本發(fā)明涉及一種腫瘤化療藥物制劑組合，尤其涉及一種包括用于對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行增敏的細(xì)胞囊泡和化療藥的腫瘤化療藥物制劑組合。

背景技術(shù)：

目前臨床上應(yīng)用最多的是利用化學(xué)藥物來消滅腫瘤細(xì)胞，然而多數(shù)化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí),對(duì)正常人體細(xì)胞也有較大損傷,產(chǎn)生毒副反應(yīng),從而使化療不能順利進(jìn)行,嚴(yán)重影響了療效，并且多次使用化療藥物可以使腫瘤細(xì)胞特別是其中具有細(xì)胞干性的這部分腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性，進(jìn)而使化療藥物失去其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，尋找到能夠增加腫瘤對(duì)化療藥物敏感性的化療增敏劑,使化療藥物能更大程度的提高療效并減少毒副反應(yīng),降低腫瘤細(xì)胞耐藥性，是治療惡性腫瘤急需解決的問題。

惡性腫瘤患者經(jīng)過多次化療后，往往會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥性。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種藥物具有耐藥性的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)不同，作用靶點(diǎn)不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。多藥耐藥性是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因，也是腫瘤化療急需解決的難題之一。腫瘤MDR的產(chǎn)生機(jī)制并非單一存在，而是多種機(jī)制聯(lián)合作用的結(jié)果：首先，MDR的產(chǎn)生與藥物在細(xì)胞內(nèi)的積蓄減少有關(guān)，而細(xì)胞內(nèi)藥物的外排主要依靠P-gp介導(dǎo)的泵類結(jié)構(gòu)，化療及相關(guān)治療可激活P-gp的功能，致使細(xì)胞內(nèi)藥物積蓄減少，從而產(chǎn)生了腫瘤的MDR。而多藥耐藥相關(guān)基因所合成的MDR轉(zhuǎn)錄蛋白，通過多種機(jī)制，影響藥物在細(xì)胞內(nèi)的分部，降低了藥物與腫瘤細(xì)胞DNA的親和性，使藥物在細(xì)胞內(nèi)外的濃度梯度和pH梯度改變，促進(jìn)了藥物的外排，從而也產(chǎn)生了腫瘤的多藥耐藥。同時(shí)，谷胱甘肽(GSH)的存在除直接滅活了藥物活性外，還可以通過競爭抑制作用保護(hù)腫瘤細(xì)胞的DNA免受抗癌藥物的攻擊，進(jìn)而產(chǎn)生了多藥耐藥。人體內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II的變異也直接影響了藥物與腫瘤細(xì)胞DNA的結(jié)合，產(chǎn)生耐藥。而蛋白激酶C則通過5種不同的機(jī)制調(diào)節(jié)藥物在細(xì)胞內(nèi)外的分布，減少細(xì)胞內(nèi)部的藥物積 蓄，從而產(chǎn)生了耐藥。凋亡基因P53促進(jìn)了MRP的表達(dá)，而產(chǎn)生了腫瘤的多藥耐藥，bcl-2通過抑制各種細(xì)胞因子而避免腫瘤細(xì)胞的壞死。CD95則降低了耐藥細(xì)胞與抗癌藥物的親和性，介導(dǎo)了腫瘤MDR。

如何來抑制腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生已成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)問題。實(shí)驗(yàn)證明，許多化合物或藥物具有體外逆轉(zhuǎn)MDR的作用，但大多由于毒副作用很大，在臨床沒有應(yīng)用價(jià)值。所以作為臨床應(yīng)用的MDR逆轉(zhuǎn)劑的藥物，至今尚未開發(fā)成功。近年來，特異性提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的增敏劑成為人們尋求逆轉(zhuǎn)MDR機(jī)制的新方向。人們期望這類藥物本身對(duì)人體沒有毒副作用，但可以使化療藥物在常規(guī)用量甚至低于常規(guī)用量的情況，對(duì)腫瘤細(xì)胞特別是多藥耐藥性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)效殺傷作用，從而達(dá)到控制腫瘤的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種腫瘤化療藥物制劑組合，以源自凋亡腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞囊泡制劑作為腫瘤細(xì)胞的增敏劑，聯(lián)合使用用于治療所述腫瘤的化療藥制劑，可以使化療藥物更多的進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥特性，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。

