凝膠過濾法，透析法，超速離心法，超濾法，微柱離心法等。最后通過超濾或透析膜除去脂質(zhì)體中的游離藥物。本發(fā)明提供了一種特利加壓素脂質(zhì)體，其內(nèi)水相的ph值為7.9～8.9。使用該脂質(zhì)體制劑解決了藥物作用時(shí)間短的缺點(diǎn)。特利加壓素等電點(diǎn)偏堿性，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)體內(nèi)部ph值，使內(nèi)部ph呈弱堿性，藥物在弱堿性條件下沉積，藥物能夠緩慢釋放，從而達(dá)到更好的緩釋效果。本發(fā)明提供的脂質(zhì)體后可以維持較長作用時(shí)間，血藥濃度平穩(wěn)，不良反應(yīng)發(fā)生率低?？s寫及英文對應(yīng)的含義請見表1：表1縮寫及英文含義縮寫及英文含義dspe-peg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇peg-pe磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇hspc氫化磷脂spc大豆磷脂本發(fā)明提供的特利加壓素脂質(zhì)體及其制備方法中所用原料及試劑均可由市場購得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1：將藥物特利加壓素500mg溶于20ml水相中得到含有活性成分的水相；dspe-peg20002g溶于氯仿20ml(油相)中，置圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相；加入水相，由碳酸氫鈉與氫氧化鈉配制得ph在8.0之間，渦旋得到粗略的脂質(zhì)體，先均質(zhì)再通過0.22μm的濾膜，使用透析膜法除去游離的水相，即得到藥物的脂質(zhì)體溶液。實(shí)施例2：將藥物特利加壓素5mg溶于20ml水相中得到含有活性成分的水相；peg-pe2g、膽固醇1g溶于氯仿20ml(油相)中，置圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相；加入水相，由硫酸銨與氫氧化鈉，蔗糖配制的ph在8.4～8.5之間，渦旋得到粗略的脂質(zhì)體，先均質(zhì)再通過0.22μm的濾膜，使用透析膜法除去游離的水相，即得到藥物的脂質(zhì)體溶液。實(shí)施例3：將藥物特利加壓素5mg溶于20ml水相中得到水相；dspe-peg20002g、膽固醇1g溶于氯仿20ml(油相)中，置圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相；加入水相，由碳酸鈉與檸檬酸配制的ph在7.9～8.0之間，渦旋得到粗略的脂質(zhì)體，先均質(zhì)再通過0.22μm的濾膜，使用透析膜法除去游離的水相，即得到藥物的脂質(zhì)體溶液。實(shí)施例4：將藥物特利加壓素5mg溶于20ml水相中得到含有活性成分的水相；dspe-peg20002g、膽固醇1g溶于氯仿20ml(油相)中，置圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相；加入水相，由硫酸銨與氫氧化鈉配制的ph在8.8～8.9之間，渦旋得到粗略的脂質(zhì)體，先均質(zhì)再通過0.22μm的濾膜，使用透析膜法除去游離的水相，即得到藥物的脂質(zhì)體溶液。實(shí)施例5：將藥物特利加壓素5mg溶于20ml水相中得到含有活性成分的水相；dspe-peg20002g、膽固醇1g溶于氯仿20ml(油相)中，置圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相；加入水相，由硫酸銨與氫氧化鈉配制得ph在8.0～8.5之間，渦旋得到粗略的脂質(zhì)體，先均質(zhì)再通過0.22μm的濾膜，使用透析膜法除去游離的水相，即得到藥物的脂質(zhì)體溶液。對比例1：將藥物特利加壓素5mg溶于20ml水相中得到含有活性成分的水相，dspe-peg20002g、膽固醇1g溶于氯仿20ml(油相)中，置圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相，加入水相，由硫酸銨與氫氧化鈉配制得ph在7.0～7.1之間，渦旋得到粗略的脂質(zhì)體，先均質(zhì)再通過0.22μm的濾膜，使用透析膜法除去游離的水相，即得到藥物的脂質(zhì)體溶液。