本發(fā)明屬于生物化學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及通過抑制體內(nèi)脂酰輔酶A氧化酶活性，促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化和線粒體再生，提高線粒體代謝機(jī)能的方法。本發(fā)明還涉及脂酰輔酶A氧化酶抑制劑或脂酰輔酶A氧化酶抑制劑前體在制備用于治療線粒體代謝機(jī)能障礙相關(guān)疾病如糖尿病的藥物中的用途。

背景技術(shù)：
線粒體(mitochondria)是一種半自主性的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，自身有獨立的遺傳系統(tǒng)。線粒體是脂肪酸、糖類和氨基酸氧化的最終場所，通過氧化磷酸化過程中釋放的自由能，將二磷酸腺苷(ADP)和磷酸轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷(ATP)，為細(xì)胞生命活動提供直接能量，是細(xì)胞獲得能量的主要途徑。此外，線粒體是細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)產(chǎn)生的主要源頭，以及調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要樞紐之一。線粒體是細(xì)胞內(nèi)最容易受損傷的細(xì)胞器之一，當(dāng)線粒體數(shù)量減少，線粒體DNA發(fā)生突變或缺失，或呼吸鏈?zhǔn)艿揭种埔鹁€粒體氧化磷酸化異常，以及脂肪酸代謝酶活性降低等原因都能引起線粒體ATP合成減少，導(dǎo)致線粒體代謝能力下降，ROS產(chǎn)生顯著增加，引起線粒體功能障礙(mitochondrialdysfunction)。線粒體功能障礙影響整個細(xì)胞正常的生理功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生(NunnarJandSuomalainenA.，Cell，2012，148，1145-1159)。線粒體代謝功能障礙是引起胰島素抵抗的直接原因。線粒體脂肪酸氧化活性下降將導(dǎo)致肝臟和肌肉等胰島素靶組織內(nèi)甘油三酯(triacylglycerol，TG)、甘油二酯(diacylglycerol，DG)等脂質(zhì)大量積累，其中DG作為信號分子，激活PKCθ/ε等激酶，進(jìn)而磷酸化胰島素受體底物-1(IRS-1)并使其失活，并降低PI3激酶(PI3K)和AKT酶活性，導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)向膜上轉(zhuǎn)位減少，細(xì)胞對葡萄糖攝入顯著下降，形成胰島素抵抗(LowellBB.andShulmanGI.，Science，2005，307，384-387；ErionDM.andShulmanGI.，Nat.Med.，2010，16，400-402；SamuelVT.，et.al.，Lancet，2010，375，2267-2277)。另一方面，線粒體代謝機(jī)能下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)積累大量ROS，激活一系列蛋白激酶如proteinkinaseC(PKCθ/ε)，p38-MAPK，c-junNterminalkinase(JNK)，S6kinase1(S6K1)等信號蛋白，引起胰島素受體底物IRS-1磷酸化失活(Boura-HalfonS.andZickY.，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.，2009，296，E581-E591)，繼而引起下游信號蛋白如磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB/Akt)等活性下降，導(dǎo)致肌肉細(xì)胞胞漿內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位減少，肝臟肝糖原合成酶(glycogensynthase)活性顯著降低，進(jìn)一步加劇體內(nèi)胰島素抵抗(HoustisN.，et.al.，Nature，2006，440，944-948；StyktalJ.et.al.，F(xiàn)reeRadic.Biol.Med.，2012，52，46-58；RainsJLandJainSK.，F(xiàn)reeRadic.Biol.Med.，2011，50，567-575)。此外，胰島β細(xì)胞線粒體功能障礙導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡及壞死，嚴(yán)重影響胰島素的正常分泌(TrendsEndocrinol.Metab.2012，23，477-487)。胰島素抵抗是2型糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪肝病、高甘油三酯血癥等代謝性疾病共同的病理特征。促進(jìn)胰島素靶器官或組織如肝臟、肌肉以及胰島β細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)線粒體脂肪酸氧化，促進(jìn)線粒體再生，提高線粒體代謝機(jī)能，減少這些器官或組織內(nèi)脂質(zhì)和ROS積累，能顯著改善體內(nèi)胰島素抵抗，是治療2型糖尿病、肥胖癥和非酒精性脂肪肝病等代謝性疾病的重要途徑(TsengYH.，el.al.，Nat.Rev.DrugDiscov.2010，9，465-482；SerraD.，et.al.，Antioxid.RedoxSignal.，2013，19，269-284)。線粒體功能退變是導(dǎo)致細(xì)胞衰老，引起神經(jīng)退行性疾病的中心環(huán)節(jié)，也是衰老和神經(jīng)退行性疾病重要的病理標(biāo)志(BealMF.，Ann.Neurol.，2005，58，495-505；LinMT.andBealMF.，Nature，2006，443，787-795；KarbowskiMandNeutznerA.，ActaNeuropathol.，2012，123，157-171)。由于線粒體DNA缺陷，氧化磷酸化發(fā)生異常，導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，產(chǎn)生并積累大量ROS，進(jìn)一步損害線粒體自身代謝機(jī)能，生成更多ROS，對細(xì)胞核DNA造成損傷，激活與細(xì)胞衰老相關(guān)信號蛋白，引發(fā)細(xì)胞老化。線粒體已成為延緩細(xì)胞衰老和治療神經(jīng)退行性疾病的新靶點，提高線粒體代謝機(jī)能，是延緩衰老及治療神經(jīng)退行性疾病的有效手段(ReddyPHandReddyTP.，Curr.AlzheimerRes.，2011，8，393-409；GuarenteL.，Cell，2008，132，171-176)。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)是一種異源三聚體蛋白，由α，β，γ三個亞基組成，在肝臟，骨骼肌，心臟和腎臟等器官或組織均有大量表達(dá)。AMPK作為一種重要的蛋白激酶參與生物體內(nèi)多種代謝過程，被稱為細(xì)胞“能量感受器”，當(dāng)細(xì)胞受到任何引起ATP生成減少與消耗增加的應(yīng)激信號時，AMP/ATP比值增加，AMPKα亞基內(nèi)Thr172位點磷酸化，從而活化AMPK，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝?；罨疉MPK是提高線粒體代謝機(jī)能的重要手段。AMPK可以通過磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoAcarboxylase，ACC)Ser79位點抑制ACC活性，提高肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(Carnitinepalmitoyltransferase1，CPT1)活性，促進(jìn)線粒體脂肪酸β氧化，抑制脂肪酸合成；同時活化AMPK能顯著提高線粒體生成轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)線粒體再生(Biogenesis)。Metformin，resveratrol，dinitrophenol等小分子化合物可活化AMPK，另外通過限制熱量攝入(Caloricrestriction)和經(jīng)常鍛煉也能活化骨骼肌和肝臟AMPK，促進(jìn)線粒體能量代謝(ZhangBB.，et.al.，CellMetab.，2009，9，407-416；SteinbergGRandKempBE.，Physiol.Rev.，2009，89，1025-1078)。通過活化AMPK，提高線粒體代謝機(jī)能，是增強(qiáng)機(jī)體胰島素敏感性并治療代謝性疾病的重要途徑。此外，通過活化AMPK，能抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活性，進(jìn)而調(diào)控下游核糖體S6蛋白激酶(ribosomalS6kinase)和轉(zhuǎn)譯抑制因子4EBP等蛋白活性，延緩細(xì)胞老化，是延長生物體壽命及治療衰老相關(guān)疾病的重要途徑(GwinnDMetal.，Mol.Cell，2008，30，214-226；JohnsonSC.，etal.，Nature，2013，493，338-345；LaplanteMandSabatiniDM.，Cell，149，274-293；SshinEandDepinhoRA.，Nat.Rev.Mol.CellBiol.，2012，13，397-404；SelmanC.，etal.，Science，2009，326，140-144；KapahiP.，etal.，CellMetab.，2010，11，453-465)。過氧化物酶體(Peroxisome)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的具有單層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，其主要功能是催化長鏈和極長鏈脂肪酸氧化，生成短鏈脂肪酸再返回線粒體完成全部氧化過程，以及清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)等。過氧化物酶體內(nèi)含有大量氧化酶，催化底物反應(yīng)生成過氧化氫(H2O2)，再通過過氧化氫酶(Catalase)將H2O2分解成水和氧氣。過氧化物酶體對外部信號非常敏感，容易發(fā)生增殖(Proliferation)，高脂飲食、長時間空腹、降脂藥如貝特類藥物以及一些除草劑和殺蟲劑等都能誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖(ReddyJK.andHashimotoT.，Annu.Rev.Nutr.，2001，21，193-230)。另外，在線粒體代謝功能障礙的病理狀態(tài)下，過氧化物酶體通常發(fā)生代償性增殖。過氧化物酶體增殖通過過氧化物酶體增殖受體α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorα，PPARα)進(jìn)行調(diào)控。H2O2作為信號分子，在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)參與過氧化物酶體生成的PEX系列基因表達(dá)，調(diào)控過氧化物酶體再生(Lopez-HuertasE.，etal.，EMBOJ.，2000，19，6770-6777)。脂酰輔酶A氧化酶(acyl-CoAoxidase，AOX，EC1.3.3.6)，是過氧化物酶體脂肪酸β氧化過程中催化第一步反應(yīng)的酶，也是過氧化物酶體脂肪酸β-氧化過程的限速酶，分子量約72kDa，每分子AOX含有一分子黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavinadeninedinucleotide，F(xiàn)AD)。AOX催化脂酰輔酶A碳鏈2-3位脫氫，形成2-烯脂酰輔酶A(2-enoyl-CoA)，脫下的氫原子直接與分子氧結(jié)合，形成H2O2。AOX基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)通過PPARα調(diào)控。目前沒有關(guān)于脂酰輔酶A氧化酶抑制劑或脂酰輔酶A氧化酶抑制劑前體應(yīng)用于提高線粒體代謝機(jī)能的任何報道，也沒有脂酰輔酶A氧化酶抑制劑或脂酰輔酶A氧化酶抑制劑前體作為制備用于治療線粒體代謝功能障礙相關(guān)疾病如糖尿病的藥物的用途的任何報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種提高線粒體代謝機(jī)能的方法，脂酰輔酶A氧化酶抑制劑作為線粒體代謝機(jī)能促進(jìn)劑的用途，脂酰輔酶A氧化酶抑制劑或脂酰輔酶A氧化酶抑制劑前體在制備用于治療因線粒體代謝機(jī)能障礙所致疾病的組合物中的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供脂酰輔酶A氧化酶抑制劑的用途，用于制備促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化和線粒體再生，提高線粒體代謝機(jī)能，抑制過氧化物酶體增殖的組合物；所述脂酰輔酶A氧化酶的國際酶學(xué)分類編號為EC1.3.3.6。