本發(fā)明提供的一種腫瘤化療藥物制劑組合，其包括用于對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行增敏的源自凋亡腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞囊泡制劑，和用于治療所述腫瘤的化療藥制劑。

在本申請(qǐng)的方案中，所述細(xì)胞囊泡制劑和化療藥制劑，二者作為整體稱作本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合，該腫瘤化療藥物制劑組合在施用過程中，細(xì)胞囊泡制劑用于對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行增敏，化療藥制劑用于殺傷經(jīng)所述細(xì)胞囊泡制劑增敏后的腫瘤細(xì)胞。

作為本領(lǐng)域的基礎(chǔ)知識(shí)，細(xì)胞是由細(xì)胞膜包裹細(xì)胞內(nèi)容物構(gòu)成，而細(xì)胞膜是由磷脂雙分子層中間鑲嵌蛋白質(zhì)分子所組成，其球狀結(jié)構(gòu)則通過細(xì)胞內(nèi)被稱為細(xì)胞骨架的蛋白纖維絲所形成的向心牽拉力得以維持。當(dāng)細(xì)胞受到外來信號(hào)(例如：化療藥或紫外線等)刺激發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞骨架附著細(xì)胞膜部位的部分蛋白纖維絲斷裂或失去附著，向心牽拉力突然消失，使得局部細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)在外向拉力作用下，向外膨脹、突出并包裹細(xì)胞內(nèi)容物以囊泡形式 釋放到細(xì)胞外的介于細(xì)胞和分子之間的亞層次結(jié)構(gòu)中，其大小基本界于100-1000納米(nm)，即本發(fā)明所述的“細(xì)胞囊泡(microparticles,簡稱Mps或Mp)”。

本發(fā)明的具體方案中，使用紫外線誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)于細(xì)胞囊泡的收集可使用超速離心機(jī)在低溫條件下或室溫條件下進(jìn)行分離?？梢惨圆捎眠^濾方法收集細(xì)胞囊泡。通過離心機(jī)收集細(xì)胞囊泡的條件，例如，在低溫條件下(4℃左右)，以100-100000g的離心力收集細(xì)胞囊泡。進(jìn)一步的，可以在小于14000g的離心力下去除細(xì)胞及碎片，將獲得的上清液在14000g離心1小時(shí)，收集獲得的沉淀即為細(xì)胞囊泡。通過過濾方法收集細(xì)胞囊泡的條件，例如：將凋亡腫瘤細(xì)胞液以1×10⁹/L的濃度過濾，濾膜材質(zhì)為聚丙烯，濾膜孔徑為10微米。將過濾后得到的上清液以14000g的離心力離心1小時(shí)，收集獲得的沉淀即為細(xì)胞囊泡。對(duì)于所收集到的細(xì)胞囊泡，可以按照常規(guī)方法制成細(xì)胞囊泡制劑，尤其是注射制劑，例如，將收集到的細(xì)胞囊泡用生理鹽水懸浮后制成注射液。

本發(fā)明所述誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的判斷標(biāo)準(zhǔn)，例如觀察腫瘤細(xì)胞縮小、變暗，即可認(rèn)為其已經(jīng)凋亡。

在本發(fā)明提供的方案中，在使所述腫瘤細(xì)胞凋亡之前還包括對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。所述腫瘤細(xì)胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌或直腸癌的細(xì)胞。上述細(xì)胞的培養(yǎng)方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述腫瘤化療藥物制劑組合中所包含的化療藥制劑為含有治療提供所述細(xì)胞囊泡的腫瘤的有效成分的化療藥。所包含的化療藥也可以是已經(jīng)在臨床上使用的藥物，可以是注射制劑，或口服制劑，例如片劑、粉劑、顆粒劑等。例如所述化療藥可以是治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌或直腸癌的化療藥中的一種或多種。

