本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及理氣活血制劑在制備治療血管內(nèi)皮損傷及促進(jìn)血管新生藥物中的用途，尤其是在制備治療促進(jìn)血管新生藥物中的新用途。

背景技術(shù)：
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血管內(nèi)皮(Endothelium)由血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cell，EC)組成，具有屏障和分泌功能，與心腦血管疾病密切相關(guān)。血管內(nèi)皮損傷(Endothelium Dysfunction，ED)指血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能與屏障功能的失調(diào)，以血管內(nèi)皮依賴性舒張減弱為典型特征。ED病理機(jī)理主要為由于損傷因素(缺血損傷，糖尿病，高血壓及吸煙等)導(dǎo)致血管內(nèi)皮發(fā)生了氧化應(yīng)激、炎癥、血管舒縮等方面的功能失調(diào)，ED是多種疾病的主要并發(fā)癥之一。

血管新生(angiogenesis)，指成人在原始血管叢或已存在血管的基礎(chǔ)上以發(fā)芽方式形成新生血管的過程，具有維持人體正常的生長和平衡的功能，在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸、預(yù)后中扮演著重要的角色。近年來，調(diào)節(jié)血管新生的研究已成為臨床治療中的熱點(diǎn)。 血管新生主要涉及基底膜的降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和管形成等過程，其中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是血管新生的最主要指標(biāo)之一。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和死亡還是動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的重要病理過程。因此，臨床上希望發(fā)現(xiàn)一種能夠調(diào)節(jié)血管新生，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的藥物。

“米槁心樂滴丸”現(xiàn)用名為“理氣活血滴丸”，是根據(jù)苗族用藥習(xí)慣和中醫(yī)理論合理組方，以米槁?lián)]發(fā)油、薤白、川芎、冰片制成的純中藥制劑。該產(chǎn)品具有芳香溫通、行氣止痛之功效。臨床用于預(yù)防治療陰寒凝滯型胸痹心痛獲得良好效果。

目前，臨床研究已經(jīng)證實(shí)了理氣活血滴丸在治療多種心腦血管疾病中具有良好的治療效果，其臨床應(yīng)用范圍也得到了很大的拓展；但是有關(guān)理氣活血滴丸在治療血管損傷及促進(jìn)血管新生的作用未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供理氣活血制劑在制備治療血管內(nèi)皮損傷藥物中的應(yīng)用。

所述的血管內(nèi)皮損傷包括由于心肌缺血、腦缺血(中風(fēng))、高血壓、糖尿病、吸煙、紫外射線等因素所導(dǎo)致的以蛋白激酶PKG(cGMP dependent protein kinase)水平或活性下降，及其底物VASP(Vasodilator-stimulated phosphoprotein)磷酸化水平下降為標(biāo)志的ED。

本發(fā)明的另一目的是提供理氣活血制劑在制備用于促進(jìn)血管新生藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的理氣活血制劑是由米槁、川芎、薤白、冰片四味中藥作為原料制備而成的各種劑型的制劑。

　　本發(fā)明所述的理氣活血制劑，按照重量份計(jì)算，由下述原料藥制備而成：米槁350～600份，冰片4～15份，川芎250～500份，薤白25～50份。

　　準(zhǔn)確的說，按照重量份計(jì)算，由下述原料藥制備而成：米槁450份，冰片9份，川芎360份，薤白36份。

　　本發(fā)明所述的制備方法是先將原料藥經(jīng)過加工提取純化成藥物活性成分，再進(jìn)一步制備成藥物制劑；其制備方法屬于現(xiàn)有技術(shù)，可以從現(xiàn)有專利公開的文件中獲得，或根據(jù)其他公開的文獻(xiàn)技術(shù)及藥品標(biāo)準(zhǔn)制備。

　　本發(fā)明所述的理氣活血制劑可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括：片劑、糖衣片、薄膜衣片劑、腸溶片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含片、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴丸劑、貼劑。

　　本發(fā)明所述的理氣活血制劑，其制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、壓片劑、稀釋劑、潤濕劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑、潤濕劑和藥用載體材料。

　　本發(fā)明所述的理氣活血制劑優(yōu)選理氣活血滴丸。

本發(fā)明的理氣活血制劑在使用時(shí)根據(jù)病人的情況確定用法用量。例如已上市的由貴州民族藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的理氣活血滴丸，每丸重25mg，用法用量為口服，每日3次，每次10粒。

