本發(fā)明涉及一種外用制劑，具體涉及一種預(yù)防或治療乳腺癌的外用制劑，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

雞血藤為豆科植物密花豆屬密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤莖，是補(bǔ)血活血的傳統(tǒng)中藥。近年來臨床上常用雞血藤治療貧血，各種原因(如放療、化療)引起的白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞等全血象減少和再生障礙性貧血等疾病，且療效較好?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，雞血藤還具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、對酪氨酸酶雙向調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜催眠等作用。

關(guān)于雞血藤抗腫瘤作用，現(xiàn)有技術(shù)已公開其對肺癌、大腸癌、白血病、宮頸癌、胃癌等具有治療作用。但關(guān)于雞血藤治療乳腺癌的研究報道很少，未見關(guān)于其外用治療乳腺癌的報道。

異甘草素是一種異黃酮類化合物，是雞血藤的主要活性成分?，F(xiàn)有技術(shù)研究表明異甘草素具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、對心血管和氣管的作用等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于提供一種預(yù)防或治療乳腺癌的外用制劑。

本發(fā)明的另一個目的在于提供該制劑在制備外用預(yù)防或治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個目的在于提供雞血藤提取物和/或異甘草素口服制劑在制備預(yù)防或治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種預(yù)防或治療乳腺癌的外用制劑，該外用制劑包括活性成分及外用制劑輔料，其特征在于，所述活性成分為雞血藤提取物和/或異甘草素。

進(jìn)一步，所述雞血藤提取物為雞血藤水提物、乙醇提取物或雞血藤水提物、乙醇提取物用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次先后萃取或擇一萃取得到的萃取物或萃取物經(jīng)大孔樹脂柱純化得到的有效部位。

更進(jìn)一步，所述雞血藤水提取物優(yōu)選60-120℃水提取1-8次得到的提取物；更優(yōu)選提取2-5次；

所述雞血藤乙醇提取物優(yōu)選10-95％乙醇溶液提取得到的提取物，更優(yōu)選20-80％乙醇提取得到的提取物，更優(yōu)選30-70％乙醇提取得到的提取物，更優(yōu)選40-70％乙醇提取得到的提取物；提取方式可以選擇采用滲漉、回流、浸漬或超聲提??；優(yōu)選提取1-8次；更優(yōu)選提取2-5次。

更進(jìn)一步，所述大孔樹脂柱純化過程為：先用水洗脫，然后在10-95％濃度范圍內(nèi)依次用濃度逐漸增大的乙醇溶液洗脫，收集60-90％乙醇溶液洗脫物得到雞血藤有效部位；更進(jìn)一步，所述大孔樹脂為弱極性的。

進(jìn)一步，雞血藤提取物與異甘草素的比例為1～5:1。更進(jìn)一步，雞血藤提取物與異甘草素的比例為2～4:1；更進(jìn)一步，雞血藤提取物與異甘草素的比例為3:1。

本發(fā)明所述異甘草素可以從市場購買，也可以從雞血藤中提取得到，還可以從其他植物中分離純化得到，也可以通過化學(xué)合成或生物合成方法得到，其結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明所述外用制劑包括氣霧劑、霧化劑、搽劑、酊劑、乳化劑、懸浮液、 納米乳化劑、納米懸浮液、脂質(zhì)體、乳膏劑、軟膏劑、糊劑、凝膠劑、貼劑、巴布劑，沐浴液(露)等。本發(fā)明所述常規(guī)外用輔料包括表面活性劑、乳化劑、保濕劑、防腐劑、抗氧劑、增稠劑、增溶劑、拋射劑、透皮促進(jìn)劑、矯味劑等。其中，表面活性劑包括硬脂酸、十二烷基苯磺酸鈉、季銨化物、卵磷脂、氨基酸性、甜菜堿、脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯等；保濕劑包括丙三醇、丁二醇、聚乙二醇、丙二醇、木糖醇、聚丙二醇、山梨糖醇等；增稠劑包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚丙烯酸酯、明膠、海藻酸鈉等；矯味劑包括卵磷脂、甘油、山梨醇、甘露醇、薄荷油、香精等。