本發(fā)明的所述腫瘤化療藥物制劑組合中的細(xì)胞囊泡制劑和化療藥制劑均可以為單位制劑。所述單位制劑為滿足一次給藥所需有效成分的制劑，如一單位(針)針劑等?；颊咭淮问┯盟璧乃幬锏牧靠梢苑奖愕赝ㄟ^計(jì)算患者的體重和該患者一次用藥所需單位體重劑量的乘積得到。例如，在制備藥物 的過程中，一般認(rèn)為成人體重為50-70kg，可以最初可以通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的單位體重劑量之間的等效劑量換算關(guān)系來確定用藥量。例如，可以根據(jù)FDA、SFDA等藥品管理機(jī)構(gòu)提出的指導(dǎo)意見，也可參考(黃繼漢等，“藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算”，《中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)》,2004Sep；9(9):1069-1072)來確定。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可以使用按照人和小鼠的體表面積折算系數(shù)0.0026來換算人和小鼠的劑量。

更進(jìn)一步的，根據(jù)申請(qǐng)人針對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)，針對(duì)人的細(xì)胞囊泡單位制劑中可以包括5×10⁷-10×10⁷個(gè)細(xì)胞囊泡，所述化療藥單位制劑可以包含10-500mg化療藥。

進(jìn)一步的，所述化療藥為鹽酸多柔比星、甲氨蝶呤、順鉑、5-氟尿嘧啶、或羥喜樹堿。

更進(jìn)一步的，所述化療藥單位制劑中含有鹽酸多柔比星的量可以為10-50mg。

進(jìn)一步的，所述化療藥單位制劑中含有順鉑的量可以為20-60mg。

進(jìn)一步的，所述化療藥單位制劑中含有甲氨蝶呤的量可以為10-50mg。

進(jìn)一步的，所述化療藥單位制劑中含有5-氟尿嘧啶的量可以為0.1-0.5g。

進(jìn)一步的，所述化療藥單位制劑中含有羥喜樹堿的量可以為10-30mg。

本發(fā)明提供的腫瘤化療藥物制劑組合的給藥方式為：先對(duì)腫瘤細(xì)胞施用細(xì)胞囊泡單位制劑進(jìn)行增敏，然后對(duì)經(jīng)所述細(xì)胞囊泡增敏后的腫瘤細(xì)胞施用化療藥單位制劑。

本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防腫瘤的方法，包括患有腫瘤的個(gè)體或具有腫瘤發(fā)生趨勢的個(gè)體施用腫瘤化療藥物制劑組合的過程。具體過程為先對(duì)腫瘤細(xì)胞施用源自凋亡的所述腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞囊泡制劑進(jìn)行增敏，然后對(duì)經(jīng)所述細(xì)胞囊泡制劑增敏后的腫瘤細(xì)胞施用化療藥制劑，并且細(xì)胞囊泡與腫瘤細(xì)胞的數(shù)量比例為1：3-5。

根據(jù)本發(fā)明的方案，可以根據(jù)需要控制腫瘤化療藥物制劑組合中的化療藥的量，方便對(duì)不同階段的腫瘤患者的給藥。所述化療藥的量可以根據(jù)所選擇的藥物的性質(zhì)、提供細(xì)胞囊泡的腫瘤種類，以及所要治療的腫瘤患者的患病階段，通過適當(dāng)摸索而確定。

本申請(qǐng)人在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的細(xì)胞囊泡對(duì)腫瘤細(xì)胞沒有殺傷作 用，只有在細(xì)胞囊泡包裹化療藥形成微顆粒之后才具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，以及通過“連鎖反應(yīng)”，即包裹了化療藥的微顆粒殺傷了先進(jìn)入的腫瘤細(xì)胞后，被殺傷而凋亡的腫瘤細(xì)胞繼續(xù)形成新的囊泡而包裹化療藥，對(duì)其他腫瘤細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)給藥直至藥效全部發(fā)揮，來減少化療藥的使用劑量。

然而上述研究關(guān)注的是如何減少化療藥使用量的問題，并沒有就如何解決化療藥施用過程中出現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性研究。而且以上研究中強(qiáng)調(diào)的是同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞施用細(xì)胞囊泡與化療藥，并且細(xì)胞囊泡要包裹化療藥才能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。

