一種核酸適配體修飾磁性金屬有機(jī)骨架介質(zhì)的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于材料科學(xué)與現(xiàn)代分離分析領(lǐng)域，涉及到新型磁性MIL-101的制備及修 飾核酸適配體。該磁性固相萃取介質(zhì)對(duì)特定的赭曲霉素A具有高特異性識(shí)別性能，適用于 生物、環(huán)境和食品等復(fù)雜樣品的選擇性分離富集。
【背景技術(shù)】
[0002] 對(duì)于復(fù)雜生物樣品中痕量、超痕量組分分析而言，因其基體復(fù)雜、分析對(duì)象含量 低，使樣品前處理變得極其不易。簡單、快速、高效、綠色、高選擇性的樣品前處理技術(shù)是分 析復(fù)雜樣品如血漿、尿液、環(huán)境樣品和食品中痕量或超痕量待測組分的重要步驟。因樣品前 處理技術(shù)受到越來越多的關(guān)注與重視，如固相萃取、固相微萃取、液相微萃取、基質(zhì)固相分 散萃取、微波輔助萃取、加速溶劑萃取等技術(shù)。其中固相萃取和固相微萃取是研究最為廣泛 的兩種技術(shù)，兩種技術(shù)的核心是介質(zhì)材料的制備，近年來，為了解決復(fù)雜體系分離分析的問 題，國內(nèi)外眾多研究組對(duì)固相萃取的新型分離介質(zhì)研發(fā)、新方法的探索、分離分析聯(lián)用方面 進(jìn)行了深入研究，其中，磁性固相萃?。∕agneticsolid-phaseextraction,MSPE)的前處 理研究取得了長足的發(fā)展，MSPE借助外磁場作用實(shí)現(xiàn)分離，避免了高速離心，簡化了操作， 同時(shí)具有高通量和高富集能力等優(yōu)點(diǎn)。基于固相吸附萃取原理，核心在于所用的固相涂層 材料及涂漬技術(shù)，但目前商品化分離介質(zhì)種類有限，其中大多數(shù)都存在萃取容量小、選擇性 較低，萃取時(shí)易受樣品中基體或雜質(zhì)干擾等影響。
[0003] 金屬-有機(jī)骨架（Metal-organicframeworks,MOFs)材料是一種通過金屬離子和 多齒有機(jī)配體間的組裝作用而構(gòu)成的結(jié)晶多孔材料。MOFs材料的骨架結(jié)構(gòu)、孔徑分布和比 表面積等結(jié)構(gòu)參數(shù)可以方便地通過選擇合適的金屬和有機(jī)配體并控制它們間的連接方式 來進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其具有良好的可修飾性，可通過各種功能基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)專一性、復(fù)雜性、可控 性的應(yīng)用。MOFs材料因其多孔、孔徑可調(diào)、比表面積大、易于修飾以及具有不飽和配位的金 屬離子中心而在在樣品前處理領(lǐng)域中的表現(xiàn)更加令學(xué)者們期待，值得深入研究，但是該材 料存在耐溶劑性能差問題，而MIL-101具有良好的耐溶劑性能，在前處理中具有良好的應(yīng) 用前景，但其吸附性能主要靠介質(zhì)間的非特異性吸附，選擇性較差，急需對(duì)其進(jìn)行修飾，以 滿足復(fù)雜樣品尚選擇性如處理和尚靈敏、快速檢測的要求。
[0004] 適配體（Aptamer)是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX)經(jīng)體外篩選得到 的，是一類能與靶目標(biāo)專一性特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA。具有以下優(yōu)點(diǎn)，適配體靶分子 范圍廣，親和力高，特異性強(qiáng)，篩選制備方便且純度高、批次間重現(xiàn)性好，性質(zhì)穩(wěn)定，容易修 飾功能團(tuán)，適配體在化學(xué)修飾后作為配基可固定在各種材料表面，如金屬有機(jī)骨架材料、硅 膠、玻璃等，應(yīng)用于各類分離技術(shù)，包括液相色譜、親和色譜、毛細(xì)管電色譜、生物傳感器等， 因核酸適配體在分析化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，已成為國內(nèi)外研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。