本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種三七皂苷Fc的制藥用途。

背景技術(shù)：

血栓形成(thrombosis)是指在一定條件下血液中的有形成分在血管(多數(shù)為小血管)形成栓子，導(dǎo)致血管部分或全部堵塞、相應(yīng)組織器官血供障礙的病理過程。依其組成成分，血栓可分為：血小板血栓、紅細(xì)胞血栓、纖維蛋白血栓、混合血栓等四種。按形成血栓的血管種類，血栓又可分為動(dòng)脈性血栓、靜脈性血栓以及毛細(xì)血管性血栓。

血栓栓塞(thromboembolism)是指血栓從其形成部位脫落，在隨血液流動(dòng)的過程中部分或全部堵塞某些血管，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)組織器官缺血、缺氧、壞死(動(dòng)脈血栓)和/或瘀血水腫(靜脈血栓)的病理過程。

以上兩種病理過程所引發(fā)的疾病，臨床上通稱為血栓性疾病。本病的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚未完全明確，但近年的研究表明，血栓性疾病的發(fā)生、發(fā)展主要與下列兩種因素有關(guān)：

一、血小板數(shù)量增加，活性增強(qiáng)。各種導(dǎo)致血小板數(shù)量增加、活性增強(qiáng)的因素，均有誘發(fā)、促進(jìn)血栓性疾病發(fā)生的可能性，如血小板增多癥、機(jī)械、化學(xué)、生物及免疫反應(yīng)等導(dǎo)致的血小板破壞加速等。目前認(rèn)為，血小板因素在動(dòng)脈血栓形成(如心肌梗死)的發(fā)病中具有更為重要的地位。

二、血液凝固性增高。在多種生理及病理狀態(tài)下，人體的凝血活性可顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為某些凝血因子水平升高或活性增加，如妊娠、高齡及創(chuàng)傷感染等所致的應(yīng)激反應(yīng)以及高脂血癥、惡性腫瘤等。而血液的高凝狀態(tài)正是血栓性疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。

三七皂苷Fc(Notoginsenoside Fc)是一種天然的皂苷類化合物，主要存在于三七中。研究發(fā)現(xiàn)，三七皂苷具有降血脂、抗腫瘤、抗氧化等作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的旨在提供一種三七皂苷Fc的新的醫(yī)藥用途。

本發(fā)明提供了一種三七皂苷Fc在制備治療血管閉塞性缺血的藥物組合物上應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種三七皂苷Fc在制備治療血管閉塞性下肢缺血的藥物組合物上應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種三七皂苷Fc在制備治療或預(yù)防閉塞性脈管炎的藥物組合物的應(yīng)用

本發(fā)明提供了一種三七皂苷Fc在制備治療脈管炎的藥物組合物上應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種三七皂苷Fc在制備治療或預(yù)防心肌缺血或心肌梗死的藥物組合物的應(yīng)用。

具體地說，本發(fā)明提供了一種三七皂苷Fc在制備血小板聚集抑制劑中的應(yīng)用。三七皂苷Fc的濃度為0.1-40μM,優(yōu)選13.5μM。

本發(fā)明的第二方面是提供了一種三七皂苷Fc在制備凝血抑制劑中的應(yīng)用，三七皂苷Fc的濃度為1-240mg/ml，優(yōu)選，80mg/ml。

本發(fā)明的第三方面是提供了一種治療或預(yù)防血栓性疾病的藥物組合物，它包含治療有效量的三七皂苷Fc，三七皂苷Fc的濃度為1-24mg/kg，優(yōu)選，8.1mg/kg。血栓性疾病是:動(dòng)脈性血栓、靜脈性血栓以及毛細(xì)血管性血栓等。

本發(fā)明的第四方面是提供了一種治療或預(yù)防心肌缺血的藥物組合物，它包含治療有效量的三七皂苷Fc，三七皂苷Fc的濃度為1-36mg/kg，優(yōu)選12mg/kg。

