專利名稱：一種疏肝理氣,活血化瘀的中藥組合物及質(zhì)量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物及制備方法和質(zhì)量檢測(cè)方法，特別涉及一種疏肝理 氣，活血化瘀，消散乳塊的中藥組合物及制備方法和質(zhì)量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
乳腺增生為婦科常見(jiàn)病，發(fā)病率30% 50%，有一定的致癌傾向，其產(chǎn)生與內(nèi)分 泌失調(diào)尤其是卵巢功能失調(diào)有關(guān)，對(duì)乳腺增生的治療方法目前主要采用性激素替代療法或 手術(shù)切除。但性激素不良反應(yīng)較大，手術(shù)也往往不易為患者接受。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乳腺 增生屬于“乳癖”、“乳中結(jié)核”范疇，其發(fā)病與沖任二脈關(guān)系至為密切。本發(fā)明組合物制劑 有丹參、橘葉等藥物可使雌激素分泌受到抑制來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)使之平衡，達(dá)到提高免疫 功能，強(qiáng)化機(jī)體功能，從而治療乳腺疾病。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明第一個(gè)目的在于提供一種疏肝理氣，活血化瘀，消散乳塊的中藥組合物；本 發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供該中藥組合物制劑的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供 該中藥組合物制劑的質(zhì)量檢測(cè)方法。本發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明一種疏肝理氣，活血化瘀，消散乳塊的中藥組合物制劑的原料組成為橘葉275 550重量份、丹參275 550重量份、皂角刺137. 5 412. 5重量份、 王不留行137. 5 412. 5重量份、川楝子137. 5 412. 5重量份、地龍137. 5 412. 5重量 份。本發(fā)明一種疏肝理氣，活血化瘀，消散乳塊的中藥組合物制劑的原料組成優(yōu)選 為橘葉412. 5重量份、丹參412. 5重量份、皂角刺275重量份、王不留行275重量份、 川楝子275重量份、地龍275重量份。本發(fā)明一種疏肝理氣，活血化瘀，消散乳塊的中藥組合物制劑的制備方法為除地龍、王不留行外，其余橘葉等四味加水煎煮1-4次，每次0.5-2小時(shí)，合并煎 液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 10 1.40(85°C )，放冷；地龍、王不留行用50-95% 乙醇回流提取1-4次，每次0. 5-3小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，加入上述濃縮液中，調(diào)整乙醇量 達(dá)50-95%，攪拌均勻，靜置，回收乙醇并濃縮成稠膏，按照常規(guī)工藝，制成臨床或藥學(xué)上可 接受的劑型，包括但不限于滴丸、片劑、膠囊劑、散劑、軟膠囊劑、蜜丸、丸劑、顆粒劑、蜜煉膏 劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口服液體制劑、注射制劑或外用制劑。本發(fā)明一種疏肝理氣，活血化瘀，消散乳塊的中藥組合物顆粒劑的制備方法優(yōu)選 為除地龍、王不留行外，其余橘葉等四味加水煎煮二次，每次1小時(shí)，合并煎液，濾 過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1. 25 1. 30(85°C )，放冷，備用；地龍、王不留行用70%乙醇回流提取二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，加入上述濃縮液中，調(diào)整乙醇量 達(dá)70%，攪拌均勻，靜置，回收乙醇并濃縮成稠膏，加蔗糖500重量份與淀粉、糊精適量，混 勻，制成顆粒，干燥，制成即得。本發(fā)明一種疏肝理氣，活血化瘀，消散乳塊的中藥組合物片劑的制備方法優(yōu)選 為以上六味，除地龍、王不留行外，其余橘葉等四味加水煎煮二次，每次1小時(shí)，合 并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.25 1.30(85°C )，放冷，備用；地龍、王不留行用 70%乙醇回流提取二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，加入上述濃縮液中， 調(diào)整乙醇量達(dá)70 %，攪拌均勻，靜置，回收乙醇并濃縮至稠膏，干燥成干浸膏，粉碎，加輔料 適量，混勻，制成顆粒，干燥，壓制成1000片，包糖衣，即得。本發(fā)明一種疏肝理氣，活血化瘀，消散乳塊的中藥組合物膠囊劑的制備方法優(yōu)選 為以上六味，除地龍、王不留行外，其余橘葉等四味加水煎煮二次，每次1小時(shí)，合 并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.25 1.30(85°C )，放冷，備用；地龍、王不留行用 70%乙醇回流提取二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，加入上述濃縮液中， 調(diào)整乙醇量達(dá)70%，攪拌均勻，靜置，回收乙醇并濃縮成稠膏，加蔗糖500g與淀粉、糊精適 量，混勻，制成顆粒，干燥，裝膠囊，即得。本發(fā)明提供該中藥組合物制劑的質(zhì)量控制方法，該方法包括步驟A、含量測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑； (30-50 50-70)比例的甲醇-0. 01 0. 03mol/L磷酸溶液(0. 01 0. 03mol/L磷酸溶液 1000ml，用三乙胺調(diào)節(jié)pH至2. 5 3. 5)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 290nm。對(duì)照品溶液 的制備精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含2 10 y g的溶液。供試品溶液 的制備取該組合物制劑研細(xì)，取0. 5g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇約20 80ml，超聲處 理20 40分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置25 100ml量瓶中，濾渣及容器用甲醇洗滌1 3次， 每次3 10 ml，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 20 yl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得，相當(dāng) 于原藥材16-22g的組合物制劑含橘葉以橙皮苷(C28H34015)計(jì)，不得少于3. Omg ；B、鑒別取該組合物制劑10g，研細(xì)，加水30 50ml使溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值 為3 4，用醋酸乙酯振搖提取1 3次，每次20 50ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹?醇1ml使溶解，作為供試品溶液，另取原兒茶醛對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1 3mg的溶 液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各2 10 yl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以 (4-12 4-7 0.8)比例的苯-醋酸乙酯-甲酸混合溶劑為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以
三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀(1 1)。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯 相同顏色的斑點(diǎn)。C、鑒別取該組合物制劑10g，研細(xì)，加氯仿10 30ml，密塞，超聲處理15 30分 鐘，濾過(guò)，濾液濃縮至1ml，作為供試品溶液。另取地龍對(duì)照藥材lg，同法制成對(duì)照藥材溶 液，照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 10 y 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以 (13-6 1)比例的苯-醋酸乙酯混合溶劑為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，至紫外光燈(365nm) 下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。