結(jié)合 MIL-101的表面積大、易修飾以及適配體高選擇性的特點(diǎn)，發(fā)展核酸適配體修飾的MIL-101 在復(fù)雜樣品前處理中具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明針對(duì)樣品前處理技術(shù)重要性及其分析過程中關(guān)鍵地位 的認(rèn)識(shí)，結(jié)合目前國內(nèi)外MSPE方法及核酸適配體和金屬有機(jī)骨架材料研究存在的問題及 發(fā)展趨勢，將磁性Fe3O4氨基功能化與硝酸鉻、對(duì)苯二甲酸和氫氟酸高溫下化學(xué)反應(yīng)，再采 用高親和作用固載核酸適配體，獲得具有簡單、高選擇、高效的適配體修飾的磁性MIL-101。
[0006] 本發(fā)明的內(nèi)容包括一種新型分離介質(zhì)核酸適配體修飾的磁性MIL-101的制備方 法，按以下步驟進(jìn)行：
[0007] (1)將Fe2+和Fe3+混合，加入氨水生成磁性Fe304，然后采用Fe3O4與正硅酸乙酯在 加入氨水引發(fā)制備Fe3O4OSiO2，再采用Fe3O4OSiO^APTES、無水乙醇反應(yīng)生成NH2-Fe304。
[0008] (2)將硝酸鉻于超純水中充分溶解，依次加入對(duì)苯二甲酸和氫氟酸，混合均勻，得 到合成MIL-101的反應(yīng)溶液。
[0009] (3)在⑵所述合成MIL-101的反應(yīng)溶液中加入NH2-Fe3O粒子，混合均勾，放入水 熱反應(yīng)釜中密封，水熱合成反應(yīng)制備磁性MIL-101;
[0010] (4)將上述制備的磁性MIL-101加入PBS緩沖液中，活化反應(yīng)，加入鏈霉親和素溶 液，室溫振搖反應(yīng)，制得磁性MIL-101/鏈霉親和素，PBS緩沖液清洗，低溫保存。
[0011] (5)取上述制備所得磁性MIL-101/鏈霉親和素，加入Tris-HCl緩沖溶液，混合均 勻后加入赭曲霉素A核酸適配體溶液，37°C振搖反應(yīng)，再用Tris-HCl緩沖溶液清洗，制得所 述核酸適配體修飾的磁性金屬有機(jī)骨架材料，于緩沖液中低溫保存。進(jìn)一步地，所述步驟 (3)的反應(yīng)溫度為200°C，反應(yīng)時(shí)間為8h，NH2-Fe3O4的用量為900mg。
[0012] 進(jìn)一步地，所述步驟（4)的反應(yīng)溫度為25°C，反應(yīng)溶液為PBS緩沖液，pH為6. 0， 反應(yīng)時(shí)間為24h，鏈霉親和素用量為50yL，濃度為5mg/L。
[0013] 進(jìn)一步地，所述步驟（5)中所述的Tris-HCl緩沖溶液赭曲霉素A核酸適配體 的緩沖液為為pH= 7. 4,30mmolTris-HCl(pH= 7. 4,30mmol)，赭曲霉素A適配體用量為 I. 25nmol，反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間24h。
[0014] 進(jìn)一步地，所述步驟（4)中，磁性MIL-101的用量為10mg。
[0015] 進(jìn)一步地，所述步驟（5)中磁性MIL-101/鏈霉親和素用量為10mg。
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟（1)中所述Fe2+和Fe3+的摩爾比為1:2。
[0017] 本發(fā)明的內(nèi)容還包括按照上述的方法制備得到的核酸適配體修飾的磁性金屬有 機(jī)骨架材料OTAApt-MMIL-IOl。
[0018] 進(jìn)一步地，所述核酸適配體修飾的磁性金屬有機(jī)骨架材料OTAApt-MMIL-IOl，具 有在水、甲醇、乙腈、乙酸溶劑中具有良好的耐溶劑性能，確保材料可以重復(fù)使用及較好的 重現(xiàn)性。
