本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，特別是涉及Ca_V2.1通道在Ca²⁺依賴性缺血模型中調節(jié)腦組織梗塞面積中的作用。

背景技術：
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細胞膜去極化時，電壓門控Ca²⁺(Ca_V)通道允許Ca²⁺進入到細胞內。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Ca_V通道在通過提高細胞內Ca²⁺濃度調節(jié)不同的神經(jīng)元功能中起到了重要的作用。Ca_V通道是一種復雜的分子復合物，由α1，β，α2-δ和γ亞基組成。α1亞基主導通道本身的功能以及基本特性。在突觸前終端，有三大Ca_V2通道類型，Ca_V2.1(P/Q型)，Ca_V2.2(N型)和Ca_V2.3(R型)，這三種類型廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和參與Ca²⁺依賴的胞吐釋放神經(jīng)遞質。鑒于Ca_V2通道的關鍵作用在于控制特定神經(jīng)遞質的產(chǎn)生和釋放，突觸前Ca_V2通道的表達、定位、結構或調制發(fā)生缺陷都可能會導致異常的突觸信號和導致神經(jīng)網(wǎng)絡功能障礙的各種模式。

Ca²⁺濃度的增加在缺血性神經(jīng)元損傷的發(fā)病機理中起著重要的作用，缺血時，Ca²⁺濃度通過細胞外空間Ca²⁺的內流和細胞內存儲Ca²⁺的釋放而升高。Ca_V2通道作為重要的Ca²⁺內流路線，他們參與缺血性神經(jīng)元損傷，這在病理生理學方面至關重要的。

為了檢測Ca_V2.1通道的功能以及與Ca_V2.1通道有關的疾病發(fā)生過程，小鼠遺傳學的研究可能是有用的。小鼠Cacna1a基因發(fā)生突變可編碼出Ca_V2.1通道成孔的α1單元，突變包括以Ca_V2.1電流缺乏的基因敲除菌株和包涵表現(xiàn)共濟失調現(xiàn)象為常見癥狀的自發(fā)突變。Rolling Nagoya小鼠在電壓測量S4段第三重復突變，Leaner mice在剪接供體序列上發(fā)生突變，從而改變C-末端序列。Ca_V2.1通道的Rolling Nagoya型突變激活時有一個更低的電壓靈敏度，導致小腦受損突觸的傳遞。Ca_V2.1通道的leaner型突變導致了小腦中通道的低密度表達。以往的研究也表明，leaner突變型(60％)小鼠的浦肯野細胞中P型Ca²⁺電流的下降量比Rolling Nagoya(40％)突變型小鼠的要大。應用Ca_V2.1通道α1亞基(Ca_V2.1α1)基因敲除小鼠來檢測Ca_V2.1通道和缺血性神經(jīng)損傷兩者之間的關系是不可能的，因為大多數(shù)的小鼠斷奶不生存。盡管Rolling Nagoya和Leaner mice兩種突變型小鼠表現(xiàn)出正常的壽命，但是它們共濟失調的嚴重程度顯著不同，且Leaner mice要更嚴重些。由于Ca²⁺信號的精確調節(jié)對于神經(jīng)細胞突起是非常重要的，通過不同的Ca_V2.1通道突變體改變Ca²⁺離子流能夠引起神經(jīng)元和電路不同的功能障礙。 因此，通過Rolling Nagoya，Leaner mice和野生型小鼠的比較，可以闡明Ca_V2.1通道在缺血性神經(jīng)元損傷中的生理作用。

