本發(fā)明提供一種桂花萃取物用于制備促進(jìn)毛發(fā)增長組合物及傷口愈合組合物的用途。

背景技術(shù)：

桂花(Osmanthus fragrans(Thunb)Lour.)，為木犀科(Oleaceae)木犀屬(Osmanthus)常綠灌木，花芳香，可萃取其精油，制備桂花浸膏，并可用于食品及化妝品的生產(chǎn)，在醫(yī)療上，具有溫肺化飲及散寒止痛作用。在藥用上，其根或根皮可用于治胃痛、牙痛、風(fēng)濕麻木及筋骨疼痛；其花可用于化痰、散瘀、治痰飲咳喘、腸風(fēng)血痢、疝瘕、牙痛及口臭；而其果實(shí)可用于暖胃、平肝、益腎、散寒及治肝胃氣痛。

曾有中國臺灣專利公告第I341205號(專利申請案第096137207號)，揭示一種由桂花中萃取抗氣喘物質(zhì)的方法，以乙醇萃取得具抗氣喘生理功效的物質(zhì)，可減緩呼吸道及肺部的慢性發(fā)炎癥狀，達(dá)到舒緩氣喘癥狀，及預(yù)防與減少氣喘的發(fā)作，具有明顯的保健作用。中國臺灣專利公告第I442929號(專利申請案第101118954號)，揭示一種桂花水萃取的產(chǎn)物可被用來治療肺纖維化的用途。中國臺灣專利公告第I411440號(專利申請案第100119436號)，揭示一種桂花萃取物在制備預(yù)防或治療憂郁癥藥物或保健食品的用途。

另有中國專利公開第CN103768152A號(專利申請案第201410043501.8號)，揭示一種桂花苯乙醇苷提取物制備防治糖尿病的食品、藥物或保健品的應(yīng)用。中國專利公開第CN103767975A號(專利申請案第201410043486.7號)，揭示一種桂花苯乙醇苷提取物制備美白化妝品的應(yīng)用。中國專利公開第CN103768151A號(專利申請案第201410043488.6號)，揭示一種桂花苯乙醇苷提取物制備抗衰老藥物或保健品的應(yīng)用。中國專利公開第CN103223018A號(專利申請案第201310169455.1號)，揭示一種桂花多酚類提取物在制備抗腫瘤藥物或保健品的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

然而并無任一相關(guān)文獻(xiàn)曾報(bào)導(dǎo)桂花或其萃取物具有促進(jìn)毛發(fā)增長及傷口愈合的用途。本發(fā)明非可預(yù)期的發(fā)現(xiàn)一種桂花萃取物用于促進(jìn)毛發(fā)增長及傷口愈合的新穎用途。

本發(fā)明一方面提供一種桂花萃取物用于制備促進(jìn)毛發(fā)增長組合物的用途。

本發(fā)明另一方面提供一種桂花萃取物用于制備促進(jìn)傷口愈合組合物的用途。

在本發(fā)明實(shí)施例中，本發(fā)明桂花萃取物可促進(jìn)血管新生、及促進(jìn)膠原蛋白生成。

在本發(fā)明實(shí)施例中，本發(fā)明桂花萃取物其中該桂花萃取物系先以純水萃取后再以乙醇溶液萃取而得。

本發(fā)明的這些及其它方面，可通過以下的較佳具體實(shí)施例的描述以及附圖，得以更為明晰；即便其中可能會有變化或修飾，但不背離本發(fā)明所揭露的新穎觀念的精神及范疇。

附圖說明

在本發(fā)明里所呈現(xiàn)的較佳具體實(shí)施例圖示系以闡述本發(fā)明為目的。應(yīng)被理解的是，本發(fā)明并不局限于所示的較佳具體實(shí)施例。

圖1A-圖1C顯示本發(fā)明桂花萃取物其促進(jìn)毛發(fā)生長的結(jié)果。圖1A顯示各組別第0至28天毛發(fā)生長情形。圖1B顯示第0至28天的毛發(fā)生長分?jǐn)?shù)(誤差杠，SE；*，P<0.05)。圖1C顯示各組別的皮膚組織染色結(jié)果。

圖2A-圖2B顯示本發(fā)明桂花萃取物于非感染性創(chuàng)傷模式中傷口愈合的結(jié)果。圖2A顯示第0至18天的傷口愈合效率(誤差杠，SE；*，P<0.05)。圖2B顯示第0至18天該傷口的愈合情形。