本發(fā)明的第五方面是提供了一種治療或預(yù)防心肌梗死的藥物組合物，它包含治療有效量的三七皂苷Fc，三七皂苷Fc的濃度為1-36mg/kg，優(yōu)選12mg/kg。

本發(fā)明的第五方面是提供了了一種三七皂苷Fc在制備治療血管閉塞性下肢缺血的藥物上應(yīng)用，三七皂苷Fc的濃度為0.1-240mg/ml，優(yōu)選，40mg/ml。

附圖說明

圖1三七皂苷Fc對(duì)血小板聚集率的影響

圖2三七皂苷Fc對(duì)血小板聚集率的量效關(guān)系

圖3 Fc對(duì)整體動(dòng)物血小板聚集率的影響

圖4 Fc對(duì)大鼠斷尾凝血時(shí)間影響

圖5 Fc對(duì)大鼠活化部分凝血活酶時(shí)間的影響

圖6 Fc對(duì)人類凝血四項(xiàng)指標(biāo)的影響

圖7 Fc對(duì)人類凝血四項(xiàng)指標(biāo)的影響

圖8 Fc對(duì)大鼠急性心肌梗死面積百分比的影響

圖9大鼠心肌梗死手術(shù)空白組病理圖片

圖10大鼠心肌梗死假手術(shù)組病理圖片

圖11大鼠心肌梗死陽(yáng)性藥組(4.1mg/kg)病理圖片

圖12大鼠心肌梗死給藥組(4mg/kg)病理圖片

圖13大鼠心肌梗死給藥組(12mg/kg)病理圖片

圖14第一天手術(shù)后，F(xiàn)c處理組激光多普勒血流變化圖。

圖15第四天手術(shù)后，F(xiàn)c處理組激光多普勒血流變化圖。

圖16第八天手術(shù)后，F(xiàn)c處理組激光多普勒血流變化圖。

圖17第十六天手術(shù)后，F(xiàn)c處理組激光多普勒血流變化圖。

圖18手術(shù)后第二十六天后，F(xiàn)c處理組手術(shù)肢已恢復(fù)到正常肢的43％。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的問世部分是基于這樣一個(gè)意外發(fā)現(xiàn)：三七皂苷Fc可以明顯抑制大鼠的血小板聚集，延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間。因此，三七皂苷Fc有望開發(fā)成為一種抑制血小板聚集的物質(zhì)即血小板聚集抑制劑和/或一種抑制凝血的物質(zhì)即凝血抑制劑，所述“血小板聚集抑制劑”和“凝血抑制劑”可以是各種形式的物質(zhì)，包括但不限于：藥物、保健品、食品、日用品等等。用三七皂苷Fc制備的這些“血小板聚集抑制劑”和“凝血抑制劑”可用于防治各種血栓性疾病如動(dòng)脈性血栓、靜脈性血栓以及毛細(xì)血管性血栓等。

進(jìn)而，本發(fā)明提供了三七皂苷Fc在制備血小板聚集抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了三七皂苷Fc在制備凝血抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種治療血栓性疾病的藥物組合物，它包含治療有效量的三七皂苷Fc。

較優(yōu)選的，所述血栓性疾病為血小板聚集功能亢進(jìn)或高凝血癥。

本發(fā)明還提供了三七皂苷Fc在制備治療血管閉塞性缺血的藥物組合物上應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了三七皂苷Fc在制備治療血管閉塞性下肢缺血的藥物組合物上應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了三七皂苷Fc在制備治療脈管炎的藥物組合物上應(yīng)用。

本發(fā)明提供了三七皂苷Fc在制備治療或預(yù)防閉塞性脈管炎的藥物組合物的應(yīng)用

本發(fā)明的三七皂苷Fc(Notoginsenoside Fc)的分子式為：C₅₈H₉₈O₂₆，分子量為：1210.63，其結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明的三七皂苷Fc可通過商業(yè)途徑從Sigma化學(xué)公司、成都曼斯特生物科技有限公司等處購(gòu)買獲得，或者用本領(lǐng)域的常規(guī)方法從三七皂苷中分離獲得。其純度均符合藥用標(biāo)準(zhǔn)。