而在本申請(qǐng)的方案中，申請(qǐng)人針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的耐藥性的問題，出乎意料的發(fā)現(xiàn)，先將細(xì)胞囊泡以特定劑量施用給腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞囊泡能發(fā)揮類似于增敏劑的作用，再對(duì)腫瘤細(xì)胞施用特定劑量的化療藥，能實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞攝取更多的化療藥物，同時(shí)在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥特性，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。

本發(fā)明方案具有以下效果：

1、本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合，聯(lián)合使用源自凋亡腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞囊泡制劑，以及用于治療所述腫瘤的化療藥物制劑，可以使化療藥物更多的進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥特性，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。

2、通過對(duì)患者施用所述腫瘤化療藥物制劑組合在實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷的同時(shí)降低治療過程對(duì)機(jī)體的毒副作用。

3、腫瘤細(xì)胞具有無限增殖的特性，培養(yǎng)方法成熟，根據(jù)本發(fā)明記載的方案可從腫瘤細(xì)胞獲得大量的細(xì)胞囊泡，進(jìn)而獲得本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合，成本小，操作簡單。

附圖說明

圖1：顯示了電鏡下觀察到的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過凋亡處理后產(chǎn)生的細(xì)胞囊泡的圖。

圖2：本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合對(duì)人乳腺癌細(xì)胞外排多柔比星藥物情況的影響。

圖3：本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合對(duì)MCF-7、MCF-7/TRC和 ADR/MCF-7三種細(xì)胞攝取多柔比星藥物的影響。

圖4A-4B：本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合對(duì)多藥耐藥蛋白P-gp表達(dá)的影響。

圖5：本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用。

圖6：本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合體內(nèi)對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

圖7A-7B：本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合體內(nèi)對(duì)膀胱癌腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中使用的各種腫瘤細(xì)胞、藥物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：

小鼠肝癌細(xì)胞系H22(BALB/c遺傳背景)、小鼠肺癌細(xì)胞系Lewis(C57BL/6遺傳背景)、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT-26、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人乳腺癌阿霉素耐藥株(人乳腺癌鹽酸多柔比星耐藥株)ADR/MCF-7、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780，人肝癌細(xì)胞系HepG2，人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS,人直腸癌細(xì)胞系SW1116，小鼠膀胱癌細(xì)胞系MB49，均可從中國典型物保藏中心CCTCC購買。

C57BL/6小鼠，BALB/c小鼠，購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，周齡在5-6周，體重16克左右。

實(shí)施例1細(xì)胞囊泡的制備

1)實(shí)驗(yàn)材料和試劑

H22小鼠肝癌細(xì)胞為商購獲得，紫外線裝置為常規(guī)生物安全柜所有，透射電鏡為JEM1010(JEOL,日本)，濾膜品牌為PALL(Part No:J100047050)。

2)實(shí)驗(yàn)步驟

在RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)H22小鼠肝癌細(xì)胞，使細(xì)胞量達(dá)到2×10⁷/ml；將H22小鼠肝癌細(xì)胞進(jìn)行紫外線照射60分鐘；

在紫外線照射后的18小時(shí)，顯微鏡下觀察H22小鼠肝癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。通過離心收集上述凋亡腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞囊泡，包括：先以1300rpm和5000rpm轉(zhuǎn)速各離心10分鐘，之后以14000g的離心力離心1分鐘，以除去細(xì)胞及碎片，取離心后的上清再以14000g的離心力離心1小時(shí)，收集獲得 的沉淀得到來自H22小鼠肝癌細(xì)胞凋亡所產(chǎn)生的囊泡?；蛘撸瑢⒌蛲瞿[瘤細(xì)胞液以1×10⁹/L的濃度過濾，濾膜的孔徑為10微米，將過濾后得到的上清液以14000g的離心力離心1小時(shí)，收集獲得的沉淀即為細(xì)胞囊泡。過濾法與離心法相比，能夠獲得更多數(shù)量的囊泡及更高的純度。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將收集到的細(xì)胞囊泡使用1ml的0.9％(g/ml)的生理鹽水進(jìn)行重懸后在透射電鏡JEM1010下觀察，從圖1可以看出，細(xì)胞囊泡的粒徑范圍大多數(shù)是在100-1000nm之間，成囊腔狀。