上述質(zhì)量控制方法優(yōu)選包括如下含量測(cè)定含量測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲 醇-0. 025mol/L磷酸溶液(85%磷酸溶液1. 70ml，用水稀釋至近1000ml，用三乙胺約1. 8ml 調(diào)節(jié)pH至2. 9 3. 1，加水至1000ml) (40 60)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm。理論板數(shù) 按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。對(duì)照品溶液的制備精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇 制成每1ml含g的溶液，即得。供試品溶液的制備取該組合物制劑，研細(xì)，取0. 5g，精 密稱定，置錐形瓶中，加甲醇約40ml，超聲處理(功率250W，頻率33KHZ) 30分鐘，放冷，濾 過(guò)，濾液置50ml量瓶中，濾渣及容器用甲醇洗滌2次，每次4ml，洗液濾入同一量瓶中，加甲 醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各 10iU，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。上述質(zhì)量控制方法中優(yōu)選包括如下鑒別法丹參薄層鑒別取該組合物制劑10g，研細(xì)，加水40ml使溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值 為3 4，用醋酸乙酯振搖提取二次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使 溶解，作為供試品溶液。另取原兒茶醛對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含lmg的溶液，作為對(duì)照 品溶液。吸取上述兩種溶液各5 u 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸 (8:5: 0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀(1 1)。 供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。地龍薄層鑒別取該組合物制劑10g，研細(xì)，加氯仿20ml，密塞，超聲處理20分鐘， 濾過(guò)，濾液濃縮至1ml，作為供試品溶液，另取地龍對(duì)照藥材lg，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸 取上述兩種溶液各5 yl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯(9 1)為展開(kāi) 劑，展開(kāi)，取出，晾干，至紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng) 的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。上述質(zhì)量控制方法中藥組合物制劑優(yōu)選原料組成為橘葉412. 5g、丹參412. 5g、 皂角刺275g、王不留行275g、川楝子275g、地龍275g的顆粒劑，并通過(guò)如下方法制備以上 六味，除地龍、王不留行外，其余橘葉等四味加水煎煮二次，每次1小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾 液濃縮至相對(duì)密度為1. 25 1. 30(85°C )，放冷，備用；地龍、王不留行用70%乙醇回流提 取二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，加入上述濃縮液中，調(diào)整乙醇量達(dá) 70%，攪拌均勻，靜置，回收乙醇并濃縮成稠膏，加蔗糖500g與淀粉、糊精適量，混勻，制成 顆粒，干燥，即得。本發(fā)明中藥組合物具有很好的疏肝理氣，活血化瘀，消散乳塊作用。本發(fā)明中藥組合物制劑的質(zhì)量檢測(cè)方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明含量測(cè)定方法檢測(cè) 專屬性好、穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、精密度高，更加適合工業(yè)化的生產(chǎn)，真正確保了臨床用藥的 安全、有效、可靠。下面實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。本發(fā)明所有實(shí)驗(yàn)例所選用的制劑均為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1制得的本發(fā)明顆粒劑， 但是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不僅限于該顆粒劑。實(shí)驗(yàn)例1 本發(fā)明組合物制劑抗實(shí)驗(yàn)性大鼠乳腺增生作用研究1.實(shí)驗(yàn)材料藥物與試劑本發(fā)明組合物制劑；苯甲酸雌二醇注射液；黃體酮注射液；激素測(cè)定用各種放免試劑盒。動(dòng)物SD大鼠，雌性，體重200 250g。儀器M0TIC生物顯微圖像采 集分析系統(tǒng)。2.實(shí)驗(yàn)方法10周齡SD雌性大鼠60只，體重200_250g，隨機(jī)留取10只作為正常對(duì)照，其余50 只大鼠復(fù)制乳腺增生模型，首先肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇0. 5mg kg"1 cf1，每天一次，連續(xù) 20d，繼而改為肌內(nèi)注射黃體酮5mg kg"1 cf1，每天一次，連續(xù)5d。造模后大鼠隨機(jī)再分為 5組，每組10只，分別灌胃本發(fā)明組合物制劑高、中、低劑量(分別為10，5，2. 5g生藥化―1)， 正常對(duì)照組和模型對(duì)照組以等體積自來(lái)水灌胃，給藥體積均為20mL kg—1，連續(xù)35d。末次 給藥后次日，大鼠乙醚麻醉，心臟取血，2000r min_1離心分離血清，放免法測(cè)定垂體促乳素 (PRL)、雌二醇(E2)、孕酮(P)等雌、孕激素水平，用游標(biāo)尺測(cè)量大鼠第2、3對(duì)乳頭高度及直 徑，并取第二對(duì)乳腺固定于10%福爾馬林中，石蠟包埋后病理切片(每側(cè)乳腺切縱橫兩張 切片)，HE染色后鏡檢，按表1評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)級(jí)。表1乳腺增生評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. 1對(duì)乳腺增生大鼠乳頭高度和直徑的影響造模后大鼠第2，3對(duì)乳頭高度及乳頭直徑明顯增加，與正常對(duì)照組相比有明顯 差異(P< 0.05)，本發(fā)明組合物制劑中、高劑量用藥后乳頭高度明顯低于模型對(duì)照組(P <0.05)，乳頭直徑也有降低趨勢(shì)。見(jiàn)表2。表2本發(fā)明組合物制劑對(duì)乳腺增生大鼠乳頭高度的影響 注與正常對(duì)照組比較，*P < 0. 05 ；與模型對(duì)照組比較，**P < 0. 053. 2對(duì)乳腺增生大鼠血清性激素水平的影響造模后大鼠血清垂體促乳素(PRL)、雌二醇(E2)含量顯著高于正常對(duì)照組，孕酮 (P)則顯著低于對(duì)照組，睪酮(T)略有降低，本發(fā)明組合物制劑各劑量組對(duì)上述改變均有一 定的對(duì)抗作用，中、高劑量組PRL，E2及P含量與模型組相比均有顯著性差異。見(jiàn)表3。3. 3對(duì)乳腺增生大鼠乳腺病理組織學(xué)的影響乳腺病理切片鏡下可見(jiàn)正常對(duì)照組大鼠的乳腺小葉數(shù)量少，稀疏分布，小葉內(nèi)腺 泡少，一般2-4個(gè)，腺泡上皮呈立方形，腺泡腔小，無(wú)分泌物或僅有少許分泌物。模型對(duì)照組 幾乎所有大鼠的乳腺均增生小葉數(shù)量大大增加。正常對(duì)照組大鼠乳腺，腺體數(shù)量極少，稀 疏分布，小葉內(nèi)腺泡少，一般2 4個(gè)，腺泡腔小，腺泡不擴(kuò)張，腺泡上皮呈立方形，無(wú)分泌物 或僅有少許分泌物，處于靜止期狀態(tài)，導(dǎo)管未擴(kuò)張，無(wú)分泌。本發(fā)明組合物制劑中、高劑量組大鼠乳腺小葉較模型組大大減少，僅比正常對(duì)照 組稍多，每個(gè)小葉內(nèi)腺泡數(shù)也大大減少，未見(jiàn)分泌。具體評(píng)級(jí)結(jié)果見(jiàn)表4，經(jīng)Ridit分析，本 發(fā)明組合物制劑中、高劑量組對(duì)大鼠乳腺增生有明顯的治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明組合物制劑對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性乳腺增生模型有明確的治療作 用。表3本發(fā)明組合物制劑合劑對(duì)乳腺增生大鼠血清生殖激素水平的影響 1、實(shí)驗(yàn)材料本發(fā)明組合物制劑；莫沙比利、0 -NADPH、N_BT、TritonX2100、Tris緩沖液、一氧 化氮試劑盒、乙酰膽堿酯酶測(cè)定試劑盒。動(dòng)物SD系大鼠，體重(200 士 20) g，雌雄各半。