血管內(nèi)皮損傷(Endothelium Dysfunction，ED)指血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能與屏障功能的失調(diào)，以血管內(nèi)皮依賴性舒張減弱為典型特征。ED病理機(jī)理主要為由于損傷因素(缺血損傷，糖尿病，高血壓及吸煙等)導(dǎo)致血管內(nèi)皮發(fā)生了氧化應(yīng)激、炎癥、血管舒縮等方面的功能失調(diào)，ED是多種疾病的主要并發(fā)癥之一。骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）是一群具有游走特性，能進(jìn)一步增殖分化的幼稚內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏成熟內(nèi)皮細(xì)胞的特征性表型，不能形成管腔樣結(jié)構(gòu)。其功能主要為參與缺血組織的血管新生和血管損傷后的修復(fù)。

附圖說明：

附圖1：大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)，4d，7d，10d

附圖2：大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞活力檢測

附圖3：內(nèi)皮祖細(xì)胞雙染色熒光

附圖4：復(fù)方丹參滴丸干預(yù)對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的作用

附圖5：理氣活血滴丸過濾組對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的作用

附圖6：理氣活血滴丸不過濾組對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的作用

附圖7：理氣活血滴丸過濾組對內(nèi)皮祖細(xì)胞粘附的作用

附圖8：理氣活血滴丸過濾組對內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移的作用

具體實(shí)施方式：

為探究理氣活血制劑在治療血管損傷及促進(jìn)血管新生藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明是通過了系列的試驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)的探究。

試驗(yàn)一：理氣活血滴丸增強(qiáng)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能

試驗(yàn)方法：

1）大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠麻醉過量后處死，75％乙醇浸泡消毒，準(zhǔn)備好三套滅過菌的手術(shù)器械，在無菌條件下，用第1套器械剪開大鼠雙下肢腿部的皮膚，在盡量保持大鼠雙股骨和脛骨完整性的條件下，盡可能把肌肉剔除，然后將股骨脛骨迅速從大鼠中剝離下來，置于已消毒并盛有含雙抗的PBS平皿中。然后用第2套器械將股骨脛骨上殘留的肌肉剔除干凈。用第3套器械分別剪去股骨脛骨的兩端，打開骨髓腔，用5 mL注射器吸取1640從骨髓腔的一端將骨髓沖出到培養(yǎng)皿中，篩網(wǎng)過濾后將細(xì)胞懸液輕輕吹打混勻，然后將懸液貼壁輕輕加入到預(yù)置等體積淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，懸于上層，2500 r/min，離心20 min，用吸管小心地將中間云霧狀白膜層的單個(gè)核細(xì)胞吸取到另一離心管中，用PBS培養(yǎng)基洗滌兩次(1000 r/min，5 min)，棄上清液，用EBM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2×105個(gè)/cm2接種于培養(yǎng)板中，4d后將未貼壁細(xì)胞懸液接種到預(yù)先表包被好的培養(yǎng)板中，于飽和濕度37℃ 5％C02恒溫培養(yǎng)箱。2 d后進(jìn)行第一次換液，以后都每2 d換液1次，換液后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2) 細(xì)胞活力檢測

將混懸好的細(xì)胞放入細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中，圖中透亮的圓點(diǎn)顯示為活細(xì)胞。

3) 細(xì)胞功能鑒定：雙染色熒光，同時(shí)吞噬Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1的為EPCs；

將培養(yǎng)7d后的貼壁細(xì)胞與Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-acLDL，2.4mg/L）37℃孵育1h，然后用2％多聚甲醛固定細(xì)胞10min。再以PBS浸洗，將FITC標(biāo)記凝集素 I(FITC- UEA-1-lectin，10mg/L)加于上述標(biāo)本于37℃下孵育1h，通過熒光顯微鏡鑒定FITC- UEA-1-lectin和Dil-acLDL雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs。

4) 細(xì)胞CD34+和KDR+的表達(dá)：

采用免疫熒光染料直接標(biāo)記細(xì)胞膜抗原法，檢測細(xì)胞特異性膜抗原CD34-和KDR-的表達(dá)。將不同處理組EPC用0.25%胰蛋白酶消化后，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)m1，取200ul細(xì)胞懸液，加入2u1的FBS封閉15min后，分裝于兩支流式管中，分別標(biāo)記陽性管與同型管，每管100ul. 避光條件下，在同型管中同時(shí)加入Alexa Fluor647 Mouse IgGI 5ul和CFS-conjugated Mouse IgG 10ul，在陽性管中加入Alexa Fluor 647 anti-human CD34 5ul和CFS-conjugated KDR 10ul，充分混勻，在4℃冰箱中避光孵育45min后，以1500r/min，10min離心，棄上清，加入冰凍PBS500ul重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀Beckman Coulter FC-500檢測細(xì)胞膜抗原CD34+和KDR+表達(dá)的百分率，Alexa Fluor 647的excite為633n，emit668nm。CFS的excite波長為488nm，emit波長為568nm。