附圖說明

圖1：空白制劑組和ISL實驗組乳腺腫瘤的生長速率情況比較

圖2：空白制劑組和ISL實驗組腫瘤體積和肺轉(zhuǎn)移情況比較

A行為乳腺腫瘤組織和肺組織；B行和C行為病理報告

圖3：空白制劑組和ISL實驗組平均轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)情況比較

圖4：空白制劑組和ISL實驗組小鼠存活率比較

具體實施方式

實施例1雞血藤提取物的制備

取雞血藤藥材250g，用70％乙醇浸泡40min，加入10倍量70％乙醇超聲提取兩次，每次40min，合并超聲提取液。減壓回收乙醇，將濃縮液置于已經(jīng)稱重的容器中，再置于減壓冷凍干燥裝置中減壓干燥48h后取出，收集粉末，置于干燥器中備用。

實施例2雞血藤提取物的制備

雞血藤藥材100g，用10倍水(W/V)煎煮提取2次，每次1小時，合并兩次提取液，減壓濃縮至干，收集粉末，置于干燥器中備用。

實施例3雞血藤提取物的制備

雞血藤藥材1000g，用10倍量(W/V)的60％乙醇超聲提取2次，每次1 小時，合并兩次提取液，減壓濃縮至無醇味后，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。

實施例4雞血藤提取物乳膏劑的制備

原料：雞血藤提取物1500mg(按實施例1-3任一方法制備)；

輔料：硬脂酸24g、單甘油酯7g、白凡士林2.0g、羊毛脂10g、液體石蠟12ml、三乙醇胺100ml、蒸餾水120ml、樟腦約1.5g(50℃下)；

取上述原輔料，按常規(guī)制劑工藝制成乳膏劑。

實施例5雞血藤提取物噴霧劑的制備

原料：雞血藤提取物1500mg(按實施例1-3任一方法制備)；

輔料：樟腦3g、薄荷腦1g及冰片2g；

制備方法：分別取樟腦、薄荷腦及冰片，用適量70％的乙醇溶解，加入冷凍干燥得到的雞血藤提取物粉末，加50％乙醇至總量為100ml，混勻，靜置，濾過，灌裝，封口，充入拋射劑適量，即得。

實施例6雞血藤提取物沐浴液的制備

原料：雞血藤提取物(按實施例1-3任一方法制備)；

制備方法：將EDTA-2Na溶解于去離子水中，加熱至80℃，加入十二烷基醚硫酸銨(AESA)、月桂基硫酸銨(K12A)，攪拌溶解，在75℃時加入珠光粉、雞血藤提取物粉末，攪拌冷卻至60℃，加入絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、6501、甜菜堿(CAB-35)，攪拌冷卻至50℃以下，加入香精、色素、防腐劑，再繼續(xù)攪拌冷卻至40℃，出料，即為沐浴液。

實施例7異甘草素乳膏劑的制備

原料：異甘草素500mg；

輔料：硬脂酸24g、單甘油酯7g、白凡士林2.0g、羊毛脂10g、液體石蠟12ml、三乙醇胺100ml、蒸餾水120ml、樟腦約1.5g(50℃下)；

取上述原輔料，按常規(guī)制劑工藝制成乳膏劑。

實施例8雞血藤提取物和異甘草素乳膏劑的制備

原料：雞血藤提取物1500mg(按實施例1-3任一方法制備)；異甘草素500mg；

輔料：硬脂酸24g、單甘油酯7g、白凡士林2.0g、羊毛脂10g、液體石蠟12ml、三乙醇胺100ml、蒸餾水120ml、樟腦約1.5g(50℃下)；

取上述原輔料，按常規(guī)制劑工藝制成乳膏劑。

實施例9雞血藤提取物(SS)及異甘草素(ISL)乳膏劑抑制乳腺癌實驗結(jié)果

1試驗藥物

空白制劑：按實施例8不加入SS和ISL制備的空白制劑。

實驗制劑：按實施例8制備的乳膏劑。

2給藥劑量換算

通過預(yù)實驗，小鼠每次涂抹量為0.5ml，約為46.6mg(三次取平均值所得，47.0mg，46.3mg，46.6mg)，一天涂抹三次，則每天的給藥量為139.8mg。

