本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程和基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種大腸桿菌重組外膜蛋白rBamA的制備方法及其免疫保護(hù)功能的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1)大腸桿菌(Escheria coli，E.coli)，又稱大腸埃希氏菌，又廣泛存在于生物體內(nèi)，包括植物，人及其它溫血?jiǎng)游矬w內(nèi)。大多數(shù)大腸桿菌正常棲居條件下不致病，但若進(jìn)入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在腸道內(nèi)大量繁殖，常隨糞便散布在周?chē)h(huán)境中。同時(shí)，一些攜帶致病性因子(如腸毒素)的大腸桿菌能引起健康動(dòng)物發(fā)病，如腸道腹瀉型，尿路感染型，敗血癥及腦膜炎等疾病。

目前，針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的防治手段是利用抗生素和疫苗接種。然而抗生素的長(zhǎng)期大量使用大大加速了致病菌耐抗藥性的進(jìn)化。隨著抗菌藥物在獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應(yīng)用，及耐藥性質(zhì)粒在腸桿菌之間的轉(zhuǎn)移，致病性大腸桿菌對(duì)許多抗菌藥物的敏感性逐漸降低，耐藥性菌株越來(lái)越多。各地和不同動(dòng)物的分離株對(duì)抗菌藥物的耐藥性差別很大，因此很難確定一個(gè)能夠普遍適用的藥物敏感譜。根據(jù)監(jiān)測(cè)的情況，對(duì)慶大霉素、丁胺卡那霉素及痢特靈的抗生素敏感的菌株比例較高。越來(lái)越多的耐藥性菌株不斷出現(xiàn)。抗生素濫用引起的耐藥性問(wèn)題及抗生素殘留問(wèn)題已經(jīng)是一個(gè)全球性亟需解決的問(wèn)題，減少抗生素的使用是一個(gè)艱難但必須實(shí)施的方案。改善動(dòng)物養(yǎng)殖條件，接種疫苗預(yù)防病原菌是減少抗生素使用的有效途徑。

畜禽大腸桿菌病原菌的血清型很多，不同地區(qū)可能存在不同的優(yōu)勢(shì)血清群：據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大腸桿菌菌體O抗原171種，莢膜K抗原103種，鞭毛H抗原56種，這些抗原可組合成大量抗原性不同的血清型。但是，研究發(fā)現(xiàn)不同血清型之間抗原交叉保護(hù)力非常弱，目前尚不可能制備一種覆蓋所有血清型的超廣譜疫苗。此外，我國(guó)不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清群差異的存在導(dǎo)致未能像國(guó)外那樣通過(guò)開(kāi)發(fā)包括優(yōu)勢(shì)血清群抗原的疫苗就可達(dá)到理想的免疫效果。因此，畜禽大腸桿菌疫苗在我國(guó)應(yīng)用存在較大的局限性。目前疫苗主要為單一血清型或單一致病型，雖然部分疫苗對(duì)本血清型或本致病型菌株具有較好的免疫保護(hù)作用，但對(duì)其他菌株的交叉免疫保護(hù)作用較弱或者沒(méi)有。由于大腸桿菌血清型種類(lèi)繁多，這種疫苗的開(kāi)發(fā)遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了免疫防控的要求。目前針對(duì)大腸桿菌的通用型疫苗研究較少。