在一個優(yōu)選例中，所述的靶器官或組織是表達(dá)脂酰輔酶A氧化酶的器官或組織；較佳地，包括：肝臟，骨骼肌，脂肪組織，心臟，腎臟。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于預(yù)防、改善或治療線粒體代謝功能障礙相關(guān)疾病。較佳地，所述的線粒體代謝功能障礙相關(guān)疾病包括(但不限于)：代謝綜合征，衰老或神經(jīng)退行性疾??；較佳地，所述的代謝綜合征包括：胰島素抵抗，糖尿病，肥胖癥，非酒精性脂肪肝病，高甘油三酯血癥；較佳地，所述的神經(jīng)退行性疾病包括：阿爾茨海默癥或帕金森癥；較佳地，所述的糖尿病包括2型糖尿病，伴胰島素抵抗1型糖尿病(與胰島素聯(lián)合治療)。在一個優(yōu)選例中，所述脂酰輔酶A氧化酶抑制劑通過抑制脂酰輔酶A氧化酶降低靶器官或組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平，減少胰島素作用靶組織內(nèi)氧化自由基(ROS)含量，改善胰島素抵抗，從而預(yù)防、改善或治療線粒體代謝功能障礙相關(guān)疾病。在另一優(yōu)選例中，所述1型糖尿病特征為體內(nèi)胰島素分泌絕對缺乏伴胰島素抵抗，給予胰島素治療后不能有效控制血糖；所述2型糖尿病特征為胰島素抵抗伴胰島素相對缺乏，或胰島素分泌不足伴胰島素抵抗。在另一優(yōu)選例中，所述的脂酰輔酶A氧化酶抑制劑為抑制脂酰輔酶A氧化酶活性或表達(dá)的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的脂酰輔酶A氧化酶抑制劑包括(但不限于)：小分子有機(jī)物，小分子無機(jī)物，抗脂酰輔酶A氧化酶抗體，能與脂酰輔酶A氧化酶特異性結(jié)合并抑制其活性的核酸片段和多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的脂酰輔酶A氧化酶抑制劑還包括抑制劑前體。在另一優(yōu)選例中，所述的脂酰輔酶A氧化酶抑制劑或抑制劑前體包括(但不限于)：10，12-二十五碳二炔酸(Pentacosadiynoicacid；CAS編碼：66990-32-7，LH-919)或10，12-二十五碳二炔酰輔酶A(10，12-Pentacosadiynoyl-CoA，LH-919-CoA)。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于：抑制體內(nèi)靶器官或組織脂酰輔酶A氧化酶活性；抑制體內(nèi)靶器官或組織過氧化物酶體增殖；活化體內(nèi)靶器官或組織單磷酸腺苷活化蛋白激酶；降低體內(nèi)靶器官或組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平；或減少體內(nèi)胰島素作用靶器官或組織內(nèi)氧化自由基(ROS)含量；提高體內(nèi)靶器官或組織細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化磷酸化水平；增加體內(nèi)靶器官或組織細(xì)胞PGC-1α基因表達(dá)；抑制體內(nèi)靶器官或組織哺乳動物雷帕霉素靶蛋白或核糖體S6蛋白激酶活性。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于預(yù)防、改善或治療線粒體代謝功能障礙相關(guān)疾病的組合物，所述組合物包括：脂酰輔酶A氧化酶抑制劑(較佳地，為治療有效量的抑制劑)；以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在一個優(yōu)選例中，所述的脂酰輔酶A氧化酶抑制劑為抑制脂酰輔酶A氧化酶活性或表達(dá)的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的脂酰輔酶A氧化酶抑制劑包括(但不限于)：抗脂酰輔酶A氧化酶抗體，能與脂酰輔酶A氧化酶特異性結(jié)合并抑制其活性的核酸片段和多肽，小分子有機(jī)物，小分子無機(jī)物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括：藥物組合物、飲食補(bǔ)充劑、保健品組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的脂酰輔酶A氧化酶抑制劑還包括抑制劑前體；較佳地包括(但不限于)：10，12-二十五碳二炔酸(LH-919)或10，12-二十五碳二炔酰輔酶A(LH-919-CoA)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備預(yù)防、改善或治療線粒體代謝功能障礙相關(guān)疾病的組合物的方法，所述方法包括：將脂酰輔酶A氧化酶抑制劑與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合，獲得所述的藥物組合物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種預(yù)防、改善或治療線粒體代謝功能障礙相關(guān)疾病的方法，所述方法包括：抑制需要預(yù)防、改善或治療的患者體內(nèi)的脂酰輔酶A氧化酶活性或表達(dá)。在一個優(yōu)選例中，所述的抑制脂酰輔酶A氧化酶活性或表達(dá)的方法是：給需要預(yù)防、改善或治療的患者施用有效量的脂酰輔酶A氧化酶抑制劑或脂酰輔酶A氧化酶抑制劑前體。在另一優(yōu)選例中，所述脂酰輔酶A氧化酶抑制劑作用的靶器官或組織為哺乳動物或人體內(nèi)表達(dá)脂酰輔酶A氧化酶的器官組織，包括肝臟組織、肌肉組織、脂肪組織、胰島β細(xì)胞和腎臟組織等。在另一優(yōu)選例中，所述脂酰輔酶A氧化酶抑制劑是LH-919-CoA或其前體LH-919。較佳地選擇LH-919實施，其施用劑量為0.1-3000μg/kg/d，較佳劑量為0.1-1000μg/kg/d，更佳劑量為1-1000μg/kg/d，更佳劑量為10-1000μg/kg/d。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1AOX抑制劑在細(xì)胞內(nèi)提高線粒體代謝機(jī)能，抑制過氧化物酶體增殖的作用原理。N＝細(xì)胞核(nuclei)；M＝線粒體(mitochondria)；P＝過氧化物酶體(peroxisome)；MFAO＝線粒體脂肪酸氧化(mitochondrialfattyacidoxidation)；MB＝線粒體再生(mitochondriabiogenesis)；PB＝過氧化物酶體再生(peroxisomebiogenesis)。圖2.LH-919-CoA抑制純化的AOX活性分析。AOX溶于20mMPBS緩沖液中(pH7.4)，濃度80nM，向酶溶液中分別加入80nM()、240nM(△)、480nM(■)、960nM(□)LH-919-CoA，以及800nM(○)LH-919游離酸，對照組加相同體積蒸餾水(●)，于25℃下分別孵育不同時間后，測定AOX殘余酶活性。圖3.LH-919-CoA抑制AOX動力學(xué)參數(shù)測定。圖4.LH-919-CoA體外抑制大鼠肝臟過氧化物酶體AOX活性分析。圖5.不同濃度LH-919-CoA(濃度見橫坐標(biāo))體外抑制大鼠肝臟過氧化物酶體AOX活性分析。圖6.AOX抑制劑前體LH-919(濃度見橫坐標(biāo))體內(nèi)抑制C57BL小鼠肝臟AOX活性分析。圖7.AOX抑制劑前體LH-919(濃度見橫坐標(biāo))體內(nèi)抑制Wistar大鼠肝臟AOX活性分析。圖8.AOX抑制劑前體對Wistar大鼠肝臟脂肪酸氧化活性的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖9.AOX抑制劑前體對Wistar大鼠肝臟和骨骼肌AOX活性的影響。每組樣本數(shù)n＝8。圖10.AOX抑制劑前體對Wistar大鼠肝臟過氧化物酶體脂肪酸氧化活性的影響。每組樣本數(shù)n＝8。圖11.AOX抑制劑前體對Wistar大鼠骨骼肌細(xì)胞色素c氧化酶活性的影響。每組樣本數(shù)n＝8。圖12.AOX抑制劑前體對Wistar大鼠肝臟和骨骼肌檸檬酸合成酶活性的影響。每組樣本數(shù)n＝8。圖13.AOX抑制劑前體對Wistar大鼠骨骼肌線粒體DNA拷貝數(shù)的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖14.AOX抑制劑前體對Wistar大鼠骨骼肌PGC-1αmRNA表達(dá)的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖15.Westernblot檢測AOX抑制劑前體對Wistar大鼠肝臟AMPK(Thr172)磷酸化水平的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖16.Westernblot檢測AOX抑制劑前體對Wistar大鼠肝臟ACC(Ser79)磷酸化水平的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖17.Westernblot檢測AOX抑制劑前體對Wistar大鼠骨骼肌AMPK(Thr172)磷酸化水平的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖18.Westernblot檢測AOX抑制劑前體對Wistar大鼠骨骼肌ACC(Ser79)磷酸化水平的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖19.Westernblot檢測AOX抑制劑前體對Wistar大鼠骨骼肌p70S6K蛋白表達(dá)和p70S6K(Thr389)磷酸化水平(p-p70S6K)的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖20.AOX抑制劑前體對Wistar大鼠骨骼肌PEX1mRNA表達(dá)的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖21.AOX抑制劑前體對CPIB藥物誘導(dǎo)大鼠肝臟AOX活性的影響。每組樣本數(shù)n＝7。圖22.AOX抑制劑前體對CPIB藥物誘導(dǎo)大鼠骨骼肌細(xì)胞色素c氧化酶活性的影響。每組樣本數(shù)n＝7。圖23.AOX抑制劑前體對CPIB藥物誘導(dǎo)大鼠肝臟檸檬酸合成酶活性的影響。每組樣本數(shù)n＝7。圖24.AOX抑制劑前體對CPIB藥物誘導(dǎo)大鼠骨骼肌檸檬酸合成酶活性的影響。每組樣本數(shù)n＝7。圖25.AOX抑制劑前體對CPIB藥物誘導(dǎo)大鼠肝臟線粒體DNA拷貝數(shù)的影響。每組樣本數(shù)n＝7。圖26.Westernblot檢測AOX抑制劑前體對CPIB藥物誘導(dǎo)大鼠肝臟AMPK(Thr172)磷酸化水平的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖27.Westernblot檢測AOX抑制劑前體對CPIB藥物誘導(dǎo)大鼠肝臟ACC(Ser79)磷酸化水平的影響。每組樣本數(shù)n＝6。圖28.AOX抑制劑前體對CPIB藥物誘導(dǎo)大鼠肝臟線粒體PGC-1αmRNA表達(dá)的影響。每組樣本數(shù)n＝7。圖29.AOX抑制劑前體對CPIB藥物誘導(dǎo)大鼠肝臟PEX1mRNA表達(dá)的影響。每組樣本數(shù)n＝7。圖30.AOX抑制劑前體治療對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠肝臟組織學(xué)的改變。圖31A.AOX抑制劑前體治療對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠口服糖耐受(OGTT)的影響。圖31B.AOX抑制劑前體治療后四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠口服糖耐受血糖下線面積(AUC)比較。圖32.AOX抑制劑前體治療對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清甘油三酯的影響。圖33.AOX抑制劑前體治療對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清游離脂肪酸的影響。圖34.AOX抑制劑前體治療對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠肝臟AOX活性的影響。圖35.AOX抑制劑前體治療對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清MDA的影響。圖36.AOX抑制劑前體治療對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠肝臟H2O2含量的影響。