儀 器醫(yī)學(xué)彩色圖象分析儀HPIAS2500型2、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果2. 1本發(fā)明組合物制劑對(duì)大鼠胃竇組織中N0S陽(yáng)性神經(jīng)元分布面積及活性的影響 實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物分組取30只大鼠，隨機(jī)分為3組本發(fā)明組合物制劑組、陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì) 照組，每組10只。本發(fā)明組合物制劑組、陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組分別灌胃給予本發(fā)明組 合物制劑藥液、莫沙比利藥液及生理鹽水。3組動(dòng)物給藥量均為5. 0ml/kg體重，本發(fā)明組合 物制劑加水使藥物濃度為0. 486g/ml，莫沙比利研末，加水配為0. 27g/L，空白對(duì)照組給予 等體積的生理鹽水。動(dòng)物用藥后第14天，在給藥后60min后，處死動(dòng)物，在胃竇區(qū)(距幽門(mén) 0. 5cm)取組織1mm3，用4%甲醛進(jìn)行固定24h(4°C )，再入25% (4°C )蔗糖過(guò)夜。檢測(cè)方法將組織標(biāo)本用AO恒冷箱連續(xù)冰凍切片，厚度20 ii m, NADPH2黃遞酶組化 法染色顯示N0S陽(yáng)性神經(jīng)元，熒光顯微鏡下觀察，醫(yī)學(xué)彩色圖象分析儀圖象定量分析。各組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差 分析，均采用組間兩兩比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。表5本發(fā)明組合物制劑對(duì)大鼠胃竇組織中N0S陽(yáng)性神經(jīng)元分布面積及活性的影 響實(shí)驗(yàn) 與空白對(duì)照組比較，*P < 0. 05，**P < 0. 01 ；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，AP < 0. 05，AAP < 0. 01 ；A 參數(shù)A表示測(cè)量窗內(nèi)N0S陽(yáng)性神經(jīng)纖維的面積；M 參數(shù)M表示測(cè)量窗內(nèi)N0S陽(yáng) 性神經(jīng)纖維的平均光密度；n = 102. 2本發(fā)明組合物制劑對(duì)大鼠胃竇組織中NO，Ach影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組取30只大鼠，隨機(jī)分為3組本發(fā)明組合物制劑組、陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì) 照組，每組10只。本發(fā)明組合物制劑組、陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組分別灌胃給予本發(fā)明組 合物制劑藥液、莫沙比利藥液及生理鹽水。3組動(dòng)物給藥量均為5. 0ml/kg體重，本發(fā)明組合 物制劑加水使藥物濃度為0. 486g/ml，莫沙比利研末，加水配為0. 27g/L，空白對(duì)照組給予 等體積的生理鹽水。動(dòng)物取材用藥后第14天，在給藥60min后，處死動(dòng)物，在胃竇區(qū)(距幽 門(mén)0. 5cm)取組織400mg,加4ml生理鹽水，勻漿，3500r/min離心15min,取上清液于-20°C 冰箱中保存待測(cè)。
檢測(cè)方法NO、Ach均按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的檢測(cè)方法，進(jìn)行檢測(cè)。各組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差 分析，均采用組間兩兩比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。表6本發(fā)明組合物制劑對(duì)大鼠組織中NO，Ach的影響 與空白對(duì)照組比較，*P < 0. 05，**P < 0. 01 ；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，Ap < 0. 05，AAP < 0. 01 ；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下初步觀測(cè)，本發(fā)明組合物制劑組大鼠胃竇黏膜肌 內(nèi)N0S陽(yáng)性神經(jīng)纖維減少、變細(xì)，染色減弱，在黏膜下層很少看到陽(yáng)性神經(jīng)元胞體及從內(nèi)突 起，陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性產(chǎn)物與本發(fā)明組合物制劑組類似。但空白對(duì)照組胃竇部黏膜肌內(nèi)N0S 陽(yáng)性神經(jīng)元較本發(fā)明組合物制劑組和陽(yáng)性對(duì)照組明顯增粗、增多，染色增強(qiáng)。從表1中我們 可以看到，本發(fā)明組合物制劑組和陽(yáng)性對(duì)照組胃竇黏膜肌內(nèi)N0S陽(yáng)性神經(jīng)纖維及其末梢的 面積較空白對(duì)照組明顯減少，而其平均吸光度值較空白對(duì)照組也明顯降低，具有非常顯著 性差異(P < 0. 01)。從表2中我們可以看到，本發(fā)明組合物制劑組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠胃竇 組織中NO含量明顯減少，Ach含量增多，與空白對(duì)照組均有非常顯著性差異(P < 0. 01)。由此我們分析，本發(fā)明組合物制劑促胃排空的功能，與其增加胃組織中興奮性神 經(jīng)遞質(zhì)Ach的含量，同時(shí)降低胃組織中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)NO含量相關(guān)。NO的含量降低與本發(fā) 明組合物制劑減少大鼠胃竇壁內(nèi)N0S陽(yáng)性神經(jīng)元成分，降低其活性相關(guān)。實(shí)驗(yàn)例3 橘皮含量測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)本發(fā)明制劑組合物由橘皮、丹參、地龍等6味中藥組成。橙皮苷為橘皮的主要有效 成份。橙皮苷為橘皮化學(xué)成分中一種重要的黃酮類化合物，《中國(guó)藥典》2005年版I部以橙 皮苷作為橘皮的高效液相色譜含量測(cè)定的對(duì)照品。測(cè)定本發(fā)明組合物中橙皮苷的含量有助 于控制本中成藥制劑的質(zhì)量，確保臨床用藥的安全、有效。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定橙皮苷含量，分析速度快，靈敏度高，專屬性強(qiáng)， 應(yīng)用范圍廣，重現(xiàn)性與準(zhǔn)確性均優(yōu)于薄層色譜-紫外分光光度法、薄層色譜掃描法。1、測(cè)定波長(zhǎng)的選擇用流動(dòng)相稀釋后橙皮苷對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明其最大吸收在 284nm，因此選擇284nm波長(zhǎng)作為本制劑組物中橙皮苷的測(cè)定波長(zhǎng)，可有效提高測(cè)定的靈敏 度和準(zhǔn)確度，減小其它雜質(zhì)所帶來(lái)的干擾。2、色譜條件的選擇2. 1色譜柱的選擇采用三種十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，色譜柱型號(hào)如下， 結(jié)果表明，三種十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱均適用。
