本發(fā)明屬于醫(yī)學生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿及其制備方法，具體涉及一種在動物跟腱中具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿及其制備方法。

背景技術(shù)：
膠原蛋白是一種細胞外蛋白質(zhì)，它是由3條肽鏈擰成螺旋形的纖維狀蛋白質(zhì)，膠原蛋白是人體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，占全身總蛋白質(zhì)的30％以上。存在于幾乎所有組織中，是一種細胞外基質(zhì)蛋白，以不溶纖維形式存在，具高度抗張能力，對動物和人體皮膚、血管、骨、軟骨的形成十分重要，是結(jié)締組織的重要物質(zhì)，是決定結(jié)締組織韌性的主要因素，膠原蛋白也是細胞外基質(zhì)中最重要的組成部分。膠原蛋白和其他蛋白一樣也是由氨基酸組成的，但在其組成中甘氨酸幾乎占到了1/3，并且脯氨酸和羥脯氨酸是各類蛋白質(zhì)中最高的，正因為氨基酸的組成特點，膠原蛋白在空間中以穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)存在。膠原蛋白具有諸多優(yōu)異的生物學性質(zhì)，如低免疫性：膠原分子結(jié)構(gòu)中的重復性單元大，免疫原性非常低，對機體無排異反應，親和性好，一般生物機體不會對其產(chǎn)生慢性的排斥現(xiàn)象。其中，膠原蛋白海綿為白色海綿狀固體，是膠原蛋白的一種。作為常用的醫(yī)療耗材，具有充當填充物，快速止血，防止粘連，加速傷口愈合等功效，減少術(shù)后并發(fā)癥，在醫(yī)療上用途廣泛。其主要利用了膠原特殊的四級結(jié)構(gòu)，從而使血小板活化、釋放出顆粒成分，迅速凝血，在正常血液循環(huán)中，血小板并不與內(nèi)皮細胞表面或其他細胞發(fā)生作用，而是沿著毛細血管內(nèi)壁排列，維持其完整性，血管局部受損時，血小板的止血兼有機械性堵塞傷口和化學性粘附聚集作用。首先，血小板迅速粘附于暴露的膠原纖維(血小板膜上的糖蛋白GPⅡb-Ⅲa，由vWF介導與膠原結(jié)合)，此時血小板被激活，血小板形態(tài)發(fā)生改變，由正常的圓盤狀態(tài)變?yōu)閳A球形，偽足突起，血小板發(fā)生聚集(血小板膜上的糖蛋白GPⅡb-Ⅲa由膠原介導發(fā)生相互粘附聚集)，此為血小板第一相聚集，促進血小板聚集的主要物質(zhì)是膠原、損傷內(nèi)皮細胞的二磷酸腺苷和已形成的微量凝血酶；血小板的二磷酸腺苷可加速血小板的聚集、變性，成為不可逆的第二相聚集，形成白色血栓，構(gòu)成初步的止血屏障。同時，膠原激活人體內(nèi)源性凝血途徑：當血管發(fā)生損傷，皮下組織暴露，Ⅻ因子與帶負電荷的皮下膠原接觸就被激活為Ⅻa，少量Ⅻa與HMWK可使PK轉(zhuǎn)變?yōu)榧る尼尫琶福笳哂挚膳cHMWK一起迅速激活大量Ⅻa，Ⅻa又同時激活因子Ⅵ，因子Ⅵ與Ca2+、因子Ⅷ共同形成復合體，從而激活因子Ⅹ為Ⅹa，繼而在Ca2+參與下激活凝血酶原為凝血酶，凝血酶激活纖維蛋白原為纖維蛋白，然后凝固形成血栓，達到止血效果。但是，由于從不同組織中分離純化得到的膠原蛋白在純度、理化性質(zhì)和膠原蛋白構(gòu)型方面有顯著的差異，其吸水速率慢，吸水倍率低，力學強度低，生物活性差。