圖37.AOX抑制劑前體治療對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠肝臟甘油三酯含量的影響。圖38.AOX抑制劑前體治療對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠肝臟MDA的影響。圖39A.AOX抑制劑前體治療對ob/ob小鼠口服糖耐受(OGTT)的影響。圖39B.AOX抑制劑前體治療對ob/ob小鼠口服糖耐受血糖下線面積(AUC)影響。圖40.AOX抑制劑前體治療對ob/ob小鼠肝臟AOX活性的影響。圖41.AOX抑制劑前體治療對ob/ob小鼠肝臟組織學(xué)的改變。圖42.AOX抑制劑前體治療對ob/ob小鼠肝臟MDA的影響。圖43.AOX抑制劑前體治療對db/db小鼠肝臟AOX活性的影響。圖44.AOX抑制劑前體治療對db/db小鼠肝臟MDA的影響。具體實施方式本發(fā)明首次揭示脂酰輔酶A氧化酶抑制劑(或抑制劑前體)在制備用于預(yù)防、緩解或治療線粒體代謝功能障礙相關(guān)疾病的組合物中的用途。具體而言，本發(fā)明中揭示了通過給予脂酰輔酶A氧化酶抑制劑(或抑制劑前體)，抑制體內(nèi)脂酰輔酶A氧化酶活性，進(jìn)而顯著提高靶器官或組織內(nèi)線粒體代謝功能，并降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，改善體內(nèi)胰島素抵抗，延緩細(xì)胞衰老，治療線粒體功能障礙引起的疾病。本發(fā)明的具體實施方案中，以肝臟或骨骼肌為例，作為AOX抑制劑作用的靶器官，測試AOX抑制劑在體外對肝臟AOX的抑制作用，以及AOX抑制劑或AOX抑制劑前體(precursor)在體內(nèi)對肝臟AOX的抑制作用。但需要特別指出的是，AOX抑制劑或AOX抑制劑前體在體內(nèi)作用的靶器官或組織不限于肝臟和骨骼肌，包括哺乳動物或人體內(nèi)任何表達(dá)AOX蛋白的器官，例如肌肉組織、心臟、脂肪組織、胰島β細(xì)胞、腎臟組織等，因為體內(nèi)這些不同器官表達(dá)的AOX蛋白為同一基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，氨基酸序列一致，且具有相同的生理活性。如本文所用，所述的LH-919指代10，12-二十五碳二炔酸(10，12-Pentacosadiynoicacid)，其CAS編碼：66990-32-7。LH-919為LH-919-CoA的前體，LH-919在體內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化為LH-919-CoA。如本文所用，所述的LH-919-CoA指代10，12-二十五碳二炔酰輔酶A(10，12-Pentacosadiynoyl-CoA)。具體而言，本發(fā)明具體實施例中包括以下3個方面內(nèi)容：1.AOX抑制劑的制備及對AOX的抑制作用本發(fā)明人制備了LH-919-CoA。以LH-919酸為原料，制備了高純度LH-919-CoA，測試其對AOX的抑制作用。由游離脂肪酸制備脂酰輔酶A的合成方法參照文獻(xiàn)實施(LiD.et.al.，J.Am.Chem.Soc.，2001，121，9034-9042)。本發(fā)明分別從體外和動物體內(nèi)測試了AOX抑制劑對AOX的抑制作用。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，LH-919-CoA在體外能顯著抑制肝臟AOX活性。首先采用重組表達(dá)并高度純化的大鼠肝AOX作為靶蛋白，測定LH-919-CoA對AOX的抑制效果，結(jié)果LH-919-CoA能迅速抑制AOX活性，且這種抑制作用是不可逆的。游離LH-919酸對AOX沒有抑制作用。采用大鼠肝臟完整過氧化物酶體作為測定對象，測試LH-919-CoA在體外對過氧化物酶體中AOX抑制作用，結(jié)果LH-919-CoA能迅速且顯著地抑制大鼠肝臟過氧化物酶體AOX活性。本發(fā)明測試了AOX抑制劑前體在動物體內(nèi)對AOX的抑制作用。本發(fā)明首先確定了LH-919-CoA是LH-919在體內(nèi)轉(zhuǎn)化物。本發(fā)明一實施例中，將一定劑量LH-919給予Wistar大鼠灌胃，經(jīng)完全吸收后處死，迅速解剖大鼠，摘取肝臟，分離肝臟過氧化物酶體，通過對大鼠肝臟過氧化物酶體內(nèi)含物分析，檢測到過氧化物酶體中存在LH-919-CoA。因此LH-919在體內(nèi)吸收后，在肝臟轉(zhuǎn)化為LH-919-CoA。事實上，游離脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)活化為脂酰輔酶A的機(jī)制已經(jīng)非常清楚，以過氧化物酶體為例，在過氧化物酶體膜上存在長鏈/極長鏈脂酰輔酶A合成酶(acyl-CoAsynthetase)，將游離脂肪酸(NEFA)活化為脂酰輔酶A(acyl-CoA)，后進(jìn)入過氧化物酶體，作為催化底物進(jìn)入AOX蛋白活性中心(ReddyJK.andHashimotoT.，Annu.Rev.Nutr.，2001，21，193-230)。本發(fā)明一實施例中，將LH-919給予C57BL小鼠灌胃，于灌胃3h后處死，迅速解剖小鼠，摘取肝臟，分離過氧化物酶體，測定AOX酶活性，結(jié)果與對照組相比，灌藥組C57BL小鼠肝臟AOX活性顯著降低，且抑制作用強(qiáng)度與灌藥劑量成正比關(guān)系。本發(fā)明另一實施例中，將LH-919給予Wistar大鼠灌胃，于灌胃3h后處死，迅速解剖大鼠，摘取肝臟，分離過氧化物酶體，測定AOX活性，結(jié)果與對照組相比，灌藥組Wistar大鼠肝臟AOX活性顯著降低，且抑制作用強(qiáng)度與灌藥劑量成正比關(guān)系。通過體外抑制實驗得知，游離LH-919對AOX無抑制作用。LH-919在體內(nèi)吸收后，轉(zhuǎn)化為LH-919-CoA抑制AOX活性。因此，LH-919是AOX抑制劑LH-919-CoA的前體，LH-919在體內(nèi)代謝產(chǎn)物L(fēng)H-919-CoA能快速且不可逆地抑制AOX活性。2.AOX抑制劑提高靶器官或組織細(xì)胞內(nèi)線粒體代謝機(jī)能的原理本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，通過抑制體內(nèi)靶器官或組織AOX活性，可以增加AMPK(Thr172)磷酸化水平，活化AMPK，抑制ACC活性，提高CPT1活性，促進(jìn)線粒體脂肪酸β氧化，提高線粒體生成轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α基因表達(dá)，促進(jìn)線粒體再生，從而提高線粒體代謝機(jī)能，增強(qiáng)機(jī)體胰島素敏感性。此外，AOX抑制劑在體內(nèi)通過活化AMPK，能抑制mTOR及下游靶蛋白如核糖體S6蛋白激酶活性，延緩細(xì)胞衰老。另一方面，AOX催化底物反應(yīng)將產(chǎn)生大量H2O2，通過抑制體內(nèi)靶器官或組織AOX活性，減少AOX催化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2，能顯著降低參與過氧化物酶體生成的PEX系列基因的表達(dá)水平，降低靶器官或組織細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶體數(shù)量，抑制過氧化物酶體增殖，并減少ROS的產(chǎn)生。AOX抑制劑在細(xì)胞內(nèi)提高線粒體代謝機(jī)能，抑制過氧化物酶體增殖的作用原理如圖1所示。AOX抑制劑或AOX抑制劑前體作為線粒體代謝機(jī)能促進(jìn)劑的用途，其中所述AOX抑制劑前體在哺乳動物或人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為AOX抑制劑，并抑制AOX活性。本發(fā)明一實施例中，將LH-919給予Wistar大鼠灌胃連續(xù)6周，后處死大鼠，并對大鼠血清和肝臟及骨骼肌組織進(jìn)行生化分析，結(jié)果LH-919藥物組體重增重較對照組顯著減少，表明AOX抑制劑具有減輕大鼠體重的作用。藥物組血糖、血清胰島素和血清甘油三酯含量較對照組顯著降低。同時，血清β-hydroxybutyrate較對照組顯著升高，表明AOX抑制劑能顯著促進(jìn)大鼠肝臟脂肪酸氧化。通過測定大鼠肝臟脂肪酸氧化速率，結(jié)果表明，AOX抑制劑組肝臟脂肪酸氧化速率較對照組顯著升高。細(xì)胞色素c氧化酶(Cytochromecoxidase，COX)是衡量線粒體氧化磷酸化水平的標(biāo)志酶，實施例中AOX抑制劑組肝臟和骨骼肌細(xì)胞色素氧化酶活性較對照組顯著增加，表明通過抑制AOX活性，能提高大鼠肝臟和骨骼肌線粒體氧化磷酸化水平。同時，肝臟和骨骼肌AOX活性較對照組顯著降低，肝臟過氧化物酶體脂肪酸氧化也顯著降低，這些結(jié)果表明，通過抑制體內(nèi)AOX活性即過氧化物酶體脂肪酸氧化，能促進(jìn)體內(nèi)線粒體脂肪酸氧化，提高線粒體氧化磷酸化水平。本發(fā)明還通過生化分析方法比較了各組肝臟和骨骼肌citratesynthase活性，mtDNA拷貝數(shù)均為衡量細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量的特征指標(biāo)，本實驗分別測定了實驗各組的citratesynthase活性和mtDNA拷貝數(shù)，結(jié)果表明，肝臟和骨骼肌citratesynthase活性和mtDNA拷貝數(shù)較對照組顯著升高，表明AOX抑制劑能促進(jìn)線粒體再生，顯著提高大鼠肝臟和骨骼肌線粒體數(shù)量。通過對大鼠肝臟和骨骼肌組織蛋白westernblot分析，AOX抑制劑組大鼠肝臟和骨骼肌AMPK(Thr172)和ACC(Ser79)磷酸化水平均較對照組顯著提高(p＜0.01)，表明AOX抑制劑通過活化AMPK，抑制ACC活性，促進(jìn)肝臟和骨骼肌線粒體脂肪酸代謝。RT-PCR分析結(jié)果表明，AOX抑制劑組大鼠骨骼肌PGC-1α基因表達(dá)水平較對照組顯著升高(p＜0.01)，參與過氧化物酶體生成的關(guān)鍵基因PEX1表達(dá)水平較對照組顯著下降，表明AOX抑制劑在體內(nèi)促進(jìn)線粒體生成，抑制過氧化物酶體增殖。本發(fā)明一實施例中，通過抑制AOX活性，活化靶器官或組織如骨骼肌AMPK，進(jìn)而抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白活性，降低核糖體S6蛋白激酶(Thr389)磷酸化水平，減少核糖體S6蛋白激酶的表達(dá)，從而顯著降低核糖體S6蛋白激酶活性，延緩細(xì)胞衰老。本發(fā)明另一個實施例中，采用氯苯丁酯(clofibrate，CPIB)藥物誘導(dǎo)大鼠模型，進(jìn)一步通過實例闡釋AOX抑制劑抑制過氧化物酶體增殖，促進(jìn)線粒體再生的原理。氯苯丁酯是一種常用的降脂藥，其通過激活PPARα，促進(jìn)過氧化物酶體增殖。將低劑量CPIB(100mg/kg/d)和LH-919同時給予Wistar大鼠灌胃，對照組只給予相同劑量CPIB灌胃，連續(xù)灌胃12天后處死大鼠，對血清和肝臟組織生化分析，結(jié)果AOX抑制劑組血清TG較對照組顯著降低，AOX抑制劑組血清β-hydroxybutyrate較對照組顯著升高，表明抑制劑組肝臟脂肪酸氧化水平較對照組升高。AOX抑制劑組肝臟和骨骼肌COX活性較對照組顯著增加，表明通過抑制AOX活性，能提高肝臟和骨骼肌線粒體氧化磷酸化水平。CPIB誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖的一個顯著特征是肝重系數(shù)(肝重/體重比值)明顯增加，實施例中AOX抑制劑組大鼠肝重系數(shù)較CPIB對照組顯著降低(p＜0.01)，表明AOX抑制劑能在體內(nèi)能抑制CPIB誘導(dǎo)的過氧化物酶體增殖。AOX抑制劑組肝臟和骨骼肌citratesynthase活性和mtDNA數(shù)量較對照組顯著升高，肝臟PGC-1α基因表達(dá)水平也較對照組顯著提高(p＜0.01)，表明抑制劑組肝臟和骨骼肌線粒體數(shù)量較對照組顯著增加。通過對肝臟組織蛋白westernblot分析，AOX抑制劑組大鼠肝臟和骨骼肌AMPK(Thr172)和ACC(Ser79)磷酸化水平均較對照組顯著上升(p＜0.01)，表明AOX抑制劑通過活化AMPK，促進(jìn)體內(nèi)線粒體脂肪酸氧化和線粒體生成，提高線粒體代謝機(jī)能。CPIB通過激活PPARα，顯著提高肝臟AOX活性，誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖。AOX抑制劑在體內(nèi)通過抑制AOX活性，減少H2O2的生成，顯著降低肝臟PEX系列基因表達(dá)水平(p＜0.01)，抑制過氧化物酶體增殖，降低肝重系數(shù)。3.AOX抑制劑或AOX抑制劑前體在制備用于治療線粒體代謝功能障礙所致疾病的組合物中的用途本發(fā)明首次報道通過抑制體內(nèi)AOX活性，促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化和線粒體再生，提高線粒體代謝機(jī)能的原理。