Hypersil ODS C18(250mmX4. 6mm)；AQ-C18 5um 250mmX 4. 6mm(AICHR0M)；YMC-ODS-3 C18 5 u m 150mmX4.6mm。2. 2流動(dòng)相的選擇選擇乙腈-水-磷酸(20 80 0.1)和甲醇-水-醋酸(35 61 4)為流動(dòng) 相進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，后者色譜圖中橙皮苷峰對(duì)稱性較前者差，同時(shí)保留時(shí)間較前者長(zhǎng)。3、供試品溶液的制備為了確保測(cè)定結(jié)果真實(shí)、準(zhǔn)確，本發(fā)明通過(guò)一系列考察，確保制備供試品溶液時(shí)將 本發(fā)明組合物顆粒中的橙皮苷提取完全。3. 1提取方法的選擇取本發(fā)明組合物制劑研細(xì)，取0. 5g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇約40ml，稱定 重量，照以下方法試驗(yàn)a 超聲處理30分鐘；b 加熱回流30分鐘；c 索式提取60分鐘。放 冷，濾過(guò)，濾液置50ml量瓶中，濾渣及容器用甲醇洗滌2次，每次4ml，洗液濾入同一量瓶中， 加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，濾液作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液1-3各 10 yl，注入液相色譜儀，測(cè)定。提取方法的選擇見(jiàn)表7。表 7 以上數(shù)據(jù)表明，超聲提取橙皮苷含量較高，且超聲方法簡(jiǎn)便易行，故選擇超聲提 取。3. 2提取溶劑的選擇取本發(fā)明組合物制劑研細(xì)，取0. 5g，精密稱定，置錐形瓶中，照以下方法試驗(yàn)，精密 加入a:甲醇；b :80%甲醇；c :50%甲醇各40ml，超聲處理30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置50ml 量瓶中，濾渣及容器用分別用上述溶劑洗滌2次，每次4ml，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至 刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，濾液作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液1-3各10 yl，注入 液相色譜儀，測(cè)定。提取溶劑的選擇見(jiàn)表8。表 8 以上數(shù)據(jù)表明，甲醇為提取橙皮苷最佳溶劑，故選擇甲醇作為提取溶劑。3. 3提取時(shí)間的選擇取本發(fā)明組合物制劑研細(xì)，取0. 5g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇約40ml，照以 下方法試驗(yàn)分別超聲處理15、30、45分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置50ml量瓶中，濾渣及容器用 甲醇洗滌2次，每次4ml，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，濾液 作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液1-3各10 yl，注入液相色譜儀，測(cè)定。提取時(shí)間的 選擇見(jiàn)表9。表 9 以上數(shù)據(jù)表明，超聲30分鐘基本可以將制劑中橙皮苷提取完全，故超聲提取30分 鐘。3. 4提取溶劑量的優(yōu)選取本發(fā)明組合物制劑研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，照以下方法試驗(yàn)分 別精密加入甲醇25、40、50ml，超聲處理30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置50ml量瓶中，濾渣及容 器用洗滌2次，每次4ml，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，濾液 作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液1-3各10iU，注入液相色譜儀，測(cè)定。提取溶劑量 的優(yōu)選見(jiàn)表10。表 10 以上數(shù)據(jù)表明，40ml甲醇可基本將制劑中的橙皮苷提取完全，故確定提取溶劑量為 40ml。綜上試驗(yàn)最后確定本發(fā)明組合物顆粒劑中橙皮苷含量測(cè)定的色譜條件及對(duì)照品 和供試品制備方法為色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲 醇-0. 025mol/L磷酸溶液(85%磷酸溶液1. 70ml，用水稀釋至近1000ml，用三乙胺約1. 8ml 調(diào)節(jié)pH至2. 9 3. 1，加水至1000ml) (40 60)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm。對(duì)照品溶 液的制備精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含5 y g的溶液，即得。供試品溶 液的制備取本發(fā)明組合物制劑研細(xì)，取0. 5g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇約40ml，超聲 處理30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置50ml量瓶中，濾渣及容器用甲醇洗滌2次，每次4ml，洗液 濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品 溶液與供試品溶液各10yl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。實(shí)驗(yàn)例4 橙皮苷含量測(cè)定方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)檢測(cè)儀器(室溫檢測(cè))TSP高效液相色譜儀；色譜柱HypersilODS C18(250mmX4. 6mm)；流動(dòng)相乙腈-水-磷酸(20 80 0. 2)檢測(cè)波長(zhǎng)284nm流速1.0mL/min對(duì)照品來(lái)源橙皮苷(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)供試品批號(hào)04081201、04091302、04101403供試品制備取本發(fā)明組合物制劑研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇 約40ml，超聲處理30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置50ml量瓶中，濾渣及容器用甲醇洗滌2次，每 次4ml，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。對(duì)照品溶液的制備精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含g的溶 液，即得。1.含量測(cè)定方法學(xué)考察1.1線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品溶液2. 5,5,10，15，20 ii L，測(cè)定橙皮苷吸收峰面積。以橙皮苷吸 收峰面積的積分值對(duì)橙皮苷進(jìn)樣量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:A = 2562. 8X+25. 7, r = 0.9999。結(jié)果表明，橙皮苷在0. 0125 0. 1 y g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。1.2精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定橙皮苷吸收峰面積，結(jié)果RSD為1. 0%。1.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)(批號(hào)04081201)樣品五份，對(duì)每份進(jìn)行測(cè)定，求得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié) 果 RSD 為 1. 2%。1.4溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一(04081201)供試品溶液，每間隔2小時(shí)，測(cè)定橙皮苷吸收峰面積6 次，結(jié)果RSD為0. 4%，表明供試品溶液在8h內(nèi)基本穩(wěn)定。1.5回收率試驗(yàn)
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采用加樣回收法，精密稱取已知含量的本發(fā)明組合物制劑0.25g，精密稱定，精密 加入橙皮苷對(duì)照品適量，按供試品溶液制備方法制備，測(cè)定該方法橙皮苷回收率?；厥章试?驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表11。表11 1. 6本發(fā)明組合物制劑測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表12 表12 根據(jù)以上數(shù)據(jù)，將含量限度定為本發(fā)明組合物制劑每袋含橘皮以橙皮苷計(jì)，每袋 不得少于0. 3mg。實(shí)驗(yàn)例5 丹參薄層鑒別試驗(yàn)本發(fā)明組合物制劑中所含丹參藥材中的有效成分為原兒茶醛等醛類化合物。本發(fā) 明利用薄層色譜鑒別制劑中的原兒茶醛，鑒定制劑中的丹參藥材。1、薄層色譜方法的選擇常見(jiàn)的薄層色譜有硅膠薄層層析、紙層析等。硅膠薄層適用于低極性及中等極性 成分，適用范圍較廣；紙層析適用于大極性成分如多糖類成分。原兒茶醛為中等極性，選擇 硅膠層析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2、供試品的制備2. 1制劑中原兒茶醛的提取方法考察方法1 直接萃取法取本發(fā)明組合物制劑10g，研細(xì)，加水40ml使溶解，用醋酸乙酯振搖提取二次，每 次30ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液1。