技術實現(xiàn)要素：
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在神經(jīng)系統(tǒng)中，Ca_V通道在通過提高細胞內鈣離子濃度以調節(jié)不用神經(jīng)元功能中起到了重要的作用。Ca_V2通道的關鍵作用在于控制特定的神經(jīng)遞質的產(chǎn)生和釋放，突觸前Ca_V2通道的表達、定位或結構發(fā)生缺陷都可能會導致突觸型號發(fā)生異常和神經(jīng)網(wǎng)絡功能的障礙。鈣離子濃度的增加在缺血性神經(jīng)元損傷的發(fā)病機制中起著重要的作用，在缺血環(huán)境中，鈣離子濃度通過胞外空間內的鈣離子內流和胞內儲存的鈣離子釋放而獲得調節(jié)。Ca_V2通道作為重要的鈣離子內流路線，參與缺血性神經(jīng)損傷。

鑒于以上所述所有技術，本發(fā)明第一方面提供Ca_V2.1通道α亞基mRNA在小鼠大腦內部的表達情況。

由于α亞基主導Ca_V2通道的功能和基本特性，Ca_V2通道的功能缺陷都可能會導致缺血性神經(jīng)元損傷。所以對Ca_V2.1通道α亞基mRNA在小鼠大腦內部表達情況的研究，對于我們對Ca_V2.1通道在缺血性模型中所起作用的研究具有實際應用價值。

本發(fā)明第二方面提供在體內缺血模型中α亞基的突變能降低梗死體積。

Ca_V2通道的關鍵作用在于控制特定神經(jīng)遞質的產(chǎn)生和釋放，Ca_V2通道的表達、定位、結構發(fā)生缺陷都可能導致異常的突觸型號和導致神經(jīng)網(wǎng)絡功能障礙。我們通過分析比較Rolling Nagoya和Leaner mice體內缺血模型中腦損傷帶來的影響，發(fā)現(xiàn)其梗死面積都是要低于野生型的，這兩種小鼠模型中都有明顯的保護機制。

本發(fā)明第三方面提供Ca_V2.1通道α亞基突變小鼠在體外缺血模型中鈣離子濃度的變化。

細胞內鈣離子過多的流入是導致大腦局部缺血所引起的神經(jīng)細胞死亡的主要原因。鈣離子的內流是導致一系列重要的通道和轉運蛋白所介導的。經(jīng)OGD處理后，Rolling Nagoya和Leaner mice的海馬區(qū)域內鈣離子濃度有明顯的下降，也就意味著在這兩種小鼠模型中，Ca_V2通道介導梗死面積的降低可能與鈣離子濃度有關。

綜上所述，本發(fā)明發(fā)明人證實了腦梗死面積確實和Ca_V2通道有關。在Rolling Nagoya和Leaner mice模型中，通過MCA處理，本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在缺血模型中鈣離子的濃度有所下降，α1亞基基因的突變能保護大腦在缺血性損傷中所受的傷害即Ca_V2.1通道在缺血模型中有調節(jié)腦組織梗塞面積的作用。

附圖說明：

圖1：腦梗死的評價(A)大腦中動脈阻塞處理后的一系列的腦區(qū)域。分別用TTC處理后的野生型小鼠(左)，Rolling Nagoya(中)，Leaner mice(右)。(B)和對照組相比，野生型小鼠(n＝12)，Rolling Nagoya(n＝11)以及輕瘦型小鼠(n＝12)中對梗死區(qū)域體積的統(tǒng)計。

圖2：海馬切片經(jīng)OGD誘導后鈣離子增加的剖面圖。經(jīng)OGD處理后，取自野生型小鼠(n＝14,closed square)，Rolling Nagoya(n＝14,open circle)，Leaner mice的(n＝14,open triangle)的海馬CA1區(qū)域的錐體細胞層的標準化曲線隨著時間的變化而變化。標準化曲線的數(shù)據(jù)是從OGD處理前5min開始搜集，到OGD處理結束后7min。水平黑色標線指OGD處理組。

圖3：缺血環(huán)境下Ca_V2.1通道突變體介導的神經(jīng)保護作用機制。Ca_V2.1通道的重要性和鈣離子內流與調節(jié)谷氨酸釋放一致。鈣離子的升高在缺血性腦損傷的發(fā)生中起著至關重要的作用。在局部缺血中，不同的Ca_V2.1通道突變體影響著不同的鈣離子電流以及谷氨酸的釋放，最終導致神經(jīng)元損傷。