以將本發(fā)明的三七皂苷Fc制成藥物為例。本發(fā)明的三七皂苷Fc可以單獨(dú)使用或以藥物組合物的形式使用。藥物組合物包括作為活性成分的本發(fā)明的三七皂苷Fc及可藥用載體。較佳地，本發(fā)明的藥物組合物含有0.1-99.9％重量百分比的作為活性成分的本發(fā)明的三七皂苷Fc?！翱伤幱幂d體”不會(huì)破壞本發(fā)明的三七皂苷Fc的藥學(xué)活性，同時(shí)其有效用量，即能發(fā)揮藥物載體作用時(shí)的用量對(duì)人體無毒。

所述可藥用載體包括但不限于：軟磷脂、硬脂酸鋁、氧化鋁、離子交換材料、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)、吐溫或其他表面活化劑、血清蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅酸鎂、飽和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

其他常用的藥物輔料如粘合劑(如微晶纖維素)、填充劑(如淀粉、葡萄糖、無水乳糖和乳糖珠粒)、崩解劑(如交聯(lián)PVP、交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素)、潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂)以及吸收促進(jìn)劑、吸附載體、香味劑、甜味劑、賦形劑、稀釋劑、潤(rùn)濕劑等。

本發(fā)明的三七皂苷Fc以及其藥物組合物可按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備并可以通過腸道或非腸道或局部途徑給藥?？诜苿┌z囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等；非腸道給藥制劑包括注射液等；局部給藥制劑包括霜?jiǎng)?、貼劑、軟膏劑、噴霧劑等。優(yōu)選為口服制劑。

本發(fā)明的三七皂苷Fc以及其藥物組合物的給藥途徑可以為口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或皮下、皮膚粘膜、靜脈、尿道、陰道等。

除了制成藥物之外，亦可在本發(fā)明的三七皂苷Fc中加入抗氧化劑、色素、酶制劑等各種食品添加劑，按本領(lǐng)域的常規(guī)方法制成保健食品。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計(jì)。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本專利說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例中所用的三七皂苷Fc來源為上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所分離、制備，(氯吡格雷購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所)。所用樣品的純度均符合藥用標(biāo)準(zhǔn)。

1、實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥材

三七皂苷Fc(分子量1211.38，HPLC純度≥99％，中藥研究所)；氯吡格雷(分子量419.90，HPLC純度≥98％，購(gòu)自中國(guó)生物制品鑒定所)；人類標(biāo)準(zhǔn)血漿、凝血四項(xiàng)測(cè)試試劑(均購(gòu)自德國(guó)SIEMENS公司)；二磷酸腺苷(ADP)(購(gòu)自Sigma公司)

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重230±20g的SD大鼠，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(滬)2008-0016。置于常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境，自由進(jìn)食和飲水。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1Fc對(duì)血小板聚集的影響

2.1.1體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)：抽取的血液加入枸櫞酸鈉抗凝。100g離心5min，取上清，即得富血小板(PRP)；將所得PRP加入前列腺環(huán)素(2μg/ml)，離心5min(700g)；再加入0.9％的生理鹽水清洗兩次；清洗后將血小板懸浮于Tyrode buffered中，并使其濃度為4*108，備用；按比濁法進(jìn)行血小板聚集測(cè)定：將血小板血漿置于比色管杯中，加入誘聚劑(ADP：5-腺苷二磷酸二鈉鹽：1×10-4mol/L)。后，用小磁粒進(jìn)行攪拌，血小板逐漸聚集，血漿濁度降低，透光度增加。記錄此變化，形成血小板聚集的動(dòng)態(tài)曲線。以PRP的聚集率和透光度為0，以懸浮液所測(cè)得的聚集率和透光度為100％，用血小板聚集儀進(jìn)行自動(dòng)測(cè)定、記錄、描繪血小板聚集曲線。對(duì)抑制或促進(jìn)聚集的判斷，主要觀察是否與誘導(dǎo)劑發(fā)生協(xié)同作用或拮抗作用。發(fā)生協(xié)同作用即為促進(jìn)血小板聚集，發(fā)生拮抗作用的即為抑制血小板聚集。