圖3A-圖3B顯示本發(fā)明桂花萃取物于感染性創(chuàng)傷模式中該傷口的愈合結(jié)果。圖3A顯示第0至18天的傷口愈合效率(誤差杠，SE；*，P<0.05)。圖3B顯示第0至18天該傷口的愈合情形。

圖4A-圖4B顯示本發(fā)明桂花萃取物于非感染性創(chuàng)傷模式或感染性創(chuàng)傷模式中促進(jìn)血管新生的效果。圖4A顯示在非感染性創(chuàng)傷模式中各組別對于血管新生的影響。圖4B顯示在感染性創(chuàng)傷模式中各組別對于血管新生的影響。

圖5顯示本發(fā)明桂花萃取物的間接抑菌效果；系于非感染性創(chuàng)傷模式或感染性創(chuàng)傷模式中，以金黃色葡萄球菌感染傷口，經(jīng)各組別處理后的傷口周圍化膿組織的含菌數(shù)。

具體實(shí)施方式

除非另有定義，所有本文所用的技術(shù)性及科學(xué)性術(shù)語，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，皆具有與其所已知的相同意義。

除非文中有清楚指明，于本文中所使用的單數(shù)形式“一”、“一種”、及“該”的涵義均為包括“至少一種”的復(fù)數(shù)形式。因此，例如，當(dāng)提及“一成分”時，包括復(fù)數(shù)個這些成分及對本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的同等物。

此處所使用的“萃取物”指針對一材料進(jìn)行萃取所得的產(chǎn)物，通常是藉由將所欲萃取的材料浸泡或混合于溶劑中而獲得的溶液或濃縮制劑。典型地，萃取物系制備自新鮮植物或經(jīng)研磨或干燥的植物樣本。

此處所使用的“傷口”包括感染性傷口或非感染性傷口，系指是對于表皮的傷害(例如皮膚的真皮層)的傷害，包括皮膚撕裂、切斷、或刺破。傷口包括但不限于開放性傷口，例如切口、砍傷、割傷、擦傷、刺傷、外傷性皮膚損傷、滲透性創(chuàng)傷，燒傷；疾病或其它慢性組織損傷導(dǎo)致的傷口；由外來傷害或外科手術(shù)導(dǎo)致的傷口；醫(yī)療過程引起的傷口，例如皮膚科手術(shù)。傷口亦可由皮質(zhì)類固醇反應(yīng)所以引起皮膚癥狀，例如過敏性皮膚炎。

根據(jù)本發(fā)明，于動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)桂花萃取物具有促進(jìn)毛發(fā)增長的功效。因此，本發(fā)明提供一種桂花萃取物用于制備促進(jìn)毛發(fā)增長組合物的用途。該促進(jìn)毛發(fā)增長組合物可制成藥物、洗發(fā)精、潤絲精、護(hù)發(fā)劑、染發(fā)劑、發(fā)油或噴劑的形式。

另一方面，本發(fā)明又提供一種桂花萃取物促進(jìn)傷口愈合的功效。因此，本發(fā)明提供一種桂花萃取物用于制備促進(jìn)傷口愈合組合物的用途。該促進(jìn)傷口愈合組合物可制成藥物、護(hù)膚劑、防蟲劑或噴劑的形式。

根據(jù)本發(fā)明，該傷口可為感染性傷口或非感染性傷口。在本發(fā)明一特定實(shí)施例中，其中該感染性傷口系為金黃色葡萄球菌所感染。

如本發(fā)明實(shí)施例所載，本發(fā)明桂花萃取物可促進(jìn)血管新生、及促進(jìn)膠原蛋白生成。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施態(tài)樣，該桂花萃取物系先以純水萃取后再以乙醇溶液萃取而得。其中一實(shí)施例中，該桂花萃取物系取桂花(Osmanthus fragrans)以純水萃取過濾濃縮后，再以乙醇溶液進(jìn)行萃取，再經(jīng)過濾且濃縮后而得。

為實(shí)施本發(fā)明，該桂花萃取物可制成各種類型的組合物的形式使用。其中該組合物可為一種溶液、水凝膠、噴霧劑、滴劑或軟膏的形式。此外，亦可進(jìn)一步包含其他抗菌劑、消炎藥、清潔或護(hù)膚的組成份。

依本發(fā)明，其藥品型式可依任何習(xí)知技術(shù)配合常用的賦形劑或填充劑。亦可依一般醫(yī)藥上常用的技術(shù)或方法，含有醫(yī)療有效量的本發(fā)明桂花萃取物，佐以醫(yī)藥上可接受的載劑調(diào)制成藥品。