BamA蛋白屬于Omp85蛋白家族，由810個(gè)氨基酸殘基組成，前1～20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。N端位于周質(zhì)空間，為周質(zhì)多肽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)(periplasmic polypeptide transport-associated，POTRA)區(qū)域，C端為跨膜區(qū)，包含16條不連續(xù)的β-桶狀跨膜鏈。作為外膜組裝復(fù)合物的一部分，BamA主要參與外膜蛋白的正確組裝。敲除BamA蛋白對(duì)大腸桿菌是致命的，因?yàn)闀?huì)導(dǎo)致一系列的外膜蛋白，包括TolC，OmpF，OmpC及OmpA等蛋白無(wú)法正確的組裝。減少BamA表達(dá)會(huì)引起對(duì)接觸依賴性生長(zhǎng)抑制劑的敏感性降低，及外膜蛋白合成的下調(diào)。該蛋白在大腸桿菌體內(nèi)具有高度的保守性，具有開(kāi)發(fā)成通用型疫苗的潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種大腸桿菌重組外膜蛋白rBamA的制備方法，及其在免疫功能方面的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種大腸桿菌重組蛋白疫苗，重組蛋白疫苗為含有列表SEQ ID NO.1的原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-rBamA。

大腸桿菌重組蛋白疫苗的制備方法，所述質(zhì)粒pET-28a-rBamA，以大腸桿菌CVCC1515為模板，采用BamA F-EcoR I/BamA R-Not I引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與載體pET-28a(+)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pET-28a-rBamA。

所述引物為BamA F-EcoR I：5’-GAATTCAATTGGTTAGGTACAGGTTATGC-3’，BamA R-Not I：5’-GCGGCCGCCCAGGTTTTGCCGATGTTGAACT-3’。

大腸桿菌重組蛋白疫苗的應(yīng)用，及所述重組蛋白疫苗在預(yù)防和治療大腸桿菌病中的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為重組質(zhì)粒pET-28a-rBamA構(gòu)建及菌落PCR驗(yàn)證電泳圖

圖2為重組外膜蛋白rBamA誘導(dǎo)SDS電泳圖。

圖3為外膜蛋白純化SDS電泳圖。

圖4為小鼠免疫外膜蛋白血清效價(jià)。

圖5為外膜蛋白免疫小鼠攻毒大腸桿菌存活率。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，本發(fā)明實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器等均可市售獲得，若未具體指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次或三次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。

實(shí)施例1.pET-28a-rBamA載體構(gòu)建

以大腸桿菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為1089bp，其引物序列如下：BamA F-EcoR I：5’-GAATTCAATTGGTTAGGTACAGGTTAT GC-3’，BamA R-Not I：5’-GCGGCCGCCCAGGTTTTGCCGATGTTG AACT-3’。

利用天根瓊脂凝膠回收試劑盒(DP130419)對(duì)PCR產(chǎn)物切膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD-19T simple vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒測(cè)序。

對(duì)測(cè)序正確的質(zhì)粒及pET28a載體進(jìn)行EcoR I和Not I雙酶切。酶切體系如下：

37℃水浴4h，1.5％瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收。

將回收的OmpA，BamA，TolC雙酶切片段分別與pET 28a載體進(jìn)行連接，連接體系如下：

16℃連接2h.

實(shí)施例2.目標(biāo)蛋白的表達(dá)

分別挑取對(duì)照菌和重組菌1～2個(gè)菌落，接入1mL含Kan(50μg/mL)的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

取50μL過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到5mL含Kan(50μg/mL)的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD600＝0.4～0.5)。

向誘導(dǎo)管中加入IPTG使其終濃度達(dá)到1mmol/L，250rpm，37℃振蕩培養(yǎng)8h左右取樣，-20℃保存，以便SDS-PAGE電泳分析。

誘導(dǎo)結(jié)束后，取1mL菌液，8000rmp，4℃離心收集菌體，2min，棄去上清，用200μLPBS重懸菌體，40μL 6×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸10min，室溫12000rpm離心5min，取上清至新離心管中，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。經(jīng)Geliance 200凝膠電泳分析軟件分析，IPTG誘導(dǎo)6h后，空菌株對(duì)照和空載體對(duì)照組無(wú)目的蛋白表達(dá)，重組菌株均有目的蛋白表達(dá)。BamA蛋白占細(xì)胞總蛋白比例 在47.7％～60.95％之間。