2.1.2整體動(dòng)物血小板聚集實(shí)驗(yàn)：動(dòng)脈血流中的血小板當(dāng)接觸絲線的粗糙表面是粘附與線上，在其表面形成血小板血栓。血小板的粘附聚集功能受到抑制時(shí)，血栓重量較輕。因此，從血栓重量可測(cè)知血小板粘附聚集功能的情況。

2.1.2整體動(dòng)物凝血功能評(píng)價(jià)

2.1.2.1大鼠斷尾凝血時(shí)間測(cè)定：以利剪將大鼠尾尖0.5cm處橫斷，待血液自行溢出后開始記時(shí)，每隔30s用濾紙吸去血滴1次，直至血流自然停止(濾紙吸時(shí)無血)為止，即為出血時(shí)間。

2.1.2.2凝血四項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定：1)凝血四項(xiàng)指標(biāo)：凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)：主要反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況，常用于監(jiān)測(cè)肝素用量。增高見于血漿因子Ⅷ、因子Ⅸ和因子XI水平減低：如血友病A、血友病B及因子XI缺乏癥；降低見于高凝狀態(tài)：如促凝物質(zhì)進(jìn)入血液及凝血因子的活性增高等情況；活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplatin time,APTT)：主要反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況，常用于監(jiān)測(cè)肝素用量。增高見于血漿因子Ⅷ、因子Ⅸ和因子XI水平減低：如血友病A、血友病B及因子XI缺乏癥；降低見于高凝狀態(tài)：如促凝物質(zhì)進(jìn)入血液及凝血因子的活性增高等情況；凝血酶時(shí)間測(cè)定(thrombin time，TT)：主要反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)為纖維蛋白的時(shí)間。增高見于DIC纖溶亢進(jìn)期，低(無)纖維蛋白原血癥，異常血紅蛋白血癥，血中纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDPs)增高；降低無臨床意義；纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)IB)：主要反映纖維蛋白原的含量。增高見于急性心肌梗死減低見于DIC消耗性低凝溶解期、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎、肝硬化；

2.2分組及給藥方法

2.2.1血小板聚集實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

空白對(duì)照：0.9％生理鹽水(NS)。

誘導(dǎo)劑組：二磷酸腺苷(ADP)(10mM)

陽(yáng)性對(duì)照藥：氯吡格雷(5mM)。

用藥組：每組六只，F(xiàn)c用雙蒸水溶解(56μM)。

2.2.2在體血小板聚集功能實(shí)驗(yàn)

空白對(duì)照：6只，0.9％生理鹽水(NS)。

陽(yáng)性對(duì)照藥：6只，氯吡格雷(13.4mg/kg)。

用藥組：6只，F(xiàn)c用雙蒸水溶解(8.1mg/kg)。

2.2.3大鼠斷尾凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

空白對(duì)照：6只，0.9％生理鹽水(NS)。

陽(yáng)性對(duì)照藥：6只，氯吡格雷(靜注13.4mg/kg)。

用藥組：6只，F(xiàn)c用雙蒸水溶解(靜注8.1mg/kg)。

2.2.4凝血四項(xiàng)測(cè)定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

空白對(duì)照：6只，0.9％生理鹽水(NS)。

陽(yáng)性對(duì)照藥：6只，氯吡格雷(160μg/ml)。

用藥組：6只，F(xiàn)c用雙蒸水溶解(80μg/ml)。

2.4統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單向方差分析(One-way ANOVA)及LSD檢驗(yàn)，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性。