因此本發(fā)明選擇生物體內(nèi)含量最為豐富的動物跟腱作為原材料，同時，針對原料中的可能存在的危險因素在生產(chǎn)過程進行控制，以便獲得具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種具有生物活性的膠原蛋白海綿及其制備方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏高純度、生物活性結(jié)構(gòu)、生物相容性良好、表面平整細膩、質(zhì)地柔軟、富有彈性等特點的膠原蛋白海綿的問題。為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種具有生物活性的膠原蛋白海綿的制備方法，包括以下步驟：1)取動物跟腱，清洗、冰凍切片后除脂、清洗，備用；優(yōu)選地，所述動物跟腱為牛、馬、羊、豬等動物的跟腱。更優(yōu)選地，所述動物跟腱為?；蝰R的跟腱。優(yōu)選地，所述動物跟腱要剔除筋膜。所述剔除筋膜目的在于初步除去脂肪和其他雜蛋白。優(yōu)選地，所述冰凍為成束整裝冰凍。所述成束整裝是將剔除筋膜并用水清洗后的動物跟腱按順序并排在一起，捆成束處理。更優(yōu)選地，所述冰凍在低溫冰箱中進行。所述低溫冰箱為醫(yī)學生物領(lǐng)域中常規(guī)使用的低溫冰箱。更優(yōu)選地，所述冰凍的條件為：冰凍溫度：-20至-40℃；冰凍時間≥12h；所述動物跟腱避免反復凍融。優(yōu)選地，所述切片采用切片機將凍好的跟腱束切成薄片。所述切片機為醫(yī)學生物領(lǐng)域中常規(guī)使用的切片機。更優(yōu)選地，所述薄片的厚度為0.5-5mm。所述薄片切片時只管厚度，體積由牛筋本身形狀決定。優(yōu)選地，所述除脂是將跟腱片用除脂液浸泡后再用水清洗。更優(yōu)選地，所述除脂液為碳酸氫鈉與乙醇水溶液的混合液。所述除脂液能夠去除跟腱片上的脂肪。最優(yōu)選地，所述除脂液中所含碳酸氫鈉的終濃度為0.5-5％(m/V)，所含乙醇的終濃度為70-90％(V/V)。所述終濃度是指溶液中溶質(zhì)的最后濃度。更優(yōu)選地，所述除脂液浸泡條件為：浸泡次數(shù)：2-5次；浸泡時間：15-30min。更優(yōu)選地，所述跟腱片與除脂液加入的質(zhì)液比為1：10-25(g/mL)。2)取步驟1)的跟腱片，分散于水中，再加入胰蛋白酶處理并清洗；優(yōu)選地，所述含跟腱片的水的pH值調(diào)整為8.0-8.5。所述pH值調(diào)整采用堿液調(diào)整。所述堿液為氨水或氫氧化鈉水溶液。優(yōu)選地，所述跟腱片與水溶液的質(zhì)液比為1：10-100(g/mL)。優(yōu)選地，所述胰蛋白酶與水加入的質(zhì)液比為25-250：100000(g/mL)。即所述胰蛋白酶加入到水中，形成胰蛋白酶水溶液的濃度為0.025-0.25％(m/v)。優(yōu)選地，所述胰蛋白酶處理條件為：反應溫度：35-40℃，優(yōu)選為37℃；反應時間：0.5-2h。所述跟腱片與胰蛋白酶反應，能夠去除跟腱片中的部分雜蛋白。優(yōu)選地，上述步驟1)或2)中，所述清洗均為用水清洗。所述用水清洗時，使跟腱片的pH值與純化水的pH值接近，調(diào)整pH值至7，為中性。更優(yōu)選地，所述用水清洗條件為：清洗時間：3-10min，次數(shù)：2-5次。3)取步驟2)的跟腱片加酸浸泡后分散，再在分散液中加入胃蛋白酶，反應后收集酶解液；優(yōu)選地，所述跟腱片與酸加入的質(zhì)液比為1：50-150(g/mL)。優(yōu)選地，所述酸選自乙酸、鹽酸中的任意一種。所述酸為pH＝2-4的稀酸水溶液。更優(yōu)選地，所述乙酸(醋酸)水溶液的摩爾濃度為0.1-1M；所述鹽酸水溶液的摩爾濃度為0.01-0.1M。優(yōu)選地，所述酸浸泡時間為0.5-4h。