實(shí)施例2本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合對(duì)人乳腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星藥物的外排情況的影響。

1)實(shí)驗(yàn)材料和試劑

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，鹽酸多柔比星藥物為商購獲得，紫外線裝置為常規(guī)生物安全柜所有，雙光子共聚焦顯微鏡。

2)實(shí)驗(yàn)步驟

在RPMI Medium1640細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，使細(xì)胞量達(dá)到2×10⁷/ml；將人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7進(jìn)行紫外線照射60分鐘；在紫外線照射后的18小時(shí)，顯微鏡下觀察人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；離心或過濾收集上述凋亡腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞囊泡，方法同實(shí)施例1；

將正常培養(yǎng)的1×10⁵個(gè)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7種在共聚焦皿中，再將以上制備的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7來源的細(xì)胞囊泡5×10⁵個(gè)加入到該共聚焦皿中，與MCF-7共孵育12小時(shí)，作為實(shí)驗(yàn)組(即MCF-7細(xì)胞+MPs)；將未添加細(xì)胞囊泡的1×10⁵個(gè)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7作為對(duì)照組(即MCF-7細(xì)胞)。

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞分別用PBS洗一次，再加入含有多柔比星藥物的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有1μg/ml的多柔比星藥物，4小時(shí)后4％多聚甲醛固定20分鐘，雙光子共聚焦顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組人乳腺癌細(xì)胞MCF-7對(duì)多柔比星藥物的外排情況。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2顯示了實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組MCF-7人乳腺癌細(xì)胞對(duì)多柔比星藥物的外排情況的觀察結(jié)果。未與細(xì)胞囊泡共孵育的對(duì)照組MCF-7人乳腺癌細(xì)胞將大量 藥物排出到細(xì)胞膜外，細(xì)胞核內(nèi)藥物含量不高；與細(xì)胞囊泡共孵育過的實(shí)驗(yàn)組MCF-7人乳腺癌細(xì)胞外排的藥物很少，藥物大量聚集在細(xì)胞核內(nèi)。

實(shí)施例3本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合對(duì)MCF-7、MCF-7/TRC和ADR/MCF-7三種細(xì)胞攝取鹽酸多柔比星藥物的影響

1)實(shí)驗(yàn)材料和試劑

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，具有耐藥性的腫瘤再生細(xì)胞MCF-7/TRC(tumour-repopulating cancer cell)，人乳腺癌鹽酸多柔比星耐藥株ADR/MCF-7，培養(yǎng)用的三維纖維蛋白膠，鹽酸多柔比星藥物，溶酶體膜蛋白lamp-2抗體，F(xiàn)ITC熒光二抗，細(xì)胞核染料DAPI為商購獲得，紫外線裝置為常規(guī)生物安全柜所有，雙光子共聚焦顯微鏡。

2)實(shí)驗(yàn)步驟

按照實(shí)施例2方法獲得人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7來源的細(xì)胞囊泡；

將5000個(gè)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞種在三維纖維蛋白膠中，培養(yǎng)5天形成干細(xì)胞樣克隆團(tuán)，這些細(xì)胞被稱為腫瘤再生細(xì)胞，即MCF-7/TRC。MCF-7/TRC具有腫瘤干細(xì)胞特性，對(duì)多種療藥物(如順鉑，甲氨蝶呤，5-FU，鹽酸多柔比星等)有耐藥性。

將1×10⁵個(gè)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，腫瘤再生細(xì)胞MCF-7/TRC，人乳腺癌鹽酸多柔比星耐藥細(xì)胞ADR/MCF-7分別種在共聚焦皿中，將制備的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7來源的細(xì)胞囊泡分別加入到含有上述三種細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，數(shù)量為5×10⁵個(gè)/皿，孵育12小時(shí)，作為實(shí)驗(yàn)組；

將未添加細(xì)胞囊泡的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，腫瘤再生細(xì)胞MCF-7/TRC，人乳腺癌鹽酸多柔比星耐藥株ADR/MCF-7作為對(duì)照組。