3、結(jié)果

3.1三七皂苷Fc對(duì)血小板聚集的抑制作用。

3.1.1Fc對(duì)血小板聚集率的影響

圖1體現(xiàn)了三七皂苷Fc對(duì)血小板聚集率的影響，由圖1可見：誘導(dǎo)劑(ADP)單用組聚集率為52.9％，聯(lián)合引用Fc(給藥劑量均為200μM)后聚集率為25.8％，F(xiàn)c組的聚集率小于誘導(dǎo)劑單用組(*P<0.05)，并小于陽(yáng)性藥組(*P<0.05)。這說明Fc拮抗誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集。

3.1.1Fc對(duì)血小板聚集率的量效關(guān)系

圖2體現(xiàn)了三七皂苷Fc對(duì)血小板聚集率的量效關(guān)系，由圖2可見：Fc(0.1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、)對(duì)血小板聚集抑制作用的量效關(guān)系，從0.1μM---40μM的劑量范圍內(nèi)，血小板聚集率逐漸下降。隨著劑量的增加，聚集率依次下降。聚集率從最初的47.9％，降至28.1％，降幅達(dá)19.8％。其IC₅₀值為13.5μM。

3.1.3Fc對(duì)整體動(dòng)物血小板聚集率的影響

圖3體現(xiàn)了Fc對(duì)整體動(dòng)物血小板聚集率的影響，由圖3可見：三七皂苷Fc的在體血小板聚集功能的影響。通過對(duì)濕重血栓的稱重我們發(fā)現(xiàn)：Fc在體情況下仍有很強(qiáng)的活性。我們采用靜脈注射的方法，給予大鼠Fc：8.1mg/kg。給藥五分鐘后開始體外側(cè)枝循環(huán)，循環(huán)十五分鐘后即終止循環(huán)，取出血栓沉重。空白對(duì)照組與Fc給藥組差異性顯著(**P<0.01)。

3.2三七皂苷Fc對(duì)血液凝血功能的影響

3.2.1Fc對(duì)大鼠斷尾凝血時(shí)間測(cè)定

圖4體現(xiàn)了Fc對(duì)大鼠斷尾凝血時(shí)間影響，由圖4可見：Fc對(duì)于大鼠斷尾出血時(shí)間，有著明顯的影響。Fc的血栓重量為28.2mg，；明顯小于空白組：37.2mg(**P<0.01)。

3.3Fc對(duì)大鼠與人類凝血四項(xiàng)指標(biāo)的影響

圖5體現(xiàn)Fc對(duì)大鼠活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplatin time,APTT)的影響，由圖5可見：Fc在5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、80μg/ml、160μg/ml五個(gè)劑量組對(duì)APTT的量效關(guān)系。不同劑量表現(xiàn)出效應(yīng)的逐漸增強(qiáng)，F(xiàn)t1的劑量5μg/ml APTT時(shí)間為：19秒，240μg/ml為32秒。變化幅度為13秒。

圖6體現(xiàn)Fc對(duì)人類凝血四項(xiàng)指標(biāo)的影響，由圖6可見：Fc明顯延長(zhǎng)APTT時(shí)間，在80μg/ml劑量水平，APTT時(shí)間達(dá)到126秒，明顯高于空白組(91秒)(**P<0.01)。Fc在240μg/ml的劑量水平，APTT時(shí)間僅為82秒，明顯低于空白組(91秒)(**P<0.01)。

圖7體現(xiàn)Fc對(duì)人類PT時(shí)間的影響：PT也長(zhǎng)于空白組(*P<0.05)；。PT時(shí)間為17秒，明顯低于空白組(20秒)(*P<0.05)。

實(shí)施例2：三七皂苷Fc對(duì)手術(shù)大鼠心肌梗死面積的減少作用、抗心肌缺血的作用

一.實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥材

三七皂苷Fc(分子量1211.38，HPLC純度≥99％，中藥研究所)；氯吡格雷(分子量419.90，HPLC純度≥98％，購(gòu)自中國(guó)生物制品鑒定所)；

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重320±20g的SD大鼠，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(滬)2008-0016。置于常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境，自由進(jìn)食和飲水。