[0019] 進(jìn)一步地，所述核酸適配體修飾的磁性金屬有機(jī)骨架材料OTAApt-MMIL-IOl顯示 出磁分離的簡單，對(duì)小分子赭曲霉素A具有特異性識(shí)別性能。
[0020] 具體地，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0021] 本發(fā)明采用一種簡單、有效的化學(xué)鍵合策略合成了耐溶劑穩(wěn)定的新型OTA Apt-MMIL-IOl的MSPE介質(zhì)，其對(duì)赭曲霉毒素具有具有高特異性識(shí)別性能，及高萃取容量， 修飾不同的核酸適配體對(duì)相應(yīng)的靶目標(biāo)具有良好的選擇性富集能力。具有高效、高選擇的 特點(diǎn)，滿足復(fù)雜樣品中超痕量對(duì)象的分析要求。
[0022] 為了更好地理解和實(shí)施，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明。
【附圖說明】
[0023] 圖1?本發(fā)明的OTA Apt-MMIL-IOl的合成流程圖。
[0024]圖2?本發(fā)明的OTA Apt-MMIL-IOl的磁滯曲線。（a)NH2-Fe3O4; (b)Magnetic MIL-101 ; (c)OTA Apt-MMIL-101。
[0025] 圖3.本發(fā)明的OTA Apt-MMIL-101對(duì)不同物質(zhì)的選擇性。
[0026] 圖4.本發(fā)明的OTAApt-MMIL-101對(duì)不同物質(zhì)的吸附容量。
[0027] 圖5.本發(fā)明的OTA Apt-MMIL-101分析水稻和花生樣品的色譜圖。（a)標(biāo)準(zhǔn)溶液 50 y g/L直接進(jìn)樣；(b)水稻或花生樣品；（c)1.0 ng/kg加標(biāo)樣品。1.赭曲霉素A。 具體實(shí)施例
[0028] 以下結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于 說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0029] 實(shí)施例1核酸適配體修飾的磁性MIL-IOl的制備
[0030] 本發(fā)明的OTAApt-MMIL-101的合成示意圖如圖1所示：
[0031] (I)NH2-Fe3O4的制備：準(zhǔn)確稱量 28.IgFeCl3 ? 6H20, 14. 4gFeSO4 ? 7H20,用 150mL 蒸餾水溶解，倒入500mL三口燒瓶，機(jī)械攪拌，通氮除氧lOmin?？焖僦鸬渭尤?0mL25%的 氨水，之后以0. 5mL/min恒定速率將IOmL油酸滴入燒瓶中，恒溫?cái)嚢鑜h。將所得磁流體置 于磁鐵上沉降20min后倒掉上層液，采用去蒸餾水超聲清洗磁分離。量取15mL磁流體置 于200mL正丙醇中，超聲15min后，在機(jī)械攪拌下加入NH3 ?H20(25% ) (5.OmL)，連續(xù)加入 TEOS(2.OmL)，在30°C下保持12h。用CH3OH和蒸餾水各清洗4次，在150°C下真空干燥。取上 述Fe304@Si02250mg分散在 300.OmLCH3CH20I^PH20(v/v，149/1)的混合溶液中，超聲 30min， 滴加入APTES2.OmL，在室溫下攪拌8h，離心30min(轉(zhuǎn)速為10000r/min)，用CH3CH2OH清洗 5次。在150°C下真空干燥。
[0032] ⑵磁性MIL-IOl的制備：稱量1200mgCr(NO3)3 ? 9H20使用14. 4mL超純水充分 溶解后依次加入498mg對(duì)苯二甲酸和0. 5mLHF，混合均勻后放入水熱反應(yīng)釜中密封，加入 NH2-Fe304900mg，水熱合成反應(yīng)在220°C下進(jìn)行8h。反應(yīng)完成后待反應(yīng)釜冷卻至室溫，所得 產(chǎn)物分別使用二甲