方法2:酸水萃取法取本發(fā)明組合物制劑10g，研細(xì)，加水40ml使溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3 4， 用醋酸乙酯振搖提取二次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液2。方法3:固液萃取法取本發(fā)明組合物制劑10g，研細(xì)，用60ml醋酸乙酯超聲提取，30min，合并醋酸乙酯 液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液3。取原兒茶醛對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含lmg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各5iU，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸 (8:5: 0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀(1 1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下供試品溶液1非常粘稠、混濁，點(diǎn)樣困難，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的 位置上無(wú)相同顏色的斑點(diǎn)。供試品溶液2色譜中在原兒茶醛對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)， 斑點(diǎn)位置確定，顯色清晰。供試品溶液3色譜中所含成分較多，在原兒茶醛對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置上顯相 同顏色的斑點(diǎn)，，但有雜質(zhì)干擾；因此，選用酸水萃取法提取制劑中原兒茶醛。2. 2提取液pH值的考察制備供試品溶液過(guò)程中溶液的酸性會(huì)影響原兒茶醛的萃取率。取本發(fā)明組合物制劑10g三份，研細(xì)，加水40ml使溶解，分別加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值 為1 2、3 4、5 6，分別用醋酸乙酯振搖提取二次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，蒸干， 殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液1-3。取原兒茶醛對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含lmg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各5iU，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸 (8:5: 0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀(1 1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1 2供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯顏色較 弱的斑點(diǎn)；稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值為3 4供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同 顏色的斑點(diǎn)；稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值為5 6供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上無(wú)相 同顏色的斑點(diǎn)。幾乎沒(méi)有起到抑制轉(zhuǎn)化的作用。因此，選用稀鹽酸將提取液pH值調(diào)節(jié)為3 4。2. 3萃取方法的考察采用L93⑷正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)乙酸乙酯萃取方法進(jìn)行考察。見(jiàn)表13。表 13 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方案制備了 9份供試品溶液。另取原兒茶醛對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含lmg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各5iU，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸 (8:5: 0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀(1 1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下采用石油醚做萃取溶劑時(shí)，萃取效率較低，在供試品色譜中與對(duì)照品色譜相應(yīng)位 置上，無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)；采用正丁醇做萃取溶劑時(shí)，萃取能力過(guò)強(qiáng)，丹參中的很多其他成分也 被萃取出來(lái)，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有顯相同顏色的斑點(diǎn)，但雜質(zhì)較 多，干擾鑒別；采用乙酸乙酯做萃取溶劑時(shí)，萃取能力適宜，比較用量、次數(shù)及水用量等因 素，發(fā)現(xiàn)加水40ml (4倍量)使溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3 4，用醋酸乙酯振搖提取2 次，每次30ml，合并醋酸乙酯液。按該方法制備的供試品，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯 相同顏色的斑點(diǎn)，清晰、無(wú)干擾。2. 4供試品溶液及對(duì)照藥材溶液點(diǎn)樣量的考察吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液2111、5111、10111，分別點(diǎn)于同一硅膠6薄層板 上，以苯-醋酸乙酯-甲酸(8 5 0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶 液-1%鐵氰化鉀(1:1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下原兒茶醛對(duì)照品溶液點(diǎn)樣量為2 iU時(shí)，斑點(diǎn)強(qiáng)度較低，不宜觀察；點(diǎn)樣量為5iU 時(shí)，原兒茶醛對(duì)照品溶液薄層上斑點(diǎn)清晰，大小適中；點(diǎn)樣量為lOiil時(shí)，斑點(diǎn)太大，拖尾。確定原兒茶醛對(duì)照品溶液的最佳點(diǎn)樣量為5 iU。供試品溶液點(diǎn)樣量為2iU時(shí)，在原兒茶醛對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的位置上斑點(diǎn)強(qiáng)度較低， 不宜觀察；點(diǎn)樣量為5iU時(shí)，在原兒茶醛對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的位置上斑點(diǎn)明顯，斑點(diǎn)大小適中， 前后無(wú)干擾；點(diǎn)樣量為10yl時(shí)，在原兒茶醛對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的位置上斑點(diǎn)較大，明顯拖尾， 與前后斑點(diǎn)相連。確定供試品的最佳點(diǎn)樣量為5 iU。2. 5展開(kāi)劑的選擇吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各5 iU，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，分別用 以下展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀(1 1)。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下方法1 展開(kāi)劑為苯-醋酸乙酯-甲酸(3 5 0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)劑極性較大， 供試品色譜中原兒茶醛斑點(diǎn)與前后斑點(diǎn)未分開(kāi)；