所述酸浸泡能夠使跟腱片充分溶脹。優(yōu)選地，所述分散是將跟腱片與酸充分混合均勻。從而使成團的跟腱片均勻的分散在稀酸溶液中，便于在提取時更充分更均勻的反應。優(yōu)選地，所述分散采用組織搗碎機進行。所述組織搗碎機為醫(yī)學生物領(lǐng)域中常規(guī)使用的組織搗碎機。優(yōu)選地，所述跟腱片與胃蛋白酶加入的質(zhì)量之比為20-200：1。更優(yōu)選的，所述跟腱片與胃蛋白酶加入的質(zhì)量之比為50-150：1。優(yōu)選地，所述酶溶解的條件為：反應溫度：0-20℃；反應時間：24-96h；攪拌周期：每隔1h攪拌5-15min；攪拌速率：50～100rpm/min。更優(yōu)選地，所述攪拌周期為每隔1h攪拌10min。優(yōu)選地，所述收集酶解液采用離心收集上清液或壓濾收集濾液的方式收集。更優(yōu)選地，所述離心收集上清液的條件：離心力：5000-10000g；離心時間：10-60min；離心溫度：2-8℃。更優(yōu)選地，所述壓濾收集濾液的條件：壓力：0.1-0.5MPa；濾網(wǎng)目數(shù)：40-200目。所述壓濾收集濾液采用壓濾器進行。4)在步驟3)中獲得的酶解液中加入硫酸鈉水溶液，攪拌后靜置，取沉淀產(chǎn)物離心后收集沉淀物A；優(yōu)選地，所述硫酸鈉水溶液的濃度為15％-20％(m/V)。更優(yōu)選地，所述硫酸鈉水溶液的濃度為20％(m/V)。優(yōu)選地，所述硫酸鈉水溶液與酶解液加入的體積之比為1：1-4。優(yōu)選地，所述攪拌條件為：攪拌時間為1-10min；攪拌器轉(zhuǎn)速：1～10rpm/min。所述攪拌為輕微攪拌。優(yōu)選地，所述靜置時間為12-24h。所述靜置能夠使反應液充分完成自組裝。優(yōu)選地，所述離心的條件為：離心力：1000-5000g；離心時間：5-30min；離心溫度：2-8℃。5)取步驟4)中獲得的沉淀物A，加水重溶并調(diào)節(jié)pH，靜置，將再次沉淀產(chǎn)物重復進行離心清洗后收集沉淀物B；優(yōu)選地，所述加水重溶是指加入水使沉淀物A重新溶解。更優(yōu)選地，所述沉淀物A與水加入的質(zhì)量之比為：1：1-5。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)pH是通過滴加堿液進行。所述堿液優(yōu)選為氨水或氫氧化鈉水溶液。所述加水重溶并調(diào)節(jié)pH，能夠使沉淀物二次自組裝。優(yōu)選地，所述pH值控制在6-7之間。優(yōu)選地，所述靜置時間為12-24h。優(yōu)選地，所述再次沉淀產(chǎn)物的離心清洗，包括以下步驟：A)將再次沉淀產(chǎn)物進行離心后收集沉淀，用水清洗后，靜置，再離心后收集沉淀；更優(yōu)選地，所述離心的條件為：離心力：1000-5000g；離心時間：5-30min；離心溫度：2-8℃。更優(yōu)選地，所述水洗條件為：用量：跟腱與水的質(zhì)量之比為1：10-50；清洗時間：10-20min。更優(yōu)選地，所述靜置時間為5-15min。B)重復進行步驟A)后，收集獲得沉淀物B。更優(yōu)選地，所述重復次數(shù)為2-5次。所述中和產(chǎn)物的離心清洗能夠洗去反應沉淀物上的多余鹽分。6)將步驟5)中獲得的沉淀物B，加酸溶解后純化，純化完成后收集液體；優(yōu)選地，所述酸為弱酸稀溶液。更優(yōu)選地，所述弱酸稀溶液為乙酸(醋酸)水溶液，其摩爾濃度為0.01-0.3M。優(yōu)選地，所述沉淀物B加酸溶解后溶液的濃度為1-10mg/mL。優(yōu)選地，所述純化采用Akata蛋白純化系統(tǒng)，在Superdex-200凝膠柱中純化。