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的MCF-7、MCF-7/TRC和ADR/MCF-7細(xì)胞分別PBS洗一次，再加入鹽酸多柔比星藥物的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有1μg/ml鹽酸多柔比星藥物，4小時(shí)后4％多聚甲醛固定30分鐘，免疫熒光染色lamp-2和DAPI，雙光子共聚焦顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組MCF-7，MCF-TRC和ADR/MCF-7細(xì)胞(即MCF-7，MCF-7TRCs，ADR/MCF-7)及對(duì)照組MCF-7，MCF-TRC和ADR/MCF-7細(xì)胞(即MCF-7+MPs，TRC+MPs，ADR/MCF-7+MPs)對(duì)多柔比星藥物的攝取情況。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3顯示了實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組MCF-7、MCF-7/TRC和ADR/MCF-7對(duì)多柔比星藥物的攝取情況。圖3中LAMP-2指的是用溶酶體相關(guān)膜蛋白2抗體標(biāo)記后的細(xì)胞照片，Doxo指的施用鹽酸多柔比星后的細(xì)胞照片，DAPI指的是用DNA染色的細(xì)胞核染色試劑染色后的細(xì)胞照片，共聚焦(confocal)指的是將以上三個(gè)圖重疊之后的圖片?？梢钥闯?，鏡下觀察對(duì)照組MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)藥物含量不高；而與細(xì)胞囊泡共孵育過的實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞核內(nèi)多柔比星含量明顯增加。鏡下觀察對(duì)照組MCF-7/TRC和ADR/MCF-7細(xì)胞核內(nèi)藥物含量比MCF-7核內(nèi)更少，而與細(xì)胞囊泡共孵育過的實(shí)驗(yàn)組MCF-7/TRC和ADR/MCF-7細(xì)胞核內(nèi)藥物含量明顯增加。此結(jié)果說明經(jīng)細(xì)胞囊泡處理可以提高耐藥性的腫瘤再生細(xì)胞MCF-7/TRC和鹽酸多柔比星耐藥株ADR/MCF-7對(duì)藥物的攝取。

實(shí)施例4本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合對(duì)多藥耐藥蛋白P-gp表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)材料和試劑

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，人乳腺癌鹽酸多柔比星耐藥株ADR/MCF-7，人P-gp抗體均可商購獲得，P-gprealtime PCR引物通過上海生工公司合成。

1)實(shí)驗(yàn)步驟

按照實(shí)施例2方法獲得人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7來源的細(xì)胞囊泡；

將1×10⁷個(gè)腫瘤細(xì)胞來源的細(xì)胞囊泡加入到含有2×10⁶個(gè)ADR/MCF-7培養(yǎng)皿中，孵育12小時(shí)，作為實(shí)驗(yàn)組；將未添加細(xì)胞囊泡的MCF-7和ADR/MCF-7細(xì)胞作為對(duì)照組。

收集對(duì)照組ADR/MCF-7細(xì)胞(即ADR/MCF-7細(xì)胞)、實(shí)驗(yàn)組ADR/MCF-7細(xì)胞(即ADR/MCF-7細(xì)胞+Mps)、以及對(duì)照組的MCF-7細(xì)胞(即MCF-7細(xì)胞)。

將三組細(xì)胞分別提取RNA后再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，realtime PCR方法檢測三組細(xì)胞P-gp的表達(dá)情況。

引物序列為：F：CCATCATTGCAATAGCAGGA

R：TTCAGTAGCGATCTTCCCAG

PCR條件為：95℃3分鐘預(yù)變性，然后按95℃15秒，60℃30秒，共40個(gè)循環(huán)。

定量方法：Sybr green(熒光染料摻入法)，結(jié)果見圖4A。

另將同樣處理的三組細(xì)胞制備western blot蛋白樣品，western blot方法檢測三組細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見圖4B。

2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖4A-4B可以看出，無論是基因水平還是蛋白水平，經(jīng)細(xì)胞囊泡處理的實(shí)驗(yàn)組ADR/MCF-7細(xì)胞的多藥耐藥蛋白P-gp的表達(dá)水平均低于對(duì)照組ADR/MCF-7細(xì)胞。對(duì)照組的MCF-7細(xì)胞本身低表達(dá)P-gp。