具體實施方式：

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復數(shù)形式。

當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使 用的具體方法、設備、材料外，根據(jù)本技術領域的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領域常規(guī)的原位雜交，實時定量反轉錄聚合酶鏈式反應，MCA閉塞處理，梗塞面積的評估，Ca²⁺成像技術，統(tǒng)計分析及相關領域的常規(guī)技術。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，Ca_V通道在通過提高細胞內Ca²⁺濃度調節(jié)不同的神經(jīng)元功能中起到了重要的作用。Ca_V通道是一種復雜的分子復合物，由α1，β，α2-δ和γ亞基組成。在突觸前終端，有三大Ca_V2通道類型，Ca_V2.1(P/Q型)，Ca_V2.2(N型)和Ca_V2.3(R型)，這三種類型廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和參與Ca²⁺依賴的胞吐釋放神經(jīng)遞質。鑒于Ca_V2通道的關鍵作用在于控制特定神經(jīng)遞質的產(chǎn)生和釋放，突觸前Ca_V2通道的表達、定位、結構或調制發(fā)生缺陷都可能會導致異常的突觸信號和導致神經(jīng)網(wǎng)絡功能障礙的各種模式。Ca²⁺濃度的增加在缺血性神經(jīng)元損傷的發(fā)病機理中起著重要的作用，Ca_V2通道作為重要的Ca²⁺內流路線，他們參與缺血性神經(jīng)元損傷，這在病理生理學方面至關重要的。

各實施中所使用的動物程序由上海交通大學和RIKEN動物實驗委員會批準，并依照實驗室動物使用要求進行實驗。Rolling Nagoya小鼠由RIKEN生物資源中心提供，是C57BL/6J的第14代雜交小鼠。Leaner mice由Jackson實驗室提供，具有C57BL/6J的遺傳背景。這些小鼠被免費獲得物顆粒和水，飼養(yǎng)溫度為23±1℃，濕度為55±5％，光暗周期為12/12-h(開燈時間為8：00到20:00)。所有分析均由技術成熟的實驗人員在不了解小鼠基因型的情況下完成。

原位雜交技術

用于原位雜交的16周齡雄性小鼠大腦的包埋蠟塊和石蠟切片是從Genostaff有限公司(日本東京)獲得的。對小鼠進行灌注，然后解剖取出大腦，用組織固定液(Genostaff)對其進行固定，然后根據(jù)專有程序進行石蠟包埋，最后進行切片，切片厚度為6um。雜交協(xié)議按照之前報道的那樣進行實施。我們設計了一個含有691個堿基片段的探針，從位置6068到6748的Ca_V2.1α1亞基CDNA，用地高辛標記的RNA標記試劑盒(德國，Mannhein，羅氏診斷)進行示蹤。用NBT/BCIP染色液(美國Sigma)進行著色反應，過夜，然后用PBS洗。切片， kernechtrot染色液復染和安裝CC/安裝(診斷生物系統(tǒng)公司，普萊森頓，CA，USA)。

實時定量反轉錄聚合酶鏈式反應

根據(jù)試劑說明書(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，分別從16周雄性小鼠的嗅球，大腦皮層，尾狀核，海馬體，小腦和肝中利用Trizol試劑提取總RNA。使用ABI7700序列檢測系統(tǒng)，采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)量化感興趣基因的表達水平。確定野生型和Ca_V2.1α1突變體基因表達的總量，我們所使用的引物是CT1F(5’-CTGCGCTACTTCGAGATGTG-3’)和CT1R(5’-AACATAGTCAAAATATCGCAGCAC-3’)，所使用的探針是MT-probe1(5’-ATCCTCATGGTCATTGCCATGAGCAGCATCGCTCTGGCCGCCGA-GGACCCGGTGC AGCCCAACGCACC CC-3’)。為了確定等效荷載，每個樣本中的18s核糖體RNA的量使用標準的引物和Taq Man探針測定。所有的樣本都進行了重復的分析，用平均值來表示基因表達的相對量化。野生型小鼠中mRNA的表達水平的計算與Ca_V2.1α1 mRNA的表達水平是相關的。