所述Akata蛋白純化系統(tǒng)及Superdex-200凝膠柱均為GE公司生產(chǎn)的商業(yè)化設(shè)備。優(yōu)選地，所述純化時，收集管數(shù)為29-39的純化膠原蛋白液。7)將6)中收集到的純化后膠原蛋白液體進行透析，透析后脫水濃縮，獲得膠原原液，再將膠原原液進行冷凍干燥，即得膠原蛋白海綿。優(yōu)選地，所述透析在透析袋中進行。優(yōu)選地，所述透析依次分別采用透析外液、純化水進行透析。更優(yōu)選地，所述透析外液為磷酸氫二鈉水溶液。最優(yōu)選地，所述磷酸氫二鈉水溶液的濃度為0.001-0.01M。更優(yōu)選地，所述透析條件為：透析溫度：2-8℃；透析外液的透析次數(shù)：1次；透析外液的一次透析時間：12-24h；純化水的透析次數(shù)：2-5次；純化水的一次透析時間：3-9h。所述透析過后溶液的pH值與純化水的pH值接近，為中性。優(yōu)選地，所述脫水濃縮的條件為：透析外液：分子量十萬以上的聚乙二醇水溶液；透析外液濃度：0.1-10％(m/V)；脫水濃縮時間：12-20h；濃縮后膠原蛋白液體的濃度：5-20mg/mL。更優(yōu)選地，所述脫水濃縮的條件為：透析外液：分子量十萬以上的聚乙二醇水溶液；透析外液濃度：1-5％(m/V)；脫水濃縮時間：12-20h；濃縮后膠原蛋白液體的濃度：8-16mg/mL。所述脫水濃縮采用透析方式，由于聚乙二醇水溶液對水具有吸附作用，通過采用分子量十萬以上的聚乙二醇溶液為透析外液，對透析后的膠原蛋白液體進一步透析，脫水濃縮，當脫水使透析袋中膠原蛋白液體濃縮達到一定濃度時，停止透析，即得膠原原液。濃縮后所述膠原蛋白液體的濃度采用藥典2010年版二部附錄ⅦM中《蛋白質(zhì)含量測定法第三法：雙縮脲法測定蛋白濃度》進行測定。優(yōu)選地，所述膠原原液要倒入不銹鋼盤中，進行冷凍干燥。優(yōu)選地，所述冷凍干燥采用凍干機凍干方式進行。所述凍干機為醫(yī)學生物領(lǐng)域中常規(guī)使用的凍干機。更優(yōu)選地，所述凍干機凍干方式的條件為：預凍溫度：-45±5℃；預凍時間：4-12h；冷凍干燥時間：24-72h。最優(yōu)選地，所述預凍溫度為-45℃。優(yōu)選地，上述用水均為純化水。所述純化水為藥典中記載的飲用水經(jīng)蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制得的供藥用的水，不含任何添加劑。優(yōu)選地，所述膠原蛋白海綿制得后，還要進行包裝、滅菌。更優(yōu)選地，所述滅菌采用Co60輻射滅菌。本發(fā)明第二方面提供一種采用上述方法制備的具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿。優(yōu)選地，所述膠原蛋白海綿的厚度為1-10mm。所述膠原蛋白海綿的厚度有助于海綿外觀形態(tài)的美化。更優(yōu)選地，所述膠原蛋白海綿的厚度為2-5mm。優(yōu)選地，所述膠原蛋白海綿具有生物活性和三螺旋結(jié)構(gòu)，其純度＞99％，孔徑為50-350μm，孔隙率＞90％。本發(fā)明第三方面提供一種具有生物活性的膠原蛋白海綿的制備方法在制備從動物跟腱中獲得具有生物活性的高純度膠原蛋白海綿的用途。如上所述，本發(fā)明的一種具有生物活性的膠原蛋白海綿及其制備方法，通過將動物跟腱采用特殊的酶解、自組裝、凝膠層析、透析等純化過程制得純度大于99％的高純度膠原蛋白，再通過特殊的冷凍干燥程序制備出的膠原蛋白海綿，具有以下優(yōu)益效果：(1)本發(fā)明中制備的膠原蛋白海綿，純度高，通過二次自組裝三螺旋結(jié)構(gòu)保持完整，分子完整性好。