以小鼠重20g為計算單位，則小鼠的每天給藥量為SS為1.366mg，ISL為0.455mg；即為SS 68.3mg/kg/day，ISL 22.76mg/kg/day。

3外用給藥抗乳腺癌實驗

3.1小鼠前處理

實驗采用乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠。取大約三周半的陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠，麻醉后用剃毛器于小鼠上肢腋下靠內(nèi)及胸部進(jìn)行剃毛，再用脫毛膏使得試藥部位平整無毛。

3.2小鼠分組

將小鼠均分為3組，分別為：

實驗組①：陰性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠對照組；

實驗組②：陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠無藥物干預(yù)對照組(給予空白制劑)；

實驗組③：陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠給藥干預(yù)組(給予實驗制劑)。

3.3給藥

將乳膏劑及空白制劑均勻涂抹于剃毛部位，連續(xù)給藥30天，每天3次，每次0.46克外涂，每隔二天記錄每只老鼠腫瘤的生長情況，大小和小鼠狀態(tài)。于第四周周末短頸處死，剝離癌腫塊，記錄重量和特征，腫瘤出現(xiàn)時間，生長速度，數(shù)量，并于終點對腫瘤的大小多少及的總體重量進(jìn)行比較。觀察肺組織 是否出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，如果肺部出現(xiàn)腫塊，則表明已發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。

4實驗結(jié)果

結(jié)果如下表1。

表1藥物(SS+ISL)乳膏劑對抑制乳癌生長的實驗研究

上表中N/A表示“未獲得”；±/+表示“可疑轉(zhuǎn)移/可見明顯轉(zhuǎn)移”

上述實驗結(jié)果表明，實驗制劑具有抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用，與空白制劑對照組相比具有顯著性差異?？瞻字苿φ战M出現(xiàn)明顯肺轉(zhuǎn)移，而實驗制劑組未見明顯轉(zhuǎn)移。

實施例10雞血藤提取物(SS)乳膏劑抑制乳腺癌實驗結(jié)果

1試驗藥物

空白制劑：按實施例4不加入SS制備的空白制劑。

實驗制劑：按實施例4制備的乳膏劑，雞血藤提取物按實施例1方法制備。

2給藥劑量換算

通過預(yù)實驗，小鼠每次涂抹量為0.5ml，約為46.6mg(三次取平均值所得，47.0mg，46.3mg，46.6mg)，一天涂抹三次，則每天的給藥量為139.8mg。

以小鼠重20g為計算單位，則小鼠的每天給藥量為SS為1.366mg，即為SS 68.3mg/kg/day。

3外用給藥抗乳腺癌實驗

3.1小鼠前處理

實驗采用乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠。取大約三周半的陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠，麻醉后用剃毛器于小鼠上肢腋下靠內(nèi)及胸部進(jìn)行剃毛，再用脫 毛膏使得試藥部位平整無毛。

3.2小鼠分組

將小鼠均分為3組，分別為：

實驗組①：陰性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠對照組；

實驗組②：陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠無藥物干預(yù)對照組(給予空白制劑)；

實驗組③：陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠給藥干預(yù)組(給予實驗制劑)。

3.3給藥

將乳膏劑及空白制劑均勻涂抹于剃毛部位，連續(xù)給藥30天，每天3次，每次0.46克外涂，每隔二天記錄每只老鼠腫瘤的生長情況，大小和小鼠狀態(tài)。于第四周周末短頸處死，剝離癌腫塊，記錄重量和特征，腫瘤出現(xiàn)時間，生長速度，數(shù)量，并于終點對腫瘤的大小多少及的總體重量進(jìn)行比較。觀察肺組織是否出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，如果肺部出現(xiàn)腫塊，則表明已發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。