方法2 展開(kāi)劑為苯-醋酸乙酯-甲酸(8 5 0.8)，極性適宜，原兒茶醛斑點(diǎn)Rf 值接近0. 45，供試品色譜中原兒茶醛斑點(diǎn)分離良好，前后無(wú)干擾；方法3:展開(kāi)劑為苯-醋酸乙酯-甲酸(18 5 0.8)，極性偏低，供試品色譜中 原兒茶醛斑點(diǎn)與前后斑點(diǎn)未分開(kāi)。確定分離中藥組合物制劑中原兒茶醛的最優(yōu)薄層展開(kāi)劑為苯-醋酸乙酯-甲酸 (8 5 0.8)。2. 6顯色劑的選擇吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各5 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，分別用 以下展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，用以下三種顯色劑進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下方法1 顯色劑為碘蒸氣熏，供試品色譜中原兒茶醛斑點(diǎn)與前后有很多斑點(diǎn)顯色，不宜用于鑒別；方法2:顯色劑為三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀(1 1)，供試品色譜中原兒茶 醛斑點(diǎn)清晰；方法3 顯色劑為5%香草醛濃硫酸，105°C加熱至斑點(diǎn)顯色。雖然能夠?qū)θ╊惓煞?顯色，但由于原兒茶醛和原兒茶酸之間存在轉(zhuǎn)化關(guān)系，此顯色劑，顯色后，需105°C加熱破壞 了原兒茶醛的穩(wěn)定性。供試品色譜中原兒茶醛斑點(diǎn)與前后斑點(diǎn)不清晰。確定分離中藥組合物制劑中原兒茶醛的最優(yōu)薄層顯色劑為三氯化鐵溶 液-1%鐵氰化鉀。綜上試驗(yàn)最后確定中藥組合物制劑中丹參的薄層色譜鑒別條件為取本發(fā)明組合物制劑10g，研細(xì)，加水40ml使溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3 4， 用醋酸乙酯振搖提取二次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為 供試品溶液，另取原兒茶醛對(duì)照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對(duì)照品溶液，照 薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙 酯-甲酸(8 5 0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀 (1:1)。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)例6 地龍薄層鑒別試驗(yàn)本發(fā)明組合物制劑中所含地龍藥材中的有效成分為腺苷類成分。本發(fā)明利用薄層 色譜鑒別制劑中的地龍藥材。1、供試品制備方法的選擇1.1提取方法的選擇實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下取本發(fā)明組合物制劑IOg三份，分別研細(xì)，加氯仿20ml，密塞，分別超聲處理20分 鐘、回流處理30分鐘、振搖處理60分鐘，濾過(guò)，濾液濃縮至1ml，作為供試品溶液1-3。
取地龍對(duì)照藥材lg，超聲處理20分鐘，濾過(guò)，濾液濃縮至Iml，制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述溶液各5μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯(9 1)為 展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，至紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果表明振搖法不能提取完全，在供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，不顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。超聲法和回流法效果相差較小，在供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相 應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。由于超聲法比較簡(jiǎn)便，選用超聲法提取制劑中地龍 成分。2. 2超聲提取法的考察采用L93⑷正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響提取的三個(gè)因素；提取溶劑的種類、提取溶劑用 量、提取時(shí)間進(jìn)行考察。見(jiàn)表14。表14 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方案制備9份供試品溶液。取地龍對(duì)照藥材lg，超聲處理20分鐘，濾過(guò)，濾液濃縮至1ml，制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述溶液各5μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯(9 1)為 展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，至紫外光燈(365nm)下檢視。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下采用石油醚做萃取溶劑時(shí)，由于溶劑中含有很少量的水，萃取效率降低。在供試品 色譜中與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)。采用乙酸乙酯做萃取溶劑時(shí)，萃取能力過(guò)強(qiáng)，地龍中的很多其他成分也被萃取出 來(lái)，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有顯相同顏色的斑點(diǎn)，但雜質(zhì)較多，干擾鑒 別。采用氯仿做溶劑時(shí)，萃取能力適宜，比較用量、次數(shù)及水用量等因素，發(fā)現(xiàn)加氯仿 20ml (2倍量)，超聲處理20分鐘提取完全。制備的供試品溶液點(diǎn)樣后，在供試品色譜中，在 與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)最清晰、無(wú)干擾。最終確定取地龍供試品溶液的制備方法為取本發(fā)明組合物制劑IOg研細(xì)，加氯 仿20ml，密塞，超聲處理20分鐘，濾過(guò)，濾液濃縮至1ml，作為供試品溶液。3、供試品溶液點(diǎn)樣量的考察分別吸取供試品溶液2、5、8μ 1點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開(kāi)、檢識(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下供試品溶液點(diǎn)樣量為2μ 1時(shí)，斑點(diǎn)強(qiáng)度較低，不宜觀察；供試品溶液點(diǎn)樣量為 5μ1時(shí)，薄層上斑點(diǎn)清晰，大小適中，無(wú)拖尾，前后無(wú)干擾；供試品溶液點(diǎn)樣量為8μ 1時(shí)，供 試品溶液薄層上斑點(diǎn)較大，與前后熒光斑點(diǎn)相連。確定供試品溶液的最佳點(diǎn)樣量為5 μ 1。4、展開(kāi)劑的選擇照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各5 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以一下三種方法展開(kāi)，取出，晾干，至紫外光燈(365nm)下檢視。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下
方法1 展開(kāi)劑為苯-醋酸乙酯(2 1)為展開(kāi)劑，極性過(guò)小，供試品及對(duì)照藥材 色譜中斑點(diǎn)比移值較小，與前后斑點(diǎn)未分開(kāi)。方法2:展開(kāi)劑為苯-醋酸乙酯(9 1)為展開(kāi)劑，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材 色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)比移植適宜。方法3:展開(kāi)劑為為苯-醋酸乙酯(1 1)為展開(kāi)劑，極性過(guò)大，供試品及對(duì)照藥 材色譜中斑點(diǎn)比移值較大，與前后斑點(diǎn)未分開(kāi)。確定分離中藥組合物制劑中地龍成分的最優(yōu)薄層展開(kāi)劑為苯-醋酸乙酯(9 1)。5、顯色方法的選擇吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各5 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，重復(fù)三塊 薄層板分別展開(kāi)，取出，晾干，以下三種方式顯色。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下方法1 顯色劑為碘蒸氣熏，供試品色譜中對(duì)照藥材特征斑點(diǎn)前后有很多斑點(diǎn)，不 宜用于鑒別；方法2 顯色方式至紫外光燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜 相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。方法3 顯色劑為10%硫酸乙醇，105°C加熱至斑點(diǎn)顯色。供試品色譜中對(duì)照藥材 特征斑點(diǎn)前后有很多斑點(diǎn)，不宜用于鑒別；確定分離中藥組合物制劑中地龍成分的最優(yōu)薄層顯色方式為紫外光燈(365nm) 下檢視。