(2)本發(fā)明中制備的膠原蛋白海綿，表面平整細膩，孔徑大小均勻，質(zhì)地柔軟，富有彈性，可彎折，空隙率高，更有利于液體吸收，吸水倍率高，可用于自然腔道填充。(3)本發(fā)明中制備的膠原蛋白海綿，可生物降解、具有良好的細胞適應性，促進細胞增殖和促進血凝等特點，可用于創(chuàng)面快速止血，可有效快速止血，防止創(chuàng)面血液滲出。同時，該膠原蛋白海綿具有促進成纖維細胞活性和各種生長因子活性的特點，良好的降解性能可作為創(chuàng)面細胞和組織的生長支架，使止血后的創(chuàng)面更好的修復。(4)本發(fā)明中制備的膠原蛋白海綿，具有低免疫原性、具有良好生物活性及相容性，通過制造過程中的特殊工序，降低免疫原性，使膠原蛋白海綿的安全性得到更好的保障。附圖說明圖1顯示為本發(fā)明中膠原蛋白凝膠層析圖。圖2顯示為本發(fā)明中膠原蛋白提取過程中產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖。圖3顯示為本發(fā)明實施例中膠原蛋白的SDS-PAGE電泳圖。圖4顯示為本發(fā)明中膠原蛋白海綿的表面外觀示意圖。圖5顯示為本發(fā)明中膠原蛋白海綿的掃描電鏡圖(200倍)。圖6顯示為本發(fā)明中膠原蛋白海綿的透射電鏡圖。圖7顯示為本發(fā)明中膠原蛋白海綿的細胞毒性試驗結(jié)果圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復數(shù)形式。當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。本發(fā)明中使用的儀器裝置及其試劑均為常規(guī)使用的儀器裝置及試劑，均可從市場上購買獲得。實施例1取18～24月齡新鮮牛跟腱，剔除筋膜，用純化水沖洗3次，每次4min，然后成束整裝冰凍，冰凍在低溫冰箱中進行，冰凍溫度為-20至-40℃，冰凍時間≥12h，并避免反復凍融。用切片機將凍好的跟腱束切成0.5mm的薄片。稱取牛跟腱薄片40g，用1％(m/V)碳酸氫鈉的75％(V/V)乙醇水溶液作為除脂液浸泡3次，浸泡時間為20min后除去脂肪，純化水沖洗3次，時間4min至pH與純化水接近為中性。取上述經(jīng)處理的跟腱片分散于2L純化水中，調(diào)整pH為8.0，加入終濃度為0.1％的胰蛋白酶，在37℃的反應溫度中反應2h，純化水沖洗3次，時間4min至pH與純化水接近為中性。然后加入0.5M醋酸溶液2000mL浸泡，溶脹30min后，采用組織搗碎機分散，加入胃蛋白酶2g，在16℃條件下酶解72h，期間每隔1h攪拌器攪拌10min。反應完成后采用壓濾器壓濾，條件為：壓力0.2MPa，篩網(wǎng)為120目，收集濾液。配制20％硫酸鈉500mL，加入上述濾液，緩慢攪拌5min，靜置16h后收集沉淀，并將沉淀物在4℃離心力為5000g下離心10min，收集沉淀物A。再加水重溶沉淀物A，沉淀物A與水加入的質(zhì)量之比為1：5，完全溶解后緩慢滴加氨水溶液，調(diào)節(jié)pH至6.5，靜置16h后，將自組裝后的產(chǎn)物4℃下離心10min，離心力為5000g，收集沉淀加純化水清洗10-20min后，靜置10min，在離心力為5000g、4℃條件下離心收集沉淀物B，重復3次。將清洗后的沉淀物B中加入0.05M醋酸水溶液，配制成2mg/mL的溶液，在Akata蛋白純化系統(tǒng)，Superdex-200凝膠柱中純化，純化完成后收集液體。