二.方法：

模型制作方法：SD大鼠30只(上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重：320—370g。大鼠戊巴比妥(35mg/kg)麻醉，仰臥固定；頸部正中切開，分離氣管，行氣管切開術(shù)，插入呼吸管，調(diào)節(jié)好呼吸機(jī)的頻率與潮氣量；經(jīng)胸骨正中切口開胸(3-4肋間)，細(xì)手術(shù)針，六號(hào)線，從左心耳處入針，肺動(dòng)脈圓錐處出針結(jié)扎。判斷縫扎前降支成功的

標(biāo)準(zhǔn)采用肉眼觀察(前降支供血區(qū)變暗或蒼白)，便迅速關(guān)胸。假手術(shù)組只穿線繞過左冠狀動(dòng)脈前降支而不結(jié)扎，余同手術(shù)組。

TTC染色：-20℃凍存，至心臟凍硬取出，沿左室長(zhǎng)軸將心臟切為5～6片，每片厚3～4mm。然后置于0.5％TTC溶液中，37℃孵育15min,取出心肌片于4％甲醛溶液中固定。

指標(biāo)采集：心肌片呈兩種不同的顏色，紅色為正常心肌組織；白色或灰黑色為壞死心肌組織。將心肌按兩種不同的顏色分別剪下用濾紙吸干水分，稱取重量。按如下公式計(jì)算:心肌缺血面積(％)＝心臟總重÷梗死心肌重量×100％。同時(shí)，采集部分心臟進(jìn)行病理切片分析。三.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.5大鼠急性心肌梗死實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

手術(shù)空白組：6只，手術(shù)后給予0.9％生理鹽水(NS)。

假手術(shù)組：6只，開胸，穿線但不結(jié)扎。

陽(yáng)性藥組：6只，手術(shù)后給予替卡格雷(4.1mg/kg)。

4mg/kg Fc給藥組：6只，手術(shù)后給予Fc(4mg/kg)。

12mg/kg Fc給藥組：6只，手術(shù)后給予Fc(12mg/kg).

四.結(jié)論：

圖8表明:Fc具有明顯減少手術(shù)大鼠心肌梗死面積百分比的作用。并且，4mg/kg給藥組與12mg/kg給藥組具有明顯的量效關(guān)系(P＜0.001)。12mg/kg給藥組療效優(yōu)于陽(yáng)性藥組(4.1mg/kg)(P＜0.01)。各給藥組與control組比較均有顯著性差異。

圖9：手術(shù)空白組表明：心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞胞漿濃染嗜酸性，部分細(xì)胞胞漿少，部分細(xì)胞胞漿增多，細(xì)胞核分布不均勻，局部可見多核細(xì)胞形成，間質(zhì)可見明顯空泡變性，炎癥細(xì)胞少見。

圖10：假手術(shù)組表面：心肌細(xì)胞排列正常，細(xì)胞胞漿較豐富嗜酸性，細(xì)胞核大小較一致，均勻分布，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞。

圖11：陽(yáng)性藥組表明：心肌細(xì)胞排列局部紊亂，胞漿嗜酸性，較豐富，核大小較一致，分布不均勻，可見多核細(xì)胞，間質(zhì)空泡變性明顯，炎癥細(xì)胞較少見。

圖12：給藥4mg/kg組表明：心肌細(xì)胞排列大致正常，細(xì)胞胞漿嗜酸性，局部細(xì)胞核聚集，間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，空泡變性較明顯。

圖13：給藥12mg/kg組表明：心肌細(xì)胞排列大致正常，局部細(xì)胞胞漿斷裂，細(xì)胞胞漿較豐富，可見細(xì)胞核增大，間質(zhì)空泡變性減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯。

實(shí)施例3：三七皂苷Fc對(duì)小鼠血管閉塞性下肢缺血的治療作用

一.實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥材

三七皂苷Fc(分子量1211.38，HPLC純度≥99％，中藥研究所)；陽(yáng)性藥(氯吡格雷：分子量419.90，HPLC純度≥98％，購(gòu)自中國(guó)生物制品鑒定所)；三七總皂苷(來源于中藥所)；