AOX抑制劑或AOX抑制劑前體作為線粒體代謝機(jī)能促進(jìn)劑，作為治療線粒體代謝機(jī)能障礙性疾病的藥物的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明從兩個應(yīng)用方面分別舉例進(jìn)行說明。第一方面，AOX抑制劑或AOX抑制劑前體在制備作為治療包括糖尿病，肥胖癥，非酒精性脂肪肝病等以胰島素抵抗為病理標(biāo)志的疾病的藥物中的應(yīng)用。線粒體代謝機(jī)能障礙是機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗的直接原因，也是這些代謝性疾病重要的病理特征。提高線粒體代謝機(jī)能是改善體內(nèi)胰島素抵抗，治療糖尿病等代謝性疾病的主要途徑。糖尿病是一種由于遺傳和環(huán)境因素相互作用，胰島素相對或絕對缺乏以及靶組織胰島素抵抗引起的碳水化合物、脂肪及蛋白質(zhì)代謝紊亂的綜合征，是一種持續(xù)高血糖為特征的，慢性、全身性代謝疾病。糖尿病發(fā)病后若未得到有效治療，可出現(xiàn)廣泛的微血管及大血管病變，出現(xiàn)神經(jīng)、泌尿、循環(huán)等多系統(tǒng)的病理改變。糖尿病主要有2種類型：(1)1型糖尿病，胰島β細(xì)胞破壞，通常導(dǎo)致胰島素絕對缺乏；(2)2型糖尿病，又稱為非胰島素依賴型糖尿病，表現(xiàn)為全身胰島素抵抗伴胰島素相對缺乏，或胰島素分泌不足伴胰島素抵抗。2012年全世界的糖尿病患者達(dá)3.5億人，其潛在的最大增長人群在亞洲，約占總增長數(shù)的65％以上。中國糖尿病患者近10年增長了2倍，患病總?cè)藬?shù)接近1億人，居全球第一位。目前針對1型糖尿病治療以胰島素治療為主，但1型糖尿病患者常伴有胰島素抵抗，經(jīng)胰島素治療后血糖仍控制不穩(wěn)定。針對2型糖尿病治療，在控制體重和運(yùn)動均未能有效控制血糖時，常以口服降糖藥治療，目前有兩大類常用口服降糖藥物，第一類為胰島素分泌促進(jìn)劑，如磺酰脲類藥物等，這類藥物主要副作用在于容易引起低血糖，以及對肝腎毒性較大；第二類為胰島素增敏劑，主要有噻唑烷二酮類(TZDs)藥物如吡咯列酮等和雙胍類藥物如二甲雙胍等。噻唑烷二酮類藥物早期使用較多，但容易引起肥胖，心衰以及增加患膀胱癌的風(fēng)險等明顯副作用，近年來使用越來越少；雙胍類藥物使用過程中容易出現(xiàn)惡心、腹瀉等不良副作用。在線粒體代謝功能障礙的病理狀態(tài)下，由于機(jī)體胰島素抵抗引起葡萄糖利用障礙，因此組織更多地利用體內(nèi)脂肪氧化提供能量，血液中游離脂肪酸(non-esterifiedfattyacid，NEFA)含量顯著升高，進(jìn)入肝臟、肌肉、胰島β細(xì)胞等組織的NEFA也隨之增多，導(dǎo)致這些組織過氧化物酶體內(nèi)參與脂肪酸β-氧化的代謝酶活性及脂肪酸β-氧化水平均代償性顯著升高(HorieS.et.al.，J.Biochem.，1981，90，1691-1696；AsayamaK.etal.，Mol.Cell.Biochem.，1999，194，227-234)。本發(fā)明實施例中，因線粒體代謝功能障礙的各種模型動物如糖尿病大/小鼠肝臟AOX活性均較正常組顯著升高。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，通過抑制體內(nèi)靶器官或組織AOX活性，提高線粒體代謝功能，降低這些器官或組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平，顯著改善體內(nèi)胰島素抵抗，獲得意想不到的治療糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪肝病和高甘油三酯血癥等代謝性疾病的效果。本發(fā)明還包括AOX抑制劑前體在制備用于治療糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪肝病和高甘油三酯血癥的組合物中的用途，所述AOX抑制劑前體在哺乳動物或人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為AOX抑制劑，并抑制AOX活性。例如本發(fā)明實施例中，LH-919是AOX抑制劑前體，LH-919經(jīng)體內(nèi)吸收后，在肝臟轉(zhuǎn)化為LH-919-CoA，能快速顯著抑制AOX活性。應(yīng)當(dāng)理解，AOX抑制劑和AOX抑制劑前體在哺乳動物或人體內(nèi)的生理活性是相同的，即抑制靶器官或組織AOX活性。AOX抑制劑或AOX抑制劑前體可以治療1型糖尿病和2型糖尿病。其中所述1型糖尿病特征為體內(nèi)胰島素分泌絕對缺乏伴胰島素抵抗，給予胰島素治療后不能有效控制血糖；所述2型糖尿病特征為胰島素抵抗伴胰島素相對缺乏，或胰島素分泌不足伴胰島素抵抗。具體而言，本發(fā)明實施方案中，針對一種1型糖尿病動物模型和二種2型糖尿病動物模型進(jìn)行了藥效試驗。本發(fā)明實施方案以一種AOX抑制劑前體LH-919為例，進(jìn)行動物藥效試驗。LH-919在體內(nèi)轉(zhuǎn)化物L(fēng)H-919-CoA是AOX抑制劑，在體內(nèi)能快速顯著地抑制AOX活性。藥效試驗中，LH-919治療的有效劑量為0.1-3000μg/kg/d，較佳劑量為0.1-1000μg/kg/d，更佳劑量為1-1000μg/kg/d，更佳劑量為10-1000μg/kg/d。本發(fā)明一實施方案，首先針對1型糖尿病，采用四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，由于四氧嘧啶選擇性破壞胰島β細(xì)胞，引起胰島素絕對缺乏，血糖急劇升高，因此給予四氧嘧啶糖尿病大鼠皮下注射低劑量長效胰島素，防止由于血糖過高引起的酮癥酸中毒。成模后，糖尿病大鼠空腹血糖顯著升高且伴有胰島素抵抗，血清甘油三酯和游離脂肪酸顯著升高，肝臟AOX活性和體內(nèi)氧化應(yīng)激水平均顯著升高。給予不同劑量AOX抑制劑前體治療后，治療組血糖較對照組顯著降低(p＜0.01)，口服糖耐受(OGTT)能力顯著增強(qiáng)，血清甘油三酯和游離脂肪酸(NEFA)含量顯著降低(p＜0.01)。經(jīng)AOX抑制劑前體治療后，糖尿病大鼠肝臟AOX活性顯著降低(p＜0.01)，體內(nèi)氧化應(yīng)激水平隨之顯著降低，表現(xiàn)在血清丙二醛(malondialdeyde，MDA)含量顯著降低(p＜0.01)，肝臟H2O2和MDA含量顯著降低(p＜0.01)。因此，對于1型糖尿病伴胰島素抵抗動物模型，給予胰島素治療后，因體內(nèi)胰島素抵抗，不能有效控制血糖。經(jīng)AOX抑制劑或AOX抑制劑前體治療后，通過抑制體內(nèi)AOX活性，能顯著減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，改善胰島素抵抗，降低血糖，提高機(jī)體糖耐受能力，從而治療1型糖尿病(與胰島素聯(lián)合治療)。本發(fā)明另2個實施方案，針對2型糖尿病，選用ob/ob小鼠、db/db小鼠兩種動物模型，這2種動物模型均為自發(fā)性2型糖尿病動物模型，具有胰島素抵抗、高血糖、高胰島素血和高血脂等特征。同時肝臟AOX活性也顯著升高，體內(nèi)氧化應(yīng)激水平較正常組顯著升高。分別給這兩種2型糖尿病動物以AOX抑制劑前體治療后，治療組血糖和血清胰島素水平較對照組顯著降低(p＜0.01)，胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR顯著下降，口服糖耐受(OGTT)顯著增強(qiáng)。血清甘油三酯和游離脂肪酸(NEFA)含量也顯著降低(p＜0.01)。經(jīng)AOX抑制劑前體治療后，ob/ob小鼠和db/db小鼠肝臟AOX酶活性顯著降低(p＜0.01)，從而體內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著降低，表現(xiàn)在肝臟H2O2含量和MDA含量均顯著降低(p＜0.01)。經(jīng)AOX抑制劑前體治療后，ob/ob小鼠抑制劑組體重增加較對照組顯著減少，表明AOX抑制劑在體內(nèi)通過提高肝臟和骨骼肌等靶器官線粒體代謝機(jī)能，具有減輕體重，治療肥胖癥的作用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，通過抑制體內(nèi)AOX酶活性，促進(jìn)肝臟脂肪酸氧化，抑制肝臟脂肪酸合成，降低肝臟氧化應(yīng)激水平，改善肝臟胰島素抵抗，顯著降低ob/ob小鼠、db/db小鼠體內(nèi)肝臟甘油三酯含量。因此，對于2型糖尿病動物模型，給予AOX抑制劑或AOX抑制劑前體治療，抑制體內(nèi)AOX活性，能顯著減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，減輕體重，降低血糖，提高機(jī)體糖耐受能力，降低血清和肝臟甘油三酯含量。因此AOX抑制劑或AOX抑制劑前體可以治療2型糖尿病，肥胖癥，非酒精性脂肪肝病，高甘油三酯血癥等代謝性疾病。本發(fā)明另一實施方案，采用高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠模型進(jìn)行試驗，這種大鼠模型具有肥胖，胰島素抵抗，高血脂，脂肪肝等病理特征。給予高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠AOX抑制劑前體治療后，AOX抑制劑組體重增加較對照組顯著減少，治療組空腹血糖和血清胰島素水平較對照組顯著降低(p＜0.01)，胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR顯著下降。血清甘油三酯含量也顯著降低(p＜0.01)。經(jīng)AOX抑制劑前體治療后抑制劑組大鼠肝臟甘油三酯含量也顯著降低(p＜0.01)。因此，AOX抑制劑通過提高體內(nèi)線粒體代謝機(jī)能，能改善體內(nèi)胰島素抵抗，治療肥胖癥，非酒精性脂肪肝病，高甘油三酯血癥等代謝性疾病。第二方面，AOX抑制劑或AOX抑制劑前體在制備作為延緩衰老和治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途。線粒體在衰老和神經(jīng)退行性疾病的病理進(jìn)程中處于核心地位，線粒體代謝機(jī)能障礙是導(dǎo)致細(xì)胞衰老，引起神經(jīng)退行性疾病的直接原因，也是這些疾病重要的病理標(biāo)志，提高線粒體代謝機(jī)能是延緩衰老和治療神經(jīng)退行性疾病的重要途徑，這些結(jié)論都是公知的。本發(fā)明一實施例，通過抑制Wistar大鼠體內(nèi)靶器官AOX活性，可以增加AMPK(Thr172)磷酸化水平，活化AMPK，抑制ACC活性，促進(jìn)線粒體脂肪酸β氧化，提高線粒體生成轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α基因表達(dá)水平，促進(jìn)線粒體再生，從而提高線粒體代謝機(jī)能，減少線粒體ROS產(chǎn)生的效率，提高細(xì)胞的抗氧化能力，降低線粒體DNA和細(xì)胞核DNA發(fā)生突變的幾率。另一方面，本發(fā)明實施例通過抑制靶器官或組織AOX活性，活化AMPK，能抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活性，進(jìn)而抑制下游核糖體S6蛋白激酶活性，延緩細(xì)胞老化，治療衰老相關(guān)疾病。大量實驗報道證實，提高線粒體代謝機(jī)能，抑制mTOR或下游核糖體S6蛋白激酶活性，能延長動物壽命，治療退行性疾病，盡管本發(fā)明沒有進(jìn)行動物壽命藥效實驗，但本發(fā)明的實施例提供的大量實驗數(shù)據(jù)充分證明了AOX抑制劑延緩細(xì)胞衰老，治療神經(jīng)退行性疾病的有效性。因此，AOX抑制劑作為線粒體代謝機(jī)能促進(jìn)劑，能延長哺乳動物或人的壽命，治療神經(jīng)退行性疾病?；诒景l(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種AOX的抑制劑的用途，用于促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化和線粒體再生，提高線粒體的代謝機(jī)能，抑制過氧化物酶體增殖，并基于此用途制備用于預(yù)防、改善或治療包括代謝性疾病如糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪肝病、高甘油三酯血癥等，衰老，神經(jīng)退行性疾病等在內(nèi)的線粒體功能障礙相關(guān)疾病的藥物。如本文所用，所述的AOX抑制劑包括了下調(diào)劑、阻滯劑、拮抗劑、阻斷劑等。所述的AOX抑制劑是指任何可降低AOX蛋白的活性、降低AOX基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)AOX蛋白的表達(dá)、減少AOX蛋白有效作用時間、或抑制AOX基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對于下調(diào)AOX有用的物質(zhì)，從而可用于本發(fā)明。