將收集的純化產(chǎn)物裝入透析袋中，放入0.01M磷酸氫二鈉溶液透析16h后，更換透析外液為純化水，每隔4h換水一次，直至透析袋中原液pH與純化水pH接近為中性。透析完成后，將透析外液換為2％聚乙二醇水溶液(分子量為十萬)，透析12h脫水濃縮，測定透析袋中膠原蛋白濃度，調(diào)節(jié)膠原原液濃度為10mg/mL。將原液倒入316L不銹鋼盤中鋪平，開啟凍干機預凍將凍干盤轉(zhuǎn)移至凍干機中，并開始凍干程序進行凍干，其中，預凍溫度為-45℃，預凍時間為8h；冷凍干燥時間為48h。得到膠原蛋白海綿樣品1#，其厚度為2-5mm。制備過程中的相關(guān)數(shù)據(jù)圖表如下：膠原蛋白溶液進行層析純化，見圖1，由圖1顯示收集峰值蛋白獲得純化膠原蛋白的過程。將膠原蛋白提取步驟中的樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，具體結(jié)果見圖2，由圖2可知膠原蛋白在提取過程純度不斷提高。將膠原蛋白進行凝膠電泳檢測，具體結(jié)果見圖3，由圖3可知本發(fā)明提取的膠原蛋白純度非常高，其純度＞99％。由圖4可知，膠原蛋白海綿表面平整細膩，孔徑大小均勻，質(zhì)地柔軟，富有彈性，可彎折180°。將膠原蛋白海綿樣品1#進行掃描電鏡測試，具體結(jié)果見圖5，由圖5可知膠原蛋白海綿孔徑大小較為均勻，孔徑為50-350μm，孔隙率高。膠原蛋白海綿樣品1#進行透射電鏡測試，具體結(jié)果見圖6，由圖6可知膠原蛋白具有周期性橫紋結(jié)構(gòu)，具有生物活性。將膠原蛋白海綿樣品1#進行細胞毒性試驗，具體結(jié)果見圖7，由圖7可知膠原蛋白海綿無細胞毒性。由上述圖表數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明中制備方法制備的膠原蛋白海綿具有優(yōu)異的性能。實施例2取18～24月齡新鮮牛跟腱，剔除筋膜，純化水沖洗5次，時間5min，然后成束整裝冰凍，冰凍在低溫冰箱中進行，冰凍溫度為-20至-40℃，冰凍時間為12h，并避免反復凍融。用切片機將凍好的跟腱束切成0.5mm的薄片，稱取牛跟腱40g，用1％(m/V)碳酸氫鈉的75％(V/V)乙醇水溶液作為除脂液浸泡5次，浸泡時間為30min后除去脂肪，純化水沖洗5次，每次5min至pH與純化水接近為中性。取上述經(jīng)處理的跟腱片分散于1L純化水中，調(diào)整pH至8.2，加入終濃度為0.1％的胰蛋白酶，在40℃的反應溫度中反應2h，純化水沖洗5次，每次5min至pH與純化水接近為中性。然后加入0.01M鹽酸溶液2000mL浸泡，溶脹30min后，采用組織搗碎機分散，加入胃蛋白酶2g，在16℃條件下酶解72h，期間每隔1h攪拌器攪拌10min。反應完成后采用離心機在4℃離心力為5000g下10min，收集濾液。配制20％硫酸鈉500mL，加入上述濾液，緩慢攪拌5min，靜置16h后收集沉淀，并將沉淀物在4℃下10min，離心力為5000g，收集沉淀物A。加水重溶沉淀，沉淀物A與水加入的質(zhì)量之比為1：1，完全溶解后緩慢滴加氫氧化鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH至6.5，靜置16h后，將自助裝后的產(chǎn)物4℃離心力為5000g下離心10min，收集沉淀加純化水清洗10-20min后，靜置10min，在離心力為5000g、4℃條件下離心收集沉淀物B，重復3次。將清洗后的沉淀物B中加入0.05M醋酸水溶液進行溶解，配制成2mg/mL的溶液，在Akata蛋白純化系統(tǒng)，Superdex-200凝膠柱中純化，純化完成后收集液體。