4實驗結(jié)果

結(jié)果如下表2。

表2藥物(SS)乳膏劑對抑制乳癌生長的實驗研究

上表中N/A表示“未獲得”；±/+表示“可疑轉(zhuǎn)移/可見明顯轉(zhuǎn)移”

上述實驗結(jié)果表明，實驗制劑具有抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用，與空白制劑對照組相比具有顯著性差異。

實驗例11異甘草素(ISL)乳膏劑抑制乳腺癌實驗結(jié)果

1試驗藥物

空白制劑：按實施例7不加入ISL制備的空白制劑。

實驗制劑：按實施例7制備的乳膏劑。

2給藥劑量換算

通過預(yù)實驗，小鼠每次涂抹量為0.5ml，約為46.6mg(三次取平均值所得，47.0mg，46.3mg，46.6mg)，一天涂抹三次，則每天的給藥量為139.8mg。

以小鼠重20g為計算單位，則小鼠的每天給藥量為ISL為0.455mg；即為ISL 22.76mg/kg/day。

3外用給藥抗乳腺癌實驗

3.1小鼠前處理

實驗采用乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠。取大約三周半的陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠，麻醉后用剃毛器于小鼠上肢腋下靠內(nèi)及胸部進(jìn)行剃毛，再用脫毛膏使得試藥部位平整無毛。

3.2小鼠分組

將小鼠均分為3組，分別為：

實驗組①：陰性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠對照組；

實驗組②：陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠無藥物干預(yù)對照組(給予空白制劑)；

實驗組③：陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠給藥干預(yù)組(給予實驗制劑)。

3.3給藥

將乳膏劑及空白制劑均勻涂抹于剃毛部位，連續(xù)給藥30天，每天3次，每次0.46克外涂，每隔二天記錄每只老鼠腫瘤的生長情況，大小和小鼠狀態(tài)。于第四周周末短頸處死，剝離癌腫塊，記錄重量和特征，腫瘤出現(xiàn)時間，生長速度，數(shù)量，并于終點對腫瘤的大小多少及的總體重量進(jìn)行比較。觀察肺組織是否出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，如果肺部出現(xiàn)腫塊，則表明已發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。

4實驗結(jié)果

結(jié)果如下表3。

表3藥物(ISL)乳膏劑對抑制乳癌生長的實驗研究

上表中N/A表示“未獲得”；±/+表示“可疑轉(zhuǎn)移/可見明顯轉(zhuǎn)移”

上述實驗結(jié)果表明，實驗制劑具有抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用，與空白制劑對照組相比具有顯著性差異。

實驗例12雞血藤提取物(SS)噴霧劑抑制乳腺癌實驗結(jié)果

1試驗藥物

空白制劑：按實施例5不加入SS制備的空白制劑。

實驗制劑：按實施例5制備的噴霧劑。

2用法與用量

外用；噴涂乳房局部，按摩5min至發(fā)熱，每次噴射量為1ml(噴5次，每次0.2ml)，一日3次，相當(dāng)于生藥量9g/day。

3外用給藥抑制乳腺癌實驗

3.1小鼠前處理

實驗采用乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠。取大約三周半的陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠，麻醉后用剃毛器于小鼠上肢腋下靠內(nèi)及胸部進(jìn)行剃毛，再用脫毛膏使得試藥部位平整無毛。

3.2小鼠分組

將小鼠均分為3組，分別為：

實驗組①：陰性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠對照組；

實驗組②：陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠無藥物干預(yù)對照組(給予空白制劑)；

實驗組③：陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠給藥干預(yù)組(給予實驗制劑)。

3.3給藥

取氣霧劑噴射于剃毛部位，連續(xù)噴霧給藥30天。每隔二天記錄每只老鼠腫瘤的生長情況，大小和小鼠狀態(tài)。于第四周周末短頸處死，剝離癌腫塊，記錄重量和特征，30天后處死老鼠記錄每只老鼠的總量，剝離癌腫塊并記錄重量和特征，觀察肺組織是否出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。