5) 實(shí)驗(yàn)分組：

A. 正常對照組：EPC空白組；

B. 給藥組（3組/藥）：EPC + 干預(yù)藥物，分高、中、低劑量三個(gè)亞組；

C. 陽性藥物組（復(fù)方丹參滴丸）：EPC + 復(fù)方丹參滴丸；

D. 直接干預(yù)組（無過濾組）：EPC + 干預(yù)藥物，分高、中、低劑量三個(gè)亞組；

6) 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將不同處理組EPC，用0.25%胰蛋白酶消化后，制備成細(xì)胞懸液，按每孔100ul接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔和空白對照，每孔加10ul CCK-8試劑，放至細(xì)胞孵化箱繼續(xù)培養(yǎng)。4h后在微量振蕩器充分振蕩5min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測OD450nm處測量處測吸光值OD值。

7) 細(xì)胞粘附功能檢測

用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并重懸細(xì)胞，用含0.5%BSA的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml，取50ul細(xì)胞懸液，接種在包被有HFN的96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)平行孔。在放在37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)30min、60min、2h， PBS輕輕漂洗未貼壁細(xì)胞，加入CCK-8，在在37℃，5%CO2孵箱孵育4h后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測OD450nm處測量處測吸光值OD值。

8) 細(xì)胞遷移功能檢測

在24孔板內(nèi)加入500ul含VEGF50ug/ml和0.5%BSA的EGM-2。用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并重懸細(xì)胞，用含0.5%BSA的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/m1，取100ul懸液(即2×104個(gè))細(xì)胞加入Transwell小室中，輕輕放置己有600ul含VEGF 50ug/ml的EGM-2的24孔板內(nèi)，避免氣泡產(chǎn)生，放在37℃，5%CO2孵箱進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)。用棉簽輕輕擦去PET膜上層細(xì)胞后，PET膜下層朝上，用PBS輕輕漂洗，用95%乙醇固定20min，Giemsa染色，顯微鏡200倍下計(jì)數(shù)遷移至PET膜下層的細(xì)胞數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)果：

1.1大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)：

2 d后進(jìn)行第一次換液，以后都每2 d換液1次，換液后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。如附圖1，分別是4d，7d和10d的細(xì)胞。剛分離的大鼠單個(gè)核細(xì)胞，呈圓形，未貼壁。首次換液后，洗去未貼壁細(xì)胞，可見有視野下有個(gè)少量圓形的貼壁細(xì)胞聚集，未見梭形細(xì)胞生長。第4天，貼壁的梭形細(xì)胞開始從集落的邊緣出芽生長，形成典型的集落現(xiàn)象（4d）。第7天后集落生長開，第10天形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞，部分內(nèi)皮祖細(xì)胞首尾相接，形成線狀結(jié)構(gòu)（10d），如附圖1所示。

1.2細(xì)胞活力檢測：細(xì)胞活力99.7%。

將混懸好的細(xì)胞取出20μl放入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，1min后放入細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中，按照說明書操作儀器，透亮的圓點(diǎn)顯示為活細(xì)胞，細(xì)胞活力為99.7%。如附圖2所示。

1.3細(xì)胞功能鑒定：

激光共聚焦顯微鏡觀察，顯示紅色熒光的細(xì)胞為攝取Dil-ac-LDL陽性（A），顯示綠色熒光的細(xì)胞為結(jié)合FITC-UEA-1陽性（B），在同一個(gè)細(xì)胞上攝取Dil-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1為具有內(nèi)皮功能細(xì)胞（C）；如附圖3。

1.4細(xì)胞表型鑒定：

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，初步鑒定CD34和KDR表達(dá)陽性；貼壁細(xì)胞CD34陽性細(xì)胞比例為20.6±1.2%，VEGF-2陽性細(xì)胞比例為34.2±1.5%，CD34⁺/VEGF-2⁺比例為15.4±1.8%。

1.5細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

各組間相比，細(xì)胞的增殖能力均顯著提高。其中復(fù)方丹參滴丸在50ug/ml時(shí)增殖最為顯著，如圖4所示；理氣活血滴丸過濾組在100ug/ml時(shí)增殖最為顯著，如5所示；理氣活血滴丸不過濾組在25ug/ml時(shí)增殖最為顯著，如附圖6所示。

1.6細(xì)胞粘附功能檢測

將理氣活血滴丸過濾組細(xì)胞接種在包被有HFN的96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)5個(gè)平行孔。在放在37℃，5%CO₂孵箱培養(yǎng)30分鐘， PBS輕輕漂洗未貼壁細(xì)胞，加入CCK-8，4h后再酶標(biāo)儀檢測450nm的OD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)理氣活血滴丸過濾組125ug/ml濃度2h的粘附細(xì)胞最多，如圖7所示。