將收集的純化產(chǎn)物裝入透析袋中，放入0.01M磷酸氫二鈉溶液透析16h后，更換透析外液為純化水，每隔4h換水一次，直至透析袋中原液pH與純化水pH接近為中性。透析完成后，將透析外液換為2％聚乙二醇水溶液(分子量為十萬)，透析12h脫水濃縮，測定透析袋中膠原蛋白濃度，調(diào)節(jié)膠原原液濃度為10mg/mL。將原液倒入316L不銹鋼盤中鋪平，開啟凍干機將凍干盤轉(zhuǎn)移至凍干機中，并開始凍干程序進行凍干，其中，預凍溫度為-45℃，預凍時間為10h；冷凍干燥時間為72h。得到膠原蛋白海綿樣品2#，其厚度為2-5mm。獲得的膠原蛋白海綿樣品2#具有生物活性、無細胞毒性、純度高、表面平整細膩，孔徑大小均勻，質(zhì)地柔軟，富有彈性等優(yōu)異性能。實施例3取18～24月齡新鮮牛跟腱，剔除筋膜，純化水沖洗4次，時間3min，然后成束整裝冰凍，冰凍在低溫冰箱中進行，冰凍溫度為-20至-40℃，冰凍時間為15h，并避免反復凍融。用切片機將凍好的跟腱束切成5mm的薄片，稱取牛跟腱40g，用5％(m/V)碳酸氫鈉的90％(V/V)乙醇水溶液作為除脂液浸泡2次，浸泡時間為15min后除去脂肪，純化水沖洗4次，每次10min至pH與純化水接近為中性。取上述經(jīng)處理的跟腱片分散于400mL純化水中，調(diào)整pH為8.5，加入終濃度為0.025％的胰蛋白酶，在40℃的反應溫度中反應2h，純化水沖洗4次，每次10min至pH與純化水接近為中性。然后加入0.01M鹽酸溶液6000mL浸泡，溶脹4h后，采用組織搗碎機分散，加入胃蛋白酶0.2g，在20℃條件下酶解96h，期間每隔1h攪拌器攪拌15min。反應完成后采用離心機在2℃離心力為10000g下60min，收集濾液。配制15％硫酸鈉500mL，加入上述濾液，緩慢攪拌10min，靜置24h后收集沉淀，并將沉淀物在8℃離心力為1000g下30min，收集沉淀物A。加水重溶沉淀，沉淀物A與水加入的質(zhì)量之比為1：3，完全溶解后緩慢滴加氫氧化鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH至6.5，靜置24h后，將自助裝后的產(chǎn)物6℃離心力為3000g下離心20min，收集沉淀加純化水清洗10-20min后，靜置15min，在離心力為3000g、6℃條件下離心收集沉淀物B，重復3次。將清洗后的沉淀物B中加入0.3M醋酸水溶液進行溶解，配制成5mg/mL的溶液，在Akata蛋白純化系統(tǒng)，Superdex-200凝膠柱中純化，純化完成后收集液體。將收集的純化產(chǎn)物裝入透析袋中，放入0.001M磷酸氫二鈉溶液透析24h后，更換透析外液為純化水，每隔6h換水一次，直至透析袋中原液pH與純化水pH接近為中性。透析完成后，將透析外液換為1％聚乙二醇水溶液(分子量為十萬)，透析20h脫水濃縮，測定透析袋中膠原蛋白濃度，調(diào)節(jié)膠原原液濃度為15mg/mL。將原液倒入316L不銹鋼盤中鋪平，開啟凍干機將凍干盤轉(zhuǎn)移至凍干機中，并開始凍干程序進行凍干，其中，預凍溫度為-50℃，預凍時間為12h；冷凍干燥時間為48h。得到膠原蛋白海綿樣品3#，其厚度為1-10mm。獲得的膠原蛋白海綿樣品3#具有生物活性、無細胞毒性、純度高、表面平整細膩，孔徑大小均勻，質(zhì)地柔軟，富有彈性等優(yōu)異性能。對比例1按照現(xiàn)有常規(guī)方法制備膠原蛋白海綿樣品1*，具體步驟如下：將新鮮牛跟腱去脂肪、筋膜，切成片，生理鹽水反復浸泡清洗，去除血清和脂肪，再用純化水漂洗3次將40g跟腱加入2000mL0.5M的醋酸水溶液中，加入胃蛋白酶1g，在室溫條件下酶解72h，期間每天用攪拌器攪拌一次，每次30min。