對比例2：將藥物特利加壓素5mg溶于20ml水相中得到含有活性成分的水相，dspe-peg20002g、膽固醇1g溶于氯仿20ml(油相)中，置圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相，加入水相，由硫酸銨與氫氧化鈉配制的ph在10.2～10.3之間，渦旋得到粗略的脂質(zhì)體，先均質(zhì)再通過0.22μm的濾膜，使用透析膜法除去游離的水相，即得到藥物的脂質(zhì)體溶液。對比例3：將藥物特利加壓素50mg溶于30ml水相中得到含有活性成分的水相；大豆磷脂3g、膽固醇3g溶于氯仿-乙醚(1：1)30ml(油相)中，置圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相；加入水相，由硫酸銨與氫氧化鈉配制得ph在7.5之間，渦旋得到粗略的脂質(zhì)體，先通過均質(zhì)機(jī)縮小粒徑，使用超濾法除去游離的水相，再通過0.22μm的濾膜，即得到藥物的脂質(zhì)體溶液。對比例4：將藥物特利加壓素300mg溶于20ml水相中得到含有活性成分的水相；氫化磷脂3g、膽固醇1g溶于氯仿20ml(油相)中，置圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相；加入水相，由硫酸銨與氫氧化鈉配制得ph在9.2之間，渦旋得到粗略的脂質(zhì)體，先均質(zhì)再通過0.22μm的濾膜，使用透析膜法除去游離的水相，即得到藥物的脂質(zhì)體溶液。實(shí)施例10：藥物釋放度的檢測取得到的脂質(zhì)體置于具塞試管中，加入4ml含0.01％nan3的人血漿，固定于溶出儀的攪拌漿上并浸入溶出杯的水液中，水液溫度保持37℃，攪拌漿100rpm轉(zhuǎn)動。于設(shè)定的時(shí)間取樣0.5ml，所得樣品加入4.5ml生理鹽水，10000*g離心10min，棄去上清液，沉淀溶于適量酸化甲醇中，過濾后，hplc測定，即得各時(shí)間點(diǎn)脂質(zhì)體中未釋放的藥物量，以下式計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的藥物釋放百分?jǐn)?shù)：藥物釋放(％)＝(包封于脂質(zhì)體中的總藥物量-未釋放的藥物量)/包封于脂質(zhì)體中的藥物量×100％。檢測結(jié)果見表2：表2：不同實(shí)施例制備的樣品的釋放度結(jié)論：從表1可以看出使用dspe-peg，氫化磷脂，大豆磷脂制備的脂質(zhì)體釋放時(shí)間依次縮短，氫化磷脂剛性交普通磷脂強(qiáng)，藥物不容易從囊中泄露有關(guān)，而dspe-peg相對較長，可能與dspe-peg是兩親型聚合物，在脂質(zhì)體表面交錯(cuò)覆蓋成致密的構(gòu)象云，形成較厚的立體位阻層從而比較穩(wěn)定有關(guān)，而在脂質(zhì)體內(nèi)水相呈弱堿性條件下，脂質(zhì)體釋放時(shí)間更加延長，從實(shí)施例1-5說明只有內(nèi)水相的ph值在一定范圍內(nèi)才有較好的緩釋效果，對比實(shí)施例1與2可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)水相的ph值為7.9～8.9之間具有較好的緩釋效果。證明了發(fā)明者的思路，即由于特利加壓素本身呈堿性，內(nèi)水相呈堿性，藥物呈沉淀沉降，從而緩慢釋放。實(shí)施例11：體內(nèi)血藥濃度的測定體內(nèi)血藥濃度：取大鼠108只，隨機(jī)分成9組，每組各12只，分別靜脈注射給予按實(shí)施例1～5、對比例1～4樣品，然后在給藥后分別于0.5d，1d，2d，4d，8d采血，體外肝素抗凝，以8000r.min-1離心血漿，低溫保存。取血漿至離心管中，加入甲醇沉淀蛋白，渦旋混合后離心，將上清液用乙腈溶劑后，進(jìn)樣，用hplc測定血藥濃度。結(jié)果見表3:表3：不同樣品的大鼠體內(nèi)動物數(shù)據(jù)從表3結(jié)果可以看出，實(shí)施例1樣品在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間(2d)相對實(shí)施例4(4d)較短，實(shí)施例2的血藥濃度較為平緩，即實(shí)施例2釋放時(shí)間較長，提示在實(shí)施例2中加入通過調(diào)節(jié)ph具有一定的阻礙活性成分遷移的作用，從而達(dá)峰濃度較低，釋放時(shí)間更長，即有緩釋釋放效果。對比例3和對比例4也證明了氫化磷脂較普通磷脂有相對較長的釋放時(shí)間，但均較dspe-peg較快，實(shí)施例1-5說明只有內(nèi)水相的ph值在為7.9～8.9之間具有較好的緩釋效果，對比實(shí)施例1與2也佐證了這個(gè)發(fā)明。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12