本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
林麝肺炎和化膿性疾病主要是由麝致病性大腸埃希菌、麝致病性沙門(mén)菌、化膿隱秘桿菌、綠膿桿菌、蠟狀芽孢桿菌和葡萄球菌等病原微生物以及病毒性病原等造成的多病源、多病因的一類(lèi)疾病。其病理組織學(xué)變化主要變現(xiàn)為：肺臟化膿性肺炎, 肝臟急性肝炎, 心臟急性心肌心包膜炎, 腎臟急性腎小球腎炎。多年林麝疾病的流行情況表明，患有與化膿相關(guān)疾病的林麝在所有病麝中占50％以上；而在因病死亡的林麝中，與化膿有關(guān)的占總數(shù)的50％以上，林麝的肺炎和化膿性疾病一直嚴(yán)重制約著人工養(yǎng)麝的發(fā)展。
在疫苗的制備過(guò)程當(dāng)中為增強(qiáng)疫苗的免疫源性，常在滅活疫苗的研制過(guò)程中加入免疫佐劑。弗氏佐劑是免疫佐劑的一種，因其具有很高的佐劑效能而廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究工作中。弗氏佐劑包括弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA) 和弗氏不完全佐劑(Freun’s incomplated adjuvant，F(xiàn)lA)兩種。FIA由液體石蠟與羊毛脂按一定比例混合而成；向FIA中加入卡介苗(最終濃度為2-20 mg／mL)或死的結(jié)核分枝桿菌便得到FCA。由于FCA含有滅活結(jié)核分支桿菌，對(duì)體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的激活作用，而具有更強(qiáng)的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗的制備方法，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證明，該滅活苗免疫林麝后的應(yīng)激反應(yīng)小，免疫力強(qiáng)，免疫期長(zhǎng)，因此該疫苗具有較大的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施步驟：
1. 林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒滅活原液的制備。
1）取細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)CPE的林麝肺臟及化膿灶，用無(wú)菌手術(shù)剪剪成約1 cm3的小塊，置于研砵中，加液氮進(jìn)行研磨，重復(fù)4次。
2）待研磨的組織漿液解凍為液態(tài)，加入約等體積的1×PBS，混合均勻，然后將混合液裝入50 mL離心管并置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
3）取研磨組織液，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用0.22 μL一次性過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，向?yàn)V液中加入甲醛溶液，使甲醛的終濃度為0.5%，置于37℃恒溫保存滅活24 h。
2. 完全弗氏佐劑溶液的制備：用液體石蠟與無(wú)水羊毛脂按2:1比例混合的混合液，高壓滅菌，加入80℃滅活1 h 的減毒卡介苗制成。
3. 成品疫苗的制備：按體積比1:1加入完全弗氏佐劑，混合均勻制得林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一：
滅活疫苗的制備：取細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)CPE的林麝肺臟及化膿灶，用無(wú)菌手術(shù)剪剪成約1 cm3的小塊，置于研砵中，加液氮進(jìn)行研磨，重復(fù)4次。待研磨的組織漿液解凍為液態(tài)，加入約等體積的1×PBS，混合均勻，然后將混合液裝入50 mL離心管并置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙心ソM織液，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用0.22μL一次性過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，向?yàn)V液中加入甲醛溶液，使甲醛的終濃度為0.5%，置于37℃恒溫保存24 h(每隔2-3 h震蕩一次）。按體積比1:1加入完全弗氏佐劑，混合均勻制得林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗。
實(shí)施例二：
林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗的檢測(cè)
1. 性狀檢測(cè)
對(duì)按上述方法制得的林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗進(jìn)行性狀檢測(cè)，疫苗為乳白色乳濁液，滴一滴到水面上較長(zhǎng)時(shí)間不分散。
2. 甲醛含量測(cè)定
所制疫苗按《中國(guó)獸藥典》附錄中的乙酰丙酮法進(jìn)行甲醛含量測(cè)定，疫苗甲醛含量符合安全標(biāo)準(zhǔn)。
3. 無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)