MCA閉塞

用異氟烷對16周齡的雄性小鼠進行麻醉，使用一個水套加熱墊來使小鼠的體溫保持在(36±0.5攝氏度)。切開皮膚，將左側枕葉，甲狀腺上動脈，外頸動脈的分支和翼腭動脈暴露出來，電凝然后切開。用微型夾將頸總動脈結扎后，結扎并凝固左頸外動脈，切斷遠端腦甲狀腺動脈。將一條21mm的單絲尼龍線(5–0，哈佛儀器，霍利斯頓，MA，USA；熱的直徑圓尖：0.2–0.3mm)插入到ECA中，輕輕地通過頸內動脈，直至其尖端閉塞MCA的起源?？p線的位置如果正確，到左側大腦中動脈區(qū)域局部腦血流量就會突然下降，我們可以用激光多普勒血流儀來監(jiān)測10–15％的基本流動監(jiān)測。成功閉塞后，結扎固定到位，用手術夾閉合皮膚切口。

梗塞面積的評估

大腦動脈閉塞24小時后，給小鼠注射過量的戊巴比妥鈉進行麻醉處死。取出大腦，然后用振動切片機(1000S，徠卡軟體系統(tǒng)，韋茨拉爾，德國)連續(xù)切為5冠切片(厚1mm)。這些部分浸泡在含有1％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的生理鹽水中，然后在37℃的環(huán)境下孵育30min。梗死圖像和整個對側大腦半球 均采用數(shù)碼相機拍攝區(qū)域測量則使用圖像軟件(Win Roof版本5.7，山谷公司，東京，日本)。減去面積非梗死側大腦半球對側組織測定心肌梗死面積。梗死體積百分比通過將梗死體積的總和除以前面所述的總對側半球體積求得。

缺氧和葡萄糖環(huán)境中海馬切片內Ca²⁺離子成像技術

海馬切片(350μm)是取自5周齡的雄性小鼠，利用振動切片機(1000S，徠卡軟體系統(tǒng))在冰冷的人工腦脊液(ACSF)中獲得的。ACSF是由137mM的NaCl，2.5mM KCl，21mM NaHCO₃，0.58mM NaH₂PO₄，2.5mM CaCl₂,1.2mM MgCl₂和10mM的葡萄糖組成，在95％O₂/5％CO₂的飽和狀態(tài)下PH為7.4。孵育2小時后，用Ca²⁺熒光指示劑Fura-PE3/AM和0.01％聚氧乙烯蓖麻油在37℃對切片進行染色45min。然后將切片徹底清洗30分鐘，以除去額外的細胞染料。35℃時，在熒光倒置顯微鏡階段對腦片進行灌流(4ml/min)，并分別在340nm和380nm的波長下每分鐘對熒光信號進行捕捉。從CA1椎體細胞層兩個不同的區(qū)域對Ca²⁺濃度在CA1區(qū)熒光比率的平均值進行估計(比＝F340/F380)。為了符合OGD的使用要求，用95％N₂/5％CO₂使ACSF飽和，并用2-脫氧葡萄糖取代葡萄糖。規(guī)范OGD處理期間Ca²⁺濃度的非時間性增加，標準化率等于基線比除以每一個得到的比例(應用OGD前五個值的平均值)。然后在3分鐘的時間間隔使用運算箱計算標準比率上升的最大速率。

統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)是由平均值±標準差的形式呈現(xiàn)，使用Excel 2006對行為的統(tǒng)計分析和免疫細胞化學研究進行統(tǒng)計，采用重復測量的方差分析對數(shù)據(jù)進行分析，然后Tukey事后測試。