綜上試驗(yàn)最后確定中藥組合物制劑中地龍的薄層色譜鑒別條件為取本發(fā)明組合物制劑10g，研細(xì)，加氯仿20ml，密塞，超聲處理20分鐘，濾過(guò)，濾液 濃縮至1ml，作為供試品溶液，另取地龍對(duì)照藥材lg，同法制成對(duì)照藥材溶液，照薄層色譜 法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯(9 1) 為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，至紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色 譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1橘葉412. 5g 丹參 412. 5g 皂角刺 275g王不留行 275g 川楝子 275g 地龍 275g以上六味，除地龍、王不留行外，其余橘葉等四味加水煎煮二次，每次1小時(shí)，合 并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.25 1.30(85°C )，放冷，備用；地龍、王不留行用 70%乙醇回流提取二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，加入上述濃縮液中， 調(diào)整乙醇量達(dá)70%，攪拌均勻，靜置，回收乙醇并濃縮成稠膏，加蔗糖500g與淀粉、糊精適 量，混勻，制成顆粒，干燥，制成lOOOg，即得。鑒別(1)取本品10g，研細(xì)，加水40ml使溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3 4，用醋酸乙酯振搖提取二次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為供試品溶液，另取原兒茶醛對(duì)照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜法 (中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸(8 5 0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三 氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀(1 1)。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同 顏色的斑點(diǎn)。(2)取本品10g，研細(xì)，加氯仿20ml，密塞，超聲處理20分鐘，濾過(guò)，濾液濃縮至 lml，作為供試品溶液，另取地龍對(duì)照藥材lg，同法制成對(duì)照藥材溶液，照薄層色譜法(中國(guó) 藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層 板上，以苯-醋酸乙酯(9 1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，至紫外光燈(365nm)下檢視。供 試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。含量測(cè)定照高效液相色譜法，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充 齊U ；甲醇-0. 025mol/L磷酸溶液(85%磷酸溶液1. 70ml，用水稀釋至近1000ml，用三乙胺約 1. 8ml調(diào)節(jié)pH至2. 9 3. 1，加水至1000ml) (40 60)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm。理 論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。對(duì)照品溶液的制備精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每Iml含5μ g的溶 液，即得。供試品溶液的制備取本品裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置 錐形瓶中，加甲醇約40ml，超聲處理(功率250W，頻率33KHZ) 30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置 50ml量瓶中，濾渣及容器用甲醇洗滌2次，每次4ml，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度， 搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入 液相色譜儀，測(cè)定，即得。本品每袋含橘葉以橙皮苷(C28H34O15)計(jì)，不得少于3. Omg功能與主治疏肝理氣，活血化瘀，消散乳塊。用于肝氣郁結(jié)，氣滯血瘀，乳腺增 生，乳房脹痛。用法與用量開(kāi)水沖服，一次1袋，一日3次或遵醫(yī)囑。規(guī)格每袋裝IOg實(shí)施例2橘葉412. 5g 丹參 412. 5g 皂角刺 275g王不留行 275g 川楝子 275g 地龍 275g以上六味，除地龍、王不留行外，其余橘葉等四味加水煎煮二次，每次1小時(shí)，合 并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.25 1.30(85°C )，放冷，備用；地龍、王不留行用 70%乙醇回流提取二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，加入上述濃縮液中， 調(diào)整乙醇量達(dá)70%，攪拌均勻，靜置，回收乙醇并濃縮成稠膏，加蔗糖500g與淀粉、糊精適 量，混勻，制成顆粒，干燥，制成lOOOg，即得。含量測(cè)定照高效液相色譜法，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充 齊U ；甲醇-0. 025mol/L磷酸溶液(85%磷酸溶液1. 70ml，用水稀釋至近1000ml，用三乙胺約 1. 8ml調(diào)節(jié)pH至2. 9 3. 1，加水至1000ml) (40 60)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm。理 論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。
對(duì)照品溶液的制備精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每Iml含5μ g的溶 液，即得。供試品溶液的制備取本品裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置 錐形瓶中，加甲醇約40ml，超聲處理(功率250W，頻率33KHZ) 30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置 50ml量瓶中，濾渣及容器用甲醇洗滌2次，每次4ml，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度， 搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μ 1，注入 液相色譜儀，測(cè)定，即得。本品每袋含橘葉以橙皮苷(C28H34O15)計(jì)，不得少于3. Omg實(shí)施例3
橘葉412. 5g 丹參 412. 5g 皂角刺 275g王不留行 275g 川楝子 275g 地龍 275g以上六味，除地龍、王不留行外，其余橘葉等四味加水煎煮二次，每次1小時(shí)，合 并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.25 1.30(85°C )，放冷，備用；地龍、王不留行用 70%乙醇回流提取二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，加入上述濃縮液中， 調(diào)整乙醇量達(dá)70%，攪拌均勻，靜置，回收乙醇并濃縮成稠膏，加蔗糖500g與淀粉、糊精適 量，混勻，制成顆粒，干燥，制成lOOOg，即得。鑒別(1)取本品10g，研細(xì)，加水40ml使溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3 4，用醋酸乙 酯振搖提取二次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為供試品溶 液，另取原兒茶醛對(duì)照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜法 (中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸(8 5 0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三 氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀(1:1)。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同 顏色的斑點(diǎn)。(2)取本品10g，研細(xì)，加氯仿20ml，密塞，超聲處理20分鐘，濾過(guò)，濾液濃縮至 lml，作為供試品溶液，另取地龍對(duì)照藥材lg，同法制成對(duì)照藥材溶液，照薄層色譜法(中國(guó) 藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層 板上，以苯-醋酸乙酯(9 1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，至紫外光燈(365nm)下檢視。供 試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。