例如，所述的抑制劑包括：小分子有機(jī)物、小分子無機(jī)物、小分子化合物、特異性與AOX結(jié)合的抗體或配體、能與AOX特異性結(jié)合并抑制其活性的核酸片段和多肽等，特異性干擾AOX基因表達(dá)的小干擾RNA分子或反義核苷酸等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的AOX抑制劑是化合物L(fēng)H-919-CoA或其前體LH-919。本發(fā)明還包括上述化合物的異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物。所述的“藥學(xué)上可接受的鹽”是指所述化合物與無機(jī)酸、有機(jī)酸、堿金屬或堿土金屬等反應(yīng)生成的鹽?；衔锞哂幸粋€或多個不對稱中心。所以，這些化合物可以作為外消旋的混合物、單獨的對映異構(gòu)體、單獨的非對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體混合物、順式或反式異構(gòu)體存在。所述的“前體”指當(dāng)用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ煤?，該化合物的前體在病人體內(nèi)進(jìn)行代謝或化學(xué)反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成該化合物，或由該化合物所組成的鹽或溶液。作為本發(fā)明的另一種可選方式，所述的AOX抑制劑可以是一種特異性與AOX結(jié)合的抗體。所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。可用AOX蛋白免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等來生產(chǎn)多克隆抗體；多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。與之相似的，表達(dá)AOX或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體，此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。作為本發(fā)明的另一種可選方式，所述的AOX抑制劑可以是一種AOX特異性的小干擾RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)”是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾(RNAinterference)過程。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈RNA復(fù)合物。本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量的所述AOX抑制劑或AOX抑制劑前體，以及藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的組合物可用于通過抑制AOX活性，提高靶器官或組織線粒體代謝機(jī)能，改善機(jī)體胰島素抵抗，治療包括糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪肝病、高甘油三酯血癥、神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默癥和帕金森癥等、衰老等在內(nèi)的一切因線粒體代謝功能障礙引起的疾病的藥物。如本文所用，“藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和哺乳動物而無不良副作用(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥或用于保健品服用的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。如本文所用，術(shù)語“組合物”包括(但不限于)：藥物組合物、飲食補(bǔ)充劑、保健品組合物，只要它們含有本發(fā)明的AOX抑制劑或AOX抑制劑前體，作為預(yù)防、改善或治療哺乳動物和人線粒體代謝功能障礙相關(guān)疾病的活性成分。本發(fā)明中，術(shù)語“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。本發(fā)明的組合物中藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體，包括(但并不限于)：橄欖油、鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。藥物組合物宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本發(fā)明所述的組合物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有效地到達(dá)哺乳動物或人體內(nèi)的劑型都是可以的。比如可選自：片劑、膠囊、粉末、顆粒、糖漿、溶液、懸浮液、或氣霧劑。在需要的情況下，本發(fā)明的藥物組合物還可以與其它一種或多種對于代謝綜合征有效的物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用。例如，所述的組合物中還可含有選自以下的一種或多種的藥物：其它種類的抗糖尿病藥物、降脂藥物、減肥藥物、抗高血壓藥物、或抗凝血藥物。當(dāng)兩種或兩種以上的藥物聯(lián)合給藥時，一般具有優(yōu)于單獨給藥的效果。例如，其它種類的抗糖尿病藥物選自：雙胍類、磺酰脲類、格列奈類降糖藥物，α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑(如噻唑烷二酮類藥物)、aP2抑制劑、DPPIV抑制劑、SGLT2抑制劑、胰島素、胰高血糖樣肽-1(GLP-1)、或它們的類似物。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于這里描述的具體方法，包括采用的試驗方案，分析測試方法和試劑等，這些都是可以變化的。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、AOX抑制劑的制備及體外抑制實驗(1)AOX抑制劑LH-919-CoA的制備LH-919-CoA的制備方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行(LiD.et.al.，J.Am.Chem.Soc.，2001，121，9034-9042)。具體操作：LH-91920mg(Sigma，St.Louis，MO)，加入5mL無水四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)(Acros，Geel，Belgium)中，在氮氣保護(hù)下向溶液中添加0.1mmol三乙胺(triethylamine)(Sigma，St.Louis，MO)，混合攪拌10分鐘后，在0℃下向溶液中逐滴加入0.1mmol氯甲酸異丁酯(isobutylchloroformate)(Acros，Geel，Belgium)，室溫攪拌1h。后將50mg輔酶A鈉鹽(CoenzymeA)(USB，Cleveland，OH)溶于蒸餾水中，加1mol/LNaOH調(diào)pH至8.0，在氮氣保護(hù)下滴加到反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌20分鐘后，緩慢滴加1M鹽酸，將溶液pH調(diào)至5.5～6.0。在負(fù)壓下使有機(jī)溶劑揮發(fā)掉，剩下的水溶液用乙醚萃取兩次去除殘留的有機(jī)溶劑，收集下層水相，經(jīng)離心超濾管(Millipore，Billerica，MA)過濾后通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化LH-919-CoA。RP-HPLC分離條件：色譜柱hypersilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，采用梯度洗脫，流動相A為25mM磷酸鉀緩沖液(pH5.9)，流動相B為85％(v/v)甲醇水溶液，洗脫程序流動相B占流動相總體積比為：0-5min0％B，5-24min0％-100％B，24-35min100％B，流速：0.8mL.min-1，檢測波長260nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量：100μL。LH-919-CoA出峰時間約在27min，收集LH-919-CoA組分，然后經(jīng)真空冷凍干燥除去溶劑，得到LH-919-CoA凍干粉末。(2)表達(dá)純化重組AOX本發(fā)明采用重組大鼠肝AOX作為靶蛋白篩選其抑制劑，應(yīng)當(dāng)理解，重組AOX與天然AOX具有相同的生理活性。大鼠肝AOX在E.coli中的重組表達(dá)及親和純化參照文獻(xiàn)方法實施(ZengJ.et.al.，ProteinExpressionandPurification.2004，37，472-478)，高度純化后的AOX酶活性為1.89U/mg，蛋白純度＞95％。(3)LH-919-CoA對純化的重組大鼠肝AOX體外抑制作用分析將上述高度純化的重組大鼠肝AOX溶于20mMPBS緩沖液中(pH7.4)，濃度80nM，再向酶溶液中分別加入不同濃度LH-919-CoA(抑制劑組)，對照組加相同體積蒸餾水，于25℃下分別孵育不同時間后，測定抑制劑組和對照組脂酰輔酶A氧化酶殘余活性。脂酰輔酶A氧化酶活性測定方法根據(jù)文獻(xiàn)(LuoY.etal.，Arch.Biochem.Biophys.，2000，384，1-8)，通過ShimadzuUV-1800紫外/可見分光光度儀測定263nm吸光度變化，即2-烯脂酰輔酶A產(chǎn)物的生成(ε263nm＝6.7mM-1cm-1)，來測定AOX活性。反應(yīng)體系包含50mmol/LPBS緩沖液，pH7.4，30μMpalmitoyl-CoA(Sigma，St.Louis，MO)，及500ngAOX，總體積500μL。結(jié)果見圖2，LH-919-CoA能快速抑制AOX活性，且抑制作用隨LH-919-CoA濃度增加而增強(qiáng)。游離LH-919酸對AOX沒有抑制作用，LH-919游離酸必須活化為脂酰輔酶A即底物形式后才能抑制AOX活性。LH-919-CoA對AOX的抑制作用是不可逆的，實驗步驟如下：AOX溶于20mMPBS緩沖液中，pH7.4，終濃度100nM，再向酶溶液中加入2μMLH-919-CoA，于25℃下孵育60min，以保證酶與抑制劑充分作用，然后將AOX與抑制劑混合物裝入透析袋中(MWCO5000)，再放入2L20mMPBS緩沖液中(pH7.4)，于4℃對緩沖液透析24h，期間每隔4小時更換一次透析液，以充分除去游離LH-919-CoA。對照組將100nMAOX加相應(yīng)體積蒸餾水，其余操作與抑制劑組相同。透析后將抑制劑組和對照組分別測定AOX酶活性，結(jié)果如表1所示，抑制劑組通過透析除去游離LH-919-CoA后，其AOX活性不能恢復(fù)，對照組酶活性沒有顯著變化，因此，LH-919-CoA對AOX的抑制作用是不可逆的。表1、LH-919-CoA抑制AOX透析前后活性比較注：相對活性表示各組測定的活性值與透析前對照組活性的百分比值。由于LH-919-CoA對AOX的抑制作用是不可逆的，因此采用KI和kinact來表征抑制動力學(xué)，參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行(LiD.et.al.，J.Am.Chem.Soc.，2001，119，111-133)。實驗步驟如下：50nMAOX溶于20mMPBS緩沖液中，pH7.4，再向酶溶液分別加入0.5μM，1μM，3μM，5μM，10μM，15μMZ-919-CoA，于25℃下孵育0min，5min，10min，15min和20min后，分別測定各劑量組AOX活性，在各LH-919-CoA濃度下，以相對殘余活性取對數(shù)對孵育時間作圖，采用Sigmaplot12.0軟件進(jìn)行線性擬合，計算得到各抑制劑濃度下表觀抑制速率kobs，將各濃度下kobs對抑制劑濃度雙倒數(shù)作圖，如圖3所示，計算LH-919-CoA對AOX酶抑制動力學(xué)參數(shù)KI值為810nM，kinact值為3.08min-1。(4)LH-919-CoA對大鼠肝臟過氧化物酶體AOX體外抑制作用分析大鼠肝臟過氧化物酶體分離參照文獻(xiàn)實施(SmallGL.et.al.，Biochem.J.，1985，227，205-210)。操作步驟如下：準(zhǔn)確稱取大鼠新鮮肝臟組織0.5g，于冰浴上剪碎，懸浮于9倍體積勻漿緩沖液中(10％(w/v)蔗糖，3mM咪唑，20mMPBS緩沖液，pH7.4)，冰浴上電動勻漿后，4℃下5000×g離心10分鐘，吸取上清。下層沉淀再懸浮于少量勻漿緩沖液中再5000×g離心10分鐘，合并上清液于35000×g離心30分鐘，下層沉淀即為過氧化物酶體。取200μg過氧化物酶體(以蛋白計)懸浮于20mMPBS緩沖液中(pH7.4)，再向溶液中加入5μMLH-919-CoA(抑制劑組)，對照組加相應(yīng)體積蒸餾水，于25℃下孵育0min，2min，5min，10min和20min后，分別測定抑制劑組和對照組AOX活性。過氧化物酶體AOX活性參照文獻(xiàn)測定(JohnsonJK.et.al.