以上述發(fā)明說明以及下列實(shí)施例說明本發(fā)明，但并非用以限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1：桂花萃取物的制備及其處理

取1.0kg桂花(Osmanthus fragrans)加入10-20倍體積的純水，加熱萃取并過濾，接著將萃取液濃縮后，再以乙醇溶液進(jìn)行萃取，過濾且濃縮后，可得桂花萃取物(約250.4g)。

實(shí)施例2：毛發(fā)生長模式評估

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)動物系購自國家實(shí)驗(yàn)動物中心的C57BL/6小鼠，年齡為6周。該實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于國防醫(yī)學(xué)院動物中心，其動物房溫度維持18～26℃，相對濕度為30％～70％，光照周期為12小時光照，12小時黑夜，并且提供充足飼料和飲水。

為確認(rèn)桂花萃取物的促進(jìn)毛發(fā)生長的活性進(jìn)行分組處理，其中，正對照組為以習(xí)知的生發(fā)成分敏諾西迪(Minoxidil)處理。將小鼠隨機(jī)分為三組如下：空白對照組(BC；10％乙醇做為載劑)、正對照組(PC；3％敏諾西迪)及桂花萃取物(CE；1％加入10％乙醇中)。每一組各5只小鼠予以測試。桂花萃取物的促建毛發(fā)生長的活性系使用部分修改Choi等人的方法(Choi et al.,Biol Pharm Bull 37:44-53,2014)。簡而言的，小鼠藉由電剪小心剃除背側(cè)部一2cm×3cm面積的毛發(fā)。待測物(100μL)系局部施加于小鼠背側(cè)部的皮膚，每天1次連續(xù)4周。該待測物的毛發(fā)生長增進(jìn)活性系以背側(cè)部皮膚變黑作為評估標(biāo)準(zhǔn)，其表示該毛發(fā)的毛囊系于生長期。

毛發(fā)生長評分系由兩位不知悉實(shí)施方案的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室成員執(zhí)行。毛發(fā)生長系每周測量一次，連續(xù)4周，毛發(fā)生長分?jǐn)?shù)定義如下：0分＝?jīng)]有觀察到生長；1分＝達(dá)到20％生長；2分＝達(dá)到20-40％生長；3分＝達(dá)到40-60％生長；4 分＝達(dá)到60-80％生長；及5分＝達(dá)到80-100％生長。4周的毛發(fā)總生長數(shù)字影像系使用Nikon Cool Pix P100(Tokyo,Japan)攝得。將該二個別評分的平均作為評估毛發(fā)生長的毛發(fā)生長指數(shù)。

觀察小鼠處理后結(jié)果，于第16天時，發(fā)現(xiàn)桂花萃取物組較其他組其傷口外觀較完整、傷口組織表皮層已完全復(fù)原、真皮層結(jié)構(gòu)與正常小鼠較為相似。各組小鼠自處理后第0-28天的傷口照片影像如圖1A所示，相較于空白對照組及正對照組，桂花萃取物組在第14日起小鼠背部皮膚已長出毛發(fā)，其毛囊發(fā)育、毛發(fā)生成面積與毛發(fā)量在第16日起至28日止均顯著高于其他組別。其量化結(jié)果以毛發(fā)生長指數(shù)呈現(xiàn)，如圖1B顯示，以桂花萃取物處理的毛發(fā)生長相較于其他組有顯著差異(詳見圖1B)。各組小鼠傷口處理后的皮膚組織染色照片影像如圖1C所示，由皮膚組織染色可知相較于空白對照組及正對照組，桂花萃取物組其毛囊發(fā)育明顯且有毛發(fā)生長。由以上結(jié)果顯示，桂花萃取物具有促進(jìn)毛發(fā)生長的作用。

由實(shí)施例結(jié)果可知，本發(fā)明所提供的桂花萃取物能明顯促進(jìn)毛發(fā)生長的作用。

實(shí)施例3：傷口愈合實(shí)驗(yàn)動物模式評估

1.實(shí)驗(yàn)動物及模式

本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動物系購自國家實(shí)驗(yàn)動物中心的C57BL/6J Narl品系小鼠，體重40～45g，年齡為8周。該實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于國防醫(yī)學(xué)院動物中心，其動物房溫度維持18～26℃，相對濕度為30％～70％，光照周期為12小時光照，12小時黑夜，并且提供充足飼料和飲水。