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重20±5g的C57小鼠，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(滬)2008-0016。置于常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境，自由進(jìn)食和飲水。

二.方法：

模型制作方法：術(shù)前高壓滅菌器消毒手術(shù)器械。利用異氟醚或其他麻醉劑麻醉老鼠,直到它是對(duì)外界刺激的反應(yīng)遲鈍。

然后仰臥位放置在上手術(shù)臺(tái)前。使用電動(dòng)剃須刀和脫毛膏徹底清除發(fā)毛。鼠仰臥位放置在手術(shù)臺(tái)上(最好有加熱墊使昏睡的老鼠保溫)，用膠帶固定后腳，用碘和酒精擦洗皮膚。用細(xì)鑷子和手術(shù)剪，使皮膚切口，約1厘米長(zhǎng)，從膝蓋向大腿內(nèi)側(cè)。使用PBS浸濕棉簽的細(xì)尖，輕輕地刷了皮下脂肪。接下來，應(yīng)用燒灼或鈍針撥開軟組織，暴露了潛在的股動(dòng)脈。用拉鉤拉開傷口，更好的暴露下肢血管。輕輕剝離暴露的神經(jīng)血管束。然后，使用一個(gè)精細(xì)鑷子和PBS浸濕棉簽的細(xì)尖，解剖和分離股動(dòng)脈，股靜脈和神經(jīng)。剝離后，在腹股溝附近的位置,用7-0絲線手術(shù)節(jié)扎股動(dòng)脈,附近位置再次節(jié)扎；靠近膝蓋的位置,做同樣動(dòng)作。用5-0絲線仔細(xì)節(jié)扎，所有與股動(dòng)脈相連接的動(dòng)脈(大概三到四處)。切除從股靜脈到靠近膝蓋的股動(dòng)脈。取出拉鉤，用5-0縫線關(guān)閉切口。老鼠放置在加熱墊的頂部的動(dòng)物和不斷監(jiān)視，直到清醒。

指標(biāo)采集：采用moorLDLS激光多普勒，采集小鼠術(shù)后，不同時(shí)間段的血流變化數(shù)據(jù)。

三.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

手術(shù)空白組：6只，手術(shù)后腹腔注射(ip)0.9％生理鹽水(NS)。

陽(yáng)性藥組：6只，手術(shù)后腹腔注射氯吡格雷(ip)(10mg/kg)。

Fc給藥組：6只，手術(shù)后腹腔注射(ip)三七皂苷Fc(40mg/kg)。

三七總皂苷(PNS)：6只，手術(shù)后腹腔注射(ip)PNS(50mg/kg)

四.結(jié)論：

圖14第一天手術(shù)后，F(xiàn)c處理組激光多普勒血流變化圖。由于血管被截?cái)嘌骱苄　?/p>

圖15第四天手術(shù)后，F(xiàn)c處理組激光多普勒血流變化圖。血流量多于第一天的流量。

圖16第八天手術(shù)后，F(xiàn)c處理組激光多普勒血流變化圖。血流量已明顯多于第一天的流量。無血流區(qū)減少，缺血肢血流進(jìn)一步恢復(fù)。

圖17第十六天手術(shù)后，F(xiàn)c處理組激光多普勒血流變化圖。缺血肢血流已明顯恢復(fù)。

圖18手術(shù)后第二十六天后(見Table 1)，F(xiàn)c處理組手術(shù)肢已恢復(fù)到正常肢的43％，明顯優(yōu)于model組的25％(P＜0.05)，優(yōu)于陽(yáng)性藥的27％(P＜0.05)，且優(yōu)于目前廣泛使用的三七總皂苷(PNS)(23％)(P＜0.05)。

Table 1.The data of Fc treated group(after 28days)

本發(fā)明所涉及的多個(gè)方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明精神之前提下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可對(duì)其進(jìn)行等同改變和修飾，所述改變和修飾同樣落入本申請(qǐng)所附權(quán)利要求的覆蓋范圍。