，Biochemstry，1992，31，10564-10575；LuoY.etal.，Arch.Biochem.Biophys.，2000，384，1-8)，采用分光光度法，測定AOX催化底物3-indolepropionyl-CoA(IP-CoA)氧化所生成的trans-3-indoleacryloyl-CoA(IA-CoA)量來反映AOX活性，IA-CoA的消光系數(shù)ε367nm為26.5mM-1cm-1。反應(yīng)液含50mmol/LPBS緩沖液，pH7.4，30μmol/LIP-CoA(純度＞95％)，30μmol/LFAD(Sigma，St.Louis，MO)，0.5g/LBSA(SangonBiotech.，Shanghai)，0.02％TritonX-100(SangonBiotech.，Shanghai)，以及200μg過氧化物酶體(以蛋白計)。采用ShimadzuUV-1800紫外/可見光譜儀，測定367nm吸光值變化，分析條件下，每分鐘生成1μmolIA-CoA所需的過氧化物酶體蛋白量為1個酶活性單位(U)。結(jié)果如圖4所示，以大鼠過氧化物酶體為測活對象，LH-919-CoA能快速抑制大鼠過氧化物酶體AOX活性。另一實驗，取200μg過氧化物酶體(以蛋白計)懸浮于20mMPBS緩沖液中(pH7.4)，向溶液中分別加入不同濃度LH-919-CoA(抑制劑組)，對照組加相應(yīng)體積蒸餾水，于25℃下孵育2min后，分別測定抑制劑各組和對照組AOX活性，結(jié)果如圖5所示，LH-919-CoA體外抑制過氧化物酶體AOX活性與所加入抑制劑量呈正相關(guān)關(guān)系。實施例2、AOX抑制劑前體抑制大/小鼠體內(nèi)AOX作用分析(1)LH-919在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為LH-919-CoA的實驗測定SPF級Wistar大鼠6只，雄性，體重220-250g，禁食12h后，6只大鼠分為2組，對照組和藥物組，每組3只，對照組給予橄欖油灌胃0.2mL/只，藥物組將LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，灌胃LH-919100μg/kg，于3h后將全部大鼠處死，迅速解剖摘取肝臟，立即放入液氮中保存。肝臟細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞單元內(nèi)含物脂酰輔酶A的測定參考文獻(xiàn)實施(MeldeK.et.al.，Biochem.J.，1991，274，395-400)。操作步驟如下：準(zhǔn)確稱取肝臟組織0.3g，于冰浴上剪碎，懸浮于9倍體積勻漿緩沖液中(10％蔗糖，3mM咪唑，20mMPBS)冰浴上電動勻漿后，4℃5000×g離心10分鐘，吸取上清。下層再懸浮于少量勻漿緩沖液中再5000×g離心10分鐘，合并上清液于30000×g離心30分鐘，得到的沉淀即為過氧化物酶體。將過氧化物酶體首先懸浮于2mL超純水中(4℃)，然后加入200μL5mMHClO4沉淀蛋白質(zhì)，以及20nMLignoceryl-CoA(C24：0)作為參照樣，蛋白質(zhì)沉淀于16000×g離心分離，上清液用K2CO3調(diào)節(jié)pH至7.0，離心去除KClO4沉淀，上清液經(jīng)冷凍干燥去除溶劑，剩余固體物溶于200μL超純水中，通過RP-HPLC檢測對照組和藥物組各樣品LH-919-CoA含量，最后通過質(zhì)譜(MS)確認(rèn)。RP-HPLC操作條件，色譜柱hypersilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相A為25mM磷酸鉀緩沖液(pH5.9)，流動相B為85％甲醇水溶液，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序流動相B占流動相總體積比為：0-5min0％B，5-24min0％-100％B，24-35min100％B，流速：0.8mL·min-1，檢測波長260nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：25μL。結(jié)果顯示，藥物組各樣本肝臟過氧化物酶體中均檢測到LH-919-CoA，對照組肝臟過氧化物酶體中沒有檢測到LH-919-CoA。因此，LH-919經(jīng)體內(nèi)吸收進(jìn)入肝臟后，轉(zhuǎn)化為LH-919-CoA，進(jìn)入過氧化物酶體，作為底物與AOX相互作用。(2)AOX抑制劑前體對C57BL小鼠體內(nèi)肝臟AOX抑制作用分析SPF級C57BL小鼠16只，雄雌各8只，體重20-25g，小鼠禁食12h后，16只小鼠分為2組，對照組和藥物組，每組8只，雄雌各半。對照組給予橄欖油灌胃0.2mL/只；藥物組將LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，灌胃LH-91920-80μg/kg。于灌胃3h后將全部小鼠處死，迅速解剖摘取肝臟，立即放入液氮中保存。準(zhǔn)確稱取肝臟0.3g，勻漿分離得到過氧化物酶體后，分別測定對照組和藥物組各樣品AOX活性。數(shù)據(jù)以X±SEM表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組之間差異性比較采用獨立樣本t檢驗。與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。結(jié)果如圖6所示，藥物組其肝臟組織內(nèi)AOX酶活性較對照組顯著降低，表明AOX抑制劑前體LH-919在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為LH-919-CoA，能顯著抑制C57BL小鼠肝臟AOX酶活性，與體外實驗結(jié)果一致。AOX抑制劑前體LH-919在C57BL小鼠體內(nèi)抑制肝臟AOX酶活性具有良好的劑量依賴性。(3)AOX抑制劑前體對Wistar大鼠體內(nèi)肝臟AOX抑制作用分析SPF級Wistar大鼠12只，雄雌各6只，體重220-250g，大鼠禁食5h后，分為2組，對照組和藥物組，每組6只，雄雌各半。對照組給予橄欖油灌胃0.2mL/只；藥物組將LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，灌胃LH-91910-80μg/kg，于3h后將全部大鼠處死，迅速解剖摘取肝臟，立即放入液氮中保存。準(zhǔn)確稱取肝臟0.3g，勻漿分離得到過氧化物酶體后，分別測定對照組和藥物組各樣品AOX酶活性。數(shù)據(jù)以X±SEM表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組之間差異性比較采用獨立樣本t檢驗。與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。結(jié)果如圖7所示，藥物組其肝臟組織內(nèi)AOX酶活性較對照組顯著降低，表明AOX抑制劑前體LH-919在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為LH-919-CoA，能顯著抑制肝臟AOX活性，與體外實驗結(jié)果一致。AOX抑制劑前體LH-919抑制大鼠肝臟AOX酶活性具有良好的劑量依賴性。實施例3、通過抑制體內(nèi)AOX活性，活化肝臟和骨骼肌AMPK，提高肝臟和骨骼肌線粒體代謝機(jī)能(1)AOX抑制劑前體提高Wistar大鼠肝臟和骨骼肌線粒體代謝機(jī)能實驗SPF級Wistar大鼠16只，雄性，體重260-280g，分為2組，對照組和AOX抑制劑組，每組8只。對照組給予橄欖油灌胃0.2mL/只；AOX抑制劑組將LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，灌胃LH-91950μg/kg，灌胃1次/天，連續(xù)灌胃21天。期間每7天測定大鼠體重。于灌胃后第22天5：00am禁食，3h后從大鼠尾靜脈采血測空腹血糖，血糖測定采用血糖儀及配套試紙測定(OneTouchUltraVue，JohnsonandJohnson，NJ.，USA)。后摘眼球取血，分離血清。胰島素ELISA試劑盒(Millipore，Billerica，MA.，USA)測定血清胰島素，血清甘油三酯含量采用甘油三酯檢測試劑盒測定(北京北化康泰臨床診斷有限公司，北京)，血清β-hydroxybutyrate含量采用試劑盒測定(Sigma，St.Louis，MO，USA)。隨后處死所有大鼠，摘取肝臟，稱量肝臟濕重。從肝右葉固定部位切取另1塊肝組織制備肝勻漿，試劑盒測定肝臟甘油三酯含量。肝組織細(xì)胞脂肪酸氧化活性，參照文獻(xiàn)報道方法進(jìn)行測定(ZhangD.，etal.，CellMetab.，2010，11，402-411)。肝組織細(xì)胞過氧化物酶體脂肪酸氧化速率測定參照文獻(xiàn)報道方法實施(OsmundsenH.，etal.，BiochemJ.，1989，260，215-220)。肝細(xì)胞蛋白通過CelLytic組織細(xì)胞裂解抽提試劑提取(Sigma，St.Louis.MO.USA)，分別測定抽提液AOX活性，檸檬酸合成酶(citratesynthase)和細(xì)胞色素c氧化酶(cytochromecoxidase)活性。檸檬酸合成酶活性測定參照Lopez-Lluchetal.報道方法實施(Lopez-LluchG.，etal.，PNAS，2006，103，1768-1773)。細(xì)胞色素c氧化酶活性參照Zidetal.報道方法實施(ZidBM.etal.，Cell，139，149-160)。大鼠骨骼肌線粒體DNA拷貝數(shù)(mtDNAcopynumber)通過RT-PCR測定，參照文獻(xiàn)報道方法實施(HeL.，etal.，NucleicAcidsRes.，2002，30，e68)。Westernblot檢測大鼠肝臟或骨骼肌AMPK、ACC和p70S6K磷酸化水平。取液氮凍存的肝臟或骨骼肌組織100mg，剪碎，加入RIPA組織細(xì)胞裂解液勻漿，同時分別加入蛋白酶抑制劑(cOmpleteProteaseInhibitorCocktail)和磷酸酶抑制劑(PhosSTOP)(Roche，Mannheim，Germany)，Bio-RadDCproteinassaykit測定蛋白質(zhì)濃度(Bio-Rad，Hercules，CA.，USA)。SDS-PAGE分離蛋白后，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5％BSA室溫封閉2h。分別加入AMPKα、磷酸化AMPKα(Thr172)、磷酸化ACC(Ser79)、p70S6K和磷酸化p70S6K(Thr389)一抗(CellSignaling，Danvers，MA.，USA)，以β-actin(Sigma，St.Louis，MO，USA)作為內(nèi)參。4℃振蕩過夜，洗膜后加第二抗體常溫振蕩孵浴1h，ECL顯影，凝膠影像分析儀測定蛋白條帶灰度。AMPK磷酸化水平(p-AMPK)以磷酸化AMPK(Thr172)/AMPK條帶灰度比值表示，ACC磷酸化水平(p-ACC)以磷酸化ACC(Ser79)/β-actin條帶灰度比值表示，p70S6K磷酸化水平(p-p70S6K)以磷酸化p70S6K(Thr389)/p70S6K條帶灰度比值表示，p70S6K蛋白表達(dá)水平以p70S6K/β-actin條帶灰度比值表示。熒光實時定量PCR(real-timePCR)檢測肝臟PGC-1α，PEX1基因表達(dá)水平。大鼠肝臟和骨骼肌總RNA通過RNeasy試劑盒提取(Qiagen，Valenca，CA.，USA)。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈(Strategene，LaJolla，CA.，USA)。使用SYBRGreen熒光染料進(jìn)行熒光實時定量PCR(7500FastReal-timePCRSystem，AppliedBiosystems)。反應(yīng)體系為cDNA80ng，上游引物200nM，下游引物200nM，2×SYBRGreenSupermix10μL，加純水至終濃度20μL.。PEX1上游引物5’-GTGTTCCCATGTGGTCTCAT-3’，下游引物5’-ATGTGCTCTCTTTGGCTTGG-3’；PGC-1α上游引物5’-CAGCAAAAGCCACAAAGACG-3’，下游引物5’-AGTTCCAGAGAGTTCCACAC-3’。以18SrRNA作為內(nèi)參。通過Ct值來測定RNA的表達(dá)量，每個基因測定通過5個樣本，每個樣本重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以X±SEM表示，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組之間差異性比較采用t檢驗，與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。經(jīng)過21天AOX抑制劑干預(yù)后，抑制劑組大鼠體重增重量較對照組顯著減少，表明AOX抑制劑治療具有減輕體重的效果。血糖和血清胰島素含量較對照組顯著下降，AOX抑制劑組血清甘油三酯和肝臟甘油三酯含量也較對照組顯著下降，如表2所示。