各實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ降慕M別如下表所示：

其中，正對照組為敏諾西迪(Minoxidil)。

2.傷口處理

手術(shù)前將小鼠以腹腔注射方式給予0.6g/kg Avertin，其中該Avertin系以0.6g 2,2,2-三溴乙醇(2,2,2-Tribromoethanol)及1.5ml 2-甲基2丁醇(2-Methyl-2-butanol)混合后添加生理食鹽水至50ml，以0.2μm濾紙過濾，并以4℃保存。待小鼠麻醉后，將其背部毛發(fā)剃除。將紙卡固定于小鼠背部確定傷口位置，以麥克筆描繪出1.2x 1.2cm²的面積。使用手術(shù)剪刀將此面積內(nèi)的皮膚剪掉，形成傷口。于感染性創(chuàng)傷模式中，將金黃色葡萄球菌稀釋至10⁵CFU/150μl，并于每只小鼠加入150μl菌液，使菌液完全滲入皮膚內(nèi)約5分鐘(非感染性創(chuàng)傷模式不需進(jìn)行此步驟)。使用棉花棒沾取適量待測試藥物后，將其均勻涂抹在傷口上。使用防水透氣敷料(Tegaderm，3M)覆蓋傷口，以透氣膠帶將防水透氣敷料予以固定，避免防水透氣敷料脫落與其他傷口感染。

3.金黃色葡萄球菌培養(yǎng)與計(jì)算

以接種環(huán)挑取單一金黃色葡萄球菌菌落，以分區(qū)畫線法接種于LB瓊脂碟(LB agar plate)上，并于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約16小時。以接種環(huán)挑取單一金黃色葡萄球菌菌落，將其放入含有LB培養(yǎng)基的細(xì)菌培養(yǎng)試管培養(yǎng)約16小時。將試管中菌液取出，于4℃、7,000rpm下離心20分鐘。移除上清液，并將離心所得金黃色葡萄球菌菌體以LB培養(yǎng)基稀釋至1x 10⁷CFU/ml備用。

將菌液以序列稀釋至10^-9。從不同稀釋倍數(shù)試管中取出100μl菌液并加入LB瓊脂碟并均勻涂抹。在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約16小時并紀(jì)錄菌落數(shù)。原始菌液中每毫升所含菌數(shù)(CFU/ml)＝菌落數(shù)*稀釋倍數(shù)*10。

4.抑菌環(huán)試驗(yàn)

從不同稀釋倍數(shù)試管中取出100μl金黃色葡萄球菌液，分別滴于瓊脂碟并均勻涂抹，待菌液被瓊脂吸入后，以鑷子將濾紙平貼于瓊脂上，將每張濾紙滴入50μl桂花萃取物。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約16小時后，測量液菌直徑。抑菌環(huán)范圍＝抑菌環(huán)直徑(mm)－濾紙直徑(mm)。

5.傷口組織細(xì)菌含量試驗(yàn)

在感染性創(chuàng)傷模式小鼠實(shí)驗(yàn)第七天后，收集創(chuàng)傷小鼠背部傷口的化膿組織。將組織剪成碎片，并以超音波細(xì)胞粉碎機(jī)將組織打碎。于4℃下以1,500rpm離心8分鐘后，收集上清液。將該上清液進(jìn)行序列稀釋，菌液均勻涂抹于瓊脂上后，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約16小時后，計(jì)算菌落數(shù)。每克組織所含菌數(shù)(CFU/g)＝(菌落數(shù)*稀釋倍數(shù)*10)/組織克數(shù)。

6.皮膚組織切片及蘇木精及伊紅(Hematoxylin&Eosin,H&E)染色

將適量OCT(optimum cutting temperature)包埋劑加入鋁箔組織包埋盒內(nèi)，把新鮮取下的皮膚組織放入包埋盒內(nèi)，再加入OCT包埋劑將整個組織予以覆蓋，并放在液態(tài)氮上快速冷凍后，至于-70℃保存。在鋁合金組織標(biāo)本臺上加入適量OCT包埋劑，把預(yù)處理后的組織至于標(biāo)本臺上，接著將標(biāo)本臺放在切片機(jī)冷凍臺上冷凍，并把標(biāo)本臺放在切片機(jī)上且鎖緊。接著，以粗切模式(20μm)使組織塊形成平面，再利用細(xì)切模式(5～7μm)開始切片。將載玻片貼附于組織薄片，并將玻片浸泡在丙酮中，置于-20℃，30分鐘后將玻片放在-70℃保存。

