大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途。本發(fā)明采用基因重組質(zhì)粒表達大腸桿菌表面蛋白TolC，通過SELEX過程篩選與其特異性結(jié)合的核酸適配體群，測序分析適配體群的堿基序列。該序列可作為大腸桿菌表面蛋白TolC的特異性結(jié)合的探針，用于設計和制備大腸桿菌快速檢測標識物及外排泵抑制劑等。
【專利說明】大腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途
[0001] 本發(fā)明是于2013年2月28日申請的申請?zhí)枮?01310062950. 2、發(fā)明名稱為"大 腸桿菌外膜蛋白TolC核酸適配體的序列及用途"的分案申請。
【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于分子生物學和醫(yī)學微生物【技術領域】，涉及大腸桿菌外膜蛋白TolC核 酸適配體的序列及用途。
【背景技術】
[0003] 大腸桿菌（Escherichia coli)是埃希氏菌屬的代表菌，是構成人類腸道中的正常 菌群之一，又是重要的條件致病菌，極易通過多種形式和途徑侵入腸道外的組織和器官，造 成各種嚴重感染。隨著抗菌藥物的臨床廣泛應用，誘導了大量該菌屬耐藥菌株的產(chǎn)生，并 形成了該菌對單一抗菌藥物耐藥到對多種抗菌藥物同時耐藥，由低耐藥率到高耐藥率的發(fā) 展，給臨床治療帶來了極大的困難，導致較高的病死率。目前國內(nèi)外對大腸桿菌的耐藥性機 理展開了深入的研究。研究表明，主動外排泵為大腸桿菌多重耐藥的重要機制。大腸桿菌 外排泵包括：RND、MFS、ABC、SMR、MATE五類，其中前三者必須與外膜蛋白（OMP) TolC構成轉(zhuǎn) 運共同體，才能完成對多種藥物的外排，由此可見TolC是構成大腸桿菌外排泵的重要組成 成分。TolC是位于外膜上的孔道蛋白，上端為開放結(jié)構，以便給外排底物提供泵出的寬闊通 道；下端為封閉結(jié)構。外排泵三聯(lián)復合物構象的改變，可使孔道定期開放或閉合。TolC結(jié) 構的改變會引起它們?nèi)呦嗷プ饔玫臏p弱甚至三聯(lián)復合物的解體。在關于大腸桿菌外膜蛋 白的研究報導中，很多結(jié)果提示了 TolC蛋白在大腸桿菌的多重耐藥機制中起到至關重要 的作用。但目前沒有報道通過改變該蛋白結(jié)構來抑制耐藥性。
[0004] 適配體（Aptamers)的研究是一個新的熱點領域，它是能夠與許多目標分子（蛋 白，藥物，無機或有機分子）發(fā)生高親合性和特異性結(jié)合的一類單鏈核酸（DNA or RNA)。至 今發(fā)現(xiàn)高親和特異性適配體的方法是配體指數(shù)富集系統(tǒng)展開（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)。由于適配體與配體分子結(jié)合的高特異性 以及高親和性，在醫(yī)學研究中被廣泛應用于檢測和藥物研究等方面。Yuan等（Yuan L，et al，Anal Chem，2007,79(3) :1082)利用等離子體表面共振成像與適配子技術建立蛋白質(zhì)芯 片，檢測該蛋白質(zhì)芯片上吸附的蛋白抗體凝血酶、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)復合物。Cao等 (Cao X，et al，Nucleic Acids Res，2009,37(14) :4621-8)利用篩選出的針對金黃色葡萄 球菌的適配子來檢測金黃色葡萄球菌。
[0005]目前國內(nèi)外大部分從事核酸適配體研究的科學家和生物技術公司主要將適配體 運用于病毒感染、癌癥、自身免疫病、血管性疾病的臨床治療，并成為較為理想的臨床治療 的新手段。其治療機制主要是通過折疊成一定的三維結(jié)構直接與病理學相關蛋白質(zhì)特異性 結(jié)合，抑制這些蛋白質(zhì)的活性，以達到治療目的。Feng H等（Feng H，et al，PL〇S One，2011， 6(11) :e27862)篩選出了能與乙型肝炎病毒高親和力結(jié)合，干擾病毒P-e復合物形成的適 配體。但迄今尚無針對細菌外膜蛋白的適配體報道或公開，因此實有必要開發(fā)一種可特異 性結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明擬考慮將核酸適配體應用于改變TolC蛋白結(jié)構來有效阻塞大腸桿菌外排 泵外排活性。開發(fā)可特異性結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體，為抑制大腸桿菌多 重耐藥提供有力支持，具有重要的臨床價值。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種可特異結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體。該
【權利要求】
1. 特異結(jié)合大腸桿菌外膜蛋白TolC的核酸適配體，所述核酸適配體如SEQ ID NO :14 所示序列。
2. 按權利要求1所述的適配體，其特征在于，所述大腸桿菌外膜蛋白TolC采用如下方 法純化得到： 采用分子克隆技術，根據(jù)大腸桿菌外膜蛋白TolC的基因組序列設計特異引物，所述特 異引物之上游引物Pa為5' -CGGGATCCATGAAGAAAITGCTCCCCAITCTT - 3'，其下游引物Pb為 5' - CCGCTCGAGGITACGGAAAGGGITATGACCGTT - 3'，以全長 cDNA 為模板，PCR 擴增，得到目的基 因經(jīng)Bam H I和Xho I雙酶切，同樣處理PET-30a質(zhì)粒，再用T4連接酶連接制得含有TolC 基因的重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21，從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，IPTG誘導表達，經(jīng)固液分離，取沉淀經(jīng)超聲粉碎，然后電泳；再采用柱層析純化所述 大腸桿菌外膜蛋白TolC。
3. 按權利要1或2所述的適配體，其特征在于，所述序列為人工合成的序列，或任何其 他來源的同樣的序列。
4. 一種權利要求1-3中任一項所述的適配體在制備大腸桿菌外排泵抑制劑中的應用。
5. -種權利要求1-3中任一項所述的適配體在制備檢測TolC蛋白的探針或靶點中的 應用。
6. -種權利要求1所述的適配體在制備大腸桿菌外排泵抑制劑或制備檢測TolC蛋白 的探針或靶點中的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK104450722SQ201410767405
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年2月28日 優(yōu)先權日:2013年2月28日
【發(fā)明者】陳伶利, 葛金文, 李 杰 申請人:湖南中醫(yī)藥大學