實(shí)施例3.菌體裂解及初步分離

1)菌液于4℃，7000rpm離心20min，用8mL/g裂解緩沖液懸浮菌體后，冰上超聲裂解菌體(5son，10soff)。

2)4℃，14000g離心20min，去掉上清。

3)每克包涵體溶于50mL 50mM Tris-HCl緩沖液(1.5％(v/v)LDAO，pH 7.9)中，20℃震蕩孵育1h。

4)4℃，16000g離心30min沉淀包涵體。

5)每克包涵體重懸于20mL 50mM Tris-HCl，pH 7.9緩沖液中，4℃，16000g離心30min，棄上清。

6)每克包涵體加入80mL變性緩沖液，14000g離心20min，保留上清。

7)按1∶1體積比例逐步加入重折疊緩沖液，同時(shí)快速攪拌。全部加入后20℃持續(xù)攪拌1h。

8)加入4L透析緩沖液，4℃透析6-8h；相同條件下透析2次。

實(shí)施例4.純化與折疊重組蛋白

1)用10倍體積的緩沖液A平衡HISTrap柱。

2)加入透析的包涵體溶液。

3)用10倍體積的緩沖液A沖洗，收集穿透峰。

4)用8倍體積的緩沖液B梯度洗脫蛋白，收集洗脫峰。

5)樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分析檢測(cè)。

6)用緩沖液C平衡HiPrep^TM 26/10脫鹽柱，將含有目的蛋白的 收集液過(guò)HiPrep^TM 26/10脫鹽柱。

7)收集的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，測(cè)定蛋白濃度。并將收集的樣品進(jìn)行凍干，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

經(jīng)純化后，rBamA蛋白純度為87.3％，符合常規(guī)免疫的標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例4.重組蛋白小鼠免疫及攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)

純化的rBamA蛋白重懸于無(wú)菌PBS中，終濃度為1mg/mL，免疫前尾巴靜脈取血25μL，-20℃保存。25μL抗原溶液與25μL完全弗氏試劑混合，加入50μL PBS，冰上放置。按100μL/只小鼠的劑量進(jìn)行皮下注射小鼠(免疫組)。對(duì)照組用PBS代替抗原溶液(空白組)，其余成分同免疫組。初次免疫記為免疫第一天。免疫前尾巴靜脈取血25μL，-20℃保存。21日進(jìn)行加強(qiáng)免疫，將25μL抗原溶液與25μL不完全弗氏試劑混合，加入50μL PBS，冰上放置。按100μL/只小鼠的劑量進(jìn)行腹腔注射小鼠。25日小鼠尾部靜脈取血。35日進(jìn)行三免，免疫劑量及方法同二免。每日觀察小鼠，一周換兩次籠子。39日使小鼠脫頸死亡，收集血液，利用間接ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中抗體滴度。三免后rBamA免疫組小鼠血清對(duì)rBamA蛋白及大腸桿菌CVCC1515的抗體滴度分別為1∶736000和1∶152000，空白組血清效價(jià)對(duì)外膜蛋白和菌體都較低，均低于1∶500。該結(jié)果說(shuō)明rBamA蛋白能產(chǎn)生對(duì)本蛋白具有高親和力的抗體，產(chǎn)生的抗體對(duì)大腸桿菌菌株也具有較高的親和力。PBS免疫對(duì)外膜蛋白及大腸桿菌親和力均極低。

加強(qiáng)免疫后2周，每只小鼠腹腔注射10⁹CFU的大腸桿菌 CVCC1515，后續(xù)每日監(jiān)測(cè)小鼠死亡情況，統(tǒng)計(jì)小鼠死亡率，連續(xù)觀察7天。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。rBamA免疫小鼠攻毒12h后存活率維持在80％。PBS免疫組小鼠在攻毒后后0-36h內(nèi)陸續(xù)死亡，在36h后存活率保持在20％。以上結(jié)果說(shuō)明接種外膜蛋白能顯著提高小鼠存活率。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。