所制疫苗按《中國(guó)獸藥典》附錄中的方法進(jìn)行檢測(cè)，疫苗均無(wú)細(xì)菌、支原體生長(zhǎng)。
4. 安全檢驗(yàn)
取4周齡雌雄各半的SPF級(jí)BALB/c小鼠20只，隨機(jī)分成A、B兩組，每組10只；其中A組為安全檢驗(yàn)試驗(yàn)組，B組為空白對(duì)照組。正常飼養(yǎng)觀察2 d無(wú)異常后進(jìn)行安全檢驗(yàn)試驗(yàn)。A組每只小鼠分別腹腔注射無(wú)菌檢驗(yàn)后的林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗0.5 mL。B組每只小鼠分別腹腔注射無(wú)菌生理鹽水0.5 mL做對(duì)照，觀察14 d，接種小鼠均無(wú)異常臨床反應(yīng)。
5. 效力檢測(cè)
1）免疫程序和方法：將制得的林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗按照標(biāo)準(zhǔn)免疫程序?qū)ψ绪旰统赡犄曜鲆呙缑庖咴囼?yàn)。其中，仔麝和成年麝各2只為實(shí)驗(yàn)組，肌肉注射疫苗；仔麝和成年麝各1只為對(duì)照組，肌肉注射生理鹽水。期間，首免前采血2 mL并分離血清；二免前采血2 mL并分離血清；三免前采血2 mL并分離血清；三免后7 d、14 d、21 d和30 d分別采血2 mL并分離血清；所有分離的血清均放于4℃冰箱備用。所用免疫程序?yàn)椋菏酌猓? mL/頭仔麝，肌肉注射；2 mL/頭成年麝，肌肉注射；二免，首免后7 d，1 mL/頭仔麝，肌肉注射；2 mL/頭成年麝，肌肉注射；三免，二免后14 d，1mL/頭仔麝，肌肉注射；2 mL/頭成年麝，肌肉注射。
2）對(duì)流免疫電泳檢測(cè)抗體效價(jià)
用1×TBE溶液配制0.8%瓊脂糖，將配好的瓊脂糖溶液加熱融化，微冷倒入放有載玻片的平板內(nèi)，使瓊脂糖液面高于載玻片3 mm左右。待瓊脂糖完全冷卻凝固，用刀沿載玻片的輪廓切割，將載玻片和上面凝膠取出，用3 mm打孔器孔徑，孔間距5 mm。抗原抗體相對(duì)滴加，疫苗（抗原）濃度為10-1，血清（抗體）2倍稀釋?zhuān)靠?5 μL，每個(gè)樣品做一個(gè)重復(fù)。另作抗原空白實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組抗原全換為蒸餾水；抗體空白實(shí)驗(yàn)，加抗體的一孔洞換加蒸餾水。然后，將玻片置于電泳槽內(nèi)進(jìn)行電泳，疫苗（抗原）為負(fù)極，血清（抗體）為正極，用多層濾紙懸搭于玻片兩端，倒入1×TBE溶液，液面淹至電泳槽兩小槽一半以上，且保證濾紙下端浸入液面以下。調(diào)節(jié)電壓40 V，電泳1.5 h。
檢測(cè)結(jié)果顯示，抗原和抗體孔洞之間有沉淀線(xiàn)出現(xiàn)，隨血清濃度的降低，沉淀線(xiàn)的顏色依次變淺，呈梯度變化。 而抗原空白實(shí)驗(yàn)（抗原用蒸餾水代替）抗體空白實(shí)驗(yàn)（抗體用蒸餾水代替）的抗原抗體孔洞間無(wú)沉淀線(xiàn)?？贵w檢測(cè)結(jié)果表明：成年麝和仔麝使用麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗后均能產(chǎn)生較高的抗體效價(jià)，最高可達(dá)到2-4 。
6. 免疫保護(hù)檢驗(yàn)
將60只體重均一，雌雄各半的BALB/c小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組6只，共10組。1-9組為疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)組，10組為空白對(duì)照組，正常飼養(yǎng)觀察2 d。將制備好的林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗按0.5 mL/只的劑量分別于7 d、14 d、21 d對(duì)1-9組小鼠進(jìn)行首免、二免和三免。10組小鼠按0.5 mL/只的劑量以生理鹽水為對(duì)照。三免后7 d進(jìn)行抗原抗體檢測(cè)。三免后14 d開(kāi)始對(duì)1組和10組每只小鼠按LD50劑量進(jìn)行腹腔注射林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒。三免后21 d、28 d……63 d和70 d按相同劑量分別對(duì)2組、3組……8組和9組進(jìn)行病毒原毒攻毒。攻毒后正常飼喂，連續(xù)觀察詳細(xì)記錄各組死亡數(shù)，死亡率及存活率。出現(xiàn)小鼠死亡則立即解剖，觀察組織病變情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所述的林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗對(duì)實(shí)驗(yàn)小白鼠的保護(hù)率為100%；實(shí)驗(yàn)小白鼠注射該疫苗后能夠產(chǎn)生母源抗體，產(chǎn)的仔也能100%存活，保護(hù)率100%；而沒(méi)有用疫苗直接攻毒組的小白鼠產(chǎn)死胎、弱胎。另外，對(duì)家兔進(jìn)行同樣的保護(hù)實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果顯示：本發(fā)明所述的林麝肺炎和化膿性疾病病毒原毒弗氏完全佐劑滅活苗對(duì)家兔的保護(hù)率也為100%。