實(shí)施例5本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

1)實(shí)驗(yàn)材料和試劑

小鼠肝癌細(xì)胞系H22(BALB/c遺傳背景)、小鼠肺癌細(xì)胞系Lewis(C57BL/6遺傳背景)、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT-26、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、人肝癌細(xì)胞系HepG2、人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和人直腸癌細(xì)胞系SW1116；化療藥物為順鉑(Cisplatin，CDDP)、甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)、鹽酸多柔比星(Doxorubicin，Dox)均可商購獲得。

2)實(shí)驗(yàn)步驟

在RPMI Medium1640細(xì)胞培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)上述各種腫瘤細(xì)胞；將各種腫瘤細(xì)胞分別種在24孔板中，5×10⁴個(gè)/孔。按照實(shí)施例1所述方法制備各腫瘤細(xì)胞來源的細(xì)胞囊泡，將獲得的細(xì)胞囊泡加入到與提供所述細(xì)胞囊泡的腫瘤細(xì)胞相同種類的腫瘤細(xì)胞中，囊泡與腫瘤細(xì)胞的比例為1：5，孵育12小時(shí)，作為實(shí)驗(yàn)組；將未添加細(xì)胞囊泡的5×10⁴個(gè)/孔的各種腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照組；

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞分別PBS洗一次，再分別加入含有各種不同濃度化療藥物的培養(yǎng)基:1μg/ml的CDDP、0.5μg/ml的MTX、5μg/ml的5-Fu、1μg/ml的Dox培養(yǎng)基。

24小時(shí)或36小時(shí)后通過染色AnnexinV和PI檢測各組腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5顯示了本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(H22、Lewis、CT-26、MCF-7、A549、A2780、HepG2、AGS、SW1116)殺傷作用。與化療藥物直接殺傷腫瘤細(xì)胞的對(duì)照組相比，經(jīng)細(xì)胞囊泡處理的實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞凋亡率更高，說明本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，從而殺傷更多的腫瘤細(xì)胞。

實(shí)施例6本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合體內(nèi)對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

1)實(shí)驗(yàn)材料和試劑

C57BL/6小鼠，雌性，5-6周齡；小鼠肺癌細(xì)胞系Lewis(C57BL/6遺傳背景)；甲氨蝶呤(MTX)均可商購獲得。

2)實(shí)驗(yàn)步驟：

在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)上述小鼠肺癌細(xì)胞系Lewis，將Lewis細(xì)胞用PBS稀釋成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并稀釋1×10⁶個(gè)/300ul，對(duì)30只C57小鼠尾靜脈注射300ul細(xì)胞懸液，48h后進(jìn)行分組給藥；

將這些肺部成瘤的小鼠隨機(jī)分成三組，空白組即對(duì)照組，藥物組和囊泡組：

對(duì)照組每48h注射生理鹽水，共10次；

藥物組(即MTX)每48h注射10ug甲氨蝶呤，共5次；

囊泡組(即MPs+MTX)24h時(shí)注射2×10⁶個(gè)細(xì)胞囊泡，48h時(shí)注射10ug甲氨蝶呤，共10次,其中，所述細(xì)胞囊泡按照實(shí)施例1所述方法制備和收集，收集后細(xì)胞囊泡沉淀用0.9％(g/ml)生理鹽水懸浮后制成注射液。

給藥結(jié)束后第三天殺小鼠，取肺觀察。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6顯示了利用小鼠肺癌細(xì)胞Lewis構(gòu)建肺部成瘤，經(jīng)MTX和MPs+MTX兩種不同方式治療后肺部成瘤情況。先用MPs處理24小時(shí)后再注射MTX明顯好于單獨(dú)用MTX的治療效果。

實(shí)施例7本發(fā)明的腫瘤化療藥物制劑組合體內(nèi)對(duì)膀胱癌腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