4實驗結(jié)果

結(jié)果見表4。

表4藥物(SS)噴霧劑對抑制乳癌生長的實驗研究

上表中N/A表示“未獲得”；±/+表示“可疑轉(zhuǎn)移/可見明顯轉(zhuǎn)移”

上述實驗結(jié)果表明，實驗制劑具有抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用，與空白制劑對照組相比具有顯著性差異。

實驗例13雞血藤提取物(SS)沐浴液抑制乳腺癌實驗結(jié)果

1試驗藥物

空白制劑：按實施例6不加入SS制備的空白制劑。

實驗制劑：按實施例6制備的沐浴液，雞血藤提取物按實施例1方法制備。

2用法

外用；沐浴時與適量水打濕，起泡后涂抹在身體上，重點在乳房周邊涂抹。

3外用給藥抗乳腺癌實驗

3.1小鼠前處理

實驗采用乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠。取大約三周半的陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠，麻醉后用剃毛器于小鼠上肢腋下靠內(nèi)及胸部進(jìn)行剃毛，再用脫毛膏使得試藥部位平整無毛。

3.2小鼠分組

將小鼠均分為3組，分別為：

實驗組①：陰性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠對照組；

實驗組②：陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠無藥物干預(yù)對照組(給予空白制劑)；

實驗組③：陽性表達(dá)雌性轉(zhuǎn)基因小鼠給藥干預(yù)組(給予實驗制劑)。

3.3給藥

取將相對應(yīng)的沐浴液用適量水打濕，藥物均勻涂抹于剃毛部位，連續(xù)給藥 30天，每次涂抹均勻即可。每隔二天記錄每只老鼠腫瘤的生長情況，大小和小鼠狀態(tài)。于第四周周末短頸處死，剝離癌腫塊，記錄重量和特征；并于終點記錄每只老鼠的總量，剝離癌腫塊并記錄重量和特征，剝離肺組織并觀察是否出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。

4實驗結(jié)果

結(jié)果見表5。

表5藥物(SS)沐浴液對抑制乳癌生長的實驗研究

上表中N/A表示“未獲得”；±/+表示“可疑轉(zhuǎn)移/可見明顯轉(zhuǎn)移”

上述實驗結(jié)果表明，實驗制劑具有抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用，與空白制劑對照組相比具有顯著性差異。

實施例9-13實驗結(jié)果表明，本發(fā)明制劑外用對乳腺癌具有顯著的治療效果。

實驗例14異甘草素(ISL)抑制乳腺癌的生長與轉(zhuǎn)移的實驗結(jié)果

1、試驗藥物：異甘草素(98％)

2、分組、用法(內(nèi)服給藥)

空白制劑：陽性表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，灌胃生理鹽水每日0.5ml。

陰性對照組：陰性表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，灌胃生理鹽水每日0.5ml。

實驗組：陽性表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，灌胃ISL每日0.5ml，濃度為50 mg/kg/d，從斷奶后(3周大)開始給藥連續(xù)12周。

3、結(jié)果

連續(xù)觀察，于12周時觀察腫瘤的生長情況并取腫瘤組織測定其大小體積及重量，并對肺組織轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行比較。

實驗結(jié)果見表6，圖1-4。

表6 ISL口服對乳癌生長與轉(zhuǎn)移的抑制作用(mean±SD,n＝10)

與空白制劑組比較**P<0.005

由圖1可見，ISL組的腫瘤生長速率顯著低于空白制劑組。圖2顯示ISL組的腫瘤體積顯著小于空白制劑組，且ISL組的肺轉(zhuǎn)移情況較空白制劑組明顯減輕。圖3結(jié)果顯示ISL組的肺轉(zhuǎn)移情況較空白制劑組明顯減輕。圖4結(jié)果顯示ISL組小鼠12周內(nèi)存活率為100％，顯著高于空白制劑組。

表6結(jié)果表明ISL實驗組在12周與空白制劑組比較腫瘤質(zhì)量及體積有顯著性的差異(P<0.005)。

綜上所述，ISL口服具有顯著抑制乳腺腫瘤生長及其肺轉(zhuǎn)移的效果。