實施例1

Ca_V2.1α1亞基mRNA的表達模式

我們用原位雜交的方法來評估Ca_V2.1α1 mRNA在野生型小鼠(n＝6)、Rolling Nagoya和(n＝5)和Leaner mice(n＝5)中的分布；在三種小鼠體內分布都一樣(數(shù)據(jù)未顯示)。我們利用反義探針檢測到α1亞基在這三種小鼠大腦內部都有一個廣泛的表達，尤其是在嗅球神經(jīng)元細胞，大腦皮層神經(jīng)元細胞，海馬神經(jīng)元細胞和小腦神經(jīng)元細胞中有強烈的表達。但是使用正義探針之后未檢測到任何的信號。我們用real-time qRT-PCR來檢測Ca_V2.1α1 mRNA在這三種小鼠中的嗅球、 大腦皮層、尾狀殼核、海馬、小腦以及肝臟中的表達水平。在這三種小鼠的嗅球、大腦皮層、尾狀殼核、海馬、小腦中，總Ca_V2.1α1的相對表達水平并未有明顯的不同(野生型小鼠，Rolling Nagoya和Leaner mice在嗅球中的值分別是1.01±0.04,1.03±0.06,1.04±0.07，F(xiàn)(2,27)＝0.153,p>0.05；大腦皮層分別為1.03±0.01,1.03±0.04,1.04±0.08，F(xiàn)(2,27)＝0.173,p>0.05；尾狀殼殼中分別為1.02±0.05,1.03±0.03,1.04±0.04,F(2,27)＝0.145,p>0.05；海馬中分別為1.02±0.01,1.05±0.08,and 1.02±0.07，F(xiàn)(2,27)＝0.166,p>0.05；小腦中分別為1.02±0.02,1.03±0.03,and 1.06±0.03,F(2,27)＝0.182,p>0.05)。而在三種小鼠的肝臟部分未檢測到任何的PCR產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)。

實施例2

Ca_V2.1α1基因突變小鼠在體內缺血模型中梗死體積的降低

對野生型小鼠(n＝12)，Rolling Nagoya(n＝11)以及Leaner mice(n＝12)進行大腦中動脈阻塞處理。我們從顏色上來辨別腦梗死，為白色未染色區(qū)域，周邊是紅色活體組織。圖1A是一組具有代表性的實驗結果，它是梗死部分用TTC永久閉塞之后染色24h所得到的結果。經(jīng)大腦中動脈阻塞處理后，在這三種小鼠中的梗死區(qū)域有明顯不同。梗死區(qū)域在Rolling Nagoya中占大腦的總體積的比例為27.1±3.5％，Leaner mice中的比例為20.2±3.5％，野生型小鼠為42.9±4.5％。

實施例3

Ca_V2.1α1基因突變小鼠在體外缺血模型中鈣離子降低

為了調查在突變型小鼠中梗死體積的降低是否和神經(jīng)元鈣離子信號通路有關，我們用海馬切片來檢測OGD處理后鈣離子的變化，OGD處理后能使局部缺血。Ca_V2.1通道在海馬區(qū)域內的表達十分強烈。在OGD處理前，在這三種小鼠中CA1區(qū)的錐體細胞層的基礎比率并未有明顯的區(qū)別(野生型：0.847±0.011；Rolling Nagoya：0.827±0.022；Leaner mice：0.803±0.013)。一旦OGD開始處理，鈣離子出現(xiàn)遞增，處理后的4min內，野生型小鼠的標準化指數(shù)要遠遠高于其他兩組的小鼠。在這三種小鼠中增加的最大比率也都是不同的。Rolling Nagoya中的增加速率為0.083±0.007/min(p<0.01)，Leaner mice為0.062±0.006/min(p<0.01)，野生型小鼠為0.105±0.008/min。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權利要求所涵蓋。