1)實(shí)驗(yàn)材料和試劑

小鼠膀胱癌細(xì)胞系MB49，多聚賴氨酸，鹽酸多柔比星(Dox)，羥喜樹堿(HCPT)，6～8周齡雌性C57小鼠均可商購獲得。

實(shí)驗(yàn)步驟：

小鼠原位膀胱癌模型建立：

小鼠膀胱癌細(xì)胞采用10％FBS 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)培養(yǎng)期，采用胰酶消化后用PBS重懸成10⁷個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。將C57小鼠麻醉后采用靜脈留置針往小鼠膀胱內(nèi)灌注入100uL 0.1mg/mL多聚賴氨酸溶液預(yù)處理20min，之后將多聚賴氨酸溶液排出后，往膀胱內(nèi)灌注入100uL細(xì)胞懸液，并且保持1h后排出。

包裹有化療藥的細(xì)胞囊泡的制備：對(duì)1ml的1×10⁷小鼠膀胱癌細(xì)胞施用100uL化療藥(Dox或HCPT)(1mg/mL)；在施用化療藥后的48小時(shí)，先以1300rpm和5000rpm轉(zhuǎn)速各離心10分鐘，之后以14000g的離心力離心1分鐘，以除去細(xì)胞及碎片，取離心后的上清再以14000g的離心力離心1小時(shí)，收集獲得的沉淀得到包裹有化療藥的細(xì)胞囊泡。收集后細(xì)胞囊泡沉淀用0.9％(g/ml)生理鹽水懸浮后制成注射液。

細(xì)胞囊泡的制備：按照實(shí)施例1所述方法制備和收集，收集后細(xì)胞囊泡沉淀用0.9％(g/ml)生理鹽水懸浮后制成注射液。

藥物試驗(yàn)1：

小鼠分組，每組8只。對(duì)照組(Ctr)：是指接種膀胱癌細(xì)胞但未進(jìn)行治療的小鼠；Dox組：只施用鹽酸多柔比星藥物的組；Dox-Mps組：為包裹了鹽酸多柔比星藥物的MPs；Mps+Dox組：先用MPs處理再用鹽酸多柔比星處理；正常組：指的是正常小鼠組。

在第0天，將除了正常組以外的其他組的小鼠接種腫瘤細(xì)胞并按照上述方法構(gòu)建小鼠原位膀胱癌模型。

第2天Mps+Dox組每只膀胱癌小鼠膀胱灌注10⁶個(gè)細(xì)胞囊泡，并保持一 個(gè)小時(shí)后排出。Dox組小鼠在第2天不灌注細(xì)胞囊泡。Dox-Mps組在第2天膀胱灌注10⁶個(gè)包裹有化療藥的細(xì)胞囊泡。

在第3天對(duì)Dox組和Mps+Dox組膀胱灌注100uL鹽酸多柔比星溶液(1mg/mL)，并保持一小時(shí)后排出。Dox-Mps組不做處理。

第4和5天重復(fù)第2,3天步驟。

在第12天，將小鼠處死，并收取膀胱結(jié)果分析。

對(duì)照組整個(gè)過程只給生理鹽水。

藥物試驗(yàn)2：分組和實(shí)驗(yàn)過程同藥物試驗(yàn)1，除了將藥物換成100uL羥喜樹堿(HCPT)(1mg/mL)。

2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖7A和7B可以看出，對(duì)小鼠施用包裹有化療藥物的MPs治療效果和只施用Dox或HCPT無明顯差異，但兩者都不如經(jīng)細(xì)胞囊泡處理后再施用Dox或HCPT的治療效果，因?yàn)榘谢熕幍募?xì)胞囊泡的治療效果受限于包裹進(jìn)細(xì)胞囊泡的化療藥濃度，對(duì)于需要高濃度才具有殺傷效果的藥物來說，如果要提高殺傷效果，必須通過增加細(xì)胞囊泡數(shù)量來達(dá)到目的，這樣治療的成本會(huì)大幅度增高，過高的細(xì)胞囊泡數(shù)量也會(huì)增加對(duì)人體的副作用，出于降低治療成本、降低細(xì)胞囊泡對(duì)人體的副作用的目的，在給小鼠施用等數(shù)量細(xì)胞囊泡的情況下，本發(fā)明的先通過細(xì)胞囊泡致敏再給化療藥的方案能獲得更好的效果。