表2各組大鼠的代謝相關(guān)參數(shù)正常組AOX抑制劑組初始體重(g)272.7±2.6270.6±2.1日進(jìn)食量(g/d)23.2±0.123.0±0.1體重增加(g)81.9±3.367.4±3.6*空腹血糖(mmol/L)7.0±0.26.4±0.1*血清甘油三酯(mmol/L)1.12±0.110.77±0.04*血清胰島素(ng/mL)0.82±0.070.51±0.02*血清β-hydroxybutyrate(mmol/L)0.12±0.010.21±0.02*肝濕重(g)11.8±0.311.0±0.3肝臟甘油三酯(μmol/g肝)8.76±0.556.34±0.49**抑制劑組血清β-hydroxybutyrate含量較對照組顯著升高(表2)，表明抑制劑組肝臟脂肪酸氧化水平較對照組顯著增加，AOX抑制劑能提高體內(nèi)肝臟脂肪酸代謝水平。進(jìn)一步通過測定大鼠肝臟脂肪酸氧化速率，結(jié)果AOX抑制劑組肝臟脂肪酸氧化速率較對照組顯著升高，如圖8所示。同時，大鼠肝臟AOX活性較對照組顯著降低(圖9)，肝臟過氧化物酶體脂肪酸氧化也顯著降低(圖10)，這些結(jié)果表明，大鼠肝臟脂肪酸氧化活性的提高是通過提高線粒體脂肪酸氧化水平實現(xiàn)的。因此，通過抑制AOX活性，能促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化，提高大鼠肝臟脂肪酸氧化水平。此外，AOX抑制劑組骨骼肌細(xì)胞色素c氧化酶活性較對照組顯著增加，如圖11所示，表明通過抑制體內(nèi)AOX活性，能顯著提高靶器官或組織細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化磷酸化水平。通過對表征線粒體數(shù)量的特征指標(biāo)citratesynthase活性和線粒體DNA拷貝數(shù)測定，結(jié)果表明，AOX抑制劑組肝臟和骨骼肌citratesynthase活性顯著高于對照組(圖12)，抑制劑組骨骼肌線粒體DNA拷貝數(shù)也顯著高于對照組(圖13)。熒光實時定量PCR分析結(jié)果表明，AOX抑制劑組大鼠骨骼肌PGC-1α基因表達(dá)水平顯著高于對照組(圖14)，這些結(jié)果表明，AOX抑制劑治療可以增加PGC-1α基因表達(dá)，促進(jìn)線粒體再生，顯著提高大鼠肝臟和骨骼肌線粒體數(shù)量。通過Westernblot分析，AOX抑制劑組大鼠肝臟和骨骼肌AMPK(Thr172)磷酸化水平和ACC(Ser79)磷酸化水平均顯著高于對照組，如圖15-18所示，因此通過抑制AOX活性，能活化AMPK，抑制ACC活性，促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化。Westernblot分析結(jié)果還顯示，AOX抑制劑組大鼠骨骼肌p70S6K蛋白的表達(dá)水平顯著低于對照組，抑制劑組p70S6K(Thr389)磷酸化水平也顯著低于對照組，如圖19所示。這些結(jié)果表明，通過抑制體內(nèi)靶器官或組織AOX活性，活化AMPK，能抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活性，進(jìn)而降低核糖體S6蛋白激酶(Thr389)磷酸化水平，同時核糖體S6蛋白激酶的表達(dá)水平也顯著下調(diào)，從而降低核糖體S6蛋白激酶活性，延緩細(xì)胞衰老。大鼠骨骼肌參與過氧化物酶體生成的基因PEX1的表達(dá)水平顯著低于對照組(圖20)，因此通過抑制體內(nèi)AOX活性，能抑制過氧化物酶體增殖。上述結(jié)果表明，經(jīng)AOX抑制劑前體干預(yù)后，通過抑制體內(nèi)AOX活性，降低肝臟過氧化物酶體脂肪酸氧化，同時促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化，促進(jìn)線粒體生物再生，顯著提高線粒體代謝機(jī)能。因此AOX抑制劑或AOX抑制劑前體是線粒體代謝機(jī)能促進(jìn)劑。此外，AOX抑制劑或AOX抑制劑前體還可作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白或核糖體S6蛋白激酶活性抑制劑。(2)AOX抑制劑抑制CPIB藥物大鼠肝臟過氧化物酶體增殖，提高線粒體代謝機(jī)能實驗SPF級Wistar大鼠24只，體重200-220g，分為3組，正常對照組，CPIB對照組和CPIB藥物組，每組8只。正常對照組給予橄欖油灌胃0.2mL/只；CPIB對照組將CPIB溶于相應(yīng)體積橄欖油中，給予大鼠灌胃CPIB(TCI，Tokyo，Japan)100mg/kg/d；AOX抑制劑組在給予CPIB灌胃100mg/kg/d同時，給予LH-919灌胃500μg/kg/d，灌胃1次/天，連續(xù)灌胃12天。于灌胃后第13天6：00am禁食，3h后從大鼠尾靜脈采血測空腹血糖，血糖測定采用血糖儀及配套試紙測定。后摘眼球取血，分離血清，分別測定血清β-hydroxybutyrate(Sigma，StLouis，MO，USA)和血清甘油三酯含量(北京北化康泰臨床診斷有限公司，北京)。隨后處死所有大鼠，摘取肝臟，稱量肝臟濕重。從肝右葉固定部位切取另1塊肝組織制備肝勻漿，試劑盒測定肝臟甘油三酯含量。肝組織蛋白采用CelLytic組織細(xì)胞裂解抽提試劑提取(Sigma，St.Louis.MO.USA)，分別測定AOX活性，檸檬酸合成酶和細(xì)胞色素c氧化酶活性。Westernblot法檢測肝臟AMPK(Thr172)磷酸化和ACC(Ser79)磷酸化水平，實施方法與前述相同。熒光實時定量PCR檢測大鼠肝臟PGC-1α，PEX1基因表達(dá)水平，實施方法與前述相同。數(shù)據(jù)以X±SEM表示，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組之間差異性比較采用t檢驗。CPIB大鼠抑制劑組與CPIB大鼠對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。表3各組大鼠的代謝相關(guān)參數(shù)經(jīng)過12天AOX抑制劑干預(yù)后，CPIB抑制劑組大鼠血糖和血清胰島素含量較CPIB對照組顯著下降，抑制劑組血清甘油三酯和肝臟甘油三酯含量也顯著下降(表3)。CPIB藥物組血清β-hydroxybutyrate含量較對照組顯著升高(表3)，表明藥物組肝臟脂肪酸氧化水平較對照組顯著增加，AOX抑制劑干預(yù)能提高肝臟脂肪酸代謝水平。同時，肝臟AOX活性較對照組顯著降低(圖21)，這些結(jié)果表明，大鼠肝臟脂肪酸氧化活性的提高是通過提高線粒體脂肪酸氧化水平實現(xiàn)的。因此，通過抑制AOX活性，過氧化物酶體脂肪酸氧化水平下降，同時，能促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化，提高肝臟整體脂肪酸氧化水平。此外，CPIB抑制劑組大鼠骨骼肌細(xì)胞色素c氧化酶活性較對照組顯著增加，如圖22所示，表明通過抑制體內(nèi)AOX活性，能顯著提高靶器官或組織細(xì)胞線粒體氧化磷酸化水平。通過對表征線粒體數(shù)量的特征指標(biāo)citratesynthase活性和線粒體DNA拷貝數(shù)測定，結(jié)果表明，CPIB抑制劑組肝臟和骨骼肌citratesynthase活性顯著高于對照組(圖23，24)，抑制劑組肝臟線粒體DNA拷貝數(shù)也顯著高于對照組(圖25)。這些結(jié)果表明，AOX抑制劑干預(yù)能顯著提高大鼠肝臟和骨骼肌線粒體數(shù)量。通過Westernblot分析，AOX抑制劑組肝臟AMPK(Thr172)磷酸化水平和ACC(Ser79)磷酸化水平顯著高于對照組，如圖26，27所示，因此通過抑制AOX活性，能活化靶器官如肝臟或骨骼肌AMPK，并抑制ACC活性，促進(jìn)靶器官線粒體脂肪酸氧化。通過對CPIB抑制劑組和CPIB對照組肝臟RT-PCR分析，AOX抑制劑組肝臟PGC-1α基因表達(dá)水平顯著高于對照組(圖28)，因此，通過抑制AOX活性，活化肝臟和骨骼肌AMPK，能顯著提高PGC-1α基因表達(dá)水平，促進(jìn)肝臟和骨骼肌線粒體生成。通過對CPIB抑制劑組和CPIB對照組肝臟RT-PCR分析，參與過氧化物酶體生成的基因PEX1的表達(dá)水平顯著低于對照組(圖29)。因此通過抑制AOX活性，能抑制過氧化物酶體生成。上述結(jié)果表明，經(jīng)AOX抑制劑前體干預(yù)后，通過抑制體內(nèi)AOX活性，降低肝臟過氧化物酶體脂肪酸氧化，同時活化肝臟和骨骼肌AMPK，促進(jìn)線粒體脂肪酸氧化，促進(jìn)線粒體生物再生，顯著提高線粒體代謝機(jī)能。因此AOX抑制劑或AOX抑制劑前體是線粒體代謝機(jī)能促進(jìn)劑。實施例4、AOX抑制劑前體對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠降體重、降血脂、降肝脂實驗SPF級Wistar大鼠24只，雄性，體重220-250g，按體重平均分為3組，即正常對照組，高脂飲食(Highfatdiet，HFD)對照組和高脂飲食藥物組，每組8只。正常對照組予以普通大鼠飼料喂養(yǎng)(脂肪熱卡比例為12％)，高脂飲食組予以高脂飼料喂養(yǎng)(脂肪熱卡比例為58％)。正常對照組和高脂飲食對照組給予橄欖油灌胃0.2mL/只；高脂飲食抑制劑組將AOX抑制劑前體LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，給予LH-919灌胃40μg/kg，灌胃1次/天，連續(xù)灌藥8周，期間每2周稱量各組大鼠體重。第57天禁食3h，尾靜脈取血，血糖儀測定各組空腹血糖。后摘眼球取血，分離血清。胰島素ELISA試劑盒(Millipore，Billerica，MA.，USA)測定血清胰島素。試劑盒測定血清甘油三酯含量。隨后處死所有大鼠，摘取肝臟并稱重，迅速從肝右葉固定部位切取1塊肝組織，迅速以甲醛固定，制備成石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察肝臟脂肪病變情況，每組取4份肝臟樣本進(jìn)行分析。另從肝右葉固定部位切取另1塊肝組織制備肝勻漿，試劑盒測定肝臟甘油三酯含量。數(shù)據(jù)以X±SEM表示，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組之間差異性比較采用t檢驗。各組樣本數(shù)n＝8。高脂飲食藥物組與高脂飲食對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。經(jīng)過8周LH-919干預(yù)后，高脂飲食抑制劑組血糖和血清胰島素含量較高脂飲食對照組顯著下降(表4)，胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR較對照組顯著降低。高脂抑制劑組血清甘油三酯含量較對照組顯著下降，如表4所示。表4.各組大鼠的代謝相關(guān)參數(shù)普食對照組高脂對照組高脂抑制劑組初始體重(g)234.6±2.7238.7±3.3235.9±3.1日進(jìn)食量(g/d/rat)23.5±0.225.1±0.524.7±0.3空腹血糖(mmol/L)6.5±0.27.4±0.36.6±0.1*血清胰島素(ng/mL)1.28±0.1311.66±0.314.65±0.19**血清甘油三酯(mmol/L)1.02±0.081.91±O.131.43±0.10*肝重指數(shù)(g肝/100g體重)3.12±0.064.33±0.093.52±0.08**肝臟甘油三酯(μmol/g肝)8.63±0.4044.13±2.5226.29±1.94**非酒精性脂肪肝病以肝臟甘油三酯的大量沉積為最主要病理標(biāo)志。實施例中高脂飲食抑制劑組肝臟肝重系數(shù)和甘油三酯含量均較高脂飲食對照組顯著降低，如表4所示。光學(xué)顯微鏡觀察肝臟切片，結(jié)果表明，高脂飲食抑制劑組肝臟脂肪滴分布量顯著低于對照組，而高脂飲食對照組脂肪沉積以大泡性脂肪滴為主，而抑制劑組肝臟脂肪沉積以小泡性脂肪滴為主，如圖30所示，因此，經(jīng)AOX抑制劑治療能顯著減少高脂飲食引起的肝臟甘油三酯沉積。經(jīng)過AOX抑制劑前體LH-919治療后，高脂飲食藥物組大鼠體重增加較高脂飲食對照組顯著下降(表5)，說明AOX抑制劑具有減輕體重的作用，能預(yù)防和治療高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。表5各組大鼠的體重增加隨時間的變化上述結(jié)果表明，AOX抑制劑前體治療可以減輕高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠體內(nèi)胰島素抵抗，促進(jìn)體內(nèi)脂肪酸代謝，從而減輕體重，降低血清甘油三酯，減少肝臟甘油三酯含量。因此，AOX抑制劑或AOX抑制劑前體作為線粒體代謝機(jī)能促進(jìn)劑，通過促進(jìn)肝臟和肌肉脂肪酸代謝，改善體內(nèi)胰島素抵抗，可以治療肥胖癥和高甘油三酯血癥，以及的非酒精性脂肪肝病。實施例5、AOX抑制劑前體對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠降血糖，降血脂實驗SPF級Wistar大鼠50只，體重180-200g，喂以普通大鼠飼料，自由進(jìn)水進(jìn)食。