1.7 細(xì)胞遷移功能檢測：A為空白對照，B為LQ 100μg/mL

將理氣活血滴丸過濾組細(xì)胞接種在Transwell上室中，輕輕放置己有600ul含VEGF 50ug/ml的EGM-2的24孔板內(nèi)，避免氣泡產(chǎn)生，放在37℃，5%CO₂孵箱進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)。與空白對照組（A）相比，理氣活血滴丸過濾組（B）遷移的細(xì)胞顯著增多，如圖8所示。

經(jīng)上述試驗(yàn)表明：發(fā)現(xiàn)理氣活血滴丸（LQ）可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、粘附和遷移等生物學(xué)功能，并且理氣活血滴丸原藥的效果最好：未過濾的理氣活血滴丸（原藥）的最佳增殖濃度是25μg/mL；相同劑量下，理氣活血滴丸效果優(yōu)于復(fù)方丹參滴丸：理氣活血滴丸（原藥）的最佳增殖濃度是25μg/mL，復(fù)方丹參滴丸過濾組的最佳增殖濃度是50μg/mL。

試驗(yàn)二：理氣活血滴丸促血管新生作用研究：

1.原料和試劑

（1）理氣活血滴丸（貴州民族藥業(yè)有限公司提供），復(fù)方丹參滴丸（市售）；

（2）孵育第7天的雞胚(上海滬廣家禽育種有限公司)；

（3）0.45μm和0.25μm微孔濾膜；

（4）陽性對照藥物bFGF(即貝復(fù)濟(jì)，珠海東大生物制藥有限公司生產(chǎn)， 批號(98)衛(wèi)藥準(zhǔn)字S-01號，總濃度36000Au/ml)。

2.儀器

微量進(jìn)樣器，眼科鑷及剪，無菌透明膜，解剖顯微鏡(8X或16X)， 打孔器(直徑5mm)等。

3、實(shí)驗(yàn)方法

3.1、被考察藥物組的制備

理氣活血滴丸滴丸組：制成不同含量的待測藥液，分別為：0.2g/ml、0.5g/ml、0.8g/ml、1g/ml、1.2g/ml、1.5g/ml。

復(fù)方丹參滴丸滴丸組：制成不同含量的待測藥液，分別為：0.2g/ml、0.5g/ml、0.8g/ml、1g/ml、1.2g/ml、1.5g/ml。

陽性對照藥物bFGF組：制成0.2g/ml、0.5g/ml、0.8g/ml、1g/ml。

(2)濾膜載體的制備：利用打孔器將0.45μm的微孔濾膜制成直徑5mm的圓片，121℃高壓滅菌30分鐘后待用。

3.2中藥對CAM血管生成影響效應(yīng)之測定(參考張樹成等法[1])

(1) 雞胚孵育：若干白皮種蛋消毒后放入37℃孵化箱，氣室向上，每天小心轉(zhuǎn)動(dòng)3-4次，至第6天用照卵燈選擇良好的雞胚供實(shí)驗(yàn)使用；

(2) 取孵化第7天的雞胚在氣室端鉆約1.0mm的小孔，并穿透氣室殼膜， 在胚頭右下方劃定1cm×1cm的位置開窗，揭除該處蛋殼及殼膜，小心露 出絨毛尿囊膜；

(3) 將濾膜放在絨毛尿囊膜的血管較少部位，用微量進(jìn)樣器將各待測藥液或生理鹽水5μl滴入，滅菌透明膠帶封窗后放入孵化箱；

(4) 孵化72小時(shí)后，取出雞胚，用甲醇∶丙醇＝1∶1的混和固定液固定 30分鐘后將膜取出展開，貼在濾紙上，晾干后拍照保存；

(5) 血管計(jì)數(shù)：采用“血管指數(shù)”進(jìn)行盲法計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，以濾膜的圓心為圓心，在其周圍形成一個(gè)1mm的圓環(huán)。凡經(jīng)過圓環(huán)的放射狀血管，只要可以辨認(rèn)，無論是毛細(xì)血管、小動(dòng)脈，還是小靜脈，若與濾膜半徑的夾角小于45度者即可計(jì)數(shù)。在環(huán)內(nèi)分支出的新血管應(yīng)單獨(dú)計(jì)數(shù)。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1：

表1：中藥對CAM血管生成影響效應(yīng)之測定結(jié)果

上述試驗(yàn)表明：理氣活血滴丸促進(jìn)血管新生具有顯著的作用。