反應完成后采用離心機在4℃下4000g離心10min，收集濾液。將收集的濾液倒入500mL飽和氯化鈉溶液中，攪動10min，靜置16h，并將沉淀物在4℃離心力為5000g下離心10min，收集沉淀。將沉淀裝入透析袋中，置于0.05M醋酸溶液中透析48h，透析袋中為凝膠狀時換0.01M醋酸溶液中透析48h，然后換純化水透析108h，至pH與水接近為中性。將原液倒入316L不銹鋼盤中鋪平，放入凍干機進行凍干，其中，預凍溫度為-30℃，預凍時間為8h；冷凍干燥時間為48h。得到膠原蛋白海綿樣品1*。實施例4將實施例1-2與對比例1中提取獲得的膠原蛋白海綿樣品進行相關(guān)性能測試，具體數(shù)據(jù)見表1。表1膠原蛋白海綿的性能比較性能指標標準值樣品1#樣品2#樣品1*純度90.0％99.6％99.6％95.1％吸水力≥20倍60倍62倍45倍pH4.0-7.05.955.895.05脂質(zhì)體≤1％0.2％0.2％1.2％孔隙率＞90％97.9％98.4％92.1％拉伸性能＞0.5N0.8565N0.8847N0.5233N由表1中數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明中制備方法制備的膠原蛋白海綿樣品，其性能指標不僅優(yōu)于標準值，也優(yōu)于對比例中的樣品，純度可以達到99％以上，吸水力強，孔隙率高，拉伸強度高，具有非常好的實用性能。上述表1中的各項性能指標的具體意義如下：純度：按照中國藥典2010年版二部附錄ⅤF進行測定：經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)(bio-rad)掃描，測定計算膠原蛋白純度。吸水力：按照中國藥典2010年版二部吸收性明膠海綿中檢查吸水力方法進行測試。pH：按照中國藥典2010年版二部附錄ⅥHpH值測定法進行測定：取樣品0.1g放入燒杯中，加入20mL蒸餾水，于37℃下浸泡24h±1h。脂質(zhì)體：取2.0g樣品干燥失水后的樣品，按照GB/T5009.6規(guī)定的方法進行測定，酸水解法測定脂質(zhì)體含量。孔隙率：取產(chǎn)品1塊，剪成合適大小，精密稱重，記為m1，取帶有刻度的容器，清洗并干燥后向里加入指定刻度(記為V)的純化水，稱重，記為m2，將稱量好的樣品放入裝有水的容器內(nèi)，用玻璃棒小心的趕去試樣中的氣泡，使其吸飽水，注意不使試樣破裂，待試樣吸飽水后，向容器中加水到指定刻度(V),將容器外周水擦干后稱重，記為m3，用鑷子夾住試樣一角把試樣從容器中取出，在容器上方靜置1min后，稱量容器和剩余水的質(zhì)量，記為m4。按下式計算。共隨機抽取試樣5份，以平均值報告孔隙率：θ＝(m3-m4-m1)/(m2-m4)式中：θ——試樣的孔隙率；m1——試樣質(zhì)量，g；m2——加入指定刻度水后容器和水的質(zhì)量，g；m3——加水到指定刻度容器、水和試樣的質(zhì)量，g。拉伸性能：取樣品1片，剪成1cm×2cm長的膠原條，用扁平夾子夾住兩端，拉力機測定其抗拉性能。實施例5將實施例1中的提取獲得的膠原蛋白海綿樣品1#進行細胞毒性測試，具體數(shù)據(jù)見表2。表2：1#樣品細胞毒性實驗結(jié)果樣品及稀釋比例增值率(％)毒性等級100％110.3050％105.3025％102.8012.5％103.20陰性99.31陽性20.64由表2中數(shù)據(jù)并結(jié)合圖7可知，本發(fā)明中方法制備的膠原蛋白海綿無細胞毒性，安全性得到更好的保障。所以，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。