大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)一周后，20只大鼠作為正常組，其余30只大鼠造模。30只大鼠禁食18h后腹腔注射四氧嘧啶(Sigma，St.Louis，MO)200mg/kg，48h后，每只大鼠皮下注射地特長效胰島素(Determir，NovoNordisk，Denmark)4-6U/只，連續(xù)7d，給藥時間16：00-16：30，以維持其基本的生理功能，防止酮癥酸中毒。第8天晨5：00am禁食，3h后從大鼠尾靜脈采血測空腹血糖，血糖測定采用血糖儀(OneTouchUltraVue，JohnsonandJohnson，NewBrunswick，NJ)及配套試紙測定，下同。給四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠皮下注射長效胰島素連續(xù)7d后，空腹血糖升高到22-25mmol/L，血糖趨于穩(wěn)定，胰島素抵抗已形成，共24只成模。成模后糖尿病大鼠按血糖水平均勻分成3組，每組8只：糖尿病大鼠對照組，給予橄欖油灌胃0.2mL/只/天；糖尿病大鼠低劑量AOX抑制劑前體治療組，將LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，給予LH-919灌胃10μg/kg/d；糖尿病大鼠高劑量AOX抑制劑前體治療組，將LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，給予LH-919灌胃20μg/kg/d。另外設(shè)正常大鼠對照組8只，給予橄欖油灌胃0.2ml/只/天；正常大鼠藥物組8只，將LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，給予LH-919灌胃20μg/kg/d。糖尿病大鼠模型組和治療組給藥同時組繼續(xù)皮下注射長效胰島素，連續(xù)13天。期間分別于d4，d8，d125：00am禁食，3h后尾靜脈采血測定空腹血糖。d11行OGTT實驗，5：00am禁食，3h后尾靜脈采血測定空腹血糖，作為基礎(chǔ)對照(0min)，然后糖尿病大鼠各組動物給予葡萄糖2.5g/kg灌胃，分別在此之后30min，60min，和120min尾靜脈采血測定各組血糖，繪制0-120min的血糖-時間曲線，并計算血糖曲線下面積AUC0-120min。藥物治療后第13天5：00am禁食，3h后摘眼球取血，分離血清。測定血清甘油三酯含量，采用甘油三酯檢測試劑盒測定(北京北化康泰臨床診斷有限公司，北京)，血清游離脂肪酸含量采用游離脂肪酸檢測試劑盒測定(南京建成生物工程研究所，南京)。分離肝細(xì)胞過氧化物酶體，測定各組肝細(xì)胞AOX活性，以IP-CoA為底物測定。各組肝細(xì)胞內(nèi)H2O2含量采用H2O2檢測試劑盒測定(BeyotimeBiotech.，Haimen)。血清和肝臟脂質(zhì)過氧化物含量采用微量丙二醛(MDA)檢測試劑盒測定(南京建成生物工程研究所，南京)。數(shù)據(jù)以X±SEM表示，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組之間差異性比較采用獨立樣本t檢驗。與正常大鼠對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。與糖尿病大鼠模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。糖尿病大鼠在給予AOX抑制劑前體LH-919治療4天后，血糖較給藥前顯著下降，下降水平一直維持穩(wěn)定。血糖下降水平與給藥劑量呈正相關(guān)關(guān)系，如表6所示。OGTT實驗結(jié)果表明，AOX抑制劑前體LH-919能顯著改善四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠的口服糖耐受，見圖31A，與模型對照組比較，LH-919高、低劑量組的AUC0-120min面積均顯著下降(p＜0.01)，且AUC0-120min面積下降程度與給藥劑量呈正相關(guān)關(guān)系，如圖31B所示。表6、AOX抑制劑前體LH-919對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠降血糖作用各組之間差異性比較采用獨立樣本t檢驗。與糖尿病大鼠對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。經(jīng)過12天治療后，糖尿病大鼠血清甘油三酯(圖32)和游離脂肪酸(圖33)含量顯著下降。測定肝細(xì)胞過氧化物酶體AOX活性，結(jié)果如圖34所示，糖尿病大鼠對照組肝臟AOX活性較正常組顯著上升，經(jīng)AOX抑制劑前體治療后，治療組肝細(xì)胞AOX活性較對照組顯著降低。同時血清MDA含量顯著下降(圖35)，肝細(xì)胞內(nèi)H2O2含量較對照組顯著下降(圖36)。通過測定各組大鼠肝臟甘油三酯含量，結(jié)果糖尿病大鼠治療組肝臟甘油三酯含量較對照組顯著降低，如圖37所示。糖尿病大鼠治療組肝臟MDA含量較對照組也顯著下降，如圖38所示。上述結(jié)果表明，通過AOX抑制劑前體治療，提高糖尿病大鼠肝臟和肌肉線粒體代謝機(jī)能，減少糖尿病大鼠肝臟甘油三酯和ROS含量，能顯著改善糖尿病大鼠體內(nèi)胰島素抵抗，降低血糖。因此AOX抑制劑或AOX抑制劑前體可以治療伴胰島素抵抗的1型糖尿病(與胰島素聯(lián)合治療)。實施例6、AOX抑制劑前體對ob/ob小鼠降血糖、降體重、降血脂和降肝脂實驗SPF級雄性ob/ob小鼠16只，體重42-45g，作為糖尿病組；C57BL小鼠16只，體重20-22g，作為正常組。ob/ob小鼠和C57BL小鼠均喂以普通小鼠飼料，自由進(jìn)水進(jìn)食。ob/ob小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，禁食3h，尾靜脈取血，血糖儀測定空腹血糖，按血糖水平均分為兩組，每組8只：ob/ob小鼠對照組，給予0.1mL橄欖油灌胃；AOX抑制劑治療組，將AOX抑制劑前體LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，給予LH-919灌胃50μg/kg/d。C57BL小鼠隨機(jī)分為2組，每組8只：C57BL小鼠正常組，給予橄欖油灌胃0.1ml/只/天；C57BL藥物組，LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，給予LH-919灌胃50μg/kg/d。各組持續(xù)灌胃16天。于喂藥后第4、8、12、16d禁食3h，尾靜脈取血血糖儀測定空腹血糖。灌胃后第13天行OGTT實驗，5：00am禁食，3h后尾靜脈采血測定空腹血糖，作為基礎(chǔ)對照(0min)，然后ob/ob小鼠各組動物給予葡萄糖2.0g/kg灌胃，分別在此之后30min，60min，和120min尾靜脈采血測定各組血糖，繪制0-120min的血糖-時間曲線，并計算血糖曲線下面積AUC0-120min。第16天測完血糖后，摘眼球取血，分離血清。胰島素ELISA試劑盒(Millipore，Billerica，MA)測定血清胰島素，并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)(MattewsDR.et.al.，Diabetologia，1985，28，412-419)。試劑盒測定血清甘油三酯、游離脂肪酸含量。隨后處死所有ob/ob小鼠，摘取肝臟，迅速從肝右葉固定部位切取1塊肝組織，迅速以甲醛固定，制備成石蠟切片，通過HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝臟脂肪病變情況，每組取4份肝臟樣本進(jìn)行分析。同時從肝右葉相同部位切取另1塊肝組織，試劑盒測定肝臟甘油三酯含量。分離肝細(xì)胞過氧化物酶體，測定各組肝細(xì)胞AOX活性，以IP-CoA為底物測定。肝臟脂質(zhì)過氧化水平采用微量丙二醛檢測試劑盒測定(南京建成生物工程研究所，南京)。數(shù)據(jù)以X±SEM表示，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組之間差異性比較采用獨立樣本t檢驗。與C57BL小鼠對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。與ob/ob小鼠對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。ob/ob小鼠在給予AOX抑制劑前體LH-919治療4天后，治療組血糖較ob/ob小鼠對照組顯著下降，下降水平一直維持穩(wěn)定，如表7所示。OGTT實驗結(jié)果表明，經(jīng)AOX抑制劑前體LH-919治療能顯著改善ob/ob小鼠的口服糖耐受，見圖39A，與ob/ob小鼠對照組比較，AOX抑制劑組AUC0-120min面積顯著下降(p＜0.01)，如圖39B所示。表7、AOX抑制劑前體LH-919對ob/ob糖尿病小鼠降血糖作用經(jīng)過16天治療后，ob/ob小鼠藥物組血清胰島素含量顯著下降(表8)，HOMA-IR較對照組顯著下降。ob/ob小鼠治療組血清甘油三酯含量較對照組顯著下降(表8)。測定肝細(xì)胞過氧化物酶體AOX活性，結(jié)果如圖40所示，經(jīng)AOX抑制劑前體治療后，ob/ob小鼠治療組肝臟AOX活性較對照組顯著降低。ob/ob小鼠治療組肝臟肝重系數(shù)和甘油三酯含量較對照組均顯著下降(表8)。光學(xué)顯微鏡下觀察ob/ob小鼠各組肝臟病理切片，結(jié)果顯示，抑制劑組ob/ob小鼠肝臟脂肪滴分布較對照組顯著減少，呈零星狀分布，如圖41所示，AOX抑制劑治療能顯著減少ob/ob小鼠肝臟脂肪沉積。抑制劑組ob/ob小鼠肝臟MDA含量較ob/ob小鼠對照組也顯著下降(圖42)。表8.各組小鼠的代謝相關(guān)參數(shù)上述結(jié)果表明，給予ob/ob小鼠AOX抑制劑前體治療，通過提高肝臟和骨骼肌線粒體代謝機(jī)能，增強(qiáng)ob/ob小鼠體內(nèi)胰島素敏感性，能顯著降低ob/ob小鼠血糖，減輕體重，降低ob/ob小鼠血清和肝臟甘油三酯含量。因此AOX抑制劑或AOX抑制劑前體可以治療2型糖尿病，肥胖癥，非酒精性脂肪肝病和高甘油三酯血癥等代謝性疾病。實施例7、AOX抑制劑前體對db/db小鼠降血糖、降血脂和降肝脂實驗SPF級雄性db/db小鼠16只，體重38-42g；C57BL小鼠8只，體重20-23g，均喂以普通小鼠飼料，自由進(jìn)水進(jìn)食。db/db小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，禁食3h，尾靜脈取血，血糖儀測定空腹血糖，按血糖水平均勻分為兩組，每組8只：db/db小鼠對照組，給予0.1mL橄欖油灌胃；AOX抑制劑前體治療組，LH-919溶于相應(yīng)體積橄欖油中，給予db/db小鼠LH-919灌胃50μg/kg/d。另設(shè)C57BL小鼠正常組8只，給予橄欖油灌胃0.1ml/只/天。各組持續(xù)灌胃16天。于喂藥后第4、8、12、16天禁食3h，尾靜脈取血，血糖儀測定空腹血糖。第16天測完血糖后，摘眼球取血，分離血清。胰島素ELISA試劑盒(Millipore，Billerica，MA)測定血清胰島素，并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。試劑盒測定血清甘油三酯、游離脂肪酸含量。隨后處死所有db/db小鼠，摘取肝臟，從肝右葉相同部位切取1塊肝組織，試劑盒測定肝臟甘油三酯含量。制備肝勻漿，分離肝細(xì)胞過氧化物酶體，測定各組肝細(xì)胞AOX活性，以IP-CoA為底物測定。肝臟脂質(zhì)過氧化水平采用微量丙二醛(MDA)測定試劑盒檢測(南京建成生物工程研究所，南京)。數(shù)據(jù)以X±SEM表示，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各組之間差異性比較采用獨立樣本t檢驗。與db/db小鼠對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。db/db小鼠在給予AOX抑制劑前體LH-919治療后，治療組血糖較db/db小鼠對照組顯著降低，且血糖維持在較平穩(wěn)水平，如表9所示。表9、AOX抑制劑前體對db/db小鼠降血糖作用經(jīng)過16天治療后，db/db小鼠治療組血清胰島素水平較對照組顯著下降(表10)，HOMA-IR較對照組顯著降低。db/db小鼠抑制劑組血清甘油三酯(表10)含量也較對照組顯著降低。測定肝細(xì)胞過氧化物酶體AOX活性，結(jié)果如圖43所示，經(jīng)AOX抑制劑前體治療后，db/db小鼠治療組肝臟AOX活性較對照組顯著下降。同時，db/db小鼠抑制劑組肝臟甘油三酯含量(表10)和肝臟MDA含量(圖44)均較db/db小鼠對照組顯著降低。表10.各組小鼠的代謝相關(guān)參數(shù)上述結(jié)果表明，給予db/db小鼠AOX抑制劑前體治療，通過提高肝臟和骨骼肌線粒體代謝機(jī)能，能改善db/db小鼠體內(nèi)胰島素抵抗，顯著降低血糖，降低血清和肝臟甘油三酯含量。因此，AOX抑制劑或AOX抑制劑前體作為線粒體代謝機(jī)能促進(jìn)劑，可以治療2型糖尿病，非酒精性脂肪肝病和高甘油三酯血癥等代謝性疾病。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。