將組織玻片浸泡在PBS緩沖液約3～4分鐘后，將玻片以蘇木精染色10分鐘。將玻片以純水清洗三次后，再浸泡于純水，分別為5、5、5、10分鐘。將著將玻片以伊紅染色15秒。將玻片分別浸泡于95％，95％，100％，100％酒精，各1分鐘。再浸泡于二甲苯(xylene)1分鐘。以70％酒精將玻片背面擦拭干凈，等待樣本干燥。最后以蓋玻片封片(封片劑：二甲苯＝2：1)。

7.結(jié)果

在非感染性創(chuàng)傷模式中，對小鼠傷口外觀變化進(jìn)行評估。首先，在C57BL/6小鼠背部皮膚開創(chuàng)傷口后，每二天清理傷口并更換藥物。如圖2A所示，相較于其他組別，非感染性傷口以桂花萃取物進(jìn)行處理后，其傷口具有較佳的愈合效率。如圖2B所示，于第4至8天時，空白對照組及凡士林組其傷口愈合并不明顯。相較的下，桂花萃取物組其傷口外觀已明顯開始愈合。由結(jié)果顯示，在給予桂花萃取物治療后，非感染性傷口可提前約4至8天愈合。

而在感染性創(chuàng)傷模式中，以金黃色葡萄球菌感染傷口，于感染第七天后，每兩天清理傷口并更換藥物。如圖3A所示，相較于其他組別，感染性傷口以桂花萃取物進(jìn)行處理后，其傷口有顯著縮小的趨勢。在第6天時，以桂花萃取物處理的傷口，已達(dá)到60％以上的傷口愈合。如圖3B所示，于第6天時，空白對照組及凡士林組其傷口尚未開始愈合。相較的下，桂花萃取物組其傷口外觀已顯著開始愈合。由結(jié)果顯示，于感染性創(chuàng)傷模式中給予桂花萃取物治療后，傷口可提前約8至12天愈合。

無論在非感染性創(chuàng)傷模式(圖4A)或感染性創(chuàng)傷模式(圖4B)中，其傷口皮膚外觀可發(fā)現(xiàn)，相較于空白對照組和凡士林組，桂花萃取物組其具有顯著促進(jìn)血管面積、長度和分支發(fā)展的情形，顯示桂花萃取物顯著具有促進(jìn)血管新生的功效。

因膠原蛋白的合成有助于傷口愈合，進(jìn)一步檢視傷口愈合時，桂花萃取物醋促進(jìn)膠原蛋白合成的效果。對于非感染性創(chuàng)傷模式，在小鼠創(chuàng)傷第21天，而對于感染性創(chuàng)傷模式，則在第27天，取傷口周圍皮膚組織，以Masson’s trichrom染色法觀察皮膚組織內(nèi)膠原蛋白合成的情形，膠原蛋白被染成藍(lán)色呈現(xiàn)。觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)無論在非感染性或感染創(chuàng)傷模式，與正常小鼠比較下，在空白對照組和凡士林組中，組織內(nèi)部膠原蛋白合成數(shù)量少且結(jié)構(gòu)松散；而在以桂花萃取物處理的組別中，組織內(nèi)部膠原蛋白合成數(shù)量和結(jié)構(gòu)緊密程度都與正常小鼠相似。由以上結(jié)果顯示，桂花萃取物具有促進(jìn)膠原蛋白合成的功效。

傷口感染為造成傷口無法有效愈合的原因的一，因此以抑菌環(huán)試驗(yàn)測試桂花萃取物是否具有抑菌的活性。試驗(yàn)結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌以藥物處理后，與對照組比較后并無發(fā)現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，顯示桂花萃取物無直接抑菌的作用。

進(jìn)一步將小鼠背部皮膚開創(chuàng)傷口后，以金黃色葡萄球菌感染傷口并以藥物處理，感染7天后，收集傷口周圍化膿組織，分析含菌量。如圖5所示，相較于空白對照組及凡士林組，以桂花萃取物處理后其傷口表面膿菌數(shù)明顯減少。結(jié)果得知，桂花萃取物具有間接抑菌活性。

由以上結(jié)果可知，本發(fā)明桂花萃取物能促進(jìn)傷口愈合，具有促進(jìn)傷口血管新生及促進(jìn)膠原蛋白生成的功效。