權(quán)利要求
一種疏肝理氣，活血化瘀的中藥組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為橘葉275～550重量份、丹參275～550重量份、皂角刺137.5～412.5重量份、王不留行137.5～412.5重量份、川楝子137.5～412.5重量份、地龍137.5～412.5重量份。
2.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為橘葉412. 5重量份、丹參412. 5重量份、皂角刺275重量份、王不留行275重量份、川楝子275重量份、地龍275重量份。
3.如權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法為除地龍、王不留行外，其余橘葉等四味加水煎煮二次，每次1小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾 液濃縮至相對(duì)密度為1. 25 1. 30(85°C )，放冷，備用；地龍、王不留行用70%乙醇回流提 取二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，加入上述濃縮液中，調(diào)整乙醇量達(dá) 70%，攪拌均勻，靜置，回收乙醇并濃縮成稠膏，加蔗糖500重量份與淀粉、糊精適量，混勻， 制成顆粒，干燥，制成即得。
4.如權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物制劑的質(zhì)量檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟A、含量測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑； 30-50 50-70比例的甲醇-0. 01 0. 03mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 290nm ；對(duì)照品溶液的制備精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含2 10 y g的 溶液；供試品溶液的制備取該組合物制劑研細(xì)，取0. 5g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇約 20 80ml，超聲處理20 40分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置25 100ml量瓶中，濾渣及容器用 甲醇洗滌1 3次，每次3 10ml，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾 液，即得；測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 20 yl，注入液相色譜儀， 測(cè)定，即得，相當(dāng)于原藥材16_22g的組合物制劑含橘葉以橙皮苷計(jì)，不得少于3. Omg ；B、鑒別取該組合物制劑10g，研細(xì)，加水30 50ml使溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為 3 4，用醋酸乙酯振搖提取1 3次，每次20 50ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹?醇1ml使溶解，作為供試品溶液，另取原兒茶醛對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1 3mg的溶 液，作為對(duì)照品溶液；吸取上述兩種溶液各2 10 yl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以 4-12 4-7 0.8比例的苯-醋酸乙酯-甲酸混合溶劑為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀1 1 ；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相 同顏色的斑點(diǎn)；C、鑒別取該組合物制劑10g，研細(xì)，加氯仿10 30ml，密塞，超聲處理15 30分鐘，濾 過(guò)，濾液濃縮至1ml，作為供試品溶液；另取地龍對(duì)照藥材lg，同法制成對(duì)照藥材溶液，照薄 層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 10iU，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以13-6 1 比例的苯_醋酸乙酯混合溶劑為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，至365nm紫外光燈下檢視；供試 品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物制劑的質(zhì)量檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟含量測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；40 60 的甲醇-0. 025mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為284nm ；理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不 低于5000 ；對(duì)照品溶液的制備精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含g的 溶液，即得；供試品溶液的制備取該組合物制劑，研細(xì)，取0. 5g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇約40ml，功率250W，頻率33KHZ超聲處理30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液置50ml量瓶中，濾 渣及容器用甲醇洗滌2次，每次4ml，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù) 濾液，即得；測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10yl，注入液相色譜儀，測(cè) 定，即得；丹參薄層鑒別取該組合物制劑10g，研細(xì)，加水40ml使溶解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為 3 4，用醋酸乙酯振搖提取二次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶 解，作為供試品溶液；另取原兒茶醛對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含lmg的溶液，作為對(duì)照品溶 液；吸取上述兩種溶液各5 yl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以8 5 0.8的苯-醋酸 乙酯-甲酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀1 1;供試 品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)；地龍薄層鑒別取該組合物制劑10g，研細(xì)，加氯仿20ml，密塞，超聲處理20分鐘，濾過(guò)， 濾液濃縮至1ml，作為供試品溶液，另取地龍對(duì)照藥材lg，同法制成對(duì)照藥材溶液；吸取上 述兩種溶液各5iU，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以9 1苯-醋酸乙酯為展開(kāi)劑，展開(kāi)， 取出，晾干，至365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯 相同顏色的熒光斑點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種疏肝理氣，活血化瘀，消散乳塊的中藥組合物，該組合物由橘葉、丹參、皂角刺、王不留行等制成臨床或藥學(xué)上可接受的劑型，該中藥組合物具有很好的消散乳塊的作用；本發(fā)明中藥組合物制劑的質(zhì)量檢測(cè)方法檢測(cè)專屬性好、穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、精密度高，更加適合工業(yè)化的生產(chǎn)，真正確保了臨床用藥的安全、有效、可靠。
文檔編號(hào)G